CN111718413A

CN111718413A - Cthrc1在肝硬化诊断和治疗中的应用

Info

Publication number: CN111718413A
Application number: CN202010601668.7A
Authority: CN
Inventors: 张志刚; 李军; 王亚辉; 马铭泽
Original assignee: Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Shanghai Cancer Institute
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2020-09-29
Also published as: WO2016206596A1; CN106290892A

Abstract

本发明在肝硬化/纤维化领域首次提出利用检测CTHRC1基因及其产物，实现早期检测以及治疗肝硬化/纤维化的效果。本发明通过免疫组化实验、体内实验以及体外实验发现CTHRC1基因：在人肝硬化组织中表达上调，其参与调节肝纤维化的进展；有加剧肝纤维化进展的作用，能够加速肝功能损伤；可以加速肝星状细胞的活化，促进星状细胞的运动和收缩。然而使用CTHRC1中和抗体，针对CTHRC1进行阻断后，可逆转CTHRC1的作用，在动物体内使用CTHRC1中和抗体后，可以很大程度上减缓肝纤维化病变的进展。综上可见，CTHRC1具有成为良好的生物标记的潜应用前景。

Description

CTHRC1在肝硬化诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学特别是基因诊断和治疗领域，尤其是CTHRC1基因在肝硬化诊断和治疗中的应用。

背景技术

肝硬化，其前期病变表现为肝纤维化，是十分常见的肝脏慢性疾病^[1]。多数肝纤维化患者经过15到20年的时间后会转变为不可逆转的肝硬化，甚至会进一步发展为肝癌^[2]。肝纤维化的的病理表现为肝脏内纤维结缔组织的过度沉积(如Collagen)，是纤维增生(Fibrogenesis)和纤维分解(Fibrolysis)不平衡的结果。在肝纤维化进程中，肝星状细胞的活化是肝纤维化的中心事件。不同于肝癌，肝硬化的早期诊断十分困难，目前没有明确的分子标志物，临床检测手段主要是采用肝穿刺活检来进行诊断，其次是根据肝脾肿大、腹腔积液以及肝硬化并发症(如上消化道出血、肝性脑病、肝肾综合症等)这些临床病理特征来进行诊断^[3]。但已有的检测手段存在一定缺陷，活检对于病人来说有一定创伤，而以并发症为依据又很难诊断出早期肝硬化。因此，寻找简便易行且能够准确监测病情的分子标志物的意义重大。

CTHRC1是一种分子量大约为26KDa的分泌性糖蛋白，最初发现于球囊扩张动脉损伤大鼠模型研究中^[4]。CTHRC1参与了血管重构，并在胰腺癌组织中高表达^[5]。此外，CTHRC1在乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤以及结肠癌中呈高表达，并且促进上述肿瘤的侵袭迁移^[6-8]。在血管平滑肌细胞中，CTHRC1抑制TGF-β通路，但是对内皮细胞的TGF-β通路没有抑制作用^[9]。CTHRC1基因的启动子结合区域有Smad的结合位点，这提示了CTHRC1可以受到TGF-β的调节^[8]。在胃癌的研究中发现，加TGF-β1处理后，胃癌细胞的CTHRC1表达水平逐渐上调，伴随着TGF-β下游Smad信号通路的活化^[8]。CTHRC1可以通过与Wnt5a和ROR2相互作用来激活Wnt/PCP信号通路，抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而发挥调节细胞骨架重排和细胞运动的功能^[10]。所以，CTHRC1对于TGF-β和Wnt信号通路具有非常重要的调节作用。

我们通过免疫组化实验发现，CTHRC1基因在人肝硬化组织中表达上调，可能参与调节肝纤维化的进展。我们进一步通过体内实验证实CTHRC1具有加剧肝纤维化进展，加速肝功能损伤的作用。之后通过体外实验发现CTHRC1可以加速肝星状细胞的活化，促进星状细胞的运动和收缩，而使用CTHRC1中和抗体针对CTHRC1进行阻断后，可逆转CTHRC1的作用。在动物体内使用CTHRC1中和抗体后，可以很大程度上减缓肝纤维化病变的进展。

发明内容

本发明的目的是提供与CTHRC1基因或产物相关的肝硬化/纤维化检测和治疗药物以及方法。

本发明的一方面在于提供一种CTHRC1核酸序列或蛋白作为在样品中检测肝硬化或肝纤维化的试剂中的应用，其中CTHRC1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，CTHRC1蛋白如SEQ ID NO：2所示。

其中，前述试剂是用于识别CTHRC1蛋白抗原表位的抗体。

或者，前述试剂也可是用于识别CTHRC1核酸序列的核酸探针。

本发明的另一方面在于提供一种CTHRC1核酸序列或蛋白作为在制备预防或治疗肝硬化或肝纤维化的药物中的应用，其中CTHRC1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，CTHRC1蛋白如SEQ ID NO：2所示。

其中，前述药物是用于识别CTHRC1蛋白抗原表位的抗体。

或者，前述药物包括CTHRC1核酸序列的反义核酸。

本发明的另一方面在于提供一种CTHRC1核酸序列或蛋白作为体外筛选和制备肝硬化或肝纤维化药物的药靶的应用，其中CTHRC1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，CTHRC1蛋白如SEQ ID NO：2所示。

本发明的又一方面在于提供一种肝硬化或肝纤维化的试剂盒，该试剂盒中包括一容器，容器中含有CTHRC1抗体，即蛋白抗原表位的抗体。更进一步地，该容器中可包括CTHRC1抗体作为一抗以及HRP标记的山羊抗兔抗体作为二抗。

或，该容器中含有CTHRC1特异性探针。

术语：

本发明文本中所述的CTHRC1，在不同的语境下可能对应CTHRC1蛋白或核酸序列。

其中，CTHRC1蛋白可以采用各种常规的制备方法制备。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，可将CTHRC1核酸序列表达为蛋白而得。一旦获得了含有CTHRC1基因序列的重组表达质粒，就可将其转化到相应宿主中进行蛋白表达。本发明所述“CTHRC1蛋白”也包括如SEQ ID NO：2所示蛋白的天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他己知分子生物学的技术获得。所述“CTHRC1蛋白”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如氨基酸、Y-氨基酸等)的类似物。

其中，CTHRC1核酸序列可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的CTHRC1核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明的核酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。获得了CTHRC1基因序列后，就可以将CTHRC1序列插入适当的表达载体，以获得重组表达质粒。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO：1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

其中，CTHRC1的抗原表位(Epitope)，又称为抗原决定簇(Antigenicdeterminant)，是抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合。本发明中所述的CTHRC1的抗原表位的抗体，是指任何现有技术中已知的CTHRC1抗体，也包括任何通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备得到的抗体。

CTHRC1抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的CTHRC1蛋白，还可以作为用于预防肝纤维化或肝硬化的特异性治疗剂。抗体可以通过ELISA、Western印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。

CTHRC1核酸探针是指与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团，但可被放射标记；亦或者该探针连接到一种结合伴侣上，如抗体或生物素，或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。

本发明有以下特点：

本发明在肝硬化/纤维化领域首次提出利用CTHRC1基因及其产物的检测来达到早期检测以及治疗的效果。CTHRC1具有成为良好的生物标记的潜应用前景。

附图说明

本发明将参考附图进行进一步的解释，其中：

图1a-b为免疫组化染色图以及CTHRC1在组织中的表达水平的统计图；

图2为CCl₄和TAA化学诱导模型小鼠中，小鼠肝纤维化程度的组织染色图；

图3为分别经CTHRC1中和抗体处理和IgG处理的CCl₄和TAA化学诱导模型小鼠中，小鼠肝纤维化程度的组织染色图；

图4为CCl₄和TAA化学诱导模型小鼠中，小鼠肝损伤程度示意图；

图5为分别经CTHRC1中和抗体处理和IgG处理的CCl₄和TAA化学诱导模型小鼠中，小鼠肝损伤程度示意图；

图6为分别经CTHRC1中和抗体处理和IgG或mAb处理的肝星状细胞胶收缩实验示意图；

图7分别经CTHRC1中和抗体处理和IgG或mAb处理的肝星状细胞迁移实验示意图。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料或生物制剂，如无特殊说明，均为可从市场上购得的常规试剂。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件和分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

具体实施方式

以下实施例主要包括了如下内容：

检测了CTHRC1在人肝硬化组织芯片中的表达情况，发现CTHRC1在肝硬化组织中显著上调。

采用CCl₄和TAA化学诱导模型小鼠，发现野生型小鼠肝纤维化和肝损伤程度均重于CTHRC1敲除小鼠。这些实验证实了CTHRC1具有加剧肝纤维化进展，加速肝功能损伤的作用。

构建了CTHRC1的表达质粒，并转染到293T细胞中，纯化出重组CTHRC1蛋白。通过胶收缩和Transwell实验，分别观测到重组CTHRC1蛋白可以促进肝星状细胞收缩和迁移，使用CTHRC1中和抗体可逆转此作用。

在野生型小鼠中CTHRC1中和抗体可减轻CCl4和TAA所诱导的肝纤维化和肝损伤。

以上实验证实了使用CTHRC1中和抗体可以很大程度上减缓肝纤维化病变的进展，以下将详细描述各个实验：

实施例1CTHRC1在人肝硬化组织芯片中的免疫染色

1.1主要试剂

CTHRC1一抗购自Abcam公司，HRP二抗购自Abmart公司；DAB显色液购自Thermo公司；中性树胶购自上海生工生物技术有限公司；肝硬化组织芯片购自西安艾丽娜生物科技有限公司，产品编号：LV805。组织芯片包含30例正常肝组织、10例肝炎组织、40例肝硬化组织。

1.2对上述组织芯片进行免疫组化染色并统计CTHRC1在组织中的表达水平：

①脱蜡至水化：二甲苯20分钟 1/2二甲苯10分钟无水乙醇10分钟 95％乙醇10分钟 85％乙醇10分钟 75％乙醇10分钟 PBS(磷酸盐缓冲液)洗至水化；

②抗原热修复：沸水加热0.01M柠檬酸钠抗原修复液(pH6.0)至95℃左右，然后小心放入组织芯片或组织切片水浴加热15分钟，取出后可自然冷却至室温；α-SMA抗体染色不需抗原热修复步骤；

③消除内源性过氧化物酶活性：使用0.3％过氧化氢在37℃孵育30分钟，然后用PBS冲洗；

④抗原封闭：用10％牛血清(BSA)室温封闭1小时；在湿盒内进行；

⑤一抗孵育：向玻片的组织上滴加一抗150-200ul，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次；置湿盒进行反应；

⑥二抗孵育：滴加二抗(山羊抗兔-HRP标记二抗1∶500稀释，兔抗小鼠-HRP标记二抗1∶200稀释)150-200ul，在室温孵育1小时，置湿盒内进行，孵育完毕后用PBS洗3次；

⑦发色：使用DAB显色液(现用现配)，DAB显色一般持续1-5分钟，显微镜下控制发色程度，用自来水终止反应，然后PBS冲洗；

⑧使用苏木精复染细胞核1-2分钟，自来水冲洗5-10分钟；

⑨脱水，75％乙醇5分钟85％乙醇5分钟95％乙醇5分钟无水乙醇5分钟1/2二甲苯10分钟二甲苯20分钟，自然晾干。

⑩用中性树胶封片、镜检。

染色结果如图1a所示，统计结果如图1b所示，可发现CTHRC1在人肝硬化组织中显著上调。

实施例2.CTHRC1蛋白的构建和纯化，制得CTHRC1蛋白以备后续实验所用

2.1CTHRC1基因和表达载体

CTHRC1基因和表达载体均为本实验室保存，CTHRC1基因序列如SEQ ID NO：1所示，表达载体为V152，V162质粒。

2.2重组CTHRC1蛋白亲和层析纯化

收集CTHRC1-V152转染的293细胞培养液上清，进行蛋白亲和层析纯化获取重组CTHRC1-StrepII标签融合蛋白。具体步骤如下。

2.2.1组装层析柱子。层析柱由层析管、垫片、出口塞、顶盖以及管内琼脂糖磁珠组成。CTHRC1-StrepII tagged融合蛋白所用的亲和Beads是由德国iba公司(Goettingen，Germany)生产的Strep-Tactin Sepharose磁珠。Strep Tag II是仅含8个氨基酸的新型融合蛋白标签，V152载体是基于这个标签序列开发出的完备的融合蛋白真核生物表达系统。Strep Tag纯化技术的原理是基于biotin(生物素)/streptavidin(抗生物素蛋白链菌素)特异性结合的特点。Strep Tag II可以结合到Streptavidin的生物素口袋上，Strep-Tactin是改造过的Streptavidin，Strep-Tactin与Strep Tag II的亲和力远远超出普通Streptavidin约100倍，是非常高效的亲和层析分子。实验开始时向层析柱中加入2mlStrep-Tactin Sepharose。

2.2.2先加入5ml Buffer W洗涤层析柱1次。

2.2.3再分次加入收集的细胞培养液上清，至总上样量约50ml左右。加入培养液上清后，让液体由重力控制缓慢流过层析柱，全程在4℃条件下操作。细胞培养液在上柱前进行离心，14,000rpm，5min，4℃，去除杂质。

2.2.4洗柱。用Buffer W洗柱5次，每次用Buffer W约2ml。

2.2.5用2.5mM Buffer E溶解洗脱蛋白。每次加入Buffer E 1ml，分6次加入共6mlBuffer E，分次接纳Buffer E洗脱下来的蛋白溶液，依序标记，每管留出20μl蛋白溶液用于SDS-PAGE检测。

2.2.6柱子再生。用Buffer R洗柱子3次使柱子再生。每次用Buffer R 10ml，直至层析柱颜色由黄变红。

2.2.7洗柱。用Buffer W洗柱子2次，每次用Buffer W 8ml洗掉Buffer R。

2.2.8洗柱及再生后，将层析柱上灌注约2ml Buffer W(PH8.0)，并盖好顶盖，压好出口塞，保存在4℃冰箱，再生的柱子可以使用3-5次。

2.2.9收集到的蛋白溶液用NanoDrop2000进行蛋白浓度检测并记录，加入甘油后分装冻存于-80℃冰箱。每管留出的20μl蛋白溶液用于Western Blotting检测(检测CTHRC1抗体、StrepII抗体)，考马斯亮蓝检测蛋白条带单一性和准确性。

实施例3.CCl₄和TAA化学诱导小鼠模型

3.1化学诱导肝纤维化动物模型实验

SPF级CTHRC1基因敲除C57小鼠(CTHRC1-/-C57BL/6mouse)从Hiroshi Sasaki(Labfor Embryonic Induction，Kobe，Japan)购买。CCl₄诱导的肝纤维化模型：选择6周龄的同笼雄性C57野生型和CTHRC1-/-小鼠腹腔注射CCl₄，每周两次，注射的CCl₄需要按照1∶3的比例用橄榄油稀释，按照每只小鼠0.5μL/g(体重)的剂量注射。总共需要注射16次，最后一次注射后过48h处死全部小鼠，留取肝脏及血清，进行实验。

TAA(硫代乙酰胺)化学诱导肝纤维化实验：选择6周龄的同笼雄性C57野生型和CTHRC1-/-小鼠腹腔注射TAA(超纯水溶解，避光保存)，每周三次，按照每只小鼠0.2mg/g(体重)的剂量注射。总共需要注射8周，最后一次注射后过48h处死全部小鼠，留取肝脏及血清，进行实验。

CTHRC1中和抗体抗纤维化治疗的动物实验：化学诱导实验包括CCl₄和TAA诱导模型同上，实验动物选择6周龄雄性C57野生型小鼠，分为CTHRC1中和抗体处理组和IgG处理组。CTHRC1处理组以及IgG处理组分别给予中和抗体(在杭州华安公司订制)或IgG 1mg/只/次，腹腔注射，每周三次，与化学药物注射时间隔日进行，共处理8周。最后一次注射后过48h处死全部小鼠，留取肝脏及血清，进行实验。

3.2肝脏组织切片天狼星红染色

对实验3.1中获得的肝脏组织进行染色，苦味酸天狼星红染色可以使胶原持久染色，在偏振光显微镜下观察能增强胶原纤维的双折光性，从而可以特异性地显示胶原组织。在偏光显微镜下，I型胶原呈现黄或红色，III型胶原呈现绿色，II性胶原呈现蓝绿或灰蓝色。0.1％苦味酸天狼星红溶液配制方法：天狼星红0.1g，饱和苦味酸溶液100ml，苦味酸饱和液(1.22％)。组织切片需要常规脱蜡至水化，然后浸入0.1％苦味酸天狼星红染色至少1小时，然后用自来水流水冲洗4min；苏木素复染3min(非必须)，梯度乙醇脱水，脱水时间应短，晾干，中性树胶封片。实验结果如图2及图3所示。

结果表明CCl₄和TAA化学诱导模型小鼠中，野生型(WT)小鼠肝纤维化程度重于CTHRC1敲除小鼠(图2)。而使用CTHRC1中和抗体可减轻CCl₄和TAA所诱导的肝纤维化(图3)。

3.3动物血清肝功指标ALT、AST检测

检测实验3.1中所获得的小鼠血清，ALT、AST的检测试剂盒购自上海申索佑福医学诊断用品有限公司。包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒，门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒。检测的计算公式是：ALT(U/L)＝(ΔABS/min×Vt×1000)/(6.22×Vs×d)；检测方法如下；设定分光光度计测量程序为：主波长340nm，副波长600nm；血清每孔上样7.5μl，R-1试剂加150μl，R-2试剂加50μl，样品校准方式：K因子(K＝4448)，反应方向：下降；测定温度：37℃；血清样品与R-1混匀后反应5min，加入R-2混合后延迟53秒测光密度值，延迟247秒测光密度值；具体流程如下：血清样品7.5μl+R-1150μl，5min后加入R-250μl，过53秒后测光密度值(A340nm)，过247秒后测第二次光密度值(A340nm)，ΔABS/min是指每分钟平均吸光度值变化，即两次A340nm差值/6min；Vt＝总反应体积(0.2075ml)，Vs＝样品体积(0.0075ml)，6.22＝NADH的毫摩尔吸光系数，d＝比色杯光径(1cm)。AST检测方法跟ALT相同。实验结果如图4及图5所示。

结果表明CCl₄和TAA化学诱导模型小鼠中，野生型小鼠肝损伤程度重于CTHRC1敲除小鼠(图4)。而使用CTHRC1中和抗体可减轻CCl₄和TAA所诱导的肝损伤(图5)。

实施例4.肝星状细胞胶收缩实验

4.1肝星状细胞株

肝星状LX-2细胞株为本室保存，购自Millipore公司(实施例5同)。

4.2胶原晶格收缩实验

4.2.1 LX-2细胞先用无血清DMEM培养液饥饿培养过夜；用胰酶消化细胞，离心，计数；然后配制胶原晶格混合液，全程在冰上进行。按需要的总体积制成混合液体。然后向每个3.5cm皿中加入混合液2mL，摇匀，将培养皿置于37℃细胞培养箱培养；

4.2.2“摇松”，细胞培养45min至1小时凝胶凝固后，打开培养皿盖，小心加入0.5mLDMEM培养液，小心地上下、左右晃动使凝胶漂浮于液体中；间隔每4-6小时观察凝胶面积大小，去培养皿盖进行拍照，拍照时培养皿旁边放直尺；拍照者需戴口罩和帽子，不讲话。

4.2.3使用IPP软件或PhotoShop软件计算凝胶面积或凝胶占培养皿的面积比，用EXEL自带的TTEST法统计学分析。

4.2.4重组CTHRC1蛋白处理的胶原晶格收缩实验步骤和方法

配制胶原蛋白晶格混合液，分为至少7个处理组，分别加入实施例2中所获得的重组CTHRC1蛋白，0nM，20nM，50nM，以及加入mAb蛋白20nM，50nM，和IgG蛋白20nM，50nM，每组内各三皿复孔，每皿需加混合液2ml，计算总量。具体操作全部在冰上进行。

细胞准备：将2个10cm皿长满的LX-2细胞消化，离心，加入11ml含10％血清的细胞培养液重悬细胞，取出10ml细胞悬液加入到配好的胶原蛋白混合液中，用电动移液器反复吹打混匀，然后以7ml为一组将细胞/胶原蛋白混合液吸出分别加到4个50ml灭菌离心管中，在7个离心管中分别加入重组CTHRC1蛋白使蛋白浓度达到0nM、20nM、50nM，同时加入mAb蛋白达到20nM，50nM，和IgG蛋白达到20nM，50nM。将每个离心管的混合液用电动移液器充分混匀，以2ml/皿的量将混合液分别加到各个3.5cm培养皿中，2ml可分两次加。培养箱培养。1小时后进行“摇松”操作，每隔4小时拍照1次，注意拍照应关掉闪关灯，避免液体表面反光。对所获得的照片，使用IPR软件计算凝胶占培养皿的面积比，并用EXEL自带的TTEST法统计学分析，获得图6所示结果。

实验结果表明重组CTHRC1蛋白可以促进肝星状细胞收缩，而CTHRC1中和抗体可逆转此作用(图6)。

实施例5.肝星状细胞迁移实验

5.1选择对数生长期的LX-2细胞，饥饿培养过夜，然后用0.25％胰酶消化并计数，根据计数结果将细胞悬液稀释成20×104/ml的密度。

5.2将用不含血清DMEM培养基重悬的LX-2细胞以4×104/200μl的密度种到每个Transwell小室(Millicell)上层，将小室置于24孔板内，小室下层加入800μl含10％FBS的DMEM培养基，注意避免产生气泡。37℃培养箱培养17小时使细胞穿过小室的滤膜。

蛋白处理对LX-2细胞迁移能力影响的实验需注意，在小室下层的培养液内加入实施例2中所获得的重组CTHRC1蛋白达到蛋白浓度：0nM，20nM，50nM，以及加入mAb蛋白20nM，50nM和IgG蛋白20nM，50nM。下室用低血清培养液(含1％-2％血清的DMEM培养液)，小室内用不含血清的DMEM重悬细胞。

5.3取出Transwell小室，用1×PBS洗涤小室1次，用干净的小棉花团或棉签擦净小室内膜表面附着的细胞，将小室浸入2％戊二醛溶液或者4％多聚甲醛溶液中进行固定15min。

5.4固定结束后，取出Transwell小室，用PBS洗涤小室2次，稍晾干小室，然后将小室置于0.1％结晶紫染色液中染色1小时，注意小室外膜与结晶紫染液间避免产生气泡。

5.5染色结束后，取出Transwel小室，用1×PBS洗涤小室内、外膜表面的结晶紫3次，直至洗涤的PBS不呈紫色为止。

5.6将染色洗涤后的小室倒置晾干，完全干燥后用正置显微镜观察、拍照、计数、统计。结果如图7所示。

实验结果表明重组CTHRC1蛋白可以促进肝星状细胞迁移，而CTHRC1中和抗体可逆转此作用(图7)。

综上所述，CTHRC1参与调节肝纤维化的进展。CTHRC在动物体内可以加剧肝纤维化进展，加速肝功能损伤。在体外CTHRC1可以加速肝星状细胞的活化，促进星状细胞的运动和收缩。使用CTHRC1中和抗体针对CTHRC1进行阻断后，可逆转CTHRC1的作用。而在动物体内使用CTHRC1中和抗体后，可以很大程度上减缓肝纤维化病变的进展。以上结果说明该基可以成为肝硬化诊断和治疗的最新靶标。

应当注意的是，本发明的实施例有较佳的实施性，且并非对本发明作任何形式的限制，任何熟悉该领域的技术人员可能利用上述揭示的技术内容变更或修饰为等同的有效实施例，但凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改或等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

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序列表

<110> 上海市肿瘤研究所

<120> CTHRC1在肝硬化诊断和治疗中的应用

<130> HH1510159

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

atgtggccgc caggtaggag catcacagtc aagctacggg agaaaacagt ttccaggaaa 60

ctggaaatga acggcccgag tgctttccag gggctcatct gtgggaagta taatggaatg 120

tgcttacaag ggccagcagg agtgcctggt cgagacggga gccctggggc caatggcatt 180

ccgggtacac ctgggatccc aggtcgggat ggattcaaag gagaaaaggg ggaatgtctg 240

agggaaagct ttgaggagtc ctggacaccc aactacaagc agtgttcatg gagttcattg 300

aattatggca tagatcttgg gaaaattgcg gagtgtacat ttacaaagat gcgttcaaat 360

agtgctctaa gagttttgtt cagtggctca cttcggctaa aatgcagaaa tgcatgctgt 420

cagcgttggt atttcacatt caatggagct gaatgttcag gacctcttcc cattgaagct 480

ataatttatt tggaccaagg aagccctgaa atgaattcaa caattaatat tcatcgcact 540

tcttctgtgg aaggactttg tgaaggaatt ggtgctggat tagtggatgt tgctatctgg 600

gttggtactt gttcagatta cccaaaagga gatgcttcta ctggatggaa ttcagtttct 660

cgcatcatta ttgaagaact accaaaataa 690

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Trp Pro Pro Gly Arg Ser Ile Thr Val Lys Leu Arg Glu Lys Thr

1 5 10 15

Val Ser Arg Lys Leu Glu Met Asn Gly Pro Ser Ala Phe Gln Gly Leu

20 25 30

Ile Cys Gly Lys Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly Pro Ala Gly Val

35 40 45

Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Gly Ile Pro Gly Thr Pro

50 55 60

Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly Glu Lys Gly Glu Cys Leu

65 70 75 80

Arg Glu Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr Pro Asn Tyr Lys Gln Cys Ser

85 90 95

Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp Leu Gly Lys Ile Ala Glu Cys

100 105 110

Thr Phe Thr Lys Met Arg Ser Asn Ser Ala Leu Arg Val Leu Phe Ser

115 120 125

Gly Ser Leu Arg Leu Lys Cys Arg Asn Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr

130 135 140

Phe Thr Phe Asn Gly Ala Glu Cys Ser Gly Pro Leu Pro Ile Glu Ala

145 150 155 160

Ile Ile Tyr Leu Asp Gln Gly Ser Pro Glu Met Asn Ser Thr Ile Asn

165 170 175

Ile His Arg Thr Ser Ser Val Glu Gly Leu Cys Glu Gly Ile Gly Ala

180 185 190

Gly Leu Val Asp Val Ala Ile Trp Val Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Pro

195 200 205

Lys Gly Asp Ala Ser Thr Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile

210 215 220

Glu Glu Leu Pro Lys

225

Claims

1.CTHRC1核酸序列或蛋白作为在制备预防或治疗肝硬化的药物中的应用，其中所述CTHRC1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述CTHRC1蛋白如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述药物包括用于识别CTHRC1抗原表位的抗体。

3.如权利要求1所述的应用，其中所述药物包括CTHRC1核酸序列的反义核酸。

4.CTHRC1核酸序列或蛋白作为体外筛选和制备肝硬化药物的药靶的应用，其中所述CTHRC1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述CTHRC1蛋白如SEQ ID NO：2所示。