CN103675251A - 一种Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，通过检测家兔SANFH模型的股骨头组织中骨细胞的凋亡指数及MAP1-LC3的表达，表明自噬基因Beclin1即可调节自噬活性，又可以选择性的与Bcl-2家族成员相结合而调节细胞凋亡的活性。本发明通过检测Beclin1在SANFH模型中的表达，为治疗SANFH提供新的分子靶标。本发明方法简单，操作方便，较好的解决了国内外并未见到关于SANFH模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的问题，填补了ANFH模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的空白。
Description
技术领域
本发明属于股骨头缺血坏死研究技术领域，尤其涉及一种Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法。
背景技术
激素性股骨头缺血坏死(Steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)是指因长期或短期大量使用肾上腺皮质激素(以下简称激素)后造成股骨头活性成分的死亡所引起的病理过程。SANFH占非创伤性股骨头缺血坏死病因的首位。由于临床中激素的广泛应用，使得SANFH发病率逐年增高。目前关于SANFH的发病机制已经有多种假说，包括：骨内压增高、骨的灌注下降、脂肪栓塞、高凝状态等，造成股骨头的血流量减少，从而导致股骨头缺血坏死。但是以上学说均未能够完全阐明SANFH的发病机制，因此尽快探明SANFH的发病机制显得更加重要。近年来国内外学者把焦点集中于I型程序性细胞死亡-细胞凋亡(apoptosis)在SANFH中的作用的研究。因为在SANFH中观察到大量的骨细胞凋亡，所以有学者推断在SANFH的最后阶段，股骨头的血管功能发生障碍，最终导致骨细胞发生凋亡，甚至有学者直接将细胞凋亡归因于SANFH的发病机制。Robert S等分别对5例激素性、3例酒精性及1例创伤性股骨头缺血坏死患者的股骨头进行研究，观察到SANFH患者股骨头切片中存在大量凋亡的骨细胞，酒精性股骨头缺血坏死中骨细胞凋亡相对较少，而创伤性股骨头缺血坏死中骨细胞凋亡是罕见的，这一研究支持细胞凋亡在激素性和酒精性股骨头缺血坏死发病机制中起重要作用的观点。
自噬现象最早是Ashford和Porten于1962年在肝细胞中观察到的，他们将高血糖素加入鼠的肝灌流液中，结果在电镜下发现肝细胞的溶酶体增多并发生自食(self-eating)现象，De Duve将该现象命名为“autophagy(自噬)”。长期以来，自噬只被认为是细胞降解胞内物质的一种正常生理过程，因此，并未引起广泛关注。直到近10多年来，在酵母中首先发现了自噬的分子机制，随后在哺乳动物细胞中也发现了相似的机制，使得自噬的研究取得了重大进展，并成为近几年分子生物学领域中的研究热点。自噬是机体选择性降解细胞内成分的基本过程，当细胞遭受应激时，自噬可维持细胞的存活，但是当这种应激超过一定水平时，自噬还可导致非凋亡形式的自噬性程序性细胞死亡，因其有别于凋亡而被称为II型程序性细胞死亡。自噬作为一个强大的代谢平衡推动者，可以预防退化性疾病的发生。然而自噬也有不利的一面，在营养缺乏的肿瘤中，瘤细胞正是利用自噬才得以存活的。Levine等研究表明自噬通路和自噬蛋白在免疫和炎症中也起到决定性作用，它们可能通过平衡免疫和炎症对机体的利与弊，预防和对抗传染性、自身免疫性和感染性疾病。已有研究表明激素既可以诱导骨细胞发生凋亡又可以诱导骨细胞发生自噬，但只是局限于激素导致的骨质疏松模型中以及经激素刺激体外培养的骨细胞中。国内外并未见到关于SANFH模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的报道。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3，MAP1-LC3)作为自噬的标志性分子，已经被广泛应用于自噬活性的检测，
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，旨在解决国内外并未见到关于SANFH模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，该Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法包括以下步骤：
步骤一，选择成年日本大耳白兔40只，体重(2.32±0.14)kg，随机分为实验组与对照组，雌雄不限，实验组肌肉注射甲基强的松龙7.5mg/kg，2次/周，共8周；对照组肌肉注射生理盐水2ml／只，2次／周，共8周，8周后用空气栓塞法处死两组家兔，取双侧股骨头，沿冠状面剖开，左侧股骨头置于4％多聚甲醛溶液固定24h，右侧股骨头立即置于液氮中保存；
步骤二，将左侧股骨头组织放入小烧杯内，加入10％EDTA脱钙液，在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，以微波温度为40℃～60℃间歇脱钙，每次辐射1分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却15分钟，并更换新液，脱钙时间为1分钟×20次／24小时×7次，以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准；
步骤三，左侧股骨头经4％多聚甲醛溶液固定24h后，在10％EDTA脱钙液中微波脱钙7日，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚5μm切片，取左侧一半股骨头做常规HE染色，待中性树胶封片后，将切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化，即在100倍光镜下，随机挑选出5个高倍镜视野，每个视野内计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数；
步骤四，采用TUNEL方法检测细胞凋亡的原理是基于脱氧核苷酸末端转移酶可与凋亡细胞产生的DNA碎片中的3’-OH(3-羟基)末端特异性相结合，从而产生多聚脱氧核苷酸聚合物，将脱氧核糖核苷酸和过氧化物酶形成的衍生物标记到DNA的3’-OH末端，检测凋亡细胞，采用TUNEL试剂盒对组织切片进行TUNEL法染色，待染色完成，中性树胶封片后，在显微镜下观察并记录结果，TUNEL染色阳性细胞着色定位于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内可出现阳性颗粒，每张切片随机选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨细胞，计算骨细胞凋亡细胞指数(凋亡细胞数／50)；
步骤五，免疫组化方法检测股骨头Beclin1及MAP1-LC3的表达，采用SABC法，然后用苏木素复染1min，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察；
步骤六，Western blot检测股骨头骨组织中Beclin1和MAP1-LC3蛋白的表达水平；
步骤七，统计学方法，应用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验数据以
表示，计数资料采用χ2检验，组间比较独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
进一步，在步骤五中，SABC法的具体步骤为：
先将组织切片在烤箱中60℃放置60min，30％H2O21份+蒸馏水10份混合，室温5-10min用以灭活内源性酶，然后蒸馏水洗3遍，将组织切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液中(pH6.0)，微波炉加热至沸腾后停止，间隔5min～10min后，反复1次～2次，冷却后用PBS(pH7.2-7.6)洗涤1次～2次，滴加5％BSA封闭液，室温中放置20min，甩去多余液体，不洗，滴加稀释度为1∶500的兔抗兔Beclin1多克隆抗体和稀释度为1∶500兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗体，20℃放置2h，PBS(pH7.2-7.6)洗涤2min×3次，滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，37℃放置20min，PBS(pH7.2-7.6)洗涤5min×4次；使用DAB显色试剂盒，取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后滴加到组织切片上，室温下显色，镜下反应时间为10min，蒸馏水充分洗涤以终止反应，然后用苏木素复染1min，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察。
进一步，股骨头组织免疫组化结果的分析：所有组织切片均采用盲法由两位病理科医生独立阅片，以胞浆内或细胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性细胞，随机观察10个高倍镜视野，每个视野计数50个细胞，根据阳性细胞的比率和染色深度分别进行评估，最后综合评定.
进一步，在步骤六中，Western blot检测股骨头骨组织中Beclin1和MAP1-LC3蛋白的表达水平的具体步骤为：
取出保存于液氮中的右侧股骨头，电子天平迅速称重后，置于预冷的研磨器中，在液氮中研磨股骨头，组织研碎后，用预冷的刮勺收集到离心管中，按照1∶10(g／ml)的比例加入含有蛋白酶抑制剂的组织蛋白提取试剂，冰上裂解30min，然后4℃，10000g离心15min，收集到的上清即为总蛋白，然后用BCA法测定蛋白浓度；
安装好电泳装置及玻璃板，用1％琼脂封边；沿玻璃边缘加入占总体积3／5的15％分离胶，缓慢加入适量蒸馏水，室温下凝结约1.5h，倾去水相，用滤纸吸干残余水分，加入4％浓缩胶至玻璃上缘，插入梳子，用保鲜膜封闭后，置4℃冰箱中过夜，待浓缩胶凝聚后拔出梳子，将提取的准备电泳的蛋白溶液中加入上样缓冲液，加热煮沸5min，使蛋白变性，于电泳槽内加满电泳缓冲液，加样后进行电泳，
将PVDF膜修剪成和需要印记的凝胶块相匹配的大小，将准备要印迹的凝胶和PVDF膜分别浸没在盛满转膜缓冲液的盒中10min；然后将若干层滤纸剪成较凝胶块和PVDF膜略大的小块，按照以下顺序：阴极夹板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极夹板制成三明治状，整个过程中用玻璃棒尽量将每一层中的气泡排尽，在转膜装置中倒入转膜缓冲液，将印迹夹放入，凝胶端朝向负极，PVDF膜端朝向正极；在冰浴中，以200mA的电流转膜2h，关闭电源，取出PVDF膜，将PVDF膜置于封闭袋中，加入封闭缓冲液1％脱脂奶粉，TBST，封闭1h，在2个封闭袋中分别加入兔抗兔Beclin1多克隆抗体和兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗体，室温下振摇孵育1h，将PVDF膜放入杂交袋中，将封闭袋中液体加入其中，4℃过夜，从杂交袋中取出PVDF膜，在装有TBST的平皿中漂洗5min×3次，加入含有山羊抗兔二抗(1∶500)的TBST，室温下振荡孵育2h，在装有TBST的平皿中漂洗15min×3次，加入含有ABC复合物(1∶1000)的TBST，37℃孵育1h，在装有TBST的平皿中漂洗(15min×3次)；
进入暗室中，将ECL试剂盒中的A试剂和B试剂等体积混合；反应1min后，将PVDF膜和显色液充分的接触；接触1min以后，将PVDF膜取出，放进X-光片夹中；在暗室中，将X光片置于PVDF膜上，关上X-光片夹，曝光时间为30min；曝光结束后，打开X-光片夹，取出X光片，放进显影液之中，待X光片出现明显的条带后，立即终止显影；显影结束后，把X光片放进定影液中定影，直到胶片透明时即结束定影；然后用自来水冲洗后，在室温下晾干，X光片扫描后，用ImageJ2x软件分析各条条带的灰度值，然后将目的蛋白灰度值与内参的灰度值进行比较，根据条带的相对灰度值进行统计学分析，实验结果重复3次以上。
进一步，电泳条件：浓缩胶以电压50V，电流50mA，电泳2h；分离胶以电压100V，电流100mA，电泳2h，当溴酚蓝达到分离胶下缘水平时，停止电泳，取出凝胶做好标记。
进一步，该Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法表明自噬基因Beclin1即可调节自噬活性，又可以选择性的与Bcl-2家族成员相结合而调节细胞凋亡的活性，
本发明提供的Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，通过检测家兔SANFH模型的股骨头组织中骨细胞的凋亡指数及MAP1-LC3的表达，表明自噬基因Beclin1即可调节自噬活性，又可以选择性的与Bcl-2家族成员相结合而调节细胞凋亡的活性。本发明通过检测Beclin1在SANFH模型中的表达，为治疗SANFH提供新的分子靶标。本发明方法简单，操作方便，较好的解决了国内外并未见到关于SANFH模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的问题，填补了ANFH模型中研究细胞凋亡与自噬的表达及其相互关系的空白。
附图说明
图1是本发明实施例提供的Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的股骨头病理观察结果(苏木精-伊红染色)示意图；
图3是本发明实施例提供的股骨头组织中TUNEL阳性细胞表达情况示意图；
图4是本发明实施例提供的股骨头组织中Beclin1表达情况(免疫组化染色)示意图；
图5是本发明实施例提供的股骨头组织中LC3表达情况(免疫组化染色)示意图；
图6是本发明实施例提供的Western blot结果(1.实验组；2.对照组)示意图；
图7是本发明实施例提供的Western blot检测Beclin1和MAP1-LC3蛋白的相对表达水平示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例的Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法包括以下步骤：
S101：成年日本大耳白兔40只，体重(2.32+0.14)kg，随机分为实验组与对照组，实验组肌肉注射甲基强的松龙7.5mg／kg，2次／周，共8周；对照组肌肉注射生理盐水2ml／只，2次／周，共8周；
S102：8周后用空气栓塞法处死两组家兔，取双侧股骨头，沿冠状面剖开，左侧股骨头置于4％多聚甲醛溶液固定24h，右侧股骨头立即置于液氮中保存；
S103：将左侧股骨头组织放入小烧杯内，加入10％EDTA脱钙液，在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，以微波2档(温度为40℃～60℃)间歇脱钙，每次辐射1分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却15分钟，并更换新液，脱钙时间为1分钟×20次／24小时×7次；
S104：左侧股骨头经4％多聚甲醛溶液固定24h后，在10％EDTA脱钙液中微波脱钙7日，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚5μm切片，取左侧一半股骨头做常规HE染色，待中性树胶封片后。
S105：将切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数；
S106：使用TUNEL试剂盒对组织切片进行TUNEL法染色，待染色完成，中性树胶封片后，在显微镜下观察并记录实验结果，每张切片随机选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨细胞，计算骨细胞凋亡细胞指数(凋亡细胞数／50)；
S107：免疫组化方法检测股骨头Beclin1及MAP1-LC3的表达，随机观察10个高倍镜视野，每个视野计数50个细胞。根据阳性细胞的比率和染色深度分别进行评估，最后综合评定；
S108：Western blot检测股骨头骨组织中Beclin1和MAP1-LC3蛋白的表达水平；
S109：应用SPSS13.0软件进行统计学分析，组间比较独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
通过以下实验的具体实施例对本发明做进一步的说明：
1、材料与方法
1.1实验动物及分组成年日本大耳白兔(北京富豪动物养殖中心提供，合格证编号：20100137)40只，体重(2.32±0.14)kg，随机分为实验组(n＝28)与对照组(n＝12)，雌雄不限，实验组肌肉注射甲基强的松龙7.5mg／kg，2次／周，共8周；对照组肌肉注射生理盐水2ml／只，2次／周，共8周，8周后用空气栓塞法处死两组家兔，取双侧股骨头，沿冠状面剖开，左侧股骨头置于4％多聚甲醛溶液固定24h，右侧股骨头立即置于液氮中保存；
1.2王要试剂：
甲基强的松龙 法玛西亚普强公司
SABC免疫组化试剂盒 武汉博士德生物工程
有限公司
TUNEL凋亡检测试剂盒 武汉博士德生物工程
有限公司
兔抗Beclin1多克隆抗体 北京博奥森公司
兔抗MAP1-LC3多克隆抗体 北京博奥森公司
辣根过氧化酶标记的山羊抗兔 武汉博士德生物工程
IgG 有限公司
DAB显色试剂盒 武汉博士德生物工程
有限公司
PBS(pH7.4) GIBICO
柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) GIBICO
Tris Sigma(德国)
甘氨酸 Sigma(德国)
DTT Sigma(德国)
TEMED Serva
丙烯酰氨(Acrylamide) Fluka
双叉丙烯酰氨N’N- Fluka
Methylenebisarylamide
无水乙醇 湖南师范大学化学试
剂厂
甲醇 湖南化学试剂总厂
β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol) Fisher Biotech
冰醋酸 湖南化学试剂总厂
PVDF膜 Milipore
预染蛋白分子量标准 Beyotime
羊抗兔辣根过氧化物酶标记二 北京博奥森公司
抗
ECL化学发光试剂盒 Beyotime
组织蛋白抽提试剂 北京康为世纪公司
BCA法蛋白定量试剂盒 北京百泰克生物技术
有限公司
1.3实验仪器
涡旋混合器 上海琪特
电子天平 Sartorins(德国)
酸度计PB-10 Sartorins(德国)
-20℃冰箱 海尔
超低温冰箱(-80℃) SANYO
SIM-F124制冰机 SANYO
电热恒温培养箱DNP9272 北京市六一仪器厂
DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂
水平电泳槽 北京市六一仪器厂
垂直电泳槽、电转槽 北京市六一仪器厂
TS-1脱色摇床 北医仪器厂
DR-mix旋转脱色摇床 北京市六一仪器厂
X-光胶片 Kodak
磁力加热搅拌器 上海浦东物理光学仪
器厂
小容量高速冷冻离心机 Thermo(美国)
台式高速冷冻离心机1-15K Sigma(德国)
高速离心机4K-15C Sigma(德国)
数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂
GBOX HR凝胶成像分析系统 Gene Company
Linited(英国)
Quantity One-4.0.3图像分析软件 Bio-Rad
1.4实验方法
1.4.1微波脱钙将左侧股骨头组织放入小烧杯内，加入10％EDTA脱钙液，为防止酸性物质对微波炉的腐蚀，在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，以微波2档(温度为40-60℃)间歇脱钙，每次辐射1分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却15分钟，并更换新液，这样既可保证脱钙液的温度不会太高，又可弃去脱掉的钙盐，使得脱钙更为充分，增加脱钙强度，脱钙时间为1分钟×20次／24小时×7次，以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准；
1.4.2组织形态学观察左侧股骨头经4％多聚甲醛溶液固定24h后，在10％EDTA脱钙液中微波脱钙7日，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚5μm切片，取左侧一半股骨头做常规HE染色，待中性树胶封片后，将上述切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化，即在100倍光镜下，随机挑选出5个高倍镜视野，每个视野内计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数，SANFH组织学判定标准：股骨头软骨下区空缺骨陷窝率作为SANFH的组织学判定指标[10-12]已被广泛采用，正常成年家兔股骨头的软骨下区空缺骨陷窝率约为8-12％，在相同的制片条件下股骨头软骨下区的空缺骨陷窝率超过这一数值即提示骨坏死，左侧另一半股骨头用作免疫组化实验；
1.4.3免疫组织化学方法
1.4.3.1TUNEL法检测骨细胞凋亡多种技术可以用于检测细胞的凋亡，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal dexynucleotidyltransferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)可以在不损坏组织结构的情况下直接观察和定量细胞的凋亡成分，本发明中使用TUNEL方法检测细胞凋亡的原理是基于脱氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyltransferase，TdT)可与凋亡细胞产生的DNA碎片中的3’-OH(3-羟基)末端特异性相结合，从而产生多聚脱氧核苷酸聚合物，因此将脱氧核糖核苷酸和过氧化物酶形成的衍生物标记到DNA的3’-OH末端，就可以检测凋亡细胞，因为正常增殖的细胞很少有DNA的断裂，因而很少有3’-OH形成，所以正常细胞几乎不能被TUNEL法所染色，实验按照TUNEL试剂盒的说明书步骤对组织切片进行TUNEL法染色，待染色完成，中性树胶封片后，在显微镜下观察并记录实验结果，TUNEL染色阳性细胞着色定位于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内可出现阳性颗粒，每张切片随机选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨细胞，计算骨细胞凋亡细胞指数(凋亡细胞数/50)；
1.4.3.2免疫组化方法检测股骨头Beclin1及MAP1-LC3的表达采用SABC法，先将组织切片在烤箱中60℃放置60min，30％H2O21份+蒸馏水10份混合，室温5-10min用以灭活内源性酶，然后蒸馏水洗3遍，将组织切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液中(pH6.0)，微波炉加热至沸腾后停止，间隔5-10min后，反复1-2次，冷却后用PBS(pH7.2-7.6)洗涤1-2次，滴加5％BSA封闭液，室温中放置20min，甩去多余液体，不洗，滴加稀释度为1∶500的兔抗兔Beclin1多克隆抗体和稀释度为1∶500兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗体，20℃放置2h，PBS(pH7.2-7.6)洗涤2min×3次，滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，37℃放置20min，PBS(pH7.2-7.6)洗涤5min×4次；使用DAB显色试剂盒(AR1022)，取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后滴加到组织切片上，室温下显色，镜下控制反应时间，约10min，蒸馏水充分洗涤以终止反应，然后用苏木素复染1min，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察；
股骨头组织免疫组化结果的分析：所有组织切片均采用盲法由两位病理科医生独立阅片，以胞浆内或细胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性细胞，随机观察10个高倍镜视野，每个视野计数50个细胞，根据阳性细胞的比率和染色深度分别进行评估，最后综合评定；
1.5Western blot检测股骨头骨组织中Beclin1和MAP1-LC3蛋白的表达水平：
取出保存于液氮中的右侧股骨头，电子天平迅速称重后，立即置于预冷的研磨器中，在液氮中研磨股骨头，组织研碎后，用预冷的刮勺收集到离心管中，按照1∶10(g／ml)的比例加入含有蛋白酶抑制剂的组织蛋白提取试剂，冰上裂解30min，然后4℃，10000g离心15min，收集到的上清即为总蛋白，然后用BCA法测定蛋白浓度；
安装好电泳装置及玻璃板，用1％琼脂封边；沿玻璃边缘加入占总体积3／5的15％分离胶，缓慢加入适量蒸馏水，室温下凝结约1.5h，倾去水相，用滤纸吸干残余水分，加入4％浓缩胶至玻璃上缘，插入梳子，用保鲜膜封闭后，置4℃冰箱中过夜，待浓缩胶凝聚后拔出梳子，将上述提取的准备电泳的蛋白溶液中加入适当比例的上样缓冲液，加热煮沸5min，使蛋白变性，于电泳槽内加满电泳缓冲液，加样后进行电泳，电泳条件：浓缩胶以电压50V，电流50mA，电泳2h；分离胶以电压100V，电流100mA，电泳2h，当溴酚蓝达到分离胶下缘水平时，停止电泳，取出凝胶做好标记；
将PVDF膜修剪成和需要印记的凝胶块相匹配的大小，将准备要印迹的凝胶和PVDF膜分别浸没在盛满转膜缓冲液的盒中10min；然后将若干层滤纸剪成较凝胶块和PVDF膜略大的小块，按照以下顺序：阴极夹板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极夹板制成“三明治”状，整个过程中用玻璃棒尽量将每一层中的气泡排尽，在转膜装置中倒入转膜缓冲液，将印迹夹放入其中，凝胶端朝向负极，PVDF膜端朝向正极；在冰浴中，以200mA的电流转膜2h，关闭电源，取出PVDF膜，将PVDF膜置于封闭袋中，加入封闭缓冲液(1％脱脂奶粉，TBST)，封闭1h，在2个封闭袋中分别加入兔抗兔Beclin1多克隆抗体和兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗体，室温下振摇孵育1h，将PVDF膜放入杂交袋中，将封闭袋中液体加入其中，4℃过夜，从杂交袋中取出PVDF膜，在装有TBST的平皿中漂洗(15min×3次)，加入含有山羊抗兔二抗(1∶500)的TBST，室温下振荡孵育2h，在装有TBST的平皿中漂洗(15min×3次)，加入含有ABC复合物(1∶1000)的TBST，37℃孵育1h，在装有TBST的平皿中漂洗(15min×3次)；
进入暗室中，将ECL试剂盒中的A试剂和B试剂等体积混合；反应1min后，将PVDF膜和显色液充分的接触；接触1min以后，将PVDF膜取出，放进X-光片夹中；在暗室中，将X光片置于PVDF膜上，关上X-光片夹，曝光时间为30min；曝光结束后，打开X-光片夹，取出X光片，立即放进显影液之中，待X光片出现明显的条带后，立即终止显影；显影结束后，立即把X光片放进定影液中定影，直到胶片透明时即结束定影；然后用自来水冲洗后，在室温下晾干，X光片扫描后，用ImageJ2x软件分析各条条带的灰度值，然后将目的蛋白灰度值与内参的灰度值进行比较，根据条带的相对灰度值进行统计学分析，实验结果重复3次以上；
1.6统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验数据以
表示，计数资料采用χ2检验，组间比较独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
通过以下实验结果对本发明做进一步的说明：
2实验结果
2.1组织学观察对照组(1a、1c)：骨小梁结构清晰完整，粗大且排列规则，髓腔中脂肪细胞较少，造血细胞丰富，空骨陷窝少见；实验组(1b、1d)：骨小梁稀疏变细、甚至断裂，髓腔中脂肪细胞增多、肥大，造血细胞数量减少，空骨陷窝数量明显多于对照组，两个组的空缺骨陷窝率比较显示：实验组空缺骨陷窝率为(29.57±1.45)％，明显高于对照组空骨陷窝率(11.63±1.42)％，经统计分析差异有统计学意义(P＜0.05)(见表1)，因此，家兔股骨头组织病理学改变显示，SANFH模型制造成功；
表1实验组与对照组平均空骨陷窝率(％)
注：t＝28.18，P＜0.05
2.2免疫组化结果TUNEL染色阳性细胞着色定位于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内出现阳性颗粒，TUNEL染色阳性细胞在实验组中较对照组高，如图3所示，实验组骨细胞凋亡指数为(26.83±2.48)％，对照组中骨细胞凋亡指数为(3.50±1.24)％，实验组骨细胞凋亡指数明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)见表2，细胞浆或者细胞膜内出现黄色或棕黄色颗粒即为Beclin1和MAP1-LC3阳性细胞，见图4、5，Beclin1在实验组中表达的阳性率为96.43％，而在对照组中表达的阳性率为16.67％；MAP1-LC3在实验组中表达的阳性率为92.86％，而在对照组织中表达的阳性率为8.33％，见表3，Beclin1和MAP1-LC3在实验组中的表达均较对照组高，差异有统计学意义(P＜0.05)；
表2实验组与对照组的骨细胞平均凋亡指数
注：t＝26.36，P＜0.05
表3Beclin1和MAP1-LC3实验组与对照组中的表达
注：P＜0.05
2.3Western blot检测采用Western blot法检测股骨头骨组织中Beclin1和MAP1-LC3蛋白的表达水平，根据目的蛋白分子量大小，在相应位置上出现目的条带，如图6所示。结果显示：以β-actin做内参，Beclin1和MAP1-LC3蛋白在实验组的相对灰度值分别为(1.6047±0.0070)、(2.5820±0.0057)，高于对照组中的相对灰度值(0.7921±0.0062)、(0.9894±0.0036)，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图7、表4。表明Beclin1和MAP1-LC3蛋白在实验组中的表达较对照组增高。
表4Western blot检测Beclin1和MAP1-LC3蛋白在实验组和对照组中的表达
注：P＜0.05
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，该Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法包括以下步骤：
步骤一，选择成年日本大耳白兔40只，体重(2.32±0.14)kg，随机分为实验组与对照组，雌雄不限，实验组肌肉注射甲基强的松龙7.5mg／kg，2次／周，共8周；对照组肌肉注射生理盐水2ml／只，2次／周，共8周，8周后用空气栓塞法处死两组家兔，取双侧股骨头，沿冠状面剖开，左侧股骨头置于4％多聚甲醛溶液固定24h，右侧股骨头立即置于液氮中保存；
步骤二，将左侧股骨头组织放入小烧杯内，加入10％EDTA脱钙液，在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，以微波温度为40℃～60℃间歇脱钙，每次辐射1分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却15分钟，并更换新液，脱钙时间为1分钟×20次／24小时×7次，以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准；
步骤三，左侧股骨头经4％多聚甲醛溶液固定24h后，在10％EDTA脱钙液中微波脱钙7日，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚5μm切片，取左侧一半股骨头做常规HE染色，待中性树胶封片后，将切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化，即在100倍光镜下，随机挑选出5个高倍镜视野，每个视野内计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，计算出空缺骨陷窝所占的百分数；
步骤四，采用TUNEL方法检测细胞凋亡的原理是基于脱氧核苷酸末端转移酶可与凋亡细胞产生的DNA碎片中的3’-OH(3-羟基)末端特异性相结合，从而产生多聚脱氧核苷酸聚合物，将脱氧核糖核苷酸和过氧化物酶形成的衍生物标记到DNA的3’-OH末端，检测凋亡细胞，采用TUNEL试剂盒对组织切片进行TUNEL法染色，待染色完成，中性树胶封片后，在显微镜下观察并记录结果，TUNEL染色阳性细胞着色定位于胞核内，呈棕褐色或棕黄色，少数胞浆内可出现阳性颗粒，每张切片随机选5个高倍镜视野，每个视野计数50个骨细胞，计算骨细胞凋亡细胞指数(凋亡细胞数／50)；
步骤五，免疫组化方法检测股骨头Beclin1及MAP1-LC3的表达，采用SABC法，然后用苏木素复染1min，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察；
步骤六，Western blot检测股骨头骨组织中Beclin1和MAP1-LC3蛋白的表达水平；
步骤七，统计学方法，应用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验数据以表示，计数资料采用χ2检验，组间比较独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.如权利要求1所述的Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，在步骤五中，SABC法的具体步骤为：
先将组织切片在烤箱中60℃放置60min，30％H2O21份+蒸馏水10份混合，室温5-10min用以灭活内源性酶，然后蒸馏水洗3遍，将组织切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液中(pH6.0)，微波炉加热至沸腾后停止，间隔5min～10min后，反复1次～2次，冷却后用PBS(pH7.2-7.6)洗涤1次～2次，滴加5％BSA封闭液，室温中放置20min，甩去多余液体，不洗，滴加稀释度为1∶500的兔抗兔Beclin1多克隆抗体和稀释度为1∶500兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗体，20℃放置2h，PBS(pH7.2-7.6)洗涤2min×3次，滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，37℃放置20min，PBS(pH7.2-7.6)洗涤5min×4次；使用DAB显色试剂盒，取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后滴加到组织切片上，室温下显色，镜下反应时间为10min，蒸馏水充分洗涤以终止反应，然后用苏木素复染1min，在盐酸酒精中分化30s，在一系列梯度酒精中脱水、透明，中性树胶封片后在显微镜下观察。
3.如权利要求2所述的Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，股骨头组织免疫组化结果的分析：所有组织切片均采用盲法由两位病理科医生独立阅片，以胞浆内或细胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性细胞，随机观察10个高倍镜视野，每个视野计数50个细胞，根据阳性细胞的比率和染色深度分别进行评估，最后综合评定。
4.如权利要求1所述的Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，在步骤六中，Western blot检测股骨头骨组织中Beclin1和MAP1-LC3蛋白的表达水平的具体步骤为：
取出保存于液氮中的右侧股骨头，电子天平迅速称重后，置于预冷的研磨器中，在液氮中研磨股骨头，组织研碎后，用预冷的刮勺收集到离心管中，按照1∶10(g／ml)的比例加入含有蛋白酶抑制剂的组织蛋白提取试剂，冰上裂解30min，然后4℃，10000g离心15min，收集到的上清即为总蛋白，然后用BCA法测定蛋白浓度；
安装好电泳装置及玻璃板，用1％琼脂封边；沿玻璃边缘加入占总体积3／5的15％分离胶，缓慢加入适量蒸馏水，室温下凝结约1.5h，倾去水相，用滤纸吸干残余水分，加入4％浓缩胶至玻璃上缘，插入梳子，用保鲜膜封闭后，置4℃冰箱中过夜，待浓缩胶凝聚后拔出梳子，将提取的准备电泳的蛋白溶液中加入上样缓冲液，加热煮沸5min，使蛋白变性，于电泳槽内加满电泳缓冲液，加样后进行电泳；
将PVDF膜修剪成和需要印记的凝胶块相匹配的大小，将准备要印迹的凝胶和PVDF膜分别浸没在盛满转膜缓冲液的盒中10min；然后将若干层滤纸剪成较凝胶块和PVDF膜略大的小块，按照以下顺序：阴极夹板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极夹板制成三明治状，整个过程中用玻璃棒尽量将每一层中的气泡排尽，在转膜装置中倒入转膜缓冲液，将印迹夹放入，凝胶端朝向负极，PVDF膜端朝向正极；在冰浴中，以200mA的电流转膜2h，关闭电源，取出PVDF膜，将PVDF膜置于封闭袋中，加入封闭缓冲液1％脱脂奶粉，TBST，封闭1h，在2个封闭袋中分别加入兔抗兔Beclin1多克隆抗体和兔抗兔MAP1-LC3多克隆抗体，室温下振摇孵育1h，将PVDF膜放入杂交袋中，将封闭袋中液体加入其中，4℃过夜，从杂交袋中取出PVDF膜，在装有TBST的平皿中漂洗5min×3次，加入含有山羊抗兔二抗(1∶500)的TBST，室温下振荡孵育2h，在装有TBST的平皿中漂洗15min×3次，加入含有ABC复合物(1∶1000)的TBST，37℃孵育1h，在装有TBST的平皿中漂洗(15min×3次)；
进入暗室中，将ECL试剂盒中的A试剂和B试剂等体积混合；反应1min后，将PVDF膜和显色液充分的接触；接触1min以后，将PVDF膜取出，放进X-光片夹中；在暗室中，将X光片置于PVDF膜上，关上X-光片夹，曝光时间为30min；曝光结束后，打开X-光片夹，取出X光片，放进显影液之中，待X光片出现明显的条带后，立即终止显影；显影结束后，把X光片放进定影液中定影，直到胶片透明时即结束定影；然后用自来水冲洗后，在室温下晾干，X光片扫描后，用ImageJ2x软件分析各条条带的灰度值，然后将目的蛋白灰度值与内参的灰度值进行比较，根据条带的相对灰度值进行统计学分析，实验结果重复3次以上。
5.如权利要求4所述的Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，电泳条件：浓缩胶以电压50V，电流50mA，电泳2h；分离胶以电压100V，电流100mA，电泳2h，当溴酚蓝达到分离胶下缘水平时，停止电泳，取出凝胶做好标记。
6.如权利要求1所述的Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法，其特征在于，该Beclin1和MAP1-LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中表达的方法表明自噬基因Beclin1即可调节自噬活性，又可以选择性的与Bcl-2家族成员相结合而调节细胞凋亡的活性。
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