CN105043981B - 一种测定Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定Dickkopf‑1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法，通过收集经全髋置换术取下的SANFH的股骨头标本作为实验组，股骨颈骨折髋关节置换术后标本作为对照组，切取股骨头标本经固定、脱钙，制作切片，电镜观察骨细胞形态变化，光镜观察其病理变化，并用HE染色计数空缺骨陷窝，免疫组织化学染色法检测Dickkopf‑1的表达，用TUNEL凋亡检测试剂盒检测骨细胞凋亡，探索Dickkopf‑1与细胞凋亡在SANFH中的作用。本发明能为该病早期诊断、治疗提供一定帮助，也可为今后SANFH的临床预防及治疗提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于医学研究领域，尤其涉及一种Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法。
背景技术
激素性股骨头缺血坏死(Steroid-induced Avascular Necrosis of FemoralHead，SANFH)是指因长期使用或短期大量使用肾上腺皮质激素(以下简称激素)后造成股骨头活性成分的死亡所引起的病理过程。早在20世纪50年代就已发现，大量使用激素可以导致股骨头坏死。目前由于临床上对糖皮质激素的广泛应用，致使SANFH的临床病例数大幅度增加。SANFH为非创伤性股骨头坏死中发病率最高的一种类型。SANFH主要累及中青年人群，多为双侧性，其坏死率和致残率远高于一般的特发性股骨头缺血坏死。2003 年“非典”以后，又涌现出大量SANFH病例。激素引起的SANFH是一个非常复杂的生物学过程，具体的发病机制仍然不是很清楚，因此，探明SANFH的发病机制，仍然是该领域的研究重点。
虽然自上个世纪60年代开始，许多学者就开始致力于对SANFH发病机制的研究，但到目前为止仍未得到确切结论，现存在诸多比较分散的学说，比较具有代表性的有脂肪代谢紊乱、血管内凝血、激素的细胞毒作用、骨内压增高等。但是，其确切病理生理学机制并未明确。近年，相关基因学研究表明，SANFH与细胞凋亡、血液系统相关基因以及遗传易感性等因素有关。随着分子生物学的发展，细胞凋亡理论已成为研究器官组织损伤和衰老发生机制的重要研究方向，受到众多国内外学者的重视。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡，是多种细胞有机体为维护内环境稳定、调控机体发育进行的程序化细胞死亡，为细胞衰老自然死亡的主要方式之一。虽然细胞凋亡是一种生理过程，但或多或少都会引起疾病发生。细胞凋亡的发生主要与氧化应激、线粒体损伤及钙稳态失衡等有关；凋亡信号转导通路受基因调控及许多诱导因素(如激素和生长因子的失衡等)的影响。近年来已有许多学者开始初步探讨骨细胞和成骨细胞的凋亡在SANFH中的作用，对其发病机制有了新的认识。但遗憾的是，这些研究还尚未深入到对骨细胞、成骨细胞凋亡机制的研究中。而亦有研究表明在其他疾病里如肝癌、胃癌等Wnt信号途径与细胞凋亡有密切关系，但在骨细胞内尚未研究方法，而且有大量研究表明激素虽对Wnt受体LRP表达的影响甚微，但可显著增加Wnt拮抗分子Dickkopf-1的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法，旨在探索Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中的作用，为进一步探讨激素性股骨头缺血性坏死提供新的思路。
本发明是这样实现的，一种Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法通过收集经全髋置换术取下的SANFH的股骨头标本作为实验组，股骨颈骨折髋关节置换术后标本作为对照组，切取股骨头标本经固定、脱钙，制作切片，电镜观察骨细胞形态变化，光镜观察其病理变化，并用HE染色计数空缺骨陷窝，免疫组织化学染色法检测Dickkopf-1的表达，用TUNEL凋亡检测试剂盒检测骨细胞凋亡，探索Dickkopf-1与细胞凋亡在SANFH中的作用。
进一步，Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法的具体步骤如下：
步骤一、收集全髋置换手术后取下的股骨头，-80℃冰箱保存。SANFH 例作为实验组，新鲜股骨颈骨折标本作为对照组，对照组患者排除心血管及免疫系统疾患，无烟酒嗜好及服用激素史；
步骤二、标本制作：
将取下的股骨头自冠状面对半剖开，切取股骨头软骨骨块，用4％多聚甲醛固定12小时(含0.1％DEPC)后，13％乙二胺四乙酸(EDTA PH7.0)脱钙，脱钙完全后，常规石蜡包埋；
步骤三、光镜下组织形态学观察：
取石蜡包埋组织块，制成厚5μm切片，HE染色，将染色后的切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化；
步骤四、透射电子显微镜观察：
在股骨头坏死区切取骨块，2.5％戊二醛液前固定，10％EDTA脱钙，1％饿酸后固定，环氧树脂包埋，瑞典LKB2800型制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝染色，电镜观察；
步骤五、TUNEL法检测骨细胞凋亡情况；
步骤六、免疫组织化学法检测Dickkopf-1；
步骤七、统计学处理。
进一步，HE染色的具体方法为：
第一步、60℃烤箱脱蜡30分钟；
第二步、二甲苯I脱蜡10分钟；
第三步、二甲苯II脱蜡5分钟；
第四步、无水乙醇洗去二甲苯2次，每次1分钟；
第五步、95％乙醇2次，每次1分钟；
第六步、90％乙醇1分钟；
第七步、85％乙醇1分钟；
第八步、自来水洗去乙醇5分钟；
第九步、苏木素着色4分钟；
第十步、自来水冲1分钟；
第十一步、1％盐酸酒精分化20秒；
第十二步、自来水洗1分钟；
第十三步、1％稀氨水返蓝30秒，蒸馏水洗1分钟；
第十四步、伊红染色20秒，0、85％酒精脱水20秒；
第十五步、90％酒精脱水30秒；
第十六部、95％酒精脱水1分钟；
第十七步、95％酒精脱水1分钟；
第十八步、无水乙醇I脱水2分钟；
第十九步、无水乙醇II脱水2分钟；
第二十步、二甲苯I 2分钟；
第二十一步、二甲苯II 2分钟；
第二十二步、二甲苯III 2分钟；
第二十三步、中性树胶封片。
进一步，TUNEL法检测骨细胞凋亡情况的具体方法为：
第一步、标本的处理：(a)玻片预先用APES进行处理；(b)细胞涂片和冰冻切片：必须马上固定，用4％的多聚甲醛PH为7.0-7.6，在室温固定35分钟，0.01M PBS液洗2次，每次2分钟，蒸馏水洗涤2次每次2分钟。 (c)组织：立刻固定，10％中性缓冲甲醛液固定5小时，石蜡包埋，切片脱蜡干净后入水；
第二步、制备新鲜的3％的H2O2，在室温下处理10分钟，蒸馏水洗涤3 次，每次2分钟；
第三步、标本片加0.01M TBS 1∶200的新鲜稀释Proteinase K 37℃消化15分钟，0.01M的TBS液洗3次，每次2分钟；
第四步、每张标本片加标记缓冲液20μl，以防止切片干燥，将TdT和 DIG-d-UTP各1μl与18μl标记缓冲液混和滴与切片上。甩掉其上多余的液体再滴标记液，每片20μl。将样品放在37℃湿盒里2小时；
第五步、0.01M的TBS液洗涤3次，每次2分钟；
第六步、每片滴封闭液50μl，室温下30分钟后，甩去封闭液；
第七步、将1∶100的抗体稀释液稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀，每片标本滴50μl，放在37℃湿盒里反应30分钟，用0.01M TBS洗涤3次，每次2分钟；
第八步、用抗体稀释液1∶100稀释SABC：将SABC 10μl加入1ml的抗体稀释液，混匀，每片滴50μl。37℃反应30分钟，0.01M TBS洗涤4次每次5分钟；
第九步、DAB显色：在DAB试剂盒的A、B、C试剂中各加入一滴蒸馏水，混匀，滴到标本片上，显色20分钟，显微镜下观察着色情况后水洗；
第十步、苏木素轻度复染；0.01M TBS洗，蒸馏水洗；脱水，透明，封片；光学显微镜下观察且记录实验数据；TUNEL染色，当细胞核中出现棕黄色颗粒的为阳性细胞，即为凋亡的细胞；在光镜下，随机在每张玻片上找5 个高倍视野，每个高倍视野下计数50个骨细胞，计算
进一步，免疫组织化学法检测Dickkopf-1的具体步骤如下：
第一步、各蜡块连续4μm切片，置于涂有APES防脱片剂的载玻片上，置60℃烤箱中烘烤50分钟；
第二步、切片常规二甲苯脱蜡两次，每次20分钟；梯度乙醇脱水：无水乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，蒸馏水水化一分钟；
第三步、切片置于3％H2O2 10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次；
第四步、热修复抗原：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次，冷却后PBS(PH7.2-7.6) 洗涤3次，每次5分钟；
第五步、滴加5％BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，不洗；
第六步、在每张切片上滴加相应的第一抗体50μl，即兔抗人Dickkopf-1 多克隆抗体，20℃2小时。PBS(PH7.2-7.6)洗3次每次5分钟；
第七步、滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20分钟，PBS洗3次，每次3分钟；
第八步、滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS冲洗4次，每次5分钟；
第九步、制备DAB显色剂，室温显色约8分钟，在显微镜下掌握显色程度，蒸馏水洗涤5次；
第十部、苏木素复染，自来水冲洗反蓝；
第十一步、梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片；
第十二步、显微镜下观察结果。
进一步，统计学处理的具体方法为：
数据均以表示，用SPSS13.0软件进行统计分析，空缺骨陷窝率、 Dickkopf-1表达率符合正态性资料因此统计检验采用t检验，骨细胞凋亡指数不符合正态性资料因此统计检验采用秩和检验，实验组的Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡率采用Spearman线性相关，-1≤r≤+1表示两个变量呈直线相关关系，r为正数表示正相关，r为负数表示负相关，P＜0.05有统计学意义。
效果汇总
本发明得出了以下结论：Dickkopf-1与细胞凋亡参与了SANFH的过程， Dickkopf-1水平升高可能是SANFH发病的重要促进因素；骨细胞凋亡在股骨头缺血坏死过程中起重要作用。可能为该病早期诊断、治疗提供一定帮助，也可为今后SANFH的临床预防及治疗提供理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例提供的Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明的Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法流程，如图所示，本发明是这样实现的，一种Dickkopf-1 与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法通过收集经全髋置换术取下的SANFH的股骨头标本作为实验组，股骨颈骨折髋关节置换术后标本作为对照组，切取股骨头标本经固定、脱钙，制作切片，电镜观察骨细胞形态变化，光镜观察其病理变化，并用HE染色计数空缺骨陷窝，免疫组织化学染色法检测Dickkopf-1的表达，用TUNEL凋亡检测试剂盒检测骨细胞凋亡，探索Dickkopf-1与细胞凋亡在SANFH中的作用。
Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法的具体步骤如下：
S101、收集全髋置换手术后取下的股骨头，-80℃冰箱保存。SANFH例作为实验组，新鲜股骨颈骨折标本作为对照组，，对照组患者排除心血管及免疫系统疾患，无烟酒嗜好及服用激素史；
本发明实施例中SANFH 14例作为实验组，男10例，女4例，年龄45 岁～68岁，平均54岁；新鲜股骨颈骨折标本8例(受伤3d内手术者)作为对照组，男6例，女2例，年龄54岁～80岁，平均年龄68岁。
S102、标本制作：
将取下的股骨头自冠状面对半剖开，切取股骨头软骨骨块，用4％多聚甲醛固定12小时(含0.1％DEPC)后，13％乙二胺四乙酸(EDTA PH7.0)脱钙，脱钙完全后，常规石蜡包埋；
切取股骨头软骨骨块的大小为0.2cm下0.5cm×0.5cm×0.5cm，脱钙完全后(针刺无阻力为准，大约需要6至14天)，常规石蜡包埋；
S103、光镜下组织形态学观察：
取石蜡包埋组织块，制成厚5μm切片，HE染色，将染色后的切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化。
即在100倍光镜下，随机挑选出5个高倍镜视野，每个视野内计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数。
HE染色的具体方法为：
第一步、60℃烤箱脱蜡30分钟；
第二步、二甲苯I脱蜡10分钟；
第三步、二甲苯II脱蜡5分钟；
第四步、无水乙醇洗去二甲苯2次，每次1分钟；
第五步、95％乙醇2次，每次1分钟；
第六步、90％乙醇1分钟；
第七步、85％乙醇1分钟；
第八步、自来水洗去乙醇5分钟；
第九步、苏木素着色4分钟；
第十步、自来水冲1分钟；
第十一步、1％盐酸酒精分化20秒；
第十二步、自来水洗1分钟；
第十三步、1％稀氨水返蓝30秒，蒸馏水洗1分钟；
第十四步、伊红染色20秒，0、85％酒精脱水20秒；
第十五步、90％酒精脱水30秒；
第十六部、95％酒精脱水1分钟；
第十七步、95％酒精脱水1分钟；
第十八步、无水乙醇I脱水2分钟；
第十九步、无水乙醇II脱水2分钟；
第二十步、二甲苯I 2分钟；
第二十一步、二甲苯II 2分钟；
第二十二步、二甲苯III 2分钟；
第二十三步、中性树胶封片。
S104、透射电子显微镜观察：
在股骨头坏死区切取骨块，2.5％戊二醛液前固定，10％EDTA脱钙，1％饿酸后固定，环氧树脂包埋，瑞典LKB2800型制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝染色，电镜观察。
在股骨头坏死区切取4至5块0.2cm×0.2cm×0.2cm的骨块，瑞典LKB2800型制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝染色，日立700型电镜观察.
S105、TUNEL法检测骨细胞凋亡情况。
在正常人的机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统方法是用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为细胞核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。细胞凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA 断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶可以将地高辛标记的 dUTP(DIG-dUTP)标记至3’-OH末端，DIG-dUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后，再结合链酶亲和素-过氧化物酶(SABC)，然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细胞核呈棕黄褐色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。试剂组成：A、标记缓冲液；B、末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT，×20)；C、DIG-dUTP(× 20)；D、封闭液；E、生物素化抗地高辛抗体(×100)；F、SABC(×100)；G、Proteinase K(×200)；H、抗体稀释液。
TUNEL法检测骨细胞凋亡情况的具体方法为：
第一步、标本的处理：(a)玻片预先用APES进行处理。(b)细胞涂片和冰冻切片：必须马上固定，用4％的多聚甲醛PH为7.0-7.6，在室温固定35分钟。0.01M PBS液洗2次，每次2分钟。蒸馏水洗涤2次每次2分钟。 (c)组织：立刻固定。10％中性缓冲甲醛液固定5小时，石蜡包埋。切片脱蜡干净后入水。
第二步、制备新鲜的3％的H2O2，在室温下处理10分钟。蒸馏水洗涤3 次，每次2分钟。
第三步、标本片加0.01M TBS 1∶200的新鲜稀释Proteinase K 37℃消化15分钟，0.01M的TBS液洗3次，每次2分钟。
第四步、每张标本片加标记缓冲液20μl，以防止切片干燥，将TdT和 DIG-d-UTP各1μl与18μl标记缓冲液混和滴与切片上。甩掉其上多余的液体再滴标记液，每片20μl。将样品放在37℃湿盒里2小时。
第五步、0.01M的TBS液洗涤3次，每次2分钟。
第六步、每片滴封闭液50μl，室温下30分钟后，甩去封闭液。
第七步、将1∶100的抗体稀释液稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀，每片标本滴50μl，放在37℃湿盒里反应30分钟。用0.01M TBS洗涤3次，每次2分钟。
第八步、用抗体稀释液1∶100稀释SABC：将SABC 10μl加入1ml的抗体稀释液，混匀，每片滴50μl。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗涤4次每次5分钟。
第九步、DAB显色：在DAB试剂盒的A、B、C试剂中各加入一滴蒸馏水，混匀，滴到标本片上，显色20分钟，显微镜下观察着色情况后水洗。
第十步、苏木素轻度复染；0.01M TBS洗，蒸馏水洗；脱水，透明，封片；光学显微镜下观察且记录实验数据；TUNEL染色，当细胞核中出现棕黄色颗粒的为阳性细胞，即为凋亡的细胞；在光镜下，随机在每张玻片上找5 个高倍视野，每个高倍视野下计数50个骨细胞，计算
S106、免疫组织化学法检测Dickkopf-1。
免疫组织化学法检测Dickkopf-1的具体步骤如下：
第一步、各蜡块连续4μm切片，置于涂有APES防脱片剂的载玻片上，置60℃烤箱中烘烤50分钟；
第二步、切片常规二甲苯脱蜡两次，每次20分钟；梯度乙醇脱水：无水乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，蒸馏水水化一分钟；
第三步、切片置于3％H2O2 10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次；
第四步、热修复抗原：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次，冷却后PBS(PH7.2-7.6) 洗涤3次，每次5分钟；
第五步、滴加5％BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，不洗；
第六步、在每张切片上滴加相应的第一抗体50μl，即兔抗人Dickkopf-1 多克隆抗体，20℃2小时。PBS(PH7.2-7.6)洗3次每次5分钟；
第七步、滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20分钟。PBS洗3次，每次3分钟；
第八步、滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS冲洗4次，每次5分钟；
第九步、制备DAB显色剂，室温显色约8分钟(在显微镜下掌握显色程度)。蒸馏水洗涤5次；
第十部、苏木素复染，自来水冲洗反蓝；
第十一步、梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片；
第十二步、显微镜下观察结果。
S107、统计学处理：
数据均以表示，用SPSS13.0软件进行统计分析，空缺骨陷窝率、 Dickkopf-1表达率符合正态性资料因此统计检验采用t检验，骨细胞凋亡指数不符合正态性资料因此统计检验采用秩和检验，实验组的Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡率采用Spearman线性相关，-1≤r≤+1表示两个变量呈直线相关关系，r为正数表示正相关，r为负数表示负相关。P＜0.05有统计学意义。
试验结果：
1.1 组织形态学观察：实验组和对照组股骨头肉眼观察大体形态无明显差异。
1.2 HE染色切片观察
实验组：在实验组的病理切片上可以很清楚地看见非常具有特征性的骨坏死，光镜下可以看见骨小梁失去原有的形态，稀疏、变细，有些甚至出现断裂，结构紊乱，有碎片出现；造血细胞数量减少；成骨细胞排列不规则；空缺骨陷窝明显增加；骨髓内脂肪细胞体积增大，有的融合成泡状。
对照组：在对照组的病理切片上可以观察到形态完整的骨小梁，这些骨小梁排列非常整齐，致密而且饱满，骨小梁中的骨细胞清晰可见，核大并且位于中央；骨髓内造血细胞丰富，形态正常。
两个组的空缺骨陷窝率实验组空缺骨陷窝率均明显高于对照组，经统计分析，t＝28.18，P＝0.00，差异有统计学意义(P＜0.05)。(见表1)
表1 两组平均空缺骨陷窝率(％)
1.3 超薄切片透射电镜观察
实验组：股骨头切片表现为胞膜完整，细胞核固缩，染色质边集，细胞器消失，凋亡小体出现；对照组：骨细胞，骨髓细胞超微结构均正常。
1.4 TUNEL骨细胞凋亡的观察
TUNEL染色阳性在切片中的表现为：细胞核着色呈棕黄褐色，极为少数的细胞浆内可以出现阳性颗粒。凋亡细胞指数的计算方法为：在每张切片下随机挑选5个高倍镜视野，每个高倍镜视野下计数50个骨细胞， 实验组的切片上可见骨细胞的细胞核中有棕黄褐色的阳性颗粒，并且在骨髓组织中可见有大量的骨细胞凋亡。实验组的骨细胞凋亡指数明显高于对照组，经统计分析，Z＝2.26，P＝0.00，差异有统计学意义(P ＜0.05)。(见表2)
表2 两组平均骨细胞凋亡指数
1.5 Dickkopf-1表达率
实验组Dickkopf-1表达率高于对照组，经统计分析，t＝24.77，P＝0.00，差异具有统计学意义(P＜0.05)。(见表3)
表3 两组平均Dickkopf-1表达率(％)
1.6 实验组中Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数的线性相关分析
实验组中Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数经统计分析，r＝0.623， P＜0.05，具有统计学意义，二者呈正相关。
本发明通过TUNEL法观察，实验组切片在镜下出现了大量的阳性细胞，而对照组却未见阳性细胞，证实在SANFH病例中确实存在细胞凋亡。
本发明中实验组的平均骨细胞凋亡指数为35.57±2.68，而对照组的平均骨细胞凋亡指数为2.13±0.83，实验组的骨细胞凋亡指数明显高于对照组，经统计分析，Z＝2.26，P＝0.00，差异有统计学意义(P＜0.05)，从而可以近一步证实在SANFH中确实存在着细胞凋亡。
本发明通过免疫组织化学染色法检测Dickkopf-1，实验组中平均 Dickkopf-1表达率为44.36±4.94，而对照组中平均Dickkopf-1表达率为 9.87±1.25，经统计分析，t＝24.77，P＝0.00，差异具有统计学意义(P＜0.05)，进一步的说明了激素可以显著增加Dickkopf-1的表达。实验组中 Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡指数经统计分析，r＝0.623，P＜0.05，具有统计学意义，二者呈正相关，这就更加印证了Dickkopf-1可以调控凋亡控制基因这一观点。
本发明证明Dickkopf-1可能是影响SANFH发病过程的因素，临床可通过检测病人血清中Dickkopf-1浓度的改变，可能为该病早期诊断、治疗提供一定帮助。也可为今后SANFH的临床预防及治疗提供理论依据。
本发明通过对SANFH标本进行组织形态学及超微结构等观察；并运用免疫组化的方法进行综合分析。得出了以下结论：
(1)Dickkopf-1与细胞凋亡参与了SANFH的过程，Dickkopf-1水平升高可能是SANFH发病的重要促进因素。
(2)骨细胞凋亡在股骨头缺血坏死过程中起重要作用。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种测定Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的方法，其特征在于，所述的Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法通过收集经全髋置换术取下的SANFH的股骨头标本作为实验组，股骨颈骨折髋关节置换术后标本作为对照组，切取股骨头标本经固定、脱钙，制作切片，电镜观察骨细胞形态变化，光镜观察其病理变化，并用HE染色计数空缺骨陷窝，免疫组织化学染色法检测Dickkopf-1的表达，用TUNEL凋亡检测试剂盒检测骨细胞凋亡，探索Dickkopf-1与细胞凋亡在SANFH中的作用；
测定Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的方法的具体步骤如下：
步骤一、收集全髋置换手术后取下的股骨头，-80℃冰箱保存，SANFH例作为实验组，新鲜股骨颈骨折标本作为对照组，对照组患者排除心血管及免疫系统疾患，无烟酒嗜好及服用激素史；
步骤二、标本制作：
将取下的股骨头自冠状面对半剖开，切取股骨头软骨骨块，用4％多聚甲醛固定12小时后，13％乙二胺四乙酸脱钙，脱钙完全后，常规石蜡包埋；
步骤三、光镜下组织形态学观察；
取石蜡包埋组织块，制成厚5μm切片，HE染色，将染色后的切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化；
步骤四、透射电子显微镜观察：
在股骨头坏死区切取骨块，2.5％戊二醛液前固定，10％EDTA脱钙，1％饿酸后固定，环氧树脂包埋，采用瑞典LKB2800型切片机制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝染色，电镜观察；
步骤五、TUNEL法检测骨细胞凋亡情况；
步骤六、免疫组织化学法检测Dickkopf-1；
步骤七、统计学处理；
HE染色的具体方法为：
第一步、60℃烤箱脱蜡30分钟；
第二步、二甲苯I脱蜡10分钟；
第三步、二甲苯II脱蜡5分钟；
第四步、无水乙醇洗去二甲苯2次，每次1分钟；
第五步、95％乙醇2次，每次1分钟；
第六步、90％乙醇1分钟；
第七步、85％乙醇1分钟；
第八步、自来水洗去乙醇5分钟；
第九步、苏木素着色4分钟；
第十步、自来水冲1分钟；
第十一步、1％盐酸酒精分化20秒；
第十二步、自来水洗1分钟；
第十三步、1％稀氨水返蓝30秒，蒸馏水洗1分钟；
第十四步、伊红染色20秒，0、85％酒精脱水20秒；
第十五步、90％酒精脱水30秒；
第十六部、95％酒精脱水1分钟；
第十七步、95％酒精脱水1分钟；
第十八步、无水乙醇I脱水2分钟；
第十九步、无水乙醇II脱水2分钟；
第二十步、二甲苯I2分钟；
第二十一步、二甲苯II2分钟；
第二十二步、二甲苯III2分钟；
第二十三步、中性树胶封片；
TUNEL法检测骨细胞凋亡情况的具体方法为：
第一步、标本的处理：玻片预先用APES进行处理；细胞涂片和冰冻切片：必须马上固定，用4％的多聚甲醛PH为7.0-7.6，在室温固定35分钟，0.01MPBS液洗2次，每次2分钟，蒸馏水洗涤2次每次2分钟；组织：立刻固定，10％中性缓冲甲醛液固定5小时，石蜡包埋，切片脱蜡干净后入水；
第二步、制备新鲜的3％的H2O2，在室温下处理10分钟，蒸馏水洗涤3次，每次2分钟；
第三步、标本片加0.01MTBS1∶200的新鲜稀释ProteinaseK37℃消化15分钟，0.01M的TBS液洗3次，每次2分钟；
第四步、每张标本片加标记缓冲液20μl，以防止切片干燥，将TdT和DIG-d-UTP各1μl与18μl标记缓冲液混和滴于 切片上，甩掉其上多余的液体再滴标记液，每片20μl，将样品放在37℃湿盒里2小时；
第五步、0.01M的TBS液洗涤3次，每次2分钟；
第六步、每片滴封闭液50μl，室温下30分钟后，甩去封闭液；
第七步、将1∶100的抗体稀释液稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀，每片标本滴50μl，放在37℃湿盒里反应30分钟，用0.01MTBS洗涤3次，每次2分钟；
第八步、用抗体稀释液1∶100稀释SABC：将SABC10μl加入1ml的抗体稀释液，混匀，每片滴50μl，37℃反应30分钟，0.01MTBS洗涤4次每次5分钟；
第九步、DAB显色：在DAB试剂盒的A、B、C试剂中各加入一滴蒸馏水，混匀，滴到标本片上，显色20分钟，显微镜下观察着色情况后水洗；
第十步、苏木素轻度复染；0.01MTBS洗，蒸馏水洗；脱水，透明，封片；光学显微镜下观察且记录实验数据；TUNEL染色，当细胞核中出现棕黄色颗粒的为阳性细胞，即为凋亡的细胞；在光镜下，随机在每张玻片上找5个高倍视野，每个高倍视野下计数50个骨细胞，计算凋亡细胞指数等于每个视野内凋亡细胞数除以每个视野内细胞总数。
2.如权利要求1所述的方法其特征在于，免疫组织化学法检测Dickkopf-1的具体步骤如下：
第一步、各蜡块连续4μm切片，置于涂有APES防脱片剂的载玻片上，置60℃烤箱中烘烤50分钟；
第二步、切片常规二甲苯脱蜡两次，每次20分钟；梯度乙醇脱水：无水乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，蒸馏水水化一分钟；
第三步、切片置于3％H2O210分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次；
第匹步、热修复抗原：将切片浸入枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次，冷却后用PH7.2-7.6的PBS洗涤3次，每次5分钟；
第五步、滴加5％BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，不洗；
第六步、在每张切片上滴加相应的第一抗体50μl，即兔抗人Dickkopf-1多克隆抗体，20℃2小时；PH7.2-7.6的PBS洗3次每次5分钟；
第七步、滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20分钟，PBS洗3次，每次3分钟；
第八步、滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS冲洗4次，每次5分钟；
第九步、制备DAB显色剂，室温显色约8分钟，在显微镜下掌握显色程度，蒸馏水洗涤5次；
第十部、苏木素复染，自来水冲洗反蓝；
第十一步、梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片；
第十二步、显微镜下观察结果。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，统计学处理的具体方法为：
数据均以表示，用SPSS13.0软件进行统计分析，空缺骨陷窝率、Dickkopf-1表达率符合正态性资料因此统计检验采用t检验，骨细胞凋亡指数不符合正态性资料因此统计检验采用秩和检验，实验组的Dickkopf-1表达率与骨细胞凋亡率采用Spearman线性相关，-1≤r≤+1表示两个变量呈直线相关关系，r为正数表示正相关，r为负数表示负相关，P＜0.05有统计学意义。
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