CN104873986A - 一种治疗肝脏纤维化的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗肝脏纤维化的siRNA及其应用。所述siRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明所述的siRNA可有效地减少肝星状细胞（LX2细胞）靶蛋白质的产生，抑制肝星状细胞的活化，从而阻断肝纤维化的发病进程，可用于制备治疗肝纤维化的药物。而且，本发明是通过对肝纤维化本身的治疗来达到治疗肝癌等疾病的目的，能够预防肝纤维化的反复，提高治病效率与安全性，因此，对于肝癌等疾病的治疗具有重要的应用前景。

Description

一种治疗肝脏纤维化的siRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种治疗肝脏纤维化的siRNA及其应用。

背景技术

肝纤维化（Liver Fibrosis）是多种慢性肝脏疾病（包括病毒性肝炎，酒精肝和非酒精性脂肪肝等）所致肝损伤的组织学变化，是一种在损害因子持续作用下渐进的病理过程。肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化的必经病理阶段。肝癌是目前世界上最常见的癌症之一，也是导致死亡的主要因素之一。而肝纤维化是肝癌形成的主要病因，超过 80%的肝癌由肝纤维化发展而来。

目前对于肝纤维化的治疗主要包括：（1）针对原发病去除致病因素，如抗乙型肝炎、丙型肝炎病毒治疗，抗血吸虫治疗，戒酒等；（2）针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制炎症或脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞的增生活化，以及促进胶原降解等。

针对原发病去除致病因素的肝纤维化的治疗，易出现患病情况持续，反复的情况。虽然在终末期患者治疗中，进行肝移植也是一个成功的治疗方法，但可供移植器官不足，医疗费用高昂，因此，随着分子生物学的发展，阐明肝纤维化的发病机制，对于肝纤维化本身的治疗是最广泛有效的方法。其中siRNA对于基因的沉默来治疗肝脏纤维化由于其安全性高，效率高，治疗效果好，正逐渐发展，而对于该技术，靶标的寻找和siRNA的设计是关键所在。

目前已知Slit2-Robo1信号通路的激活参与了肝癌等多种肿瘤形成及炎症反应，然而其能否调节肝癌重要前期病变即肝纤维化的病理进程尚不明确。近年来研究证明 Slit2 通过富亮氨酸重复序列与其受体 Robo1 胞外免疫球蛋白样区结合，从而激活 Slit2-Robo1 信号通路，调控炎症、肿瘤、白细胞趋化、中胚层和血管平滑肌细胞迁移等病理过程。研究表明，多种肿瘤中存在 Slit2、Robo1 基因的异常表达。Slit2 与 Robo1 作用可以诱导肿瘤新生血管形成。最近研究报道，Robo1 在肝癌组织中过表达，可以作为诊断肝癌的临床指标之一。鉴于 Slit2-Robo1 信号通路在肝癌和炎症中的重要调控作用，而肝癌大多由肝纤维化发展而来，并且肝纤维化过程也是炎症反应相关的病理过程。那么，Slit2-Robo1 信号通路是否在肝纤维化的病理进程中同样发挥重要的调控作用？目前尚不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有肝纤维化治疗药物的不足，提供一种能够治疗肝纤维化的短的、双链的核糖核酸，即小干扰RNA（siRNA）。

本发明的另一目的是提供上述siRNA的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种抑制robo1基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.1所示，siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供上述抑制robo1基因表达的siRNA在沉默robo1基因中的应用。

本发明还提供上述抑制robo1基因表达的siRNA在抑制或下调TGF-β1/Smad通路蛋白和/或PI3K/AKT通路蛋白的表达中的应用。

上述抑制robo1基因表达的siRNA在抑制肝星状细胞的活化中的应用在本发明的保护范围之内。

上述抑制robo1基因表达的siRNA在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

上述抑制robo1基因表达的siRNA在制备治疗慢性肝脏疾病药物中的应用也在本发明的保护范围之内。所述慢性肝脏疾病为毒性肝炎，酒精肝或非酒精性脂肪肝。

上述抑制robo1基因表达的siRNA在制备治疗肝硬化或肝癌药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

研究表明，slit-robo通路对于肝纤维化的发展有促进作用，血清中Slit2水平与肝纤维化程度呈正相关，利用Slit2抗体通过常规的ELISA、免疫组化、免疫荧光等方法，可以特异性地标识Slit2与肝纤维化程度的关系，α-SMA与Slit2的表达呈正相关性。

另外，在肝纤维化的发展过程中，两条通路起着非常重要的作用，一条是TGF-β 1/Smad3通路，转化生长因子-β1（TGF-β1）过度表达已被公认为肝纤维化发生的最重要的因素之一。TGF-β1通过与其跨膜受体结合，激活胞内 Smad3蛋白，进而调控α-SMA等细胞外基质蛋白的转录翻译，并促进其合成ECM并抑制ECM降解，诱导静息状态的肝星状细胞（HSC）向肌纤维细胞转化，进而引起肝纤维化。因此，阻断TGF-β1合成或抑制TGF-β1/Smad3信号通路均可显著减轻实验性肝纤维化程度；NF-κB是介导炎症反应的一个关键的核转录因子，在调节肝脏炎症信号通路方面发挥着重要作用，NF-κB通过上调 TGF-β1 表达进而激活 TGF-β1/Smad3通路，促进ECM 积聚，从而参与肝脏炎症、肝纤维化和肝癌病变进程。

?另一条是PI3K/AKT通路，能够在多方面管控肝脏星状细胞的激活，包括胶原的生成与肝星状细胞的增殖。其与胶原形成具有明显的相关性。而胶原沉积是产生肝脏纤维化的最主要的原因。其主要是通过作用于基质金属蛋白酶（MMP）和金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP），MMP具有降解细胞外基质中胶原的作用，而TIMP则可以抑制TIMP的作用。正常人体肝脏组织中，TIMP与MMP的水平是保持动态平衡的。而PI3K/AKT通路则可以增加TIMP的表达，将这个平衡破坏，从而促进细胞外基质的堆积，导致肝脏纤维化。

我们通过在基因水平上沉默robo1基因，使得TGF-β1/Smad通路蛋白均有不同程度的下调，PI3K/AKT通路蛋白也有一定程度下调，从而使得在TGF-β 1/Smad3与PI3K/AKT这两条通路上缓解肝纤维化的病理进程，从而从根本上遏制肝纤维化的发展，从而达到治疗肝纤维化的目的。

对于robo1基因的抑制能够有效的治疗肝脏纤维化，而肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化的必经病理阶段和肝癌形成的主要病因，因此，对于肝癌等疾病的治疗具有重要的应用前景。而且，根据本发明的siRNA制备药物是通过对肝纤维化本身的治疗来达到治疗肝癌等疾病的目的，能够预防肝纤维化的反复，提高治病效率与安全性。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种治疗肝脏纤维化的siRNA及其应用。所述siRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，该siRNA可以有效的沉默Robo1基因，从而阻断Slit2-Robo1信号通路，继而达到从根本上遏制肝纤维化发展的目的。

另外，本发明所述的siRNA沉默Robo1基因后，可有效地减少肝星状细胞（LX2细胞）靶蛋白质（TGF-β1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT通路蛋白）的产生，抑制肝星状细胞的活化，从而使得在TGF-β 1/Smad3与PI3K/AKT这两条通路上缓解阻断肝纤维化的病理进程，从而从根本上遏制肝纤维化的发展，从而达到治疗肝纤维化的目的。

总之，本发明siRNA对于robo1基因的抑制能够有效的治疗肝脏纤维化，而肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化的必经病理阶段和肝癌形成的主要病因，因此，对于肝癌等疾病的治疗具有重要的应用前景。

而且，本发明是通过对肝纤维化本身的治疗来达到治疗肝癌等疾病的目的，能够预防肝纤维化的反复，提高治病效率与安全性。

附图说明

图1为Elisa检测血清中Slit2含量的结果。

图2为免疫组化（IHC）检测Slit2和免疫荧光技术（IF）检测α-SMA表达的结果。

图3为不同肝纤维素化分期的Slit2表达量。

图4为不同肝纤维素化分期的α-SMA表达量。

图5为α-SMA和Slit2的表达关系。

图6为western blot检测robo1基因沉默后TGF-β1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT通路蛋白的表达。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 ELISA检测人Slit2

1、Elisa检测正常人和肝纤维化患者血清中Slit2含量，采用市购的人Slit2 ELISA 试剂盒（Human Slit2 ELISA Kit），方法步骤如下：

（1）将各种试剂移至室温（18～25℃）平衡至少30分钟，配制试剂。

（2）加样：分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时。

（3）弃去液体，甩干，不用洗涤。

（4）每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。

（5）弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干。

（6）每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。

（7）弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干。37℃

（8）依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15～30分钟。

（9）依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。

（10）在反应终止后5分钟内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

2、结果

结果如附图1所示，正常人血清中Slit2的含量约20 ng/mL，而肝纤维化患者的血清中Slit2含量显著增加，约100 ng/mL。表明血清中Slit2水平与肝纤维化程度呈正相关。

实施例2 免疫组化（IHC）检测Slit2

1、Slit2抗体的制备

所述Slit2抗体（BA2082）购买于博士德公司，为兔多克隆抗体，可针对大鼠、小鼠及人源性标本进行实验检测。本发明中应用的抗体体积稀释配比为1：150，稀释液体为1%（w/v）BSA液体或pH7.2～7.6的PBS。

2、获取小鼠肝脏

分别选取6～8周龄的Slit2 过表达小鼠Slit2-Tg，由本研究所自行构建，饲养于本研究所（广东药学院血管生物学研究所）动物房。

C57BL/6J小鼠，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2008-0002）。

分别用CCl4 和胆管结扎诱导肝纤维化模型，并按照以下方法获取小鼠肝脏：

S1.将小鼠颈部脱臼处死；

S2.将小鼠仰卧，腹中间开口暴露腹腔，用镊子夹住胆囊，将肝脏分离出来，放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的小皿中。将肝脏放入专用小盒编号，后固定、脱水、包埋。

3、将上述获得的肝脏进行切片、HE染色及免疫组化。利用IHC的方法，以Slit2抗体（一抗）进行检测，以PBS作为阴性性对照。

IHC操作流程可以按照市售试剂盒和常规方法进行，具体的可以操作如下：

（1）脱蜡：按照如下顺序进行处理：二甲苯I，II各处理20min，无水乙醇处理15min，再换新的无水乙醇处理10min，95%酒精处理10min，90%酒精处理10min，80%酒精处理5min，70%酒精处理5min。

（2）PBS洗5min，重复3次。

（3）柠檬酸盐缓冲液（PH=6.0）修复10～15min（先将柠檬酸盐置于高压锅中煮沸，然后放入切片，待充气后10～15min）。

（4）取出烧杯，在室温中静置降温。

（5）PBS洗5min，重复3次。

（6）将载玻片放入3%的H₂O₂甲醇溶液中，37℃，30min。

（7）PBS洗5min，重复3次。

（8）10% BSA（PBS稀释）在湿盒中，37℃封闭1小时。

（9）将10% BSA直接甩掉，加入Slit2抗体，4℃过夜。

（10）静置室温中45min，PBS洗5min，重复4次。

（11）加二抗（羊抗兔IgG/HRP，购于博士德公司，1：150稀释后使用）室温放置1h。

（12）PBS 洗5min，重复3次。

（13）DAB显色（使用Thermo SCIENTIFIC公司的DAB浓缩液(10X)，利用Thermo SCIENTIFIC公司DAB稀释液，进行1：9稀释后，按照使用说明书进行）。

（14）自来水涮洗5～10下。

（15）苏木素复染20 s。

（16）自来水洗30min。

（17）80%酒精处理20s，95%酒精处理20s，无水乙醇处理20s（两次），二甲苯处理20s（两次）。

（18）风干，封片剂封片。所述封片剂为中性树胶，购于国药集团化学试剂有限公司。

实施例3 免疫荧光技术（IF）检测α-SMA表达

1、Slit2抗体以及小鼠肝脏的获取同实施例3。

2、将上述获得的胚胎进行切片、染色，利用IF的方法，以Slit2抗体（一抗）进行检测，以PBS作为阴性对照。

IF的操作流程可以按照市售试剂盒和常规方法进行，具体的可以操作如下：

（1）石蜡切片正常脱蜡，PBS洗5分钟，3次。

（2）抗原修复：0.01M枸橼酸盐缓冲液pH=6.0（修复液），沸水浴热修复7～10分钟。

（3）取出烧杯，在室温中静置降温。

（4）PBS洗5min，重复3次。

（5）10% BSA（PBS稀释）在湿盒中，37℃封闭1小时。

（6）将10% BSA直接甩掉，加入Slit2抗体，4℃过夜。

（7）静置室温中45min，PBS洗5min，重复4次。

（6）二抗孵育（AlexaFluor 488标记的羊抗小鼠IgG，1：500倍稀释），37℃，60分钟，从这一步开始全程避光。

（7）PBS洗5分钟，4次。

（8）DAPI复染10分钟，PBS洗5分钟，3次。

（9）防猝灭荧光封片剂封片。

（10）镜检。

其中，所述的0.01M枸橼酸盐缓冲液（Citrate buffer）的配制方法如下：

储存液：A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸（C₆H₈O₇·H₂O）溶于1000mL蒸馏水中。

B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸三钠（C₆H₅Na₃O₇·2H₂O）溶于1000mL蒸馏水中。

工作液：取9mL A液和41mL B液加入450mL蒸馏水中，溶液pH值应为5.9～6.1。

所述防猝灭荧光封片剂为购于北京中杉金桥生物技术有限公司的Mounting Medium。

3、实施例3和4的结果如附图2～5所示，有正常肝组织及肝纤维化1期、2期、3期和4期的肝组织的HE染色结果、Slit2染色的免疫组化结果和α-SMA染色的免疫荧光结果，以及α-SMA和Slit2的表达量。结果显示，随着肝纤维化程度的加重，α-SMA表达增加，Slit2表达也相应增加，并且两者的表达呈正相关性。

综上所述，结果证明：血清中Slit2水平与肝纤维化程度呈正相关，利用Slit2抗体通过常规的ELISA、免疫组化、免疫荧光等方法，可以特异性地标识Slit2与肝纤维化程度的关系。因此，Slit2有望作为临床检测肝纤维化程度的生物学指标，预测肝纤维化程度，再结合其他指标进行综合分析，可预测评价肝脏疾病程度和类型。

实施例4 RNAi干扰沉默Robo1基因

基于上述研究，而且Slit2-Robo1信号通路的激活参与了肝癌等多种肿瘤形成及炎症反应，研究也证明了Slit2 通过富亮氨酸重复序列与其受体 Robo1胞外免疫球蛋白样区结合，从而激活 Slit2-Robo1信号通路，因此，本发明以Robo1基因为靶标，希望阻断Slit2-Robo1信号通路，从而达到从根本上遏制肝纤维化发展的目的。

1、siRNA的设计

以基因Robo1序列为靶标，设计了一对能够治疗肝纤维化的短的、双链的核糖核酸，即小干扰RNA（siRNA），所述siRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2、RNA干扰：

（1）6孔板以2×10⁵/cm²的密度接种LX-2细胞（人肝星状细胞株），加含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液2 mL，37℃，5% CO₂培养箱中培养24 h左右，细胞融合至60～80%水平即可开始转染实验。

（2）2个无菌1.5mL 的离心管（EP管）中准备好A，B两种溶液；每孔中A、B溶液的用量：

A溶液：2 μL DNA转染试剂（lipofectamine 3000，1:500）+ 200 μL 减血清培养基（Opti-MEM）；

B溶液：5 μL Robo1 siRNA（1:200，美国匹兹堡飞世尔科技Dharmacon公司）+ 200 μL Opti-MEM；

 A、B液配好后室温放置5 min。

（3）将A，B两种溶液轻轻混匀，室温下放置20 min，使siRNA序列与脂质体形成复合体。

（4）吸掉6孔板中的培养基，用2 mL PBS洗涤6孔板中的细胞，吸掉PBS。

（5）往复合物中加入0.6 mL Opti-MEM，温和混匀，加入到1个孔中。

（6）将6孔板置于37℃，5% CO₂培养箱中，孵育6～8 h后换含10% FBS的DMEM培养液，24 h后加入5μL 2g/mL的TGF-β处理24h后收获细胞。

3、基因Robo1沉默效果

利用western blot（具体如下文所述）检测robo1蛋白的表达，对基因Robo1的沉默效果进行检测。

结果如附图6所示，本发明的siRNA可以特异灵敏的抑制沉默Robo1基因的表达，进而可以阻断Slit2-Robo1信号通路，从而达到从根本上遏制肝纤维化发展的目的。

实施例5 western blot检测TGF-β1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT通路蛋白的表达

western blot检测基因Robo1沉默后，TGF-β1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT通路蛋白的表达。具体western blot方法如下。

1、细胞中总蛋白的提取：

（1）倒掉培养细胞的培养皿中的培养液，用预冷过的PBS洗三次，弃PBS后将其置于冰上。

（2）加100μL PIRA裂解液于培养皿中，置于冰上静置，至充分裂解。

（3）裂解后，用细胞刮将裂解液移至1.5mL离心管中；然后在4℃下12000rpm离心15min ，取上清分装于0.5mL离心管中，置于-80℃保存。

2、蛋白含量的测定

（1）制作标准曲线，检测样品蛋白含量（BCA法）

待测蛋白/PBS=2μL/18μL（如果蛋白浓度高，须事先稀释）。

BSA标准品为0. 5mg/mL，由2 mg/mL稀释得到。不同浓度的BSA标准品如表1所示。

表1

（2）将不同浓度的BSA标准品和蛋白以2：18的比例（20μL）分别加入96孔板孔内。

BCA定量中的A液：B液=50：1，配制混合液后，向各孔中各加200μL。迅速震荡混匀，37℃孵箱孵育30min。

（3）机器读数，制作标准曲线，计算样品浓度。

3、按照本领域常规方法进行配制分离胶和浓缩胶并灌胶，具体方法如下：

（1）玻璃板蘸洗洁精轻轻擦洗，用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里烘箱烘干。玻璃板对齐后放入夹中卡紧，卡在架子上准备灌胶（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）

（2）分离胶（10%）配方如表2所示。

表2

加 TEMED 后立即混匀灌胶，快速在右上角斜灌。最后几滴不注入以免产生气泡，胶面与把手齐平。灌胶后立即加水，枪平放，快速均匀缓慢注水。10min 后出现折线再等30min ，整套拿去水槽倾去水，滤纸小心吸干。

（3）浓缩胶（5%）配方如下：

超纯水                         2.14mL                       

30%Acr/Bic                     0.64mL                         

0.5 mol/L Tris ·HCl（Ph6.8）      0.94mL                         

10%SDS                        37.5 μL                         

10%AP（过硫酸胺）             18.75 μL                          

TEMED                         3.75  μL                           

浓缩胶配好后迅速沿右上角灌封，迅速插入梳子（水洗晾干），水平插入后等1h。

4、电泳，具体方法如下：

（1）在灌好的胶上方的梳子部分冲少量双蒸水，然后双手对称轻轻将梳子拔出，再用蒸馏水冲洗梳孔，将孔内水分排净。将夹子松开取出玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，另一边需垫塑料板）。先向两块板间注入1 ×电泳液至玻板上缘，然后电泳液在外盒加1/4。

（2）测量样品蛋白含量，计算含80 μg蛋白的溶液体积即为上样量。1.5mm 板每孔上样总体积（最大量每孔可加30μL蛋白样品）15 μL（12μL样品＋3μL 5×上样buffer）＝（80μg）/蛋白浓度≤12μL，不足部分以裂解液补充。显影Marker（红色）2μL +3μL（5×上样buffer）。

（3）样品混匀后沸水煮5min，迅速冰上冷却，4℃ 12000r×30s 瞬时离心。

（4）上样：用微量进样器吸取样品，插入加样孔缓慢加入，防止样品溢出。加下一样品前在电泳液中洗涤3 次，防止交叉污染。

（5）电泳：浓缩胶跑时80v；进入分离胶后改为100v，直至溴酚蓝跑出至距胶底10cm停止。

5、转膜

（PVDF膜大小：可根据分离胶的长宽量好尺寸然后再小心剪下，滤纸大小可根据既往所用的滤纸进行剪裁）

（1）转一张膜需准备6张适当大小的滤纸（夹的黑面和白面海绵上方各放3张，尺寸要大于膜和胶）和PVDF膜（换带新手套，防止手上的蛋白污染膜）。膜（剪角或写字作标记）预先在甲醇中浸泡约2-3min即可，然后准备电转，先在盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、各3层滤纸，摆放好位置后，以回收的电转液充分浸泡。

（2）在电转液中用刮胶板轻轻撬去玻璃板，刮去浓缩胶，并于分离胶两侧用刮胶板沿两侧玻板和分离胶的缝隙进行轻轻刮离，在电转液中轻轻撬下分离胶，注意胶放置在夹子的黑色面一侧的滤纸上。（胶与膜浸盒中，余浸入盆中）

（3）夹板黑面向下，向上依次为海绵、三层滤纸、胶、膜、三层滤纸、海棉。擀去气泡合起夹子，整个操作在电转液中进行。

（4）夹子放入转移槽，夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面（短白夹向上），槽的旁边放一块冰盒，整个转移槽放入4℃，200mA，90min。

6、免疫反应

（1）取出膜，直接（不用洗）放入5 %脱脂奶封闭室温缓慢振摇 2h（1g脱脂奶粉＋20mL TBST→一张膜），若抗体较弱可用2%BSA 封闭。

（2）封闭后用TBST稍洗一下直接封闭，一抗以封闭液稀释，先在室温缓慢振摇1h，后 4 ℃孵育过夜（第二天室温孵育缓慢摇床1h ）。用封口袋剪去3 边，把膜放入，封口机封两边，留一边加一抗，2mL一抗/膜，一定要赶气泡，封口。

（3）取出膜，TBST 5min×3 (一张膜一个盒子，充分洗干净)。

（4）4mL二抗/膜于肥皂盒，室温摇床孵育2h（二抗以封闭液稀释）。

（5）取出膜，TBST处理10min，重复4次。

7、化学发光，显影，定影

采用Thermo Scientific Pierce化学发光液试剂盒，按照说明书进行，具体如下：

（1）化学发光

在暗室中将A、B 两种试剂在4mLEP管上等体积混合（1 张膜1mL ，AB各0.5mL）。 膜在滤纸上滴尽残液，蛋白面向上，将膜移至X 光片夹中的保鲜膜上，用加样器加发光液，也可将发光液至于盒子中，膜浸于盒子，然后盖上保鲜膜（注意蛋白膜始终在保鲜膜内，不直接与X光片接触），然后将剪好的X光片放在有蛋白膜的保鲜膜上方，快速盖上压片盒盖子不可移动。压制时间视情况而定。

（2）显影定影

在暗室中将1×显影液、1×定影液、水分别倒入瓷盘中，曝光后取出 X 光片，迅速浸入显影液，在红灯下看到明显条带后终止显影，水洗，浸入定影液，至胶片透明。晾干。

8、结果

结果如附图6所示，其主要是在细胞水平，培养人体的肝星状细胞LX2细胞，通过药物或因子刺激之后提取蛋白获得的实验结果。

图6可以看出，沉默robo1基因后，TGF-β1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT通路蛋白均有不同程度的下调，因为TGF-β1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT通路均可调控α-SMA，而α-SMA是检测肝纤维化发展的最重要的指标，同时图6也可以看出沉默robo1之后，α-SMA蛋白表达量下降，则可说明其遏制了肝纤维化的发展。

综上所述，本发明所述的siRNA能够特异的沉默robo1基因，从而达到遏制肝纤维化的发展的目的。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广东药学院

 

<120>  一种治疗肝脏纤维化的siRNA及其应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  siRNA的正义链序列

 

<400>  1

ggauguauuu gcaacaagat t                                               21

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  siRNA的反义链序列

 

<400>  2

ucuuguugca aauacaucct t                                               21

 

 

Claims (8)

1.一种抑制robo1基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链序列如SEQ ID NO.1所示，siRNA的反义链序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述抑制robo1基因表达的siRNA在沉默robo1基因中的应用。

3.权利要求1所述抑制robo1基因表达的siRNA在抑制或下调TGF-β1/Smad通路蛋白和/或PI3K/AKT通路蛋白的表达中的应用。

4.权利要求1所述抑制robo1基因表达的siRNA在抑制肝星状细胞的活化中的应用。

5.权利要求1所述抑制robo1基因表达的siRNA在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。

6.权利要求1所述抑制robo1基因表达的siRNA在制备治疗慢性肝脏疾病药物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述慢性肝脏疾病为毒性肝炎，酒精肝或非酒精性脂肪肝。

8.权利要求1所述抑制robo1基因表达的siRNA在制备治疗肝硬化或肝癌药物中的应用。