KR20110116021A - 항-혈관생성 활성이 있는 저해제에 대한 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 식별된 바이오마커의 사용에 의해 혈관생성에 대한 인테그린 저해제 및 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 암과 같은 혈관생성 연관 질환의 치료에 주로 사용되는 인테그린 저해제 및 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 효능을 측정하는데 특히 유익하다. 특히, 본 발명은 바람직하게는 체액 중 접근가능하므로 비침습적 방식으로 표적 조정의 분석을 허용하는 혈관생성과 연관되는 바이오마커에 관한 것이다. 인테그린 저해 활성이 있는 화합물의 스크리닝을 위한 상기 바이오마커의 용도가 또한 개시된다.

Description

항-혈관생성 활성이 있는 저해제에 대한 바이오마커{BIOMARKERS FOR INHIBITORS WITH ANTI-ANGIOGENIC ACTIVITY}

본 발명은 특정 식별된 바이오마커의 사용에 의해 혈관생성에 대한 인테그린 저해제 및 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 암과 같은 혈관생성 연관 질환의 치료를 위해 주로 사용되는 인테그린 저해제 및 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 효능의 측정에 특히 유익하다. 특히, 본 발명은 바람직하게는 체액 중 접근가능하므로 비침습적 방식으로 표적 조정의 분석을 허용하는 혈관생성과 연관되는 바이오마커에 관한 것이다. 인테그린 저해 활성이 있는 화합물의 스크리닝을 위한 상기 바이오마커의 용도가 또한 개시된다.

혈관생성은 일반적으로 이미 존재하는 혈관계로부터 새로운 혈관이 형성됨을 의미하는데 쓰인다. DNA 합성을 수반하는 내피 세포의 증식은 혈관생성적 미세혈관 발아의 공통된 특징인 한편, 광범위한 발아는 주로 내피 세포의 이주를 요구한다. 혈관생성은 다양한 혈관생성 인자 및 저해제에 의해 조정되는 본질적 과정이다. 내피 세포 증식 및 이주의 활성제는 주로 수용체 티로신 키나아제 리간드, 예컨대 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 및 표피 성장 인자 (EGF) 이나, 또한 매우 상이한 기원, 예컨대 리소포스파틱 기원 (LPA) 의 것일 수 있다 (Bergers et al. (2003) Nature Reviews 3, p.401-410). EGF 는 VEGF, FGF 및 인터루킨-8 (IL-8) 을 상향조절하는 한편, LPA 는 VEGF 수준을 상향조절한다. 최초로 기술된 혈관생성 저해제는 프롬보스폰딘-1 이며, 이는 내피 세포 증식 및 운동성을 조정한다. 주목할 만하게는, 많은 저해 분자, 예컨대 스타틴이 혈관생성에 대한 효과를 갖지 않는 더 큰 분자로부터 유래한다; 예를 들어 안지오스타틴 (ATP 신타아제 및 아넥신 III 에 결합하는 플라스미노겐의 조각) 뿐만 아니라 엔도스타틴, 툼스타틴 및 칸스타틴 (인테그린에 결합하는 콜라겐의 조각). 일반적으로, 활성제 및 저해제의 수준은 내피 세포가 휴지 상태 또는 혈관생성 상태일지 여부를 지시한다. 혈관생성 균형의 변화가 혈관생성 전환을 매개하는 것으로 여겨진다.

그것의 생리적 역할은 세포, 조직 및 기관의 발달, 생식 및 복구이다. 병적 혈관생성은 종양 및 종양의 미시적 크기를 넘어서 성장하는 전이에 필수적이고, 출혈, 혈관 유출 및 조직 파괴를 야기할 수 있다. 병적 혈관생성의 결과는 직간접적으로 광범위한 혈관생성 연관 질환과 관련되는 증상, 무능력화 또는 사망의 원인이 될 수 있다. 그러한 질환의 예는 특히 종양 질환, 자가면역 질환, 황반 변성 및 죽상동맥경화증을 포함한다.

종양 진행과 관련하여 혈관생성 전환은 종양 유형 및 환경에 따라 종양 진행 경로 상의 상이한 단계에서 일어날 수 있다. 그러나, 혈관신생은 보통 종양 진행의 전제조건이다.

여러 신호전달 경로가 혈관생성의 과정에 관여한다. VEGF 는 혈관형성 및 혈관생성에서 중추적 역할을 한다; 모든 혈관생성 인자 중에서, VEGF 가 종양 진행 및 전이에 가장 빈번하게 연관된다. 예비적 증거는 다양한 동형의 과발현이 종양에 상이한 효과를 미칠 수 있음을 시사한다.

종양 연관 혈관생성에서 핵심 단계는 내피 세포 상의 뉴로필린 및 수용체 VEGFR2 에 결합하는 종양 세포에 의한 VEGF 의 분비를 포함한다 (Folkman 2007, Nature Reviews, 6, p.273-286). 그것은 종양으로부터의 적어도 6 개의 다른 혈관생성 촉진 인자 중 가장 흔하다. 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 는 종양 세포로부터, 그러나 또한 VEGF-자극된 세포에 의해 방출된다. MMP 는 스트로마로부터 혈관생성 촉진 단백질을 동원하나, 또한 혈관 벽 중 콜라겐 18 로부터 혈관생성 저해제 엔도스타틴을 절단하고, 순환성 플라스미노겐으로부터 혈관생성 저해제 안지오스타틴을 절단하는데 참여한다. 종양 세포는 내피 TIE2 수용체에 대한 결합에서 ANGPT1 과 경쟁하는 안지오포이에틴 2 (ANGPT2) 를 분비한다. 안지오포이에틴 1 (ANGPT1) 은 많은 세포에 의해 발현되고, 내피 TIE2 (TEK 로도 알려짐) 수용체에 결합하고, 혈관 중 정상화된 상태를 유지하는 것을 돕는다. ANGPT2 는 혈관 기저 막의 붕괴 및 내피 세포의 이주를 증가시키고, 그러므로 발아 형성을 촉진한다. PDGF 는 많은 종양에 의해 분비되고, 내피 세포 상의 그 자신의 수용체 (PDGFR) 를 상향조절할 수 있다. 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 는 다른 종양에 의해 분비된다. 성장 조절제 예컨대 VEGF 및 bFGF 에 반응하여 내피 세포는 특정 인테그린을 상향조절한다. 인테그린은 세포 표면 부착 분자로서, 세포외 환경에 대한 내피 부착을 촉진하는데, 이는 세포가 생활력 및 성장 조절 단백질에 대한 반응성을 유지하기 위한 필요조건이다. 내피 세포는 가장 부착 의존적인 세포이다. 인테그린은 종양을 향해 이주하는데 요구되는 간헐적 탈착 동안 내피 세포 생활력을 지속시키고, 성장 조절제 예컨대 VEGF 및 bFGF 에 대한 그들의 감수성을 증가시키는 것으로 여겨진다.

인테그린은 종양 혈관생성 및 전이, 및 여러 다른 혈관생성 의존적 인간 질환 예컨대 건선 및 류마티스 관절염에서 핵심적 역할을 한다 (Mousa SA, Drugs of the Future 1998; 23(1):51-60). 인테그린은 세포외 환경을 세포골격에 연결시키는 세포 표면 부착 분자이다 (Geiger B. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2:793-805). 구조적 기능에 더하여, 인테그린은 세포 부착, 이주, 증식 및 생존에 중요한 신호를 전달하는 수용체이다.

인테그린에 의해 유도되는 신호전달 사건은 다중적이고 세포 상황에 의존적이다. 세포외 인테그린 도메인에 대한 리간드 결합은 입체형태 변화 및 인테그린 집락화를 유도하여 신호전달 캐스캐이드의 활성화 및 국소적 부착으로의 다중단백질 복합체의 동원을 초래한다 (Geiger B. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2:793-805). 메시지는 다양한 세포내 단잭질 키나아제 및 아답터 분자 예컨대 Ras, MAP 키나아제 (MAPK), 국소 부착 키나아제 (FAK), Src, Rac/Rho/cdc42 GTPase, PKC 및 PI3K 를 통해 전달된다. 이들 분자를 통해, 인테그린 신호전달은 수용체 티로신 키나아제 신호전달과 긴밀하고 협력적으로 상호작용하여 생존, 증식, 부착 및 이주를 조절한다 (Giancotti FG. et al., Science 1999; 285(5430):1028-32).

인테그린은 2 개의 서브유닛, 알파 및 베타로 이루어지는 이종이량체를 형성한다 (Hynes RO. Trends Cell Biol 1999; 12: 33-37). 인테그린은 다양한 세포 유형에서 차등적으로 발현되고, 세포외 매트릭스 단백질의 다수의 리간드 예컨대 콜라겐, 비트로넥틴, 피브로넥틴 및 라미닌을 인식한다. 알파(V)베타(3) 및 알파(V)베타(5) 를 포함하는 인테그린의 부분집합은 그들의 리간드 중 공통의 모티프, RGD 서열 (비트로넥틴, 피브로넥틴, 피브리노겐과 같은 리간드 중 존재함) 을 인식한다 (Ruoslahti E. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1996. 12: 697-715).

αvβ5 인테그린은 비트로넥틴에 특이적으로 결합하고, 한편 αvβ3 은 또한 임시적 ECM 의 다른 거대분자에 결합한다. αvβ3 은 예를 들어 리간드 예컨대 피브린, 피브리노겐, 라미닌, 트롬보스폰딘, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자, 오스테오스폰틴 및 뼈 시알로단백질 I 에 결합한다. 조직 중 많은 세포 상호작용에 있어서 이들 인테그린의 특이적 세포 부착의 역할은 여전히 연구 중에 있으나, 상이한 생물학적 기능이 있는 상이한 인테그린이 존재한다는 것은 명백하다.

αvβ3 은 활성화된 내피 세포, 예컨대 종양 내피 세포에서는 고도로 발현되나, 휴지기 내피 세포 및 대부분의 정상적 기관 시스템에서는 그렇지 않으므로, αvβ3 은 항-혈관생성 요법에 대한 적합한 표적이 될 수 있다 (Brooks PC et al., Science 1994; 264:569-71). αvβ3 은 최초에 암에서 악성 흑색종에 대한 진행-의존적 마커로서 주목되었다. αvβ3 은 생체내 흑색종 성장 및 시험관내 생존을 증강시켰다. αvβ3 차단제는 이들 효과를 역전시켰다. 그 후, αvβ3 은 다른 종양 예컨대 교아세포종, 신장 암종, 난소 암종 등에서 발견되었다. αvβ3 은 또한 많은 악성종양의 EC 에서 광범위하게 과발현되었다. 시험관내에서, 종양-유래 성장 인자에 의해 활성화된 혈관생성 모델은 발아 혈관계 상에서 αvβ3 을 과발현시키고 요구했으며, 한편 αvβ3 및 αvβ5 차단은 혈관생성 표현형을 억제할 수 있었다. 또한, αvβ5 는 일부 종양-유래 성장 인자에 의해 유도되는 신생혈관계를 지지하는 것으로 밝혀졌다. αvβ5 의 저해는 종양 세포의 어팝토시스를 유발할 수 있다.

인테그린 저해제는 특히 주로 혈관생성 연관 장애의 예방 및 치료를 위한, 인간 및 동물 의약 중 제약적 활성 성분으로서 제안되어왔다. 인테크린 저해제는 순환, 혈전증, 심근경색증, 동맥경화증, 염증, 중풍, 협심증, 종양 질환, 골용해 장애, 특히 골다공증, 혈관생성 및 혈관생성으로 초래되는 장애 예를 들어 눈의 당뇨병성 망막증, 황반변성, 근시, 안구 히스토플라스마증, 류마티스 관절염, 골관절염, 신생혈관 녹내장, 및 또한 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 건선 및 혈관성형술 후의 재협착의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

암, 관절염 및 건선의 치료를 위한 임상 개발에서 여러 인테그린 저해제, 예컨대 실렌지타이드 (cilengitide), abegrin (vitaxin, MEDI-522), CNTO95, DI-17E6 및 volociximab 이 존재한다 (Nemeth JA et al., Cancer Invest. 2007; 25(7): 632-646). 이들은 세포외 매트릭스 (ECM) 와의 인테그린 상호작용에 대항하고, 내피 및 종양 세포의 기능을 교란시킨다. 상기 인테그린 저해제는 작용의 메카니즘 및 독특한 특이성이 특징이다. Abegrin, volociximab, DI-17E6 및 CNTO95 는 모노클로날 항체 대항제이다.

실렌지타이드는 RGD-모티프를 모방하는 대항적 시클릭 펩티드 (시클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)) 이다 (EP 0770622). 실렌지타이드는 αv-인테그린, 특히 αvβ3 및 αvβ5 를 표적화한다.

US6521593 은 실렌지타이드를 α_vβ₃/α_vβ₅ 인테그린 저해제로서 사용하여, 뇌에서 종양 성장을 저해하는 방법을 개시한다. 그 발명은 상기 인테그린 저해제가 항-혈관생성에 의존하는 항-종양생성 효과를 나타내는 것을 포함한다. 또한 상기 인테그린 대항작용은 항-혈관생성으로부터 독립적인 직접적 종양 세포사를 유도할 수 있다. WO02/41910 은 혈관생성으로부터 초래되는 환자의 눈 질환의 치료를 위한 α_vβ₃/α_vβ₅ 인테그린 저해제로서의 실렌지타이드의 용도에 관한 것이다.

모노클로날 마우스 항체 17E6 은 인간 인테그린 수용체 보유 세포의 αv-인테그린 서브유닛을 특이적으로 저해한다. 마우스 IgG1 항체는 예를 들어 Mitjans et al. (1995; J.Cell Sci. 108, 2825) 및 특허 US 5,985,278 및 EP 719 859 에 의해 기술된다. 쥐 17E6 은 정제된 세파로오스-고정 인간 αvβ3 으로 면역화된 마우스로부터 생성되었다. 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구는 쥐 골수종 세포와 융합되었고, 생성된 하이브리도마 클론 중 하나가 모노클로날 항체 17E6 을 생산했다. DI-17E6 (CAS No: 1105038-73-0) 은 모노클로날 마우스 항체 17E6 의 생물학적 특성을 갖지만 인간에서의 면역원성에 관하여 무엇보다 개선된 성질을 갖는 항체이다. 이 개질 항체의 완전한 가변 및 불변 아미노산 서열이 도 1 및 WO 2009/010290 에 제시되어 있다.

예를 들어 VEGF 및 VEGFR 에 대한 티로신 키나아제 저해제가 항-혈관생성 요법에 사용하기 위한 용도로 개발되었다. VEGFR 의 티로신 키나아제 저해제는 VEGFR 의 티로신 키나아제 도메인의 ATP-결합 촉매 자리에 결합하여 세포내 신호전달의 차단을 초래하는 저분자량 ATP-모방 단백질이다 (Morabito et al 2006 The Oncologist 11: 753-764). 이들 물질 중 여럿이 현재 임상 개발의 상이한 단계에 있다. 대규모 무작위 제 II 상 시험은 각각 표준 요법에 불응성인 위장관기질종양 (GIST) 및 신장 암에 걸린 환자의 치료에 있어서 수니티니브 (sunitinib) 및 소라페니브 (sorafenib) 의 효능을 입증했다.

수니티니브 (SU011248) 는 강력한 항혈관생성 및 항종양 활성을 나타내는 경구 소분자 티로신 키나아제 저해제이다 (O`Farrell AM et al., 2003. Blood 101: 3597-3605). 수니티니브는 소분자 ATP 자리 지향성 경쟁적 저해제이다. 티로신 키나아제 저해제 예컨대 SU6668 및 SU5416 (semaxanib) 은 불량한 약리적 성질 및 제한된 효능을 나타냈다: 그러므로, 수니티니브는 항혈관생성 수용체 티로신 키나아제 (RTK)-혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 에 대한 나노몰농도 범위 잠재능 및 높은 생체이용률 때문에 선택되고 합리적으로 고안되었다. 수니티니브는 다수의 악성종양 예컨대 소세포 폐암, GI 간질 종양 (GIST), 유방암, 급성 골수성 백혈병, 다발성 내분비 신생물 유형 2A 및 2B, 및 가족성 수질 갑상선 암종에 관여하는, 다른 티로신 키나아제 예컨대, KIT, FLT3, 콜로니-자극 인자 1 (CSF-1), 및 RET 를 저해한다. 수니티니브는 VEGFR 및 PDGFR 인산화의 저해와 연관되었던, 대장암, 비소세포 폐암, 흑색종, 신장 암종 및 편평세포암종의 모델에서 종양 성장 저해 뿐만 아니라 종양 퇴행을 초래한 임상전 연구에서 강건한 항종양 활성을 나타냈다. 임상적 활성은 제 II 상 연구에서 신경내분비, 대장 및 유방암에서 입증되었고, 한편 명확한 효능은 진행성 신장 세포 암종 및 imatinib-불응성 GIST 에서 입증되어, 이들 2 가지 질환의 치료에 대해 수니티니브의 미국 식품 및 의약국 승인을 초래했다. 다양한 종양 유형에서 수니티니브 단독으로 및 화학요법과 조합하여 조사하는 연구가 현재 진행중이다. RTK 의 스플릿-키나아제 도메인 패밀리의 일원의 이러한 소분자 저해제의 임상적 벤치마킹은 생물학, 잠재적 바이오마커, 및 종양, 간질, 및 내피 구획 중 다중 신호전달 경로를 표적화하는 물질의 임상적 유용성과 관련된 부가적 통찰을 초래할 것이다.

소라페니브는 처음에는 Raf 키나아제 신호전달의 특이적 저해제로서 개발되었던, 신규한 bi-아릴 요소이다 (Morabito et al 2006 The Oncologist 11: 753-764). 그 뒤의 연구는 이 화합물이 종양 진행에 관여하는 여러 다른 티로신 키나아제, 예컨대 VEGFR 을 또한 저해하는 것을 밝혔다. 소라페니브로 처리된 대장, 유방, 및 비소세포 폐암 (NSCLC) 의 이종이식 모델은 종양 혈관생성의 유의미한 저해 (항-CD31 면역염색으로 측정됨) 를 나타냈다. 대규모 제 II 상 무작위 시험이 상이한 유형의 종양 환자에서 소라페니브로 수행되었다. 결과가 진행성 신장 세포 암종 환자 202 명에 대해 보고되었다. 그 뒤의 무작위, 플라시보 대조군, 제 III 상 시험은 사이토카인-불응성 진행성 신장 암종 환자에서 소라페니브의 효능을 확인했다. 소라페니브는 좋은 내약성을 나타냈고, 하기 관리가능한 부작용을 초래했다: 발진 (34 %), 설사 (33 %), 수족 피부 반응 (27 %), 피로 (26 %) 및 고혈압 (11 %). 상기 결과에 기초하여, FDA 는 2005 년 12 월에 진행성 신장 암 환자에 대해 소라페니브의 승인을 발표했다. 더욱이, 유럽 위원회는 최근 간세포 암종의 치료에 대해 소라페니브에게 희귀 의약품 자격을 인정했다. 제 II 상 시험에서, 소라페니브로 처리된 43 % 의 환자가 4 달 이상 동안 안정적 질환을 경험했고, 추가적 9 % 의 환자가 종양 위축을 경험했다. 현재, 제 III 상 임상 시험이 간세포 암종, 전이성 흑색종 및 NSCLC 에서 소라페니브의 효능을 평가하고 있고; 더욱이, 약물의 치료 잠재력을 최대화하기 위해, 진행성 고체 종양에서 여러 화학처리 (irinotecan, dacarbazine) 또는 분자 표적화 (gefitinib) 물질과 조합된 소라페니브에 대해 여러 다른 제 I/II 상 연구가 현재 진행 중이다.

항-혈관생성 요법은 예를 들어 종양에서 활성화된 혈관 내피 세포를 주로 표적화한다. 항-혈관생성 요법은 이를 상기 기술된 바와 같이 인테그린의 저해를 통해 내피 세포가 환경에 반응하는 것을 방지함으로써 직접 달성할 수 있다. 항-혈관생성 요법은 또한 베바시주맙 (bevacizumab) 이 그러하듯이 혈관생성 인자의 중화에 의해 작용할 수 있다 (하기 참조).

예를 들어 혈관생성 인자의 유전적 변이는 혈관생성-연관 질환의 임상적 치료에 중요한 결과를 낳는다. 예를 들어, 다운 증후군이 있는 개체는 엔도스타틴 전구체 유전자의 추가의 카피 때문에 정상적 개체보다 1.6 배 더 높은 수준의 엔토스타틴을 갖는다. 그들은 모든 인간 중에서 암에 대해 가장 잘 보호되는 것으로 보인다. 그러므로, 유전적 변이로 인한 혈관생성의 차이가 항-혈관생성 요법에서 고려되어야 한다.

항-혈관생성 요법은 내피 세포가 항정 상태 혈액 수준의 저해제에 노출될 것을 최적으로 요구할 것이다. 그러므로, 종종 도우징 (dosing) 은 시클로폴리펩티드 저해제 예컨대 실렌지타이드에 대해 최적일 것이다. 그러나, 모노클로날 항체 예컨대 D7E16 은 항체가 오래 지속되므로 더 긴 간격으로 투여될 것이다.

특히 모노-항-혈관생성 요법이 오직 하나의 혈관생성 단백질 (예를 들어 VEGF) 을 표적화하는 경우, 종양은 항-혈관생성 요법에 대해 불응성으로 변할 것이다. 항-VEGF-요법 (예컨대 VEGF 에 대한 항체 베바시주맙) 으로, 초기 종양의 혈관계가 감소하고 종양 성장이 제한된다. 그러나, 후향적 분석에서 베바시주맙에 의한 전이성 종양의 계속된 항-혈관생성 처리는 유익을 초래하지 않았다. VEGF 는 60 % 이하의 인간 종양에 의해 발현되지만, 대부분의 종양은 5 내지 8 개의 다른 혈관생성 단백질을 또한 발현할 수 있다. 발현이 장시간 동안 억제되는 경우, 또다른 혈관생성 단백질의 발현이 나타날 것이다 (Dorrell et al (2007) Proc. Natl. Acad. Sci doi:10.1073/ pnas.0607542104).

그러므로, 상기 기술된 이유로 연관된 신호 경로를 밝히는 감수성 특이적 바이오마커의 패널 (panel) 은 항-혈관생성 요법의 선택을 보조할 수 있었다. 게다가, 상기 패널은 미시적 재발성 종양을 심지어 해부학적 위치결정 전에 진단하는 것을 지지할 것이다.

게다가, 불량하게 혈관 발달된 종양은 고도로 혈관 발달된 종양에 대해 요구되는 것보다 상당히 더 낮은 투여량의 혈관생성 저해제에 의해 저해될 것이다. 이들 종양은 고유의 혈관생성 저해제를 발현할 것이고, 더 낮은 투여량의 혈관생성 저해제에 반응할 것이다.

예를 들어 광범위한 종양 유형에서 유전적 변이 및 다양한 혈관생성 과정 및 그들의 발달은 특히 항-혈관생성 요법을 최적화하고 개별화하는 정보적 바이오마커의 넓은 패널을 요구한다.

혈관생성 기재 바이오마커를 사용하여 비신생물성인 특정 혈관생성 의존적 질환의 진행 또는 퇴행을 모니터링하는 것이 또한 가능할 것이다. 이들은 특히 예를 들어 죽상경화증, 자궁내막증, 크론병 및 류마티스 관절염을 포함한다.

발명의 요약

본 발명은 항-혈관생성 치료제가 정보적 분자 바이오마커를 요구하는 다양한 실험에 기초한다 (Bertolini F et al. Drug Discov Today. 2007; 12(19-20):806-12). 상기 바이오마커는 바람직하게는 예를 들어 하기에 사용될 수 있다:

(1) 표적에 대한 약물 효과의 약역학적 (PD) 종말점 및 분자 표적 상태의 측정,

(2) 혈관생성 연관 경로의 식별,

(3) 개별 환자에 대한 가장 적당한 항-혈관생성 약물의 발견,

(4) 표적 조정에 대한 개념 증명의 제공,

(5) 기초 가설의 시험,

(6) 항-혈관생성 요법의 투여량 및 일정의 합리적 선택의 제공,

(7) 임상 결과의 설명 또는 예측.

분자 암 치료제 예컨대 trastuzumab 및 imatinib 의 많은 성공에도 불구하고, 임상에 들어가는 종양 약물 중 오직 소수만이 시판 승인을 받는다. 분자 바이오마커의 사용은 이러한 높은 수준의 소모를 감소시킴으로써, 약물 개발 비용을 감소시키고, 암 환자에게 혁신적인 활성 약물을 제공할 가능성을 증가시킬 것이다.

이들 분자 바이오마커는 세포 바이오마커에 의해 제공되는 정보를 보완할 수 있다. 세포 바이오마커는 예를 들어 혈관생성에 대한 마커로서 사용되는 상이한 내피 세포 집단 예컨대 순환 내피 세포 및 순환 내피 전구세포이다. 분자 바이오마커는 세포 바이오마커의 단점 예컨대 내피 세포 집단의 대상 계수를 보상할 수 있다. 상기 세포 바이오마커의 사용은 암 관련 내피의 특성화에서 훨씬 더 많은 작업을 요구한다 (Bertolini et al (2007) Drug discovery today 12, 806-812). 또한 혈관생성의 측정에 대한 접근으로서 이미징 기술 예컨대 동적 대비 자기 공명 이미징 (DCE-MRI) 은 일상적 적용에 약간 강한 제한을 갖는다. 이들 기술은 비용이 많이 들고, 충분한 장비를 갖춘 센터에 제한된다.

본 발명은 혈관생성 관련 질환, 바람직하게는 암에 걸린 환자의 치료용 혈관생성 저해제, 바람직하게는 인테그린 저해제 또는 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제인 치료제 또는 약물의 효과, 효능, 안전성, 예후 및/또는 투여량을 평가하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 그와 같이 혈관생성에 대한 혈관생성 저해제 바람직하게는 인테그린 저해제 또는 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포 기반 모델에서 인테그린 조정 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

첫번째 양상에서, 본 발명은 특이적 정보적 분자 바이오마커에 의해 혈관생성에 대한 혈관생성 저해제, 바람직하게는 인테그린 또는 ATP 자리 지향성 멀티키나아제 저해제의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다. 그럼으로써, 본 발명은 특히 바람직하게는 항-혈관생성 요법의 맥락에서 개체에게 적용되는 혈관생성 저해제의 효능을 평가할 필요에 기초한다. 상기 항-혈관생성 요법은 배경기술 부분에 기술되어 있는 혈관생성 연관 질환을 치료하기 위해 적용될 것이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 혈관생성, 바람직하게는 인테그린 관련 질환을 앓는 환자의 진단 및 치료에 있어서 상기 저해제의 효능을 측정 및 예측하기 위한 상기 정보적 분자 바이오마커의 용도에 관한 것이다.

항-혈관생성 요법의 맥락에서 개체에게 투여되는 혈관생성 저해제의 효능을 평가할 정보적 분자 바이오마커의 확립에서 고려되어야 하는 상이한 힌트가 존재한다.

예를 들어, 항-혈관생성 요법은 상이한 종류의 혈관생성 연관 질환을 앓는 개체에게 투여될 것이고 상이한 종류의 조직 및/또는 기관이 상기 질환에 관련되므로, 분자 바이오마커의 분석을 위한 충분한 생검를 수득하는 것이 곤란하거나 의학적 이유로 심지어 가능하지 않다. 더욱이, 혈관생성 저해제가 예를 들어 개체에서 전이 종양을 표적화하는데 사용되는 경우, 상기 저해제의 효과를 분석하기 위해 다양한 표적 조직의 상이한 생검이 필요할 것이다. 그러므로, 혈관생성 저해제에 의한 처리로 인한 혈관생성 의존적 종양 진행의 평가는 특정 상이한 조직 샘플을 요구할 것이다.

게다가, 혈관생성은 새로운 혈관의 형성에 의존하고, 많은 혈관생성 단계가 순환 중인 단백질을 수반하므로, 항-혈관생성 요법의 성공은 특정 조직 내 분자 바이오마커의 출현 또는 소멸의 분석에 의해 평가될 수 없다.

따라서, 바이오마커로서 순환 단백질의 사용은 항-혈관생성 요법의 성공에 관한 정보를 제공할 것이다. 상기 순환 단백질은 체액 중 탐지가능할 것이므로, 논의된 힌트를 극복하는데 유리할 수 있다. 단일 선택된 혈관생성 성장 인자 예컨대 VEGF, bFGF 및 PLGF 가 특정 항-혈관생성 요법의 투여 후 혈액 혈장 중 분석되었다 (Jubb et al. 2006, Nature Reviews, 6, 626-635). 그러나 혈액 혈장 중 혈관생성 성장 인자의 의미있는 평가는 혈소판 및 다른 세포로부터 많은 성장 인자의 능동적 흡수로 인해 제한된다. 게다가, 종양 세포는 상기 혈관생성 성장 인자를 뚜렷한 수준으로 발현한다. 또한, 혈관생성의 복잡성 및 단백질 순환의 복잡성으로 인해, 샘플 중 소수의 단일 바이오마커의 평가는 항-혈관생성 요법을 평가하는데 효율적이지 않다. 그러므로, 바람직하게는 상이한 단백질 패밀리에 속하고 상이한 방식으로 혈관생성 또는 연관되는 신호전달 경로에 관여하는 특정 분자 바이오마커의 패널은 항-혈관생성 약물의 모니터링에 있어서 충분한 도구의 결여를 보완할 것이다.

본 발명은 바람직하게는 혈관생성 저해제의 개체로의 투여로 인해 그리고 선택적 표적에 대한 이의 결합으로 인해 조직 세포로부터 그들의 환경으로 분비되는 특정 분자 바이오마커에 관한 것이다. 바람직하게는, 이들 분자 바이오마커는 조직 세포로부터 그들의 환경으로 분비될 수 있고, 그 결과 그들은 체액 중 탐지가능하지 않을 수 있다. 따라서, 상기 혈관생성 저해제로 처리된 개체로부터의 체액이 바람직하게는 분자 바이오마커의 분석에 사용되었다.

본 발명에 따라 혈관생성 관련 수용체, 바람직하게는 인테그린 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 및 이들 수용체의 저해제에 반응성인 것으로 밝혀진 바이오마커는 하기와 같다:

일부 특이적 혈관생성 저해제의 처리에 대한 반응성과 관련하여 본 발명에 따라 바람직한 바이오마커는 하기이다:

ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, CD40 리간드, 및 IL6.

본 발명에 따라 가장 바람직한 바이오마커는 ADAMTS1, STC1, EDN1, 및 IL8, 또는 그의 조합이다.

바람직한 구현예에서, 분자 바이오마커는 체액 예컨대 혈액 및 혈액 혈장, 림프, 액 및/또는 소변에서 탐지될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 분자 바이오마커는 혈액 및/또는 소변에서 탐지될 수 있다. 혈액 및 소변은 비침습적 방식으로 채취될 수 있으므로, 이 경우 바이오마커는 용이하게 조사될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 혈관생성 저해제는 인테그린 저해제로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 저해제는 알파 (v) 인테그린 저해제로부터 선택된다.

특히 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 저해제는 DI-17E6 또는 그의 유도체 및/또는 실렌지타이드 (시클로-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)) 로부터 선택된다. 그렇게 함으로써, 추정 치료 유효량의 DI-17E6 또는 그의 유도체 및/또는 실렌지타이드로 처리된 개체로부터 수득된 체액에서 분자 바이오마커가 분석될 수 있다.

또다른 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 저해제는 내피 세포 상의 인테그린에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 분자 바이오마커는 상기 내피 세포에서 상향조절되고 더 많은 양으로 내피 세포의 환경으로 분비될 것이다. 또다른 경우에, 상기 바이오마커의 분비는 상기 저해제에 의한 처리로 인해 시작된다. 내피 세포의 환경은 혈관의 내강 및 인접 조직을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 분자 바이오마커는 내피 세포로부터 분비된 후 혈류에 도달한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 내피 세포에 대한 상기 인테그린 저해제의 특이적 결합으로 인해, 분자 바이오마커는 상기 내피 세포에서 하향조절되고 더 적은 양으로 내피 세포의 환경으로 분비된다. 또다른 경우에, 상기 바이오마커의 분비는 상기 저해제에 의한 처리로 인해 중단될 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 인테그린 저해제에 의한 처리로 인해 특정 체액 중 탐지될 수 있는 상기 분자 바이오마커는 단백질이다. 바람직하게는, 상기 단백질은 혈액 혈청의 가용성 단백질 또는 혈액 혈장에 포함된 단백질이다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 단백질은 주로 면역학 기반 기술 예컨대 웨스턴 블롯, Elisa, Luminex 및 관련 기술에 의해 탐지될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 상기 바이오마커 바람직하게는 단백질은 인테그린 저해제를 통한 처리에 반응하여 바람직한 체액 중 양적으로 증가 또는 감소된다. 바람직한 구현예에서, 다수의 시험에서 특징화된 인테그린 저해제의 처리로 인한 특정 바이오마커의 증가 또는 감소는 0.01 을 초과하지 않는 p-값에 의해 정의된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 상기 바이오마커 바람직하게는 단백질은 인테그린 저해제에 의한 처리에 반응하여 개질된다. 이들 변경은 단백질의 분자 크기 변화, 단백질의 개질 예컨대 당화 및 상이한 또는 동일한 단백질 서브유닛과의 상호작용을 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 양상에서, 상기 바이오마커의 변경된 유전자 발현은 RNA 수준에서 탐지될 수 있다. 그때문에, RNA 는 인테그린 저해체를 통한 처리에 반응하여 개체로부터 수득되는 조직 세포의 샘플로부터 추출될 것이다. 특정 바이오마커의 발현된 RNA 전사체는 따라서 알려진 유전자 발현 프로파일링 기술 예컨대 배열 기술에 의해 분석될 수 있다. 바람직하게는, RNA 추출을 위해 채취되는 조직 세포의 샘플은 내피 세포에서 유래한다.

바람직하게는, 항-혈관생성 요법에서 인테그린 저해제의 효능을 평가하는 방법은 먼저 추정 치료 유효량의 인테그린 저해제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 치료 유효량의 추정 및 결정은 예를 들어 이전의 전임상 및 임상 연구에 기초한다. 둘째로, 추정 치료 유효량의 상기 인테그린 저해제의 투여의 효능은 상기 본 발명의 방법에 의해 평가된다. 상기 평가의 사정이 내전되어 (adducted) 변경된 조건 하에 추가의 라운드 동안 혈관생성 요법을 반복한다.

본 발명의 하나의 구현예에 따라, 바이오마커는 바람직하게는 혈관생성과 연관되었던 후보이고, 인테그린 수용체에 연결되는 신호 경로에 관여할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 바이오마커는 인테그린 저해제의 투여 후 혈관생성을 차단하는데 관여할 수 있다. 또다른 양상은 상기 발명의 바이오마커의 군의 다양성에 관한 것이다. 바람직하게는, 바이오마커는 하나의 단백질 패밀리에서의 높은 서열 상동성으로 인해 분류될 수 없고, 작용기 예컨대 혈관생성 인자 VEGF, EGF 및 PLGF 등에서의 생리적 관련성으로 인해 분류될 수 없다.

본 발명의 또다른 양상에서, 항-혈관생성 약물 효과를 평가하기 위해, 바이오마커는 별도로, 상기 발명의 상이한 바이오마커와 조합되어 또는 본 발명 이외의 밝혀진 다른 혈관생성 바이오마커와 함께 사용될 수 있다.

또한, 샘플 예컨대 체액 중 단백질 수준의 측정에 의해 수득되는 분자 바이오마커 평가의 결과는 샘플 예컨대 내피 세포 중 RNA 수준의 측정에 의해 수득되는 유전자 발현 결과에 의해 달성될 수 있다. 상기 비교는 유용할 수 있는데 이는 단백질 전사체 형태의 분자 바이오마커가 예를 들어 특정 생리적 환경으로 인해 혈액 또는 소변 중 안정적이지 않기 때문이다.

본 발명의 두번째 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 분자 바이오마커에 의해 혈관생성 저해제의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다: 혈관생성 저해제의 투여 전에 개체로부터 조직 샘플을 수득하고, 채취되는 조직 샘플 세포로부터 바람직하게는 내피 세포가 제조되는 단계. 상기 세포는 규정된 실험실 조건 하에 시험관내 배양되고, 그 뒤에 혈관생성 저해제로 처리된다. 혈관생성 저해제에 의한 처리로 인해 바이오마커의 발현 및 분비는 변화될 것이다. 세포 배양 배지에서 상기 변화된 분비가 뒤따를 수 있다. 상세히, 혈관생성 저해제에 의한 처리로 인해 이들 분자 바이오마커는 상기 세포로부터 그들의 환경, 즉 배양 배지로 분비된다. 결과적으로 그들은 세포 배양 배지에서 탐지가능하다. 이 경우, 분자 바이오마커는 용이하게 조사되고 모니터링될 수 있는데, 이는 배양된 세포의 세포 배양 배지가 입수하고 취급하기 용이하기 때문이다.

바람직한 구현예에서, 분자 바이오마커는 내피 세포에서 상향조절되고 더 많은 양으로 내피 세포의 배양 배지로 분비될 것이다. 또다른 경우에, 상기 바이오마커의 분비는 상기 저해제에 의한 처리로 인해 시작될 것이다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 분자 바이오마커는 내피 세포에서 하향조절되고, 더 적은 양으로 내피 세포의 배양 배지로 분비된다. 또다른 경우에, 상기 바이오마커의 분비는 상기 저해제에 의한 처리로 인해 중단될 것이다.

상기 단계에 의해 특징화되는 방법은 바람직하게는 인테그린 저해제로부터 선택되는 혈관생성 저해제를 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 저해제는 알파 (V) 인테그린 저해제로부터 선택된다.

특히 바람직한 구현예에서, 상기 인테그린 저해제는 DI-17E6 또는 그의 유도체 및/또는 실렌지타이드로부터 선택된다. 그렇게 함으로써, 추정 유효량의 DI-17E6 또는 그의 유도체 및/또는 실렌지타이드로 처리된 내피 세포로부터 수득된 세포 배양 배지에서 분자 바이오마커가 분석될 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 인테그린 저해제를 통한 처리로 인해 상청액에서 탐지될 수 있는 상기 바이오마커는 상기 기술된 바와 같은 단백질이다.

본 발명의 목적을 위해 상기 바이오마커 바람직하게는 단백질은 인테그린 저해제를 통한 처리에 반응하여 내피 세포 샘플의 상청액에서 양적으로 증가 또는 감소된다. 바람직한 구현예에서, 특정 시험에서 특징화된 인테그린 저해제의 처리로 인한 특정 바이오마커의 증가 또는 감소는 0.01 을 초과하지 않는 p-값에 의해 정의된다.

본 발명의 또다른 양상에서 세포 배양 배지에서 탐지되는 상기 분자 바이오마커 바람직하게는 단백질은 상기 기술된 바와 같이 개질된다.

본 발명의 또다른 양상에서 인테그린 저해제를 통한 처리로 인한 상기 바이오마커의 유전자 발현의 변화는 내피 세포로부터의 RNA 의 추출에 의해 RNA 수준에서 탐지될 수 있다. 특정 바이오마커의 발현된 RNA 전사체는 따라서 알려진 유전자 발현 프로파일링 기술 예컨대 배열 기술에 의해 분석될 수 있다.

상기 기술된 상기 세포 배양 시스템에서 혈관생성에 대한 인테그린 저해제의 효과를 평가하는 방법은 먼저 추정 치료 유효량의 인테그린 저해제를 내피 세포에 투여하는 것을 포함한다. 추정 치료 유효량의 결정은 예를 들어 이전의 임상전 및 임상 연구에 기초한다. 둘째로, 추정 치료 유효량의 상기 인테그린 저해제의 투여 효과는 상기 발명에 기술된 분자 바이오마커에 의해 분석된다. 항-혈관생성 요법의 반복 또는 측정을 위해 상기 평가의 사정은 내전된다.

또다른 양상에서, 상기 기술된 상기 세포 배양 시스템에서 혈관생성에 대한 인테그린 저해제의 효과를 평가하는 방법은 먼저 탐색적 양 (explorative amount) 의 인테그린 저해제를 내피 세포에 투여하는 것을 포함한다. 탐색적 양의 결정은 예를 들어 이전의 임상전 및 임상 연구에 기초한다. 둘째로, 탐색적 유효량의 상기 인테그린 저해제의 투여 효과는 상기 발명에 기술된 분자 바이오마커에 의해 분석된다. 상기 분석의 평가는 추가의 임상전 또는 임상 연구를 위해 내전된다.

본 발명의 하나의 구현예에 따라 세포 배양 배지에서 측정되는 분자 바이오마커는 바람직하게는 상기 기술된 후보이다.

본 발명의 또다른 양상에서, 항-혈관생성 약물 효과를 평가하기 위해, 바이오마커는 별도로, 상기 발명의 상이한 바이오마커와 조합되어, 또는 본 발명 이외의 밝혀진 다른 혈관생성 바이오마커와 함께 사용될 수 있다.

또한, 세포 배양 배지 중 단백질 수준의 측정에 의해 수득되는 분자 바이오마커 평가의 결과는 세포 배양 세포의 RNA 수준의 측정에 의해 수득되는 유전자 발현 결과에 의해 달성될 수 있다.

또한, 분자 바이오마커에 의한 혈관생성 저해제 효과의 평가는 인테그린 저해제로 처리된 개체로부터 수득되는 조직 샘플 또는 심지어 체액 및 인테그린 저해제에 의해 처리된 상기 기술된 세포 배양 샘플 또는 심지어 그의 세포 배양 배지의 조합된 분석에 의해 수행될 수 있다.

추가의 양상에서, 인테그린 저해제의 항-혈관생성 효과 및 혈관생성 연관 질환에 대한 상기 저해제의 효능을 평가하기 위한 본원에서 기술된 방법은 또한 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 항-혈관생성 효과 및 혈관생성 연관 질환에 대한 상기 저해제의 효능을 평가하기 위해 적용될 수 있다.

바람직한 구현예에서 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제는 표적 키나아제의 촉매 활성 자리에 국소화되어 있는 표적 키나아제의 ATP-결합 자리에 결합하고 이를 모방한다.

상기 멀티 키나아제 저해제의 표적 키나아제는 바람직하게는 상이한 수용체 티로신 키나아제 예컨대 VEGFR, PDGFR, KIT, FLT3, CSF-1 및 RET 뿐만 아니라 세린/트레오닌 세포내 키나아제 RAF 를 포함한다.

특히 바람직한 구현예에서, 소분자 ATP 자리 멀티 키나아제 저해제는 수니티니브 및/또는 소라페니브이다.

또한, 분자 바이오마커에 의해 혈관생성 저해제 효과를 평가하는 상기 발명의 모든 방법 및 그의 용도는 배경기술에 기술되어 있는 혈관생성-연관 질환의 예방 및 치료에 유익할 수 있다.

추가의 양상에서, 본 발명은 상기 발명의 분자 바이오마커의 사용에 의해 광범위한 항-혈관생성 약물의 효과를 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 바이오미커는 상기 발명의 항-혈관생성 약물에 포함되거나 이에 관련되지 않는 혈관생성에 대한 다른 항-혈관생성 약물의 효과를 평가하는데 사용될 수 있다.

또다른 양상에서, 혈관생성 요법의 맥락에서 혈관생성 약물의 평가를 위한 상기 바이오마커의 용도 외에, 그들은 또한 초기 발견에서 관심의 대상일 수 있다.

본원에 기술된 방법은 하기 방식으로 항-혈관생성 요법의 성공에 관한 정보를 제공할 수 있다. 상기 방법은 혈관생성 연관 질환을 앓는 환자에게 투여되는 항-혈관생성 약물의 유효량 및/또는 유효 일정을 탐색하고 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 상세히, 예를 들어 혈관생성-연관 질환을 앓는 환자를 항-혈관생성 약물 예를 들어 인테그린 저해제에 의해 효과적일 것으로 추정되는 초기 투여량으로 처리하는 것을 포함하는 항-혈관생성 요법의 효능이 상기 발명의 방법에 의해 평가될 수 있다. 상기 항-혈관생성 요법의 효능이 예를 들어 낮아 보이는 경우, 상기 환자에게 변경된 조건 예컨대 투여량 및/또는 투여 일정 및/또는 항-혈관생성 약물의 선택의 변화가 적용될 수 있다. 상기 발명의 방법은 변경된 항-혈관생성 요법 조건으로 인해 상기 환자에 대한 최적 개체 요법이 발견될 때까지 추가의 라운드 동안 반복될 수 있다.

또다른 바람직한 양상에서, 항-혈관생성 질환을 앓는 환자에게 투여되는 항-혈관생성 약물의 초기 투여량이 상기 발명의 방법에 의해 효과적인 것으로 평가되는 경우, 변경된 조건은 투여량의 감소 또는 일정의 확장을 포함할 수 있다. 개체에게 투여되는 화합물, 조성물, 물질 및 요법의 투여량 감소의 유익은 더 높은 투여량과 연관되는 유해 효과 발생의 감소를 포함한다. 청구되고 실시예에서 더욱 상세히 기술되어 있는 방법의 결과로서, 상기 요법은 현재의 약물을 변화시키고 그것을 더욱 분명한 바이오마커 패턴을 야기하는 또다른 약물로 대체할 수 있다.

상기 바이오마커는 또한 내피 세포 항상성 또는 혈관생성을 일반적으로 연구하는데 사용될 수 있다. 상기 바이오마커의 평가는 상기 생리적 과정을 더 잘 이해할 수 있는 실험에서 정보를 제공할 것이다.

본 발명의 또다른 양상에 따르면, 본 발명은 잠재적 인테그린 조정 활성이 있는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 체액 및/또는 조직의 샘플에서 하나 이상의 선택된 바이오마커의 기준선 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계로서, 샘플이 상기 저해제로 처리되지 않은 개체로부터 수득되는 단계;

(b) 상기 저해제로 처리된 (a) 의 샘플에서 상기 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계;

(c) 상기 단계 (a) 및 (b) 에 의해 수득되는 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태 사이의 차이를 계산하는 단계;

(d) 상기 차이로부터 혈관생성에 대한 효과 및/또는 혈관생성 연관 질환에 대한 항혈관생성 효능이 있는 인테그린 조정 분자에 대한 지표인 특성을 평가 또는 예측하는 단계.

바람직한 구현예에서, 관심의 화합물의 투여는 처리된 세포를 수득하기 위해 세포 바람직하게는 내피 세포에 대한 가능한 인테그린 조정 활성의 범위 내에 있는 것으로 추정되는 상이한 투여량으로 수행된다.

바람직한 구현예에서, 상기 처리된 세포의 세포 배양 배지는 상기 기술된 바와 같은 분석을 위해 채취된다.

바람직한 구현예에서, 상기 스크리닝 화합물에 의한 처리에 반응하여 세포 배양 배지에서 분석되고 모니터링되는 상기 바이오마커는 상기 기술된 바와 같은 단백질이다.

바람직한 구현예에서, 특정 시험에서 특징화된 스크리닝 화합물의 처리로 인한 특정 바이오마커의 증가 또는 감소는 0.01 값을 초과하지 않는 p-값에 의해 정의된다.

본 발명의 또다른 양상에서 상기 바이오마커 바람직하게는 단백질은 상기 기술된 바와 같은 상기 스크리닝 화합물에 반응하여 개질된다.

본 발명의 또다른 양상에서 상기 바이오마커의 유전자 발현의 변화는 스크리닝 화합물로 처리된 세포로부터 RNA 를 추출함으로써 RNA 수준에서 탐지될 수 있다. 특정 바이오마커의 발현된 RNA 전사체는 따라서 알려진 유전자 발현 프로파일링 기술 예컨대 배열 기술에 의해 분석될 수 있다.

따라서, 요약하면, 본 발명은 더욱 상세히 하기에 관한 것이다:

· 하나 이상의 선택적 바이오마커에 의해 혈관생성에 대한 혈관생성 저해제의 효과 및/또는 혈관생성 연관 질환에 대한 상기 저해제의 효능을 생체외 평가하는 방법으로서, 바이오마커가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 산물로부터 선택되는 방법:

상기 방법은 하기 단계를 포함함:

(a) 체액 또는 조직의 샘플에서 하나 이상의 선택된 바이오마커의 기준선 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계로서, 샘플이 상기 저해제로 처리되지 않은 개체로부터 수득되는 단계;

(b) 상기 저해제로 처리된 개체로부터 수득되는 (a) 의 샘플에서 또는 다음 단계에서 상기 저해제에 의해 처리되는 (a) 의 샘플에서 상기 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계;

(c) 상기 단계 (a) 및 (b) 에 의해 수득되는 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태 사이의 차이를 계산하는 단계;

(d) 상기 차이로부터 저해제의 하나 이상의 하기 특성을 평가 또는 예측하는 단계:

-- 분자 표적에 대한 및 분자 표적에 연결되는 각각의 신호전달 경로에 대한 약역학적 효과,

-- 혈관생성에 대한 효과,

-- 혈관생성 연관 질환을 앓는 환자에서의 치료의 효능 및 임상적 결과.

· 상응하는 생체외 방법으로서, 채취된 체액 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 소변, 눈물, 윤활액, 상처 유체 및/또는 뇌척수액인 방법.

· 상응하는 방법으로서, 조직 샘플이 병든 또는 건강한 조직을 포함하는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 조직 샘플이 암 조직, 피부 조직 및/또는 윤활막 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

· 상응하는 생체외 방법으로서, 채취된 조직 샘플로부터 내피 세포가 제조되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 내피 세포가 개체로부터 수득되고 조직 샘플로부터 제조된 후 실험실 조건 하에 배양되고, 하나 이상의 바이오마커가 세포 배양 배지 또는 상기 세포로부터의 추출물로부터 측정되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 혈관생성 저해제가 인테그린 저해제인 방법.

· 상응하는 방법으로서, 혈관생성 저해제가 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제인 방법.

· 상응하는 방법으로서, 인테그린 저해제가 알파 (V) 인테그린의 저해제인 방법.

· 상응하는 방법으로서, 알파 (V) 인테그린의 저해제가 항체, 또는 그의 유도체 또는 화학적 소분자 또는 RGD 펩티드인 방법.

· 상응하는 방법으로서, 알파 (V) 인테그린의 저해제가 DI-17E6 또는 실렌지타이드인 방법.

· 상응하는 방법으로서, 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제가 수니티니브 및/또는 소라페니브인 방법.

· 상응하는 방법으로서, 내피 세포 및/또는 체액의 샘플이 건강한 개체 및/또는 종양 질환 및/또는 또다른 혈관생성 연관 질환을 앓는 병든 개체에서 유래하는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 혈관생성 연관 질환이 종양 또는 그의 각각의 질환 또는 장애인 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커가 혈관생성 저해제의 투여로 인해 그의 수준 및/또는 개질 상태가 하향조절 또는 상향조절되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커가 ADAMTS1, STC1, MCP-1, IL-8, EDN1, PDGF-BB, INHBA, IL-6, CRP, CD40 리간드 및/또는 MMP9 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커 ADAMTS1 및/또는 STC1 이 기술된 바와 같은 하나 이상의 인테그린 저해제의 투여로 인해 상향조절되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커 MCP1, INHBA, EDN1 및/또는 PDGF-BB 가 기술된 바와 같은 하나의 인테그린 저해제의 투여로 인해 하향조절되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커 IL8 이 실렌지타이드 또는 소라페니브의 투여로 인해 하향조절되고 DI-17E6 또는 수니티니브의 투여로 인해 상향조절되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커 IL6 및/또는 CRP 가 DI-17E6 의 투여로 인해 상향조절되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커 CD40 리간드가 DI-17E6 의 투여로 인해 하향조절되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커 STC1 이 기술된 바와 같은 소분자 ATP 지향성 멀티 키나아제 저해제의 투여로 인해 하향조절되는 방법.

· 상응하는 방법으로서, 바이오마커 EDN1 이 기술된 바와 같은 소분자 ATP 지향성 멀티 키나아제 저해제의 투여로 인해 상향조절되는 방법.

· 하나 이상의 선택적 바이오마커에 의해, 세포 기반 모델에서 인테그린 조정 화합물을 생체외 스크리닝하는 방법으로서, 바이오마커가 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 산물로부터 선택되는 방법:

상기 방법은 하기 단계를 포함함:

(a) 체액 및/또는 조직의 샘플에서 하나 이상의 선택된 바이오마커의 기준선 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계로서, 샘플이 상기 저해제로 처리되지 않은 개체로부터 수득되는 단계;

(b) 상기 저해제로 처리된 (a) 의 샘플에서 상기 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계;

(c) 상기 단계 (a) 및 (b) 에 의해 수득되는 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태 사이의 차이를 계산하는 단계;

(d) 상기 차이로부터 혈관생성에 대한 효과 및/또는 혈관생성 연관 질환에 대한 항혈관생성 효능이 있는 인테그린-조정 분자에 대한 지표인 특성을 평가 또는 예측하는 단계.

· 하기를 포함하는 진단 키트:

로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커에 대한 탐지 시스템 및 방법을 적용할 수 있게 하는 기술된 바와 같은 혈관생성 저해제.

· 세포 기반 검정으로 혈관생성에 대한 인테그린 저해제 또는 소분자 ATP 자리 지향성 키나아제 저해제의 효과, 또는 그러한 저해제의 효능 및/또는 투여량을 생체외에서 평가 및 예측하기 위한, ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, CD40 리간드 및 IL6 으로 이루어지는 바람직한 군으로부터 선택되는 바이오마커 유전자 또는 그의 유전자 산물의 용도.

· ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, CD40 리간드 및 IL6 으로 이루어지는 바람직한 군으로부터 선택되는 바이오마커 유전자 또는 그의 유전자 산물의, 하나 이상의 상기 바이오마커에 반응성인 환자에서 암을 치료하기 위한 인테그린 저해제 또는 소분자 ATP 자리 지향성 키나아제 저해제의 제조를 위한 용도.

발명의 상세한 설명

용어 " 혈관생성 연관 질환" 은 탈조절된 (deregulated) 혈관생성으로부터 직접 초래되거나 탈조절된 혈관생성에 의한 간접적 효과에 편향되는 다수의 질환 또는 장애에 기여한다. 이들 다수의 질환은 종양 질환, 심장혈관 질환, 염증, 자가면역 질환, 변성 장애, 눈 장애를 포함한다. 탈조절된 혈관생성은 다양한 병적 자극에 의해 유도될 수 있다.

용어 "항-혈관생성 효과" 는 혈관생성이 차단되거나 적어도 저해됨을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 항-혈관생성 약물 또는 물질은 바람직하게는 새로운 혈관의 병적 형성 (혈관생성) 을 제한함으로써 혈관생성-연관 질환에 대항작용하는데 사용되고, 혈관생성에 의해 매개되는 질환 증상은 항-혈관생성 약물의 투여로 인해 개선된다.

용어 "바이오마커" 는 생물학적 상태의 지표로서 사용되는 물질을 언급한다. 바이오마커는 정상적 생물학적 과정, 병적 과정, 또는 치료적 개입에 대한 약리적 반응의 지표로서 객관적으로 평가되고 측정되는 특징이다. 본 발명에서, 용어 바이오마커는 바람직하게는 RNA 와 같은 유전자 전사체 및 단백질을 포함하는 분자 바이오마커로서 사용된다. 상기 바이오마커는 정량적으로 뿐만 아니라 정성적으로 변화될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서, 특정 시험에서 동일한 조건 하에 조사되는 바이오마커의 신뢰도를 특징화하는 p-값이 0.01 의 값을 초과하지 않도록, 분자 바이오마커는 정량적으로 변화, 즉, 분자 바이오마커의 수준이 감소 또는 증가된다.

용어 "체액" 은 개체 내에 존재하는 유체를 포함한다. 체액은 신체로부터 배출 또는 분비되는 유체 뿐만 아니라 정상적으로는 존재하지 않는 유체를 포함한다. 이들 각각의 유체는 수양액, 혈액, 혈청, 간질액, 림프, 점액, 흉수, 타액, 혈장, 소변, 눈물, 윤활액, 상처 유체 및/또는 뇌척수액을 포함한다. 바람직하게는, 혈액 혈청 및 혈액 혈장을 포함하는 혈액 및 소변이 본 발명에 사용된다.

용어 "암" 및 "종양/종양 질환 " 은 전형적으로는 탈조절된 세포 성장이 특징인 포유류에서의 생리적 조건을 언급하거나 기술한다. 본 발명에 따른 제약 조성물에 의해 종양 예컨대 유방, 심장, 폐, 소장, 대장, 비장, 신장, 방광, 머리 및 목, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 자궁경부 및 간의 종양이 치료될 수 있다.

용어 "세포 기반 모델/검정" 은 본원에서 동물 또는 인간 조직 및/또는 기관으로부터 유래하고, 가장 바람직하게는 혈관생성 조정 화합물의 스크리닝을 위해 사용하기 전에 실험적 조건 하에 배양되는 세포를 언급한다. 세포 기반 모델은 또한 세포주를 포함한다.

항체의 "유도체" 는 항체의 유도된 형태를 나타낸다.

용어 "진단 키트" 는 바람직하게는 본 발명의 바이오마커의 정량적 및/또는 정성적 평가에 필요한 진단 항체 및/또는 유전자 칩 배열 및/또는 시약의 상이한 패키지 및, 일반적으로는, 시약, 진단 항체 또는 유전자 배열의 사용에 대한 지침이 있는 탐지 시스템을 포함한다. 항체 뿐만 아니라 시약이 액체, 분말, 정제, 현택액으로서 제공될 수 있다. 항체 즉 유전자 배열 및 시약은 본 발명의 방법에 따라 별도로 적용하기에 적합한 별도의 패키지로 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 패키지에 함유된 물질의 "사용 지침" 을 포함한다.

용어 "개질 상태" 는 유전자 산물에서의 개질의 변화 예컨대 단백질의 당화 또는 분자 크기의 변경을 언급한다. 게다가, 개질 상태는 상이한 단백질 또는 동일한 단백질 서브유닛과의 상호작용의 변화를 언급한다.

"개체" 는 질환/장애를 앓고/거나 대조군 발단자 (proband) 로서 건강한 인간 또는 동물을 포함한다. 게다가, 실험적 동물이 포함된다.

"수용체" 또는 "수용체 분자" 는 리간드가 결합하여 수용체-리간드 복합체를 형성하는 하나 이상의 도메인을 포함하는 가용성 또는 막 결합된/연합된 단백질 또는 당단백질이다. 작용제 또는 대항제일 수 있는 리간드에 결합함으로써, 수용체는 활성화 또는 비활성화되고, 경로 신호전달을 개시 또는 차단한다.

"조직 샘플" 은 바이오마커의 분석 및 평가를 위해, 바람직하게는 세포의 면에서, 그 물질을 사용하기 위해 개체로부터 제거되는 생검을 의미한다. 본 발명에서, 조직 샘플은 생검 직후 바이오마커의 분석을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 또다른 양상에서, 생검 물질로부터 추출되는 세포는 특정 실험실 조건 하에 배양된 후, 그것의 바이오마커에 대해 분석될 수 있다. 본 발명에서, 바람직하게는 내피 세포가 사용된다.

용어 "치료 유효량 (Therapeutically Effective Dose, TED)" 은 포유류에서 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 약물 예를 들어 치료적 항체의 양을 언급한다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물은 암 세포의 수를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 저해 (즉, 어느 정도 저속화, 바람직하게는 중단) 하고; 종양 성장을 어느 정도 저해하고/거나; 암과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 존재하는 암 세포의 성장을 방지하고/거나 사멸할 수 있는 정도까지, 그것은 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 항-종양 치료의 경우, 효능은, 예를 들어, 질환 진행 시간 (TTP) 을 평가하고/거나 반응 속도 (RR) 를 결정함으로써 측정될 수 있다.

용어 "반응" 또는 "반응성" 은 완전한 정지의 저속화; 질환 사건 및/또는 증상의 수의 감소; 적용된 저해제 약물에 대한 자가면역 반응의 감소; 치료후 질환 없는 제시 길이의 증가; 및 치료 후 소정의 시점에서 감소된 사망률을 비롯한, 질환 진행의 어느 정도의 저해를 제한 없이 포함하는, 환자에게 유익인 임의의 종말점 지시약을 사용하여 평가될 수 있는 상태를 언급한다. 이 용어는 측정가능한 반응 예컨대 완전한 반응 (CR) 및 부분적 반응 (PR) 을 언급한다.

본 발명의 맥락에서 쥐, 키메라 또는 인간화 형태의 항체는 쥐 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체의 정의에 따라 항체의 일부가 치환된 등가 항체 또는 유도체를 포함한다.

본 연구에서, 체액 중 접근가능할 수 있으므로 비침습적 방식으로 표적 조정의 분석을 허용할 수 있는 인테그린 저해제 및 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 항-혈관생성 활성과 연관되는 바이오마커가 식별되었다. 이에 대해, 2 가지 상이한 전략이 추구되었다. 첫째, 약물 치료에 반응하는 내피 세포의 유전자 발현 프로파일의 게놈 전체 (genome-wide) 변화가 분석되었다. 둘째, 생체내 혈관생성 모델을 사용하여 약물-조절성 혈장 바이오마커를 식별하는 후보자-단백질체 추진된 접근이 수행되었다.

1. 유전자 발현 프로파일을 사용하는 바이오마커의 식별

치료와 연관되는 바이오마커를 식별하기 위해, HUVEC 을 실렌지타이드 또는 DI-17E6 으로 처리했다. 웨스턴 블롯 분석으로 치료 후 FAK 및 MAPK 의 인산화가 각각 실렌지타이드 및 DI-17E6 에 대해 저해되었음을 밝혔다. 각 조건으로 3 회 시험한 실험으로부터 유전자 발현 프로파일을 생성했다. 이 경우, 처리된 세포 및 대조군 세포로부터 RNA 를 추출하여 게놈전체 Affymetrix 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 혼성화하여 유전자 발현 프로파일을 생성했다. GCRMA 알고리즘으로 전처리한 후 (Wu Z, Journal American Statistical Association 2004; 99: 909-917), Affymetrix GeneChip 데이타를 필터링하여 낮은 가변성, 낮은 신호 또는 불량한 탐침 주석을 갖는 탐침 세트를 배제했다. 유전자를 특이적으로 필터링하여, 인간의 체액에서 탐지가능할 수 있고 환자에서 비침습적 방식으로 모니터링될 수 있는 분비된 후보를 수득했다. 약물 처리된 세포 및 미처리된 또는 대조군 처리된 세포 사이에 차등적으로 발현되는 유전자를 각각의 탐침 세트의 발현 데이타의 선형 모델 분석에 의해 식별한 후, 조정 (moderated) t-시험을 수행했다 (Smyth GK, Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology 2004; 3: Article 3).

· DI-17E6 에 반응하여 상향조절되는 유전자는 하기를 포함한다:

· 실렌지타이드에 반응하여 상향조절되는 유전자는 하기를 포함한다:

· DI-17E6 에 반응하여 하향조절되는 유전자는 하기를 포함한다:

· 실렌지타이드에 반응하여 하향조절되는 유전자는 하기를 포함한다:

소정의 조건 하에 비범한 반응/반응 변화/반응성을 나타내는 유전자에 밑줄이 그어져 있다.

유전자 및 상기 유전자의 유전자 산물은 본 발명에 따른 정의에 의해 동일한 기능적 활성을 유발하는 상동체 서열을 또한 포함하고; 특히 상기 원래의 서열과 80 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과, 특히 95 % 초과의 상동성을 갖는 서열이 관련된다. 따라서, 하기 상동성을 갖는 서열이 본 발명의 주제이다: 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 및 99 %.

각각의 인테그린 저해제에 의해 RNA 수준에서 고도로 상당히 조절되는 유전자를 단백질 수준에서 분석했다. 분비되는 바이오마커가 관련되므로, 인테그린-저해제 처리한 세포의 상청액에서 개개의 후보를 분석했다. HUVEC 을 DI-17E6 또는 실렌지타이드로 처리했다. 상이한 시간 후 배양 상청액을 수집하고, 상이한 바이오마커 후보에 대해 웨스턴 블롯팅, ELISA 또는 Luminex 에 의해 분석했다. 약물-유도성 바이오마커 조절을 대조군 세포와 비교하여 평가했다. 상이한 후보 중에서, ADAMTS1, STC-1, MCP-1, IL-8, 엔도텔린-1 (Endothelin-1), 액티빈 A 및 PDGF-BB 가 인테그린 저해제에 반응하여 조절되는 것으로 밝혀졌다.

웨스턴 블롯 분석으로 트롬보스폰딘 유형 1 모티프 (ADAMTS1) 및 스탄니오칼신-1 (Stanniocalcin-1, STC-1) 이 있는 ADAM 메탈로펩티다아제가 DI-17E6 또는 실렌지타이드에 의한 처리에 반응하여 상향조절되었음을 밝혔다 (도 2-4). ADAMTS1 은 세포외 공간에 거주하는 메탈로프로테아제이다. 상이한 생물 시스템을 사용하여, ADAMTS1 이 혈관생성을 저해함이 입증되었다 (Vazquez F. et al., J Biol Chem 1999; 274(33): 23349-57). STC-1 은 본래 경골 어류에서 칼슘 및 포스페이트 항상성에 관여하는 호르몬으로서 기술되었던 분비되는 당단백질이다. 그것은 많은 생리적 과정 예컨대 혈관생성에서 역할을 하며, 혈관생성촉진 및 항-혈관생성 활성 모두가 STC-1 에 대해 기술되었다 (Filvaroff EH. Et al., Endocrinology 2002; 143: 3681-90; Zlot C. et al., J Biol Chem. 2003; 278(48):47654-9).

단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-1/CCL2) 및 인터루킨-8 (IL-8/CXCL8) 을 Luminex 에 의해 분석했다. MCP-1 은 DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하여 하향조절되었다 (도 5). 대조적으로, IL-8 은 두 가지 인테그린 저해제에 의해 차등적으로 조절되었다. DI-17E6 에 반응하여 IL-8 은 상향조절되었고, 한편 실렌지타이드는 이 케모카인의 하향 조절을 유도했다 (도 6). MCP-1 은 마크로파지의 동원 및 활성화에서 중요한 역할을 한다. 그것은 혈관생성촉진 마크로파지를 종양으로 유인하는 핵심 작용제 중 하나이다. MCP-1 의 저해는 마우스에서 혈관생성 및 종양 성장을 감소시켰다 (Koga M. et al., Biochem Biophys Res Commun. 2008; 365(2): 279-84). IL-8/CXCL8 은 최초에 그것의 백혈구 화학주성 활성에 대해 특징화되었고, 종양형성 및 혈관생성촉진 성질을 보유하는 것으로 알려져 있다 (Xie K et al., Cytokine Growth Factor Rev 2001; 12(4): 375-91).

액티빈 A, 엔도텔린-1 (EDN1) 및 혈소판 유래 성장 인자 BB (PDGF-BB) 를 ELISA 에 의해 분석했다. 3 가지 단백질 모두 DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하여 하향조절되었다 (도 7-9). EDN1 은 혈관생성을 비롯한 다중 종양-촉진 활성을 매개한다. 그것은 인테그린에 의해 유발되는 세포내 신호전달을 수송하는 다중도메인 국소 부착 단백질인, 인테그린-연관 키나아제 (ILK) 를 조절한다 (Rosano L. et al., Mol Cancer Ther. 2006; 5(4):833-42). 2 가지 인히빈 βA 서브유닛의 동종이량체인, 액티빈 A 는 전환 성장 인자-β (TGF-β) 슈퍼패밀리에 속하는 액티빈/인히빈 패밀리의 일원이다. 그것은 발달 및 생식 과정, 염증, 암 및 혈관생성을 비롯한 넓은 범위의 생물적 활성을 나타낸다. 혈관생성촉진 및 항-혈관생성 기능이 기술된 이후로, 혈관생성의 조절에서 액티빈 A 의 역할이 고안되고 있다 (Panopoulou E et al., Cancer Res. 2005; 65(5):1877-86; Poulaki V. et al., Am J Pathol. 2004; 164(4): 1293-302). PDGF-BB 는 4 가지 PDGF 리간드, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C 및 PDGF-D 중 하나이다 (Fredriksson L et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2004; 15: 197-204). 그것은 근사한 서열 상동성 및 진화적 관계에 기초하여 함께 분류되는 리간드 및 수용체의 VEGF/PDGF 슈퍼패밀리에 속한다. PDGF-BB 는 다양한 종양 조직에서 높은 수준으로 빈번하게 발현된다 (Nguyen M. et al., J. Natl. Cancer Inst.1994; 86:356-361). 그것은 혈관주위세포에 대한 분열촉진 및 화학주성인자이고, 혈관 벽 구축 동안 혈관 세포를 조절하는데 중요한 역할을 한다 (Lindahl P et al., Science 1997; 277: 242-245).

다른 상이한 혈관생성 저해제, 수니티니브 및 소라페니브에 반응하는 식별된 바이오마커의 조절이, 식별된 바이오마커가 일반적으로 혈관생성 저해와 관련되는지 여부를 밝히기 위해 분석되었다. 2 가지 저해제는 모두 키나아제의 ATP-결합 촉매 자리에 결합함으로써 무관련 작용 메카니즘을 통해 작동하는 소분자 멀티 키나아제 저해제이다 (Morabito A et al., Current status and Future oncologist 2006; 11: 753 - 764).

바이오마커 후보의 수준이 수니티니브 및 소라페니브로 처리한 후 내피 세포 상청액에서 분석되었다. 인테그린 저해제에 대해 분석된 바와 같이 여러 바이오마커가 이들 키나아제 저해제에 반응하여 조절되었다. 예를 들어, STC-1 은 각각의 약물에 반응하여 하향조절되었고 (도 10), 한편 EDN1 은 상향조절되었다 (도 11). 흥미롭게도, 역 조절이 인테그린 저해제에 대해 관찰되었다. IL-8 은 각각의 키나아제 저해제에 의해 차등적으로 조절되었다. 수텐트는 이 케모카인의 상향조절을 야기했고, 한편 소라페니브는 처리 후 단백질 수준을 감소시켰다 (도 12). 인테그린 저해제의 경우 차등적 조절이 또한 관찰되었다. 또한 이들 데이타는 식별된 바이오마커가 인테그린 저해제 뿐만 아니라 키나아제 저해제의 활성을 모니터링하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 그러나, 각각의 단백질이 상이한 방식으로 조절되므로 내피 세포항상성에 대한 독특한 효과가 예상될 수 있고, 독특한 생물학적 반응을 초래할 수 있다. 모든 약물이 독특한 작용 메카니즘을 통해 작동하므로, 상이한 바이오마커를 조절하는데 연루되는 경로는 상이한 저해제 사이에 다를 수 있다.

요약하면, 인테그린 저해제의 약역학적 효과와 관련되는 약물-특이적 바이오마커가 내피세포 배양물 내 유전자 발현 프로파일에서 식별되었다. 여러 식별된 후보자가 세포 상청액 중 약물-조절성 단백질로서 확인되었는데, 이는 그들이 체액 중 탐지가능할 수 있음을 나타낸다. 일부 후보자가 무관련 멀티 키나아제 저해제에 의해 또한 조절되었는데, 이는 바이오마커가 넓은 의미에서 내피 세포항상성 및 혈관생성에 대한 효과를 모니터링하는데 적용될 수 있음을 나타낸다.

2. 생체내 혈관생성 모델에 의한 약물-조절성 혈장 바이오마커의 식별

이 모델에서, 혈관생성 성장 인자 bFGF 에 의해 마트리겔 플러그 (matrigel plug) 에서 혈관생성이 유도되었다. bFGF 를 함유하는 마트리겔 플러그를 건강한 사이노몰구스 원숭이 (Cynomolgus monkey) 의 복부에 피하 이식한 직후, 그 동물들을 상이한 투여량의 DI-17E6 으로 정맥내 주사했다. 혈관생성의 평가를 마트리겔 이식 후 마트리겔 플러그 중 헤모글로빈 함량의 정량화에 의해 수행했다. 각각의 조건을 마트리겔 플러그로 이식한 상이한 동물들에서 시험했다. DI-17E6 에 의한 원숭이의 처리가 모든 투여량에서 새로운 혈관의 형성을 차단했음이 밝혀졌다 (도 13).

DI-17E6 의 PD 효과와 연관되는 바이오마커를 식별하기 위해, 혈장 샘플을 처리 전 및 처리 후 수집했다. 상이한 단백질의 절대 농도를 Luminex 에 의해 각각의 표준에 비교함으로써 측정했다. 미가공 데이타를 로그 변환에 의해 전처리했고, DI-17E6 의 효과를 t-시험 분석으로 각 시점에서 DI-17E6-처리된 군을 플라시보-처리된 동물에 비교함으로써 조사했다.

상당히 조절된 단백질은 C-반응성 단백질 (CRP) 및 IL-6, CD40 리간드 및 MMP9 를 포함한다. CRP 및 IL-6 은 DI-17E6 에 의한 처리에 반응하여 상향조절되었다 (도 14). 대조적으로, CD40 리간드 및 MMP9 는 대조군에서 특이적으로 조절되었다. 144h 후, 플라시보 처리된 동물에서 CD40 리간드는 하향조절되었고, MMP9 는 상향조절되었다 (도 15). CRP 는 염증의 마커이고, 급성기 반응의 핵심 매개체이다 (Pepys MB et al., Adv Immunol 1983; 34: 141-212). 그것은 손상된 세포를 인지하고, 면역계와 상호작용함으로써 그들의 제거를 개시하고, 따라서 DI-17E6 처리에 반응하여 손상된 세포를 제거하는데 관여할 수 있다. IL-6 은 혈관생성 및 종양 성장과 연관되는 다면발현성 사이토카인이다 (Keller ET et al., Front. Biosci. 1996. 1: 340-357 및 Ancrile B et al., G enes Dev. 2007 Jul; 21(14): 1714-9). DI-17E6 처리에 반응하는 IL-6 의 상향조절은 그것의 약리적 활성과 충돌하는 것으로 보이나, 다른 혈관생성 저해제에 대해 관찰되었던 바와 같이 조절성 피드백 고리를 반영할 수 있다. CD40 리간드는 종양 괴사 인자-α 와 구조적으로 관련되는 경막 단백질이다. 그것은 염증, 혈전증 및 혈관신생에 기여하는 염증촉진성 및 응고촉진성 인자이다 (Ferroni P et al., Curr Med Chem. 2007; 14(20):2170-80). 마지막으로, MMP9 는 세포외 환경의 항상성을 매개하는 역할을 하는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 패밀리에 속한다. 종양형성촉진 및 항-종양형성 활성 모두가 기술된 바 있다 (Egeblad M et al., Nature Rev. Cancer 2002; 2:161-174). 그것은 신생혈관 재형성을 조정하고 종양 성장을 촉진한다 (Seandel M et al., Cancer Cell 2008; 13(3):181-3).

요약하면, 인간의 체액에서 탐지가능할 수 있고, 표적 조정에 대한 개념 증명을 제공하고; 적당한 투여량 및 일정을 선택하고; 임상적 결과를 잠재적으로 설명하거나 예측하는데 사용될 수 있는, 약물-특이적 약역학적 혈장 바이오마커가 탐지되었다. 식별된 바이오마커 중에서, CRP 및 MMP9 가 DI-17E6 처리 후 혈관생성을 차단하는데 기계적으로 관여할 수 있다.

3. 요약

이들 2 가지 연구에서 인간의 체액에서 탐지가능할 수 있고, 표적 조정에 대한 개념 증명의 제공하고; 투여량 및 일정의 합리적 선택을 제공하고; 임상적 결과를 잠재적으로 설명하거나 예측하는데 사용될 수 있는, 인테그린 저해제 및 멀티 키나아제 저해제에 대한 여러 PD 바이오마커가 식별되었다. 흥미롭게도, 대부분의 후보가 혈관생성과 연관되었고, 따라서 약물 처리 후 혈관생성을 차단하는데 기계적으로 관여할 수 있다. 흥미롭게도, 일부 바이오마커는 무관련 약물에 의해 상이한 작용 메카니즘으로 조절되었는데, 이는 그들이 내피 세포항상성 및 혈관생성에 대한 효과를 일반적으로 모니터링하는데 사용될 수 있고, 따라서 상이한 약물 종류, 예컨대 인테그린 저해제 (예컨대 실렌지타이드, DI-17E6), VEGF 저해제 (예컨대 Avastin), 멀티 키나아제 저해제 (예컨대 수니티니브, 소라페니브) 에 적용하는데 적합함을 시사한다.

도 1 은 DI-17E6 의 완전한 경 (A) 및 중 (B) 쇄 서열을 나타낸다. 가변 영역이 굵은 글씨체의 CDR 로 밑줄이 그어져 있다. 불변 영역 내의 굵은 서열은 개질된 IgG1 힌지 및 위치 296 및 297 에서의 돌연변이를 나타낸다.
도 2 는 DI-17E6 이 HUVEC 상청액 중 ADAMTS1 단백질의 수준을 유도함을 나타낸다.
도 3 은 실렌지타이드가 HUVEC 상청액 중 ADAMTS1 단백질의 수준을 유도함을 나타낸다.
도 4 는 DI-17E6 및 실렌지타이드가 HUVEC 상청액 중 STC-1 의 단백질 수준을 유도함을 나타낸다.
도 5 는 DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 MCP-1 의 조절을 나타낸다.
도 6 은 DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 IL-8 의 조절을 나타낸다.
도 7 은 DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 PDGF-BB 의 조절을 나타낸다.
도 8 은 DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 EDN1 의 조절을 나타낸다.
도 9 는 DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 액티빈 A 의 조절을 나타낸다.
도 10 은 수텐트 및 소라페니브에 반응하는 HUVEC 중 STC-1 의 조절을 나타낸다.
도 11 은 수텐트 및 소라페니브에 반응하는 HUVEC 중 EDN1 의 조절을 나타낸다.
도 12 는 수텐트 및 소라페니브에 반응하는 HUVEC 중 IL-8 의 조절을 나타낸다.
도 13 은 원숭이에서 마트리겔 플러그에서 혈관생성의 DI-17E6 억제를 나타낸다.
도 14 는 DI-17E6 에 의한 처리에 반응하는 혈장 CRP 및 IL-6 의 조절을 나타낸다.
도 15 는 DI-17E6 에 의한 처리에 반응하는 혈장 CD40 리간드 및 MMP9 의 조절을 나타낸다.
도 16 은 인테그린-특이적 신호전달 경로의 제어를 나타낸다.

실시예

실시예 1:

DI-17E6 은 HUVEC 상청액 중 ADAMTS1 단백질의 수준을 유도함

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 DI-17E6 과 6h 내지 72h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 ADAMTS1 에 대해 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. A) DI-17E6 은 ADAMTS1 의 조절을 매개했다 (65kD 및 85kD) (도 2).

실시예 2:

실렌지타이드는 HUVEC 상청액 중 ADAMTS1 단백질의 수준을 유도함

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 실렌지타이드와 6h 내지 72h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 ADAMTS1 에 대해 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. A) 실렌지타이드는 ADAMTS1 의 조절을 매개했다 (65kD 및 85kD) (도 3).

실시예 3:

DI-17E6 및 실렌지타이드는 HUVEC 상청액 중 STC-1 의 단백질 수준을 유도함

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 DI-17E6 또는 실렌지타이드와 24h 내지 72h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 STC-1 에 대해 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. A) DI-17E6 에 반응하는 STC-1 의 조절. B) 실렌지타이드에 반응하는 STC-1 의 조절 (도 4).

실시예 4:

DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 MCP-1 의 조절

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 DI-17E6 또는 실렌지타이드와 6h 내지 72h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 MCP-1 에 대해 Luminex 에 의해 분석했다. A) DI-17E6 에 반응하는 MCP-1 의 조절. B) 실렌지타이드에 반응하는 MCP-1 의 조절 (도 5).

실시예 5:

DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 IL-8 의 조절

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 DI-17E6 또는 실렌지타이드와 6h 내지 72h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 IL-8 에 대해 Luminex 에 의해 분석했다. A) DI-17E6 에 반응하는 IL-8 의 조절. B) 실렌지타이드에 반응하는 IL-8 의 조절 (도 6).

실시예 6:

DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 PDGF-BB 의 조절

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 DI-17E6 또는 실렌지타이드와 6h 내지 72h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 PDGF-BB 에 대해 ELISA 에 의해 분석했다. A) DI-17E6 에 반응하는 PDGF-BB 의 조절. B) 실렌지타이드에 반응하는 PDGF-BB 의 조절 (도 7).

실시예 7:

DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 EDN1 의 조절

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 DI-17E6 또는 실렌지타이드와 6h 내지 72h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 EDN1 에 대해 ELISA 에 의해 분석했다. A) DI-17E6 에 반응하는 EDN1 의 조절. B) 실렌지타이드에 반응하는 EDN1 의 조절 (도 8).

실시예 8:

DI-17E6 및 실렌지타이드에 반응하는 HUVEC 중 액티빈 A 의 조절

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 DI-17E6 또는 실렌지타이드와 6h 내지 72h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 액티빈 A 에 대해 ELISA 에 의해 분석했다. A) DI-17E6 에 반응하는 액티빈 A 의 조절. B) 실렌지타이드에 반응하는 액티빈 A 의 조절 (도 9).

실시예 9:

수텐트 및 소라페니브에 반응하는 HUVEC 중 STC-1 의 조절

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 수텐트 또는 소라페니브와 6h 내지 48h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 STC-1 에 대해 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. A) 수텐트에 반응하는 STC-1 의 조절. B) 소라페니브에 반응하는 STC-1 의 조절 (도 10).

실시예 10:

수텐트 및 소라페니브에 반응하는 HUVEC 중 EDN1 의 조절

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 수텐트 또는 소라페니브와 6h 내지 48h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 EDN1 에 대해 ELISA 에 의해 분석했다. A) 수텐트에 반응하는 EDN1 의 조절. B) 소라페니브에 반응하는 EDN1 의 조절 (도 11).

실시예 11:

수텐트 및 소라페니브에 반응하는 HUVEC 중 IL-8 의 조절

HUVEC 를 비트로넥틴 코팅된 접시에서 밤새 배양하고, 상이한 농도의 수텐트 또는 소라페니브와 6h 내지 48h 동안 인큐베이션했다. 배양 상청액을 수집하여 IL-8 에 대해 Luminex 에 의해 분석했다. A) 수텐트에 반응하는 IL-8 의 조절. B) 소라페니브에 반응하는 IL-8 의 조절 (도 12).

실시예 12:

DI-17E6 은 원숭이에서 마트리겔 플러그 중 혈관생성을 저해함

DI-17E6 에 의한 원숭이에서 마트리겔 플러그 중 혈관생성의 저해. 사이노몰구스 원숭이에서 5 ㎍/㎖ 의 bFGF 를 함유하는 피하 마트리겔 이식물에서 혈관생성을 유도했다. DI-17E6 을 100, 30, 10, 또는 3 ㎎/㎏ 의 단일 주입으로서 제공했다. 6 일 후, 마트리겔 플러그 중 헤모글로빈 함량을 측정함으로써 혈관생성을 정량화했다. * 는 p-값 < 0.05 을 나타내고, ** 는 p-값 <0.01 을 나타낸다 (도 13).

실시예 13:

DI-17E6 에 의한 처리에 반응하는 혈장 CRP 및 IL-6 의 조절

사이노몰구스 원숭이를 bFGF-함유 마트리겔 플러그 및 상이한 농도의 DI-17E6 으로 6 일 동안 이식했다. 혈장을 수집하여 CRP 및 IL-6 에 대해 Luminex 에 의해 분석했다. A) CRP 의 조절. B) IL-6 의 조절 (도 14).

실시예 14:

DI-17E6 에 의한 처리에 반응하는 혈장 CD40 리간드 및 MMP9 의 조절

A) 사이노몰구스 원숭이를 bFGF-함유 마트리겔 플러그 및 상이한 농도의 DI-17E6 으로 6 일 동안 이식했다. 혈장을 수집하여 CD40 리간드 및 MMP9 에 대해 Luminex 에 의해 분석했다. A) CD40 리간드의 조절. B) MMP9 의 조절 (도 15).

실시예 15:

인테그린-특이적 신호전달 경로의 저해:

성장 인자 자극 외에, 세포외 매트릭스에 대한 인테그린-매개 부착이 세포 증식, 생존 및 이주를 촉진하는데 중요하다. 인테그린 결찰시 Ras, MAPK, FAK, Src, Rac/Rho/cdc42 GTPase 의 활성화를 비롯한 광범위한 세포내 신호전달 사건이 유도된다. 혈관 생성 동안 내피 세포의 생존을 지지하기 위해, MAPK 캐스캐이드 (즉 ERK1/2) 의 지속적 활성화에 인테그린 알파(V) 베타(3) / (5) 가 FAK 와 함께 요구된다. 이 연구에서 내피 세포에서 인테그린-매개 신호전달 경로에 대한 2 가지 인테그린 저해제, DI-17E6 및 실렌지타이드의 효과를 분석했다. 이 목적으로, 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC) 를 비트로넥틴 상에서 플레이팅하여 알파(V)베타(3) 인테그린을 활성화시킨 후, 배양 배지 또는 상이한 농도의 DI-17E6 또는 실렌지타이드로 처리했다. 24h 의 처리 후, 세포 용해물을 제조하고 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. 신호전달 경로에 대한 효과를 각각의 신호전달 분자의 총 수준에 대한 인산화물의 비를 비교함으로써 평가하여, 세포 탈착으로부터 발생하는 잠재적 효과를 설명했다. 나타난 바와 같이, 농도 범위 0.01 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖ 의 DI-17E6 및 농도 범위 0.01 μM 내지 10 μM 의 실렌지타이드는 FAK 및 ERK1/2 의 활성화를 투여량 의존적 방식으로 차단했다 (도 16).

SEQUENCE LISTING <110> Merck Patent GmbH <120> Biomarkers for Inhibitors with Anti-Angiogenic Activity <130> P08/201-bz <140> PCT/EP2009/008929 <141> 2008-12-23 <160> 120 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutated murine immunoglobulin chain <220> <221> CHAIN <222> (1)..(214) <223> DI17E6 variable and constant light chain. <220> <221> CHAIN <222> (1)..(107) <223> variable light chain <220> <221> BINDING <222> (24)..(34) <223> CDR1=Seq.ID.No.5 <220> <221> BINDING <222> (50)..(56) <223> CDR2=Seq.ID.No.6 <220> <221> BINDING <222> (89)..(97) <223> CDR3=Seq.ID.No.7 <220> <221> CHAIN <222> (108)..(214) <223> constant light chain <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Ile His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 2 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> mutated murine immunoglobulin chain <220> <221> CHAIN <222> (1)..(447) <223> DI17E6 variable and constant heavy chain 1D) <220> <221> CHAIN <222> (1)..(118) <223> variable heavy chain <220> <221> BINDING <222> (30)..(35) <223> CDR1=Seq.ID.No.8 <220> <221> BINDING <222> (50)..(66) <223> CDR2=Seq.ID.No.9 <220> <221> BINDING <222> (99)..(107) <223> CDR3=Seq.ID.No.10 <220> <221> CHAIN <222> (119)..(447) <223> constant heavy chain <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Ile Phe 50 55 60 Arg Asp Lys Ala Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Phe Leu Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala Gln Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Claims (22)

1. 하기 단계를 포함하는, ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, CD40 리간드 및 IL6 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 선택적 바이오마커 유전자 또는 그의 유전자 산물에 의해, 혈관생성에 대한 인테그린 저해제, VEGF 저해제 또는 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 효과, 및/또는 혈관생성 연관 질환에 대한 상기 저해제의 치료적 효능을 생체외 측정하는 방법:
   (a) 기술적 수단 및/또는 장치에 의해 체액 및/또는 조직의 샘플에서 하나 이상의 선택된 바이오마커의 기준선 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계로서, 샘플이 상기 저해제로 처리되지 않은 개체로부터 수득되는 단계;
   (b) 기술적 수단 및/또는 장치에 의해 상기 저해제로 처리된 개체로부터 수득되는 (a) 의 샘플에서 또는 다음 단계에서 상기 저해제에 의해 처리되는 (a) 의 샘플에서 상기 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계;
   (c) 기술적 수단 및/또는 장치에 의해 상기 단계 (a) 및 (b) 에 의해 수득되는 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태 사이의 차이를 측정하는 단계;
   (d) 상기 단계 (c) 로부터 수득되는 상기 차이로부터 저해제의 하나 이상의 하기 성질 또는 파라미터를 측정하는 단계:
   -- 분자 표적에 대한 및 분자 표적에 연결되는 각각의 신호전달 경로에 대한 약역학적 효과,
   -- 혈관생성에 대한 효과,
   -- 혈관생성 연관 질환을 앓는 환자에서의 치료의 효능 및 임상적 결과, 및 임의로
   (e) 상기 단계 (a) 내지 (d) 를 원하는 성질/파라미터가 수득될 때까지 반복하여,
   개체에서 혈관생성 관련 질환 또는 상기 저해제의 치료적 효능, 안전성, 예후 또는 투여량 또는 혈관생성에 대한 효과와 관련되는 활성 및 임상적 측정의 평가를 허용하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 채취된 체액 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 소변, 눈물, 윤활액, 상처 유체 및/또는 뇌척수액인 생체외 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 조직 샘플이 병든 또는 건강한 조직을 포함하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 조직 샘플이 암 조직, 피부 조직 및/또는 윤활막 조직으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 채취된 조직 샘플로부터 내피 세포가 제조되는 생체외 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 내피 세포가 개체로부터 수득되고 조직 샘플로부터 제조된 후 실험실 조건 하에 배양되고, 하나 이상의 바이오마커가 세포 배양 배지 또는 상기 세포로부터의 추출물로부터 측정되는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 저해제가 알파 (v) 인테그린 저해제이고, 재조합 모노클로날 항체 또는 RGD 펩티드인 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 저해제가 mAb DI-17E6 또는 RGD 펩티드 실렌지타이드인 방법.
9. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제가 수니티니브 및/또는 소라페니브인 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 내피 세포 및/또는 체액의 샘플이 종양 질환 및/또는 또다른 혈관생성 연관 질환을 앓는 병든 개체 및/또는 건강한 개체로부터 유래되는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관생성 연관 질환이 암 또는 암 관련 질환인 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 인테그린 저해제 또는 소분자 ATP 자리 지향성 멀티 키나아제 저해제의 투여로 인해 그의 수준 및/또는 개질 상태가 하향조절 또는 상향조절되는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 ADAMTS1 및/또는 STC1 또는 그의 유전자 산물이고, 인테그린 저해제의 투여로 인해 상향조절되는 방법.
14. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 MCP1, INHBA, EDN1 및/또는 PDGF-BB 또는 그의 유전자 산물이고, 인테그린 저해제의 투여로 인해 하향조절되는 방법.
15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 IL8 또는 그의 유전자 산물이고, 실렌지타이드 또는 소라페니브의 투여로 인해 하향조절되고, DI-17E6 또는 수니티니브의 투여로 인해 상향조절되는 방법.
16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커 IL6 및/또는 CRP 가 DI-17E6 의 투여로 인해 상향조절되는 방법.
17. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커 CD40 리간드가 DI-17E6 의 투여로 인해 하향조절되는 방법.
18. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커 STC1 이 소분자 ATP 지향성 멀티 키나아제 저해제의 투여로 인해 하향조절되는 방법.
19. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커 EDN1 이 소분자 ATP 지향성 멀티 키나아제 저해제의 투여로 인해 상향조절되는 방법.
20. 하기 단계를 포함하는, ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, CD40 리간드 및 IL6 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 선택적 바이오마커 또는 그의 유전자 산물에 의해, 세포 기반 모델에서 인테그린 조정 화합물을 스크리닝하는 방법:
    (a) 기술적 수단 및/또는 장치에 의해 체액 또는 조직의 샘플에서 하나 이상의 선택된 바이오마커의 기준선 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계로서, 샘플이 상기 인테그린 조정 화합물로 처리되지 않은 개체로부터 수득되는 단계;
    (b) 기술적 수단 및/또는 장치에 의해 상기 인테그린 조정 화합물로 처리된 개체로부터 수득되는 (a) 의 샘플에서 상기 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태를 측정하는 단계;
    (c) 기술적 수단 및/또는 장치에 의해 상기 단계 (a) 및 (b) 에 의해 수득되는 선택된 바이오마커의 농도 및/또는 개질 상태 사이의 차이를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c) 로부터 수득되는 상기 차이로부터 상기 세포 검정에서 혈관생성의 조정에 효력을 미치는 인테그린 조정 화합물의 성질 또는 파리마터를 측정하는 단계.
21. 세포 기반 분석으로 혈관 생성에 대한 인테그린 저해제, VEGF 저해제 또는 소분자 ATP 자리 지향성 키나아제 저해제의 효과, 또는 상기 저해제의 효능 및/또는 투여량을 생체외에서 평가 및 예측하기 위한, ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, CD40 리간드 및 IL6 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이오마커 유전자 또는 그의 유전자 산물의 용도.
22. ADAMTS1, STC1, EDN1, MCP1, IL8, PDGF-BB, CRP, CD40 리간드 및 IL6 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이오마커 유전자 또는 그의 유전자 산물의, 하나 이상의 상기 바이오마커에 반응성인 환자에서 암을 치료하기 위한 인테그린 저해제 또는 소분자 ATP 자리 지향성 키나아제 저해제의 제조를 위한 용도.
    
    

Images