CN1977049A - 用于检测疾病的血小板生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明人出乎意料地发现，血小板能螯合血管发生调节剂，并且防止它们降解。因此，通过分析血小板中的血管发生调节剂，目前可以检测血管发生活性，甚至在早期阶段也可以检测。通过监测血管发生活性的改变，可以预测癌症或其它血管发生疾病或病症的存在。

Description

用于检测疾病的血小板生物标志物

相关申请的相互参考

[001]本申请在美国的35U.S.C.§119(e)下要求2004年4月26日提交的美国临时申请系列号60/565,286、2004年8月2日提交的美国临时申请系列号60/598,387、2004年9月13日提交的美国临时申请系列号60/609,692、2004年12月3日提交的美国临时申请系列号60/633,027、和2004年12月6日提交的美国临时申请系列号60/633,613的优先权，在此全文引入这些文献作为参考。

发明背景

[002]血管发生是组织血管化的过程，包括新发生的血管生长到组织中，并且也称作新血管化。血管是氧气和营养物供应到活组织，并且从活组织清除废物的途径。合适时，血管发生是关键的生物过程。例如，血管发生在生殖、发育和创伤修复方面是关键的。相反，不适当的血管发生会具有严重不良后果。例如，仅仅在实体瘤由于血管发生而血管化后，肿瘤才具有足够的氧气和营养物质供应，使得其迅速生长和转移。

[003]血管发生依赖性疾病是需要或诱导了血管生长的疾病。所述疾病占寻求医学治疗的所有疾病的显著部分，并且诱导了炎性病症，如免疫和非免疫炎症、慢性关节风湿和牛皮癣、与不适当或不合适的血管侵入相关的病症，如糖尿病视网膜病、新血管性青光眼、再狭窄、动脉粥样硬化斑中的毛细血管增生和骨质疏松，以及癌症相关病症，如实体瘤、实体瘤转移、血管纤维瘤、晶状体后纤维增生、血管瘤、卡波西肉瘤等癌症，其需要新血管化，以支持肿瘤生长。

[004]在Folkman最近的综述中，估计所有40-50岁的女性中超过三分之一具有乳腺原位肿瘤。所述肿瘤在身体中处于静息状态，仅仅在很少数情况下诊断出乳腺癌。认为男性中存在涉及前列腺癌的相似现象。根据这些数据，癌症可能定义为具有两个不同的阶段：(1)获得将正常细胞转化为癌细胞的突变，和形成原位肿瘤；和(2)转变为血管发生表型，从而给原位肿瘤提供新血管，支持迅速的肿瘤生长和转移(Nature，Vol.427，Feb.26，2004，p.787)。需要在血管发生转变，即在形成原位肿瘤前检测肿瘤的方法。

[005]血管发生是由影响毛细血管生长速度的不同阳性和阴性效应分子之间的平衡驱动的。目前已经克隆并且已知了多种血管发生和抗血管发生因子(Leung et al.，Science.246：1306-9，1989；Ueno et al.，Biochem Biophys Acta.1382：17-22，1998；Miyazono et al.，ProgGrowth Factor Res.3：207-17，1991)。血管内皮生长因子(VEGF)和血小板反应蛋白-1(TSP-1)是最充分研究的两种。VEGF是与TSP-1作用相反的血管发生因子，TSP-1是作为抗血管发生因子而起作用的(Tuszynski et al.，Bioessays.18：71-6，1996；Dameron，et al；.Science.265：1582-4，1994)。由这些作用相反因子的平衡和协调表达导致了正常血管生长。通过上调血管发生刺激剂或下调血管发生抑制剂可以发生从正常到不受控制的血管生长的转变，表明血管发生过程受到这些作用相反的力之间的摆动的紧密调节(Bouck et al.，Adv Cancer Res.69：135-74，1996)。例如，在肿瘤组织中，向血管发生表型的转变是作为进展到肿瘤表现前的一个不同步骤发生的，并且与外遗传或遗传改变相关(Hanahan et al.，Cell.86：353-64，1996)。为了支持该理论，VEGF的mRNA表达在表达活化的ras癌基因的迅速进展的肿瘤细胞系中上调(Rak et al.，Neoplasia.1：23-30，1999)。相反，VEGF的转录在破坏突变的ras等位基因后在这些相同的肿瘤细胞中下调，由此消除了VEGF表达，并且使得细胞不能在体内形成肿瘤(Stiegler et al.，J Cell Physiol.179：233-6，1999)。向血管发生表型的转变也与肿瘤阻抑物基因p53的灭活相关(Holmgren et al.，Oncogene.17：819-24，1998)。相反，p16缺失的细胞系在恢复野生型细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)抑制剂p16后恢复到抗血管发生表型(Harada et al.，Cancer Research.59：3783-3789，1999)。

[006]大多数癌症是用诸如MRIs、生物标志物如PSA、乳腺X线照像术、触诊和组织活检的技术检测的。采用这些方法，发现大多数癌症是在相当程度发展或转移后才发现的。因此，通常错过了任何早期治愈的机会。这部分是由于常规诊断方法的低准确性以及需要昂贵的设备，如NMRS、体层X线照像术等，这对患者是经济负担。此外，患者必须住院接受准确测定，如组织活检。因此，常规诊断方法对于癌症的早期诊断不是最佳的，前述技术都不能作为早期检测癌症的迅速或简便的程序。

[007]认为血管发生过程是以内皮细胞(EC)分泌，由诸如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素-8(IL-8)、胎盘样生长因子(PLGF)、转化生长因子-β(TGF-β)和其它的有丝分裂原活化的蛋白酶对基底膜的降解开始的。细胞迁移并增殖，导致在基质间隙中形成实体内皮细胞芽，然后，形成血管环，随着紧密连接的形成和新基底膜的沉积发生毛细血管。血管发生也可涉及血管发生阻抑蛋白，如血小板反应蛋白的下调。

[008]血管发生生长因子的治疗暗示首先在30多年前由Folkman及其同事描述(Folkman，N.Engl.J.Med.，285：1182-1186(1971)。当身体丧失对血管发生的至少一些控制时，发生异常血管发生，导致过量或不足的血管生长。例如，诸如溃疡、卒中和突发心脏事件的状况可能由于缺乏血管发生导致的，所述血管发生是自然愈合正常需要的。相反，过量的血管增殖会导致肿瘤生长、肿瘤传播、早发性或糖尿病视网膜病、牛皮癣和类风湿关节炎。

[009]血管发生调节剂具有非常短的半衰期，例如，天然VEGF在血浆中的半衰期是大约3分钟。因此，目前用于测量血管发生生长因子水平以检测所述调节剂的方法没有提供血管发生活性的可靠指示。

[010]用于早期检测癌症和其它血管发生疾病和病症的方法是高度需要的。

发明概述

[011]本发明人出乎意料地发现，血小板能螯合血管发生调节剂，并且防止它们降解。因此，通过分析血小板中的血管发生调节剂，目前可以检测血管发生活性。通过监测血管发生活性的改变，可以预测癌症或其它血管发生疾病或病症的存在。

[012]因此，本发明提供了用于检测个体中的癌症的新方法。优选地，早期检测癌症。在一种优选实施方案中，在第一时间点从个体(患者)分离血小板。分析血小板，得到至少一种血管发生调节剂的水平。血管发生调节剂可以是血管发生的正或负调节剂。在第二，即后面的时间点，从患者分离血小板，分析血管发生调节剂的水平。随后，将来自第一样品的血小板的血管发生调节剂水平与来自第二样品的血小板的血管发生调节剂水平进行比较。与第一样品中的血管发生正调节剂的水平相比，来自第二样品的血小板中至少一种血管发生正调节剂的水平增加，表明癌症或其它血管发生疾病或病症。或者，与第一样品中的血管发生负调节剂的水平相比，来自第二样品的血小板中至少一种血管发生负调节剂的水平减少，表明癌症或其它血管发生疾病或病症。在一种优选实施方案中，从血液样品分离血小板。优选地，测量一种以上血管发生调节剂。

[013]血管发生正调节剂包括，但不限于VEGF-A(VPC)、VEGF-C、bFGF、HGF、促血管生成素(angiopoietin)-1、PDGF、EGF、IGF-1、IGF BP-3、BDNF、基质金属蛋白酶(MMPs)、玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、乙酰肝素酶(heparanase)和鞘氨醇-1PO₄。

[014]血管发生负调节剂包括，但不限于，PF-4、血小板反应蛋白-1和2、HGF的NK1、NK2、NK3片段、TGF-β-1、纤维蛋白原(制管张素)、纤维蛋白原激活剂抑制剂1、α-2抗纤溶酶及其片段、α-2巨球蛋白、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)、β-血小板球蛋白、内皮抑制素、肿瘤抑制素(tumstatin)、BDNF(脑来源的神经生长因子)和可溶性VEGFR2。

[015]用于分析血管发生的正调节剂或负调节剂的方法包括，例如，蛋白阵列、ELISA、蛋白印迹、表面增强激光解吸电离谱或质谱。

[016]在一种实施方案中，个体具有癌症的遗传倾向。该倾向可以是肿瘤阻抑物基因中的突变。肿瘤阻抑物基因可以包括，例如，BRCA1、BRCA2、p53、p10、LKB1、MSH2和WT1。

[017]在另一种实施方案中，个体以前进行过癌症治疗。或者，认为患者是健康无病的个体。

[018]在一种优选实施方案中，在第二个时间点进行的血液分离发生在第一次分离后至少1个月。但是，第二个时间点可以是第一次分离后2个月、6个月、10个月、或1年以上。

[019]要用本发明的方法检测和治疗的癌症包括，但不限于，胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系统癌、膀胱癌、成血管细胞瘤、成神经细胞瘤、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

[020]在本发明的一种实施方案中，描述了治疗患有血管发生疾病或病症，如癌症的患者的方法。在所述方法中，在第一时间点从个体分离第一血小板样品，并且分析至少一种血管发生正调节剂或负调节剂的水平。从个体获得在后面的时间点分离的第二血小板样品，分析至少一种血管发生正调节剂或负调节剂的水平。随后，将来自第一血小板样品的血管发生调节剂水平与来自第二血小板样品的血管发生调节剂水平进行比较。与第一样品中的水平相比，第二样品中血管发生调节剂的水平改变，表明存在血管发生疾病或病症。诊断后，施用治疗。优选血管发生治疗。本发明的方法可以用于监测治疗过程。采用该方法，不必诊断确切的疾病或病症。所有的要求是以表明治疗起作用的方式改变血小板谱。如果发现特定治疗无效，可以改变该治疗，以提供更有效的治疗。

[021]优选地，抗癌治疗包括施用血管发生抑制剂。或者，可以用化疗、放疗或如果大到能够检测，可以手术切除肿瘤。在另一实施方案中，给患者施用上述抗癌治疗的组合。

[022]可以用血小板送递抗血管发生治疗。本发明的发明人出乎意料地发现血小板可以螯合各种血管发生因子，并且防止其降解。此外，发明人发现，血小板在生理合适的位置，例如，肿瘤上选择性释放它们的加载物。因此，一旦被诊断，可以给血小板加载抗癌化合物，并且送递到需要其的患者。在这样的方法中，将化合物选择性送递到需要治疗的位点，即，肿瘤。

[023]公知的血管发生抑制剂包括但不限于：直接血管发生抑制剂、制管张素、Bevacizumab(Avastin)、美替克仑、Canstatin、Caplostatin、Combretastatin、内皮抑制素、NM-3、血小板反应蛋白、肿瘤抑制素、2-甲氧基雌二醇和Vitaxin；和间接血管发生抑制剂：ZD1839(Iressa)、ZD6474、OSI774(Tarceva)、CI1033、PKI1666、IMC225(Erbitux)、PTK787、SU6668、SU11248、Herceptin和IFN-α。CELEBREX^(塞来昔布)、THALOMID(沙立度胺)和IFN-α也被认为是血管发生抑制剂(Kerbel et al.，Nature Reviews，Vol.2，October 2002，pp.727。

[024]本发明也包括用“有节奏的”化疗治疗血管发生疾病/病症。有节奏的化疗包括施用低剂量的化疗剂，参见Folkman，APIS112：2004。

[025]诊断后，本发明的方法使得能够评估采用的治疗。治疗后，该方法可用于复发的早期诊断。

[026]本发明的方法也可以用于血管发生疾病或病症，包括，例如视网膜病、糖尿病视网膜病或黄斑变性的早期诊断。此外，本发明的方法可以用于早期检测和治疗慢性炎性病症，包括，pyresis、疼痛、骨关节炎、类风湿性关节炎、偏头痛、神经退化性疾病(如多发性硬化)、阿尔茨海默病、骨质疏松、哮喘、狼疮和牛皮癣。

[027]在本发明的另一种实施方案中，建立了与特定血管发生疾病或病症，如癌症相应的血小板谱。该血小板谱也称作标准物或记录。在这样的实施方案中，分离来自个体的血小板样品，并且分析特定血管发生因子的存在与否。通过比较该谱与标准物而进行诊断。例如，对于脂肪肉瘤的诊断，通过分析患有诊断的脂肪肉瘤的患者而建立血管发生因子谱标准物。采用该标准物进行比较，可以分析来自个体的血小板样品。如果个体(测试)样品与标准物相关，则进行阳性诊断。同样，可以将这类诊断用于任何数目的癌症、血管发生疾病和病症、炎性疾病或病症，或血管异常。

[028]此外，本发明提供了监测抗血管发生治疗的有效性，或检测化合物在调节宿主中血小板血管发生调节剂水平中的有效性的方法。在该实施方案中，在第一时间点获得来自个体(宿主或宿主动物)的血小板，并且筛选血管发生正或负调节剂的存在与否。建立血小板谱(或记录)。然后给个体(或宿主)施用血管发生治疗(或测试化合物)。在第二，即后面的时间点，获得来自相同个体(或宿主)的血小板，并且筛选血管发生正和负调节剂的存在与否。获得第二血小板谱(或记录)。通过比较第一和第二血小板谱而确定血管发生治疗(或测试化合物)的有效性。与第一样品相比，第二样品中血管发生正调节剂的水平减少，表明是有效的抗血管发生治疗。同样，与第一样品相比，第二样品中血管发生负调节剂的水平增加，表明是有效的抗血管发生治疗。该实施方案允许相对容易和快速地分析多种治疗的有效性和筛选测试化合物的有效性的方法。如果发现特定治疗无效，则可以改变治疗，以提供更有效的治疗。

[029]宿主动物包括哺乳动物，如小鼠和大鼠。

[030]在该实施方案中，可以在开始施用抗血管发生治疗后的任何时间获得个体(或宿主)的第二血小板样品。例如，可以在开始治疗后约1周-约1个月获得第二血小板样品。或者，可以在治疗开始后2个月、3个月、6个月或最多到1年获得第二样品。

[031]本发明的该实施方案和其它实施方案也包括在两个以上的时间点进行分析。例如，可以在抗血管发生治疗的一些时间点分析血小板。以此方式，可以随时间分析抗血管发生治疗的有效性，并且可以分析治疗方案的改变。

[032]血管发生调节剂(正和负)是本领域公知的，但也可以是未鉴定的蛋白或没有鉴定为“血管发生调节剂”的已知蛋白。这样，本发明的方法可以鉴定已知或未知蛋白作为血管发生调节剂。血管发生调节剂也可以在本文中称作生物标志物，并且将在下文详细描述。本发明的血管发生调节剂包括蛋白、蛋白片段，如裂解的蛋白，和融合蛋白，如bcr-ab1。

附图说明

[033]用内皮抑制素对人血小板进行体外加载。将富含血小板的血浆(PRP)与浓度增加的内皮抑制素一起温育1小时，然后分离血小板，洗涤并且裂解，以获得纯蛋白提取物，然后进行SDS-PAGE。采用抗人内皮抑制素、抗人VEGF和抗人bFGF进行的标准蛋白印迹发现，内皮抑制素的增加与VEGF和bFGF的细胞内含量的减少呈负相关。

[034]图2：通过SDS-PAGE检测的血小板蛋白的体外选择性替代。内皮抑制素在预先加载了VEGF的血小板中摄取与内皮抑制素预先加载的对照相比不仅仅是完全的、没有阻碍的和增强的(图2的第1道)，也导致预先加载的VEGF的完全替代(图2的第2道)。相反，在相反的实验中，即将VEGF加载到用内皮抑制素预先加载的血小板中，导致内皮抑制素的较不完全的替代。

[035]图3：图3表明肝、Matrigel、脾、肾、血浆和血小板级分中每克组织中的计数(×10⁵)。碘化的VEGF在血小板中浓集为超过其在血浆中浓度的很多倍。

[036]图4：图4显示来自对照、非血管发生和血管发生样品的血小板和血浆中PF4(图4A)、PDGF(图4B)和VEGF(图4C)的谱。结果表明了血小板样品中PF4、PDGF和VEGF的浓度。

[037]图5：图5显示来自携带脂肪肉瘤的小鼠的血小板和血浆中bFGF(图5A)、VEGF(图5B)、PDGF(图5C)和ES(图5D)的谱。

[038]图6：示出了用免疫荧光检测的血小板活化前、活化期间和活化后VEGF的细胞内分布。在静息的血小板中，大多数VEGF定位于血小板的细胞内、细胞质部分(图6)，沿着细胞膜移动到VEGF的环形排列(图6D插图)，然后沿着活化的血小板的伪足(图6D)。活化诱导的血小板胞吐作用的模式更加表明血小板的细胞内容物与组织的直接交换，而不是常规采用的血小板的细胞内容物“释放”到循环中。

[039]图7：静息和活化的血小板中的VEGF定位。用固定和透化的静息血小板的双标记免疫荧光显微术确定VEGF的细胞内定位。微管蛋白在静息血小板中的边缘微管带中浓集，该结构限定了血小板的外周(图7A)。抗VEGF抗体一致地用在血小板细胞质中分布的具点的、小泡样结构标记(图7B)。用荧光标记的毒伞素和VEGF进行的活化的血小板的双染色发现VEGF与血小板的持续相关，甚至在活化时也是如此(图7F)。与活化一致的血小板形状改变由板足(lamelipodia)和丝足的形成明确表现出来。发现VEGF在活化的、伸展的血小板中是具点的模式，但更多的VEGF沿着丝足和沿着板足外周定位，而不是保留在细胞质中。

[040]图8显示VEGF在血小板中的细胞内分布。图8A：血小板被毒伞素染色。图8B：血小板被抗VEGF染色。图8C：层叠图。

[041]图9显示血小板(右侧)与巨核细胞(左侧)的相互作用。由免疫荧光显示VEGF的细胞内分布。

[042]图10显示血小板和巨核细胞中VEGF(图10A)、vWF(图10B)的细胞内分布和层叠图(图10C)。

[043]图11显示血小板内的血管发生正调节剂和负调节剂。

[044]图12显示小鼠中matrigel(50ng¹²⁵IVEGF)的放置。

[045]图13显示血管化的人肿瘤、非血管发生性静息细胞和血管发生性生长细胞的示意图。

[046]显示裸鼠中非血管发生与血管发生性人脂肪肉瘤。通过133天时的荧光酶发光而分析血管发生。

[047]图15显示用SELDI-TOF进行血小板和血浆蛋白表达的程序。

[048]图16显示肿瘤植入后30天，来自携带非血管发生和血管发生性人脂肪肉瘤的SCID小鼠的血小板和血浆提取物的蛋白表达图。标出了VEGF。

[049]图17显示了肿瘤植入后30天，来自携带非血管发生和血管发生性人脂肪肉瘤的SCID小鼠的血小板和血浆提取物的蛋白表达图。标出了PF-4。

[050]图18显示了肿瘤植入后30天，来自携带非血管发生和血管发生性人脂肪肉瘤的SCID小鼠的血小板和血浆提取物的蛋白表达图。标出了PDGF。

[051]图19显示了携带肿瘤的小鼠的血小板中bFGF的螯合的时程。仅仅包含了1820道尔顿的分子量。

[052]图20显示了从对照动物(灰线)和植入了静息肿瘤的动物(黑线)取出的血小板提取物的质量分光光度表达图。x轴上的数字表示观察到的颗粒的质量与电荷之比(m/z)，曲线的高度相应于观察到的峰的强度。如实施例的描述，采用的提取物是从初始的阴离子交换分级分离的级份2获得的。在WCX2ProteinChip阵列上分析来自该级份的样品。鉴定出CTAPIII和PF4在携带肿瘤的小鼠中是上调的。图20b显示CTAPIII和PF4(箭头)在携带静息和血管发生肿瘤的小鼠的血小板中是上调的，但在血浆中没有上调。

[053]图21a显示了分别在取自三组小鼠的血小板的提取物中测量的归一化CTAPIII峰强度的曲线图，所述三组小鼠是：对照、携带静息(非血管发生)性人脂肪肉瘤和携带血管发生性人脂肪肉瘤小鼠。图21B显示了分别在取自三组小鼠的血浆的提取物中测量的归一化CTAPIII峰强度的曲线图，所述三组小鼠是：对照、携带静息(非血管发生)性人脂肪肉瘤和携带血管发生性人脂肪肉瘤小鼠。

[054]图21C显示了与21A和21B相同组的小鼠的血小板中归一化的PF4峰强度的曲线图。图21D显示了与21A、21B和21C相同组的小鼠的血浆中归一化的PF4峰强度的曲线图。

[055]图22A显示了生长的第19天、32天和120天时携带肿瘤的小鼠的血小板中归一化的CTAPIII峰强度的曲线图，表明血小板CTAPIII水平在研究的时程中增加，而图22B显示血浆CTAPIII水平在相同时间段中减少，或没有改变。

[056]图22C显示了生长的第19天、32天和120天时携带肿瘤的小鼠的血小板中归一化的PF4峰强度的曲线图，明血小板PF4水平在研究的时程中增加，而图22D显示血浆PF4水平在相同时间段中减少，或没有改变。图22中示出了每组的峰强度的中值±标准误。

[057]图23a显示了用抗碱性成纤维细胞生长因子(抗bFGF)抗体得到的血小板和血浆提取物的抗体相互作用发现图。具体地，该图显示了携带静息(非血管发生)肿瘤的小鼠的血小板中bFGF及其片段是上调的。

[058]图23b显示了使得能够比较血小板与血浆提取物中改变的表达水平的表达图，还显示了携带非血管发生和血管发生肿瘤的小鼠中表达的差异。

[059]图24显示了用抗血小板来源的生长因子(抗PDGF)抗体得到的血小板提取物的抗体相互作用发现图。该图显示了携带静息肿瘤的小鼠的血小板中PDGF及其片段的上调(植入后30天)。

[060]图25显示了在阴离子交换柱上进行血小板提取物的分级分离，然后在WCX2ProteinChip阵列上对这些级份之一(级份1)进行谱分析后观察到的生物标志物的表达图。该图显示了与来自对照小鼠(灰色)的血小板提取物相比，一些标志物，包括20400Da的蛋白在取自携带肿瘤的小鼠(黑色)的血小板中上调。

[061]图26显示了在阴离子交换柱上进行血小板提取物的分级分离，然后在WCX2ProteinChip阵列上对这些级份之一(级份1)进行谱分析后观察到的生物标志物的表达图。该图表示鉴定了一些标志物在携带静息肿瘤的小鼠(黑色)中相对于在对照小鼠(灰色)得到了上调。

[062]图27：从ADP或凝血酶活化的血小板释放生长因子。用可商购ELISA的分析暴露于浓度增加的内皮抑制素的PRP的血浆部分中的VEGF和bFGF。用内皮抑制素对血小板进行的简单加载不将VEGF或bFGF释放到上清液(血浆)中，由经典的脱颗粒剂，如凝血酶或ADP进行的这些因子的释放是高度选择性的。一些(但不是全部)VEGF是由凝血酶(而不是ADP)活化的血小板释放的。这两种试剂都不能将bFGF从血小板释放出来。

[063]图28：血小板进行的选择性VEGF蛋白摄取。用放射性碘标记VEGF蛋白，将100μlMatrigel中的大约50ng¹²⁵I标记的VEGF皮下植入C57BLK/6小鼠的左侧胁腹中。3天后，处死小鼠，通过末梢取血采集柠檬酸化的血液。在γ计数器上对每个组织样品的放射性进行定量，校正数值的组织重量差异，表示为每克组织每分钟的计数[cpm/g组织]。在两个分开的场合重复该实验，每个实验5只小鼠，该图代表平均值±标准误。

[064]图29A-H：携带肿瘤的小鼠的血小板蛋白谱的代表性分析。在凝胶上展示来自健康小鼠(“对照”)、携带非血管发生性静息肿瘤异种移植物的小鼠(“非血管发生”)和携带血管发生性肿瘤异种移植物的小鼠(“血管发生”)的谱。检测了几种肽的差别表达模式。例如，在血小板裂解物的基本级分中，在8200Da鉴定了一个条带，随后通过免疫耗竭证实是血小板因子-4(PF-4)。横坐标：从m/z值计算的相对MW，纵坐标：通过免疫耗竭或免疫沉淀证实的鉴定的肽。带强度与蛋白的相对表达谱相关。

发明详述

[065]本发明涉及对癌症和血管发生疾病和病症进行早期检测、诊断和治疗的方法。具体地，用分离静息血小板的标准实验室程序(Fujimura H，Thrombos Haemost 2002，87(4)：728-34)在第一时间点从患者分离血小板。分析血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平。在第二，即后面的时间点，从个体分离血小板，分析至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平。随后，将来自第一样品的血小板的血管发生调节剂水平与来自第二样品的血小板的血管发生调节剂水平进行比较。与第一样品中的血管发生调节剂的水平相比，来自第二样品的血小板中血管发生调节剂的水平改变，表明血管发生疾病或病症，如癌症的存在。

[066]具体地，与第一样品中的血管发生正和/或负调节剂的水平相比，来自第二样品的血小板中至少一种血管发生正调节剂的水平增加或至少一种血管发生负调节剂的水平减少，表明血管发生疾病或病症，如癌症的存在。

[067]本发明的血管发生正调节剂包括，但不限于VEGF-A(VPC)、VEGF-C、bFGF、HGF、促血管生成素-1、PDGF、EGF、IGF-1、IGFBP-3、BDNF、基质金属蛋白酶(MMPs)、玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、乙酰肝素酶(heparanase)和鞘氨醇-1PO₄。

[068]本发明要分析的血管发生负调节剂包括，但不限于，PF-4、血小板反应蛋白-1和2、HGF的NK1、NK2、NK3片段、TGF-β-1、纤维蛋白原(制管张素)、纤维蛋白原激活剂抑制剂1、α-2抗纤溶酶及其片段、α-2巨球蛋白、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)、β-血小板球蛋白、内皮抑制素、肿瘤抑制素和可溶性VEGFR2。

[069]除了已知的血管发生调节剂，本发明也包括常规没有分类为血管发生调节剂，但也存在于血小板中的蛋白、蛋白片段和融合蛋白。本发明的方法提供了所述蛋白的发现。

[070]典型地在早期检测由本发明的方法检测的癌症。例如，肿瘤大小在毫米范围。所述肿瘤采用肿瘤检测的常规方法很难检测，所述方法如MRI、触诊、乳腺X线照像术等。要检测的癌症的实例包括，但不限于，胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系统癌和膀胱癌。

[071]具体地，可以通过本发明的方法鉴定和测量包含在分离自个体的血液的血小板中的血管发生正调节剂和负调节剂，所述个体被认为是健康和无病的，或所述个体倾向于患癌症、患有癌症或以前进行过癌症治疗。

[072]分离血小板的方法是本领域技术人员公知的，并且描述于″Current Protocols in Immunology by F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，K.Struhl and V.B.Chanda(Editors)，John Wiley & Sons，2004.″，在此引入该文献作为参考。例如，将全血从供体收集到含有柠檬酸钠或其它抗凝剂的真空容器中。然后，在低转速下离心全血，以便在第一阶段中使富含血小板的血浆与其它成分分离。在该程序的第二阶段，将富含血小板的血浆分离到新的试管中，通过以较高的速度离心血小板而获得血小板浓缩物。然后将血小板浓缩物重悬于标准裂解缓冲液中，分离相关的蛋白。

[073]从细胞，包括血小板中分离蛋白的方法是本领域技术人员公知的，并且描述于″Current Protocols in Immunology，F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，K.Struhl and V.B.Chanda(Editors)，John Wiley & Sons，2004.″，在此引入作为参考。在描述于在此引入作为参考的WO02/077176的一个实例中，该程序通常包括采用非常小体积的独特缓冲液，以一个溶解步骤提取蛋白。该程序的结果是得到完整蛋白，基本无交叉污染。分离的蛋白保持活性，使得能够通过多种测定进行分析。

[074]蛋白分离步骤的缓冲液可以包括一种或多种缓冲液成分、盐、去污剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。具体地，用于提取要通过免疫组织化学分析的蛋白的一种有效缓冲液包括缓冲液Tris-HCl、NaCl、去污剂Nonidet(g)P-40、EDTA和焦磷酸钠、蛋白酶抑制剂-牛胰蛋白酶抑制剂和亮抑蛋白酶肽，以及磷酸酶抑制剂脱氧胆酸钠、原钒酸钠和4-2氨基乙基苯磺酰氟(AEBSF)。可以使用的另一种盐是LiCl，而甘油是可以加入级分缓冲液中的合适乳化剂。另一种任选的蛋白酶抑制剂包括大豆胰蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂。其它合适的磷酸酶抑制剂包括苯基甲基磺酰氯、钼酸钠、氟化钠和β磷酸甘油酯。

[075]对于二维凝胶分析，用1％SDS进行简单裂解是有效的，而采用SELDI^程序进行的最终分析需要溶于标准PBS碱中的Triton-X-100；即一种去污剂(Sigma，St.Louis，MO)、MEGA109(ICN，Aurora，OH)和辛基B-吡喃葡糖苷(ESA，Chelmsford，MA)。在二维凝胶分析前采用的另一种缓冲液是7M脲、2M硫脲、CHAPS、MEGA 10、辛基B-吡喃葡糖苷、Tris、DTT、三丁基膦和Pharmalytes。

[076]一旦溶解了蛋白，可以将多种不同的免疫或生化分析用于表征分离的蛋白。通过ELISA和蛋白印迹进行分析的方法是本领域技术人员公知的，并且进一步描述于″Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，K.Struhl and V.B.Chanda(Editors)，John Wiley & Sons，2004″，在此引入该文献作为参考。进行质谱法的方法是本领域技术人员公知的，并且进一步描述于Methods of Enzymology，Vol.193：″MassSpectrometry″(J.A.McCloskey，editor)，1990，Academic Press，NewYork。

[077]可以进行的一种类型的测定是可溶性免疫测定，其中使用了目的蛋白的特异性抗体。可以用多种标记物对抗体进行标记，例如化学发光、荧光或放射性标记物。为了得到最佳结果，可以采用高灵敏度测定，如微粒酶免疫测定(MEIA)。通过应用用于估计血清中免疫检测的分子的校准曲线，可以估计每个细胞的分子数目。因此，目前描述的方法提供了定量免疫测定，其可以体内测量目的蛋白分子的实际数目。

[078]可以用于分析提取的蛋白的第二类测定是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)。通过对第一时间点提取的蛋白和第二时间点提取的蛋白进行电泳，并且比较印迹，可以观察到差异蛋白表达。具体地，通过将染色的凝胶扫描到计算机中，并且采用图像比较软件，可以确定存在于一种细胞类型而不存在另一种细胞类型(反之亦然)的蛋白的位置。此外，可以从凝胶中蛋白存在的位置分离这些改变的蛋白，并且如果序列存在于数据库中，可以用质谱MS-MS测序鉴定蛋白。以此方式，可以更完全地理解第一和第二时间点之间的蛋白差异。

[079]在一种优选实施方案中，用表面增强激光解吸电离谱技术或SELDI(Ciphergen Biosystems Inc.，Palo Alto，CA)进行分析。

[080]该方法可以分离不能由二维凝胶分析分开聚焦的蛋白，特别是非常碱性、非常小(＜7000道尔顿)或在细胞中以低或中等水平表达的蛋白。SELDI也比凝胶分析更快地分离蛋白。SELDI利用“蛋白芯片“，使得能够从粗样品中以毫微微摩尔水平解吸和检测完整蛋白。将目的蛋白直接施加到铝支持物上排列为8-24个预定区域的蛋白芯片的确定的小表面积上。这些表面包被了确定的化学“诱饵”基质，其包含标准色谱支持物，如疏水、阳离子或阴离子或生化诱饵分子，如纯化的蛋白配体、受体、抗体或DNA寡核苷酸(参见Strauss，Science282：1406，1998)。在血小板收集的样品中，将溶解的蛋白施加到SELDI芯片的表面。蛋白与表面的结合依赖于采用的诱饵表面的性质和洗涤条件。然后通过激光解吸和电离，以及随后从灵敏的分子量检测器产生的飞行时间(TOF)质量分析，对结合的蛋白的混合物进行表征。这些数据产生了样品的蛋白指纹，SELDI具有1000-300,000道尔顿的实际分辨和检测工作范围，这取决于利用的能量吸收分子和采用的诱饵表面/洗涤条件。

[081]本发明包括给患者施用有效量的具有抗血管发生活性的抗癌治疗。抗癌治疗可以包括，例如，施用血管发生抑制剂。血管发生抑制剂的施用可以通过本领域技术人员公知的常规方法或通过本发明的方法，例如给血小板(患者或匹配的供体)加载血管发生抑制剂并且将这些加载的血小板施用给有需要的个体。通过抑制血管发生，可以干预疾病、缓解症状，并且在某些情况下治愈疾病。或者，抗癌治疗可以包括给患者施用化疗或放疗。最后，抗癌治疗可以包括手术切除肿瘤。该治疗可以包含上述治疗的组合。

[082]本发明也涉及用于对血管发生疾病或病症进行早期检测、诊断和治疗性处理的方法。

[083]认为血管发生在多种疾病或病症中是重要的，所述疾病或病症称作血管发生疾病或病症。这里用到的术语血管发生疾病或病症或状况的特征在于异常或有害(如刺激或抑制)的血管化或由异常或有害的血管化导致。异常或有害的血管发生可能直接导致特定疾病，或加重存在的病理状况。血管发生疾病的实例包括眼病，如糖尿病视网膜病、黄斑变性、新血管性青光眼、早发性视网膜病、角膜移植物排斥、晶状体后纤维瘤、虹膜发红、由于干扰导致的视网膜新血管化、眼肿瘤和沙眼，以及眼的其它异常新血管化状况，其中新血管化可能导致失明。

[084]本发明包括的其它血管发生疾病或病症包括但不限于赘生性疾病，如肿瘤，包括膀胱、脑、乳腺、宫颈、结肠、直肠、肾、肺、卵巢、胰腺、前列腺、胃和子宫、肿瘤转移、良性肿瘤，如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼；和脓性肉芽肿、增生，如心肌肥厚、炎性状况，如免疫和非免疫炎症、慢性关节风湿和牛皮癣、与不适当或不合适的血管侵入相关的病症，如再狭窄、动脉粥样硬化斑中的毛细血管增生和骨质疏松，以及癌症相关病症，如实体瘤、实体瘤转移、血管纤维瘤、晶状体后纤维增生、血管瘤、卡波西肉瘤等癌症，其需要新血管化以支持肿瘤生长。也包括淋巴系统恶性肿瘤，如慢性和急性淋巴细胞白细胞和淋巴瘤。在本发明的一种优实施方案中，该方法涉及抑制患有癌症的哺乳动物中的血管发生。

[085]在本发明的很多实施方案中检测的患者理想地是人类患者，但应该理解，本发明的原理表明，本发明对于所有的哺乳动物都是有效的，它们意欲包括在术语“患者”中。在该上下文中，哺乳动物应理解为包括任何哺乳动物物种。

[086]在一种替代的实施方案中，本发明的方法可以用于刺激有需要的患者中的血管发生。已经建议将血小板用于多种疾病治疗中的药物送递用途，如1998年6月2日授权的美国专利No.5,759,542中的讨论。该专利公开了制备由包含结合于血小板外膜的尿激酶型纤溶酶原激活剂的A链的融合药物形成的复合物的制备。因此，根据本发明，血小板可以被分离，并且用血管发生刺激因子缔合(“加载”)。因此，可以认为“加载的”血小板被送递到需要血管化的位点。

[087]本发明的方法可以用于增加有需要的患者中的血管化。因此，本发明的方法可以用于治疗从血液循环增加中获益的疾病或状况，用于提供用于移植的血管化位点，用于增强伤口愈合，用于减少瘢痕组织形成，即，在损伤或手术后，用于可能从特定位点的免疫应答的定向抑制获益的状况等。

[088]包括了从血流增加获益的任何状况，例如，坏疽、糖尿病、循环不良、动脉硬化、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、主动脉瘤、下肢的动脉疾病、脑血管疾病等。以此方式，本发明的方法可以用于给血小板预先加载血管发生刺激剂并且将其输入患者，从而促进血管化，由此治疗外周血管病。同样，该方法可以用于治疗患病或缺氧的心脏，特别是当通向心脏的血管堵塞时。具有动脉硬化的其它器官可以从该方法获益。同样，可以通过更高的血管化而增强功能的器官可以通过施用预先加载了血管发生刺激剂的血小板而得到改进。这包括需要改进功能的肾脏或其它器官。以相同的方式，动脉硬化的其它靶包括缺血性肠病、脑血管病、基于血管的阳痿，等。此外，心脏中新血管的形成在保护心肌免受冠状动脉阻塞的后果方面是非常重要的。给具有缺血心肌的患者施用加载过的血小板，可以增强侧枝的发育，促进坏死组织的愈合，并且防止梗塞扩展和心脏扩大。

[089]由于血小板在与肿瘤相关的新形成的血管中循环，它们能够以定位的方式送递抗有丝分裂药物，同样，在肿瘤的新血管中循环的血小板可以沉积抗血管发生药物，以阻断肿瘤的血液供应。血小板加载了选定的药物，如内皮抑制素，替代了促血管发生因子，如VEGF或bFGF。根据本发明，可以制备加载了抗血管发生因子的血小板，并且输入患者，用于治疗应用。加载了药物的血小板特别适于血液携带的药物送递，例如选定的药物导向于血小板介导的形成中的血栓或血管损伤部位。如此加载的血小板对至少一种激动剂，特别是对凝血酶具有正常反应。由于肿瘤表现出血小板刺激物如组织因子或凝血酶的上调，“预先加载”了血管发生抑制剂的血小板可以直接送递到肿瘤部位。

[090]本发明的方法中也包括了用已知从血小板释放血管发生调节剂的试剂(下文称作“释放剂”)和在其它实施方案中用已知阻抑血管发生调节剂释放的试剂(下文称作“阻抑剂”)对这些“预先加载的”血小板在特定时间和/或在特定组织中的控制的释放。

[091]在一种实施方案中，释放剂是蛋白酶活化的受体(PAR)激动剂。在一种优选实施方案中，PAR激动剂是PAR4激动剂。在另一种实施方案中，释放剂是PAR1拮抗剂。PAR1和PAR4激动剂是本领域技术人员公知的，并且包括在本发明的范围内，参见，例如Ma et al.，PNAS，January 4，2005，vol.102(1)，在此全文引入作为参考。

[092]由于PAR1和PAR4以相反的调节方式影响血管发生调节剂从血小板的释放，可以给需要阻抑或活化血管发生的患者施用激动剂和拮抗剂。以此方式，通过给个体控制释放PAR激动剂和拮抗剂，调整对有需要的位点的调节剂送递。

[093]血管发生抑制剂包括但不限于制管张素、Bevacizumab(Avastin)、美替克仑、Canstatin、Caplostatin^TM、Combretastatin、内皮抑制素、NM-3、血小板反应蛋白、肿瘤抑制素、2-甲氧基雌二醇、Vitaxin、ZD1839(Iressa)、ZD6474、OSI774(Tarceva)、CI1033、PKI1666、IMC225(Erbitux)、PTK787、SU6668、SU11248、Herceptin和IFN-α、CELEBREX^(塞来昔布)、THALOMID(沙立度胺)、罗格列酮、bortezomib(Velcade)、bisphosphonate zolendronate(Zometa)和IFN-α。

[094]在本发明的另一种实施方案中，描述了建立血管发生疾病或病症的血小板记录或谱的方法。该血小板谱也称作标准物。在该实施方案中，从两组个体分离血小板，一组患有已知的血管发生疾病或病症(血管发生组)，第二组没有血管发生疾病或病症(对照组)。分析血小板中血小板相关生物标志物的水平。计算每一组的生物标志物的平均值，并且进行评估，以确定两组之间的差异。然后建立特定血管发生疾病或病症的血小板记录或谱，其中该记录列出了在血管发生组与对照组中差异表达的生物标志物。

[095]本发明使得能够检测和分辨血管发生相关的状况，特别是癌症。本发明涉及用血小板中发现的生物分子作为与血管发生状态相关的临床状况，特别是癌症状态的生物标志物。此处用到的血管发生状态包括但不限于疾病与无病状态的区别，如癌症与正常(即非癌症)的区别，特别是血管发生性癌症与良性或非血管发生性癌症的区别。

[096]实际上，已经出乎意料地发现，本发明的许多生物标志物可以用于区别良性与恶性肿瘤，以及血管发生与非血管发生性肿瘤等。血小板对血管发生调节剂的选择性摄取，而没有血浆中这些蛋白的相应增加，提供了辅助诊断，特别是在临床检测到肿瘤前对癌症的早期诊断的有用的测量方法。此外，发现血小板中多种生物标志物的多重测量，即，血小板谱分析，提供了患者中血管发生活性改变的非常灵敏的指示，并且提供了疾病的特异性鉴定。可以用血小板特性检测目前存在的诊断方法不能检测到的显微水平的人类癌症。甚至血管发生蛋白的小来源，如静息的非血管发生性肿瘤可以在临床检测到肿瘤本身之前可检测地改变蛋白谱。在某些实施方案中，血小板血管发生谱比单一生物标志物范围更广，因为它可以检测多种肿瘤类型和肿瘤大小。血小板血管发生谱的相对改变使得能够在肿瘤发展过程中对肿瘤进行追踪，所述发展过程从原位癌早期开始，即从临床检测到肿瘤前开始，并且使得能够快速预后、早期治疗和精确监测疾病进展或消退(如用诸如血管发生抑制剂的无毒药物治疗后)。

[097]血小板摄取很多已知的血管发生调节蛋白，如正调节剂，如VEGF-A、VEGF-C、bFGF、HGF、促血管生成素-1、PDGF、EGF、IGF-1、IGF BP-3、玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、乙酰肝素酶和鞘氨醇-1PO₄，和/或负调节剂，如血小板反应蛋白、HGF的NK1/NK2/NK3片段、TGF-β-1、纤维蛋白原(制管张素)、高分子量激肽原(结构域5)、纤连蛋白(45kD片段)、EGF(片段)、α-2抗纤溶酶(片段)、β-血小板球蛋白、内皮抑制素和BDNF(脑来源的神经生长因子)，并且只要来源(如肿瘤)存在，则继续螯合它们。不将本发明限制于螯合血管发生调节剂的任何特定生物机制或作用，认为血小板作为有效的转运蛋白，将这些蛋白转运到活化的内皮部位，并且血小板中生物标志物的谱反映了肿瘤存在的开始和生长。

[098]一方面，本发明提供了确定受试者中的血管发生状况的方法，该方法包括：(a)测量来自受试者的生物样品中的至少一种血小板相关生物标志物；和(b)将该测量值与血管发生状态进行关联。

[099]在一种实施方案中，测量了至少一种血小板相关生物标志物，所述测量是通过将生物标志物捕获在SELDI探针的吸附剂上，并且通过激光解吸电离质谱检测捕获的生物标志物。在某些实施方案中，吸附剂是阳离子交换吸附剂、阴离子交换吸附剂、金属螯合物或疏水吸附剂。在其它实施方案中，吸附剂是生物特异性吸附剂。在另一种实施方案中，至少一种血小板相关生物标志物是通过免疫测定法测量的。

[0100]在另一种实施方案中，通过软件分类算法进行关联。在某些实施方案中，血管发生状态是癌症与正常(非癌症)。在另一种实施方案中，血管发生状态是良性肿瘤与恶性肿瘤。在另一种实施方案中，血管发生状态是血管发生性肿瘤与非血管发生性肿瘤，即静息肿瘤。在另一种实施方案中，血管发生状态是特定类型的癌症，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、成血管细胞瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、脑癌、成神经细胞瘤、结肠癌、癌、肉瘤、白细胞、淋巴瘤和肌瘤。

[0101]在另一种实施方案中，该方法进一步包括：(c)根据血管发生状态控制受试者治疗。如果该测量与癌症相关，则控制受试者治疗包括给受试者施用例如化疗剂、血管发生治疗、放疗和/或手术。

[0102]在另一实施方案中，该方法进一步包括：(d)在受试者控制后测量至少一种血小板相关生物标志物，以评估治疗的有效性。

[0103]另一方面，本发明提供了试剂盒，其中包含：(a)固体支持物，其包含至少一种与其附着的捕获试剂，其中捕获试剂结合至少一种血小板相关生物标志物；和(b)采用固体支持物检测至少一种生物标志物的说明书。在另一种优选实施方案中，至少一种血小板相关生物标志物选自以下生物标志物：VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、内皮抑制素、肿瘤抑制素、金属蛋白酶的组织抑制剂、载脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金属蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素和血小板反应蛋白，及其组合。

[0104]在一种实施方案中，试剂盒提供了用固体支持物检测生物标志物的说明书，所述生物标志物选自以下生物标志物：VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、内皮抑制素、肿瘤抑制素、金属蛋白酶的组织抑制剂、载脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金属蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素和血小板反应蛋白，及其组合。

[0105]在另一种实施方案中，包含捕获试剂的固体支持物是SELDI探针。在某些实施方案中，吸附剂是阳离子交换吸附剂、阴离子交换吸附剂、金属螯合物或疏水吸附剂。在某些优选的实施方案中，捕获试剂是阳离子交换吸附剂。在其它实施方案中，试剂盒还包含(c)阴离子交换色谱吸附剂，如季胺吸附剂(如BioSepra Q Ceramic HyperDF吸附剂珠)。在其它实施方案中，试剂盒还包含(c)含有至少一种表1和表2的血小板相关生物标志物的容器。

[0106]另一方面，本发明提供了试剂盒，其中包含：(a)固体支持物，其包含至少一种与其附着的捕获试剂，其中捕获试剂结合至少一种血小板相关生物标志物；和(b)包含至少一种生物标志物的容器。

[0107]在一种实施方案中，试剂盒提供了用固体支持物检测生物标志物的说明书，所述生物标志物选自以下生物标志物：VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、内皮抑制素、肿瘤抑制素、金属蛋白酶的组织抑制剂、载脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金属蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素和血小板反应蛋白。在另一种实施方案中，试剂盒提供了用固体支持物检测每一种以下生物标志物，或额外检测以下每一种生物标志物的说明书：VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、内皮抑制素、肿瘤抑制素、金属蛋白酶的组织抑制剂、载脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金属蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素和血小板反应蛋白。

[0108]另一方面，本发明提供了软件产品，该软件产品包含：(a)存取归于样品的数据的代码，该数据包含生物样品中至少一种血小板相关生物标志物的测量值；和(b)执行分类算法的代码，该算法将样品的血管发生疾病状态分类为测量值的函数。

[0109]在一种实施方案中，该分类算法将样品的血管发生状态分类为选自下组的生物标志物的测量值的函数：VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、内皮抑制素、肿瘤抑制素、金属蛋白酶的组织抑制剂、载脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金属蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素和血小板反应蛋白。在另一种实施方案中，该分类算法将样品的血管发生状态分类为以下每一种生物标志物的测量值的函数：VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、内皮抑制素、肿瘤抑制素、金属蛋白酶的组织抑制剂、载脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金属蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素和血小板反应蛋白。

[0110]在其它方面，本发明提供了选自表1和表2所列血小板相关生物标志物的纯化的生物分子，此外，提供了包含检测表1和表2所列生物标志物的方法。

[0111]如果计算出不同组的生物标志物的平均值或中值表达水平具有显著统计学差异，与一种表型状态相比，生物标志物不同地存在于取自另一种表型状态(如患病)的受试者的样品中。统计学显著性的常用检验包括，但不限于t检验、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和让步比。单独或组合的生物标志物提供了受试者属于一种表型状态或另一种表型状态的相对风险。因此，它们可用作疾病(诊断学)、药物的治疗效果(治疗诊断学)和药物毒性的标志物。

[0112]发现血小板是癌症和特征在于血管发生(包括抗血管发生)活性差异的其它状况的生物标志物的出乎意料好的来源。具体地，血小板来源的生物标志物表明非常早期的疾病状态改变，并且不仅区分癌症和非癌症，还能区分良性肿瘤和恶性肿瘤。因此，本发明提供了多种临床状况，如癌症、关节炎和妊娠的早期诊断途径。可以用本发明区分不同的临床状况，因为所述每一种状况可能导致不同生物标志物或多个生物标志物簇的改变。因此，特定临床状况的生物标志物表达模式可能是疾病或代谢状态的指纹或谱。因此，本发明提供了用于检测和确定生物标志物的表达水平的试剂盒、方法和装置，所述生物标志物表明疾病状态或与血管发生活性改变相关的代谢活性改变。

[0113]此外，本发明提供了血小板谱标准或记录的建立。例如，通过分析来自患有已知癌症的个体的血小板样品，可以建立标准谱或记录。该记录可以用作与测试样品进行比较的对照。可以从血小板谱获益的疾病状态的实例包括但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌、成血管细胞瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、脑癌、成神经细胞瘤、结肠癌、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤和肌瘤。

[0114]本发明检测肿瘤生长变化的能力描述于例如此处提供的附图和表。用于获得附图和表中所示数据的方法在实施例中详细描述。简言之，给小鼠植入静息或血管发生性肿瘤，使该肿瘤生长预定的时间段。也研究了没有植入肿瘤的对照动物。从这些小鼠获得血小板，匀浆，按照实施例的描述进行处理，用SELDI质谱和本领域技术人员实施的其它方法进行分析。采用该方法，鉴定了血小板来源的生物标志物，所述标志物可以在非常早期表明疾病状态的改变，并且不仅可以区分癌症与非癌症，也可以区分良性肿瘤和恶性肿瘤。例如，生物标志物PF4的表达在来自患有肿瘤的小鼠的血小板中增强。出乎意料地，PF4表达在具有静息(非血管发生性)肿瘤的小鼠中的表达是最高的。附图和表1和2举例说明了对于生物标志物CTAPIII的相似结果，其二聚体的质量是大约16.2。

[0115]注意建立适于检测的生物标志物仅仅需要生物标志物的分子量，但也可以使用观察到的峰的形状和强度以及其它参数。例如，如果生物标志物的活性已知，则可以使用生物标志物的抗体，酶测定可以用于对生物标志物进行检测和定量。

[0116]生物标志物

[0117]本发明提供了在具有特征在于血管发生或抗血管发生活性的状况，特别是癌症与正常(非癌症)或良性肿瘤与恶性肿瘤的受试者的血小板中差别存在的基于多肽的生物标志物。生物标志物是通过质谱确定的质荷比、通过它们在飞行时间质谱中的谱峰形状和通过它们与吸附表面的结合特征而表征的。这些特征提供了确定被检测的特定生物分子是否是本发明的生物标志物的方法。这些特征代表生物分子的固有特征，并且不以区别生物分子的方式产生限制。一方面，本发明提供了分离形式的这些生物标志物。

[0118]本发明的血小板相关生物标志物是采用来自CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont，CA)的ProteinChip阵列(″Ciphergen″)，用SELDI技术发现的。从属于以下三种表型状态之一的鼠受试者收集血小板样品：正常、良性肿瘤、恶性肿瘤。用脲缓冲液提取血小板，然后直接加入阴离子交换、阳离子交换或IMAC铜SELDI生物芯片中进行分析，或在阴离子交换珠上分级分离，然后加入阳离子交换SELDI生物芯片中进行分析。通过在Ciphergen PBSII质谱仪上进行飞行时间质谱产生样品中多肽的谱。通过Ciphergen Biosystems公司的装有Biomarker Wizard and Biomarker Pattern软件的Ciphergen Express^TM数据管理软件分析由此获得的谱。对每一组的质谱进行散点图分析。用Mann-Whitney检验分析比较三个不同的组，选择在两组之间有显著差异(p＜0.0001)的蛋白。这些方法在实施例部分有更详细的描述。

[0119]可以通过质谱法测定的质荷比表征本发明的生物标志物。每个生物标志物的质荷比(“M”值)也可以标为“标志物”。因此，例如M8206的测量质荷比是8206。从Ciphergen Biosystems公司的PBSII质谱仪上产生的质谱确定质荷比。该仪器具有约+/-1000m/dm的质量准确度，m是质量，dm是0.5峰高度时的质谱峰宽度。用BiomarkerWizard^TM软件(Ciphergen Biosystems，Inc.)确定生物标志物的质荷比。Biomarker Wizard簇集通过PBSII确定的所分析的所有质谱的相同峰的质荷比，取簇中的最大和最小质荷比，除以2，从而给生物标志物赋予质荷比。因此，提供的质量反应了这些规格。

[0120]可以通过在飞行时间质谱中的质谱峰的形状进一步表征本发明的生物标志物。附图中示出了显示代表生物标志物的峰的质谱。

[0121]可以通过在色谱表面的结合特性进一步表征本发明的生物标志物。例如，在pH6时结合级分III(pH5洗涤)中的标志物，但被pH5时的洗涤洗脱。大多数生物标志物在pH5时用50mM乙酸钠洗涤后结合于阳离子交换吸附剂(如Ciphergen WCX ProteinChip阵列)，并且很多结合于IMAC生物芯片。

[0122]已经确定了本发明的某些生物标志物的身份。该确定的方法描述于实施例部分。对于确定了身份的生物标志物，可以通过本领域公知的其它方法确定生物标志物的存在，所述方法包括但不限于光度和免疫检测。

[0123]可以通过质荷比、结合特性和质谱形状表征用本发明可以检测的生物标志物，而不需要预先知道它们的特定身份。但是，如果需要，可以通过例如确定多肽的氨基酸序列而鉴定身份未确定的生物标志物。例如，可以通过用一些酶，如胰蛋白酶或V8蛋白酶进行肽作图而鉴定蛋白标志物，并且用消化片段的分子量来检索数据库，得到与作图中使用的蛋白酶产生的消化片段的分子量匹配的序列。或者，可以用串联质谱(MS)技术对蛋白生物标志物进行测序。在该方法中，通过例如凝胶电泳分离蛋白。切下含有生物标志物的条带，使蛋白接受蛋白酶消化。通过串联MS的第一个质谱仪分离各个蛋白片段。该片段然后进行碰撞诱导的冷却。这使得肽片段化，产生多肽梯。然后可以通过串联MS的第二质谱仪分析多肽梯。多肽梯成员的质谱中的差异鉴定了序列中的氨基酸。可以以此方式对完整肽进行测序，或序列片段可以进行数据库搜索以找到身份候选物。

[0124]修饰形式的血小板相关生物标志物的用途

[0125]已经发现蛋白通常在样品中以多种不同形式存在，其特征在于质量差异是可检测的。这些形式可以由翻译前和翻译后修饰中的任意一种或这两者一起导致。翻译前修饰的形式包括等位基因变体、剪接变体和RNA编辑形式。翻译后修饰的形式包括由蛋白水解裂解(如亲本蛋白的片段)、糖基化、磷酸化、脂化、氧化、甲基化、胱氨酰化、磺化和乙酰化得到的形式。包含特定蛋白及其所有修饰形式的蛋白的集合在此称作“蛋白簇”。特定蛋白的所有修饰形式的集合，排除该特定蛋白本身，在此称作“修饰的蛋白簇”。本发明的任何生物标志物的修饰形式本身也可以用作生物标志物。在某些情况下，修饰形式在诊断中可以比此处描述的特定形式表现出更好的区分能力。

[0126]最初可以通过能够检测和区分生物标志物的修饰形式的任何方法检测生物标志物的修饰形式。初始检测的优选方法包括首先用例如生物特异性捕获试剂捕获生物标志物及其修饰形式，然后通过质谱检测捕获的蛋白。更具体地，用生物特异性捕获试剂，如识别生物标志物及其修饰形式的抗体、适体或Affibodies捕获蛋白。该方法也导致捕获了结合于蛋白或通过其它方式由抗体识别并且本身可以是生物标志物的蛋白相互作用物。优选地，生物特异性捕获试剂结合于固相。然后，可以通过SELDI质谱或通过从捕获试剂上洗脱蛋白，并且通过常规MALDI或通过SELDI检测洗脱的蛋白，从而可以检测捕获的蛋白。质谱的使用是特别吸引人的，因为它可以基于质量对蛋白的修饰进行区分和定量，而无须进行标记。

[0127]优选地，生物特异性捕获试剂结合于固相，如珠子、板、膜或芯片。将诸如抗体的生物分子偶联于固相的方法是本领域公知的。它们可以利用例如双功能连接剂，或可以用在接触时结合分子的反应基团如环氧化物或咪唑对固相进行衍生化。可以在相同位置混合针对不同靶蛋白的生物特异性捕获试剂，或它们可以在不同的物理或可寻址的位置附着于固相。例如，可以给多个柱子加载衍生化的珠子，每个柱子能够捕获单一蛋白簇。或者，可以用针对多个蛋白簇的捕获试剂衍生化的不同珠子装填单个柱子，从而在单一位置捕获所有分析物。因此，可以用基于抗体衍生化的珠子的技术，如Luminex(Austin，TX)的xMAP技术检测蛋白簇。但是，为了区分，生物特异性捕获试剂必须特异性针对簇的成员。

[0128]在另一种实施方案中，可以在相同位置或物理不同的可寻址位置用针对蛋白簇的捕获试剂对生物芯片的表面进行衍生化。在不同可寻址位置捕获不同簇的一个优点是分析变得更简单。

[0129]鉴定蛋白的修饰形式，并且与目的临床参数进行关联后，可以将修饰形式用作本发明任何方法的生物标志物。此时，可以通过任何特异性检测方法实现修饰形式的检测，所述方法包括亲和捕获，然后进行质谱，或特异性针对修饰形式的常规免疫测定。免疫测定需要生物特异性捕获试剂，如抗体，以捕获分析物。此外，如测定必须设计为特异性区分蛋白和蛋白的修饰形式，这可以通过以下方式实现，例如，采用夹心测定，其中一种抗体捕获一种以上的形式，并且第二种区别标记的抗体特异性结合多种形式，并且提供其区别检测。可以通过用生物分子免疫动物而制备抗体。本发明涉及常规免疫测定，包括，例如，包括ELISA或基于荧光的免疫测定的夹心免疫测定，以及其它酶免疫测定。

[0130]血小板相关生物标志物的检测

[0131]可以通过任何合适的方法检测本发明的生物标志物。可以用于此处的检测范例包括光学法、电化学法(电压测定和电流测定技术)、原子能显微镜和射频法，如多极共振光谱。除了显微术(共焦和非共焦)外，光学法的实例包括检测荧光、发光、化学发光、吸光度、反射率、透光率和双折射或折射指数(如表面等离子共振、椭圆光度法、共振镜法、光栅耦合器波导法或干涉测量法)。

[0132]在用要求保扩的方法检测前，可以对生物标志物进行分级分离，以便由其分离可以干扰检测的血液成分。分级分离可以包含血小板与其它血液成分的分离、血小板成分的亚细胞分级分离和/或需要的生物标志物与血小板中的其它生物分子的分级分离，所述分离采用诸如色谱、亲和纯化、一维和二维作图的技术，和本领域技术人员公知的其它纯化方法。在一种实施方案中，通过生物芯片分析样品。生物芯片通常包含固体基质，并且通常具有平坦表面，其上附着了捕获试剂(也称作吸附剂或亲和试剂)。通常，生物芯片的表面包含多个可寻址的位置，每个位置上结合了捕获试剂。

[0133]蛋白生物芯片是适于捕获多肽的生物芯片。本领域描述了很多蛋白生物芯片。这些包括，例如，由Ciphergen Biosystems公司(Fremont，CA)，Packard BioScience公司(Meriden CT)，Zyomyx(Hayward，CA)，Phylos(Lexington，MA)和Biacore(Uppsala，Sweden)生产的蛋白生物芯片。所述蛋白生物芯片的实例描述于以下专利或公开的专利申请中：美国专利No.6,225,047；PCT国际公开No.WO99/51773；美国专利No.6,329,209；PCT国际申请No.WO00/56934；和美国专利No.5,242,828。

[0134]通过质谱法检测

[0135]可以通过质谱法检测本发明的生物标志物，质谱法是采用质谱仪检测气相离子的方法。质谱仪的实例是飞行时间、磁区、四极滤光器、离子收集器、离子回旋共振、静电区分析仪和这些的混合。

[0136]在进一步优选的方法中，质谱仪是激光解吸/电离质谱仪。在激光解吸/电离质谱法中，将分析物置于质谱探针(一种适配装置)的表面上，以便接合将质谱仪的探针界面，并且给分析物施加电离能，以进行电离，并且导入质谱仪中。激光解吸质谱仪利用典型地来自紫外激光，但也可以来自红外激光的激光能，将分析物从表面解吸，以便使其挥发和电离，使它们能够用于质谱仪的离子光学。

[0137]SELDI

[0138]用于本发明的一种优选的质谱技术是“表面增强激光解吸和电离”或“SELDI”，该技术描述于例如Hutchens和Yip的美国专利No.5,719,060和No.6,225,047。这是指一种解吸/电离气相离子谱(如质谱)的方法，其中将分析物(此处是一种或多种生物标志物)捕获在SELDI质谱探针的表面。存在几种形式的SELDI。

[0139]一种形式的SELDI称作“亲和捕获质谱”。其也称作“表面增强亲和捕获”或″SEAC″。这种形式涉及使用在探针表面具有捕获分析物的材料，该捕获是通过材料和分析物之间的非共价亲和相互作用(吸附)。该材料在不同场合也称作“吸附剂”、“捕获试剂”、“亲和试剂”或“亲和部分”。该探针也可以称作“亲和捕获探针”，并且具有“吸附表面”。捕获试剂可以是任何能够结合分析物的材料。捕获试剂可以直接附着于选择性表面的基质，或基质可以具有携带能够结合捕获试剂的反应部分的反应表面，所述结合是通过例如形成共价或配位共价键的反应。环氧化物和carbodiimidizole是有用的反应部分，以共价结合多肽捕获试剂，如抗体或细胞受体。次氮基乙酸和亚氨基乙酸是有用的反应部分，它们的功能是作为螯合剂结合金属离子，所述金属离子与含有组氨酸的肽非共价相互作用。吸附剂通常分类为色谱吸附剂和生物特异性吸附剂。

[0140]“色谱吸附剂”是指通常用于色谱中的吸附材料。色谱吸附剂包括，例如，离子交换材料、金属螯合剂(如次氮基乙酸或亚氨基乙酸)、固定的金属螯合物、疏水相互作用吸附剂、亲水相互作用吸附剂、染料、简单生物分子(如核苷酸、氨基酸、简单糖和脂肪酸)和混合模式的吸附剂(如疏水吸引/静电排斥吸附剂)。

[0141]“生物特异性吸附剂”是指包含生物分子的吸附剂，所述生物分子如核酸分子(如适体)、多肽、多糖、脂质、甾体类或这些物质(如糖蛋白、脂蛋白、糖脂、核酸(如DNA)-蛋白缀合物)的缀合物。在某些情况下，生物特异性吸附剂可以是大分子结构，如多蛋白复合物、生物膜或病毒。生物特异性吸附剂的实例是抗体、受体蛋白和核酸。生物特异性吸附剂通常对靶分析物比对色谱吸附剂具有更高的特异性。用于SELDI的吸附剂的进一步的实例可以参见美国专利No.6,225,047。“生物选择性吸附剂”是指以至少10^-8M的亲和力结合分析物的吸附剂。

[0142]由Ciphergen Biosystems公司生产的蛋白生物芯片包含在可寻址的位置上附着了色谱或生物特异性吸附剂的表面。CiphergenProteinChip^阵列包含NP20(亲水)；H4和H50(疏水)；SAX-2、Q-10和LSAX-30(阴离子交换)；WCX-2、CM-10和LWCX-30(阳离子交换)；IMAC-3、IMAC-30和MAC 40(金属螯合物)；和PS-10，PS-20(具有carboimidizole、环氧化物的反应表面)和PG-20(通过carboimidizole偶联的蛋白G)。疏水ProteinChip阵列具有异丙基或壬基苯氧基聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯官能团。阴离子交换ProteinChip芯片具有季铵官能团。阳离子交换ProteinChip阵列具有羧酸酯官能团。固定的金属螯合物ProteinChip阵列具有次氮基乙酸官能团，其通过螯合吸附过渡金属离子，如铜、镍、锌和镓。预活化的ProteinChip阵列具有可以与蛋白上用于共价结合的基团反应的carboimidizole或环氧化物基团。

[0143]所述生物芯片进一步描述于美国专利No.6,579,719(Hutchens和Yip，″Retentate Chromatography，″2003年6月17日)；PCT国际公开No.WO00/66265(Rich et al.，″Probes for a Gas PhaseIon Spectrometer，″2000年11月9日)；美国专利No.6,555,813(Beecheret al.，″Sample Holder with Hydrophobic Coating for Gas Phase MassSpectrometer，″2003年4月29日)；美国专利申请No.U.S.20030032043Al(Pohl and Papanu，″Latex Based Adsorbent Chip，″2002年7月16日)；和PCT国际公开No.WO03/040700(Urn et al.，″Hydrophobic Surface Chip，″2003年5月15日)；美国专利申请No.US2003/0218130Al(Boschetti et al.，″Biochips With Surfaces Coated WithPolysaccharide-Based Hydrogels，2003年4月14日)和美国专利申请No.60/448,467，名称是″Photocrosslinked Hydrogel Surface Coatings″(Huang et al.，2003年2月21日提交)。

[0144]概言之，具有吸附表面的探针与样品接触足够的时间，使得可能存在于样品中的生物标志物能够结合吸附剂。温育期后，洗涤基质，以除去未结合的材料。可以使用任何合适的洗涤溶液，优选使用水溶液。可以通过调节洗涤的严格性操作分子保持结合的程度。洗涤溶液的洗脱特征可以依赖于例如pH、离子强度、疏水性、离液程度、去污剂强度和温度。除非探针具有SEAC和SEND这两种特性(如此处的描述)，然后将能量吸附分子施加到具有结合的生物标志物的基质。

[0145]在气相离子质谱仪如飞行时间质谱仪中检测与基质结合的生物标志物。通过诸如激光的电离源对生物标志物进行电离，通过离子光学组装收集产生的离子，然后质量分析仪分散并且分析通过的离子。然后，检测器将检测到的离子的信息翻译为质荷比。生物标志物的检测通常涉及检测信号强度。这样，可以确定生物标志物的数量和质量。

[0146]另一种形式的SELDI是表面增强净解吸(SEND)，其涉及使用包含与探针表面(″SEND探针″)化学结合的能量吸收分子。短语“能量吸收分子”(EAM)表示能够从激光解吸/电离源吸收能量，随后导致与其接触的分析物分子解吸和电离的分子。EAM类别包括用于MALDI的分子，通常称作“基质”，其实例是肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基-羟基-肉桂酸(CHCA)和二羟基苯甲酸、阿魏酸和羟乙酰苯衍生物。在某些实施方案中，将能量吸收分子掺入线性或交联的聚合物，如聚甲基丙烯酸酯。例如，组合物可以是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸和丙烯酸酯的共聚物。在另一种实施方案中，组合物是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸、丙烯酸酯和3-(三乙氧基)甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯的共聚物。在另一种实施方案中，组合物是a-氰基-4-甲基丙烯酰氧基肉桂酸和十八烷基甲基丙烯酸酯的共聚物(″C18SEND″)。SEND进一步描述于美国专利No.6,124,137和PCT国际公开WO03/64594(Kitagawa，″Monomers And Polymers Having EnergyAbsorbing Moieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes，″2003年8月7日)。

[0147]SEAC/SEND是SELDI的一种形式，其中捕获试剂和能量吸收分子均附着于存在样品的表面。因此，SEAC/SEND探针使得能够通过亲和捕获和电离/解吸而捕获分析物，而不需要施加外部基质。C18SEND生物芯片是SEAC/SEND的一种形式，包含作为捕获试剂起作用的C18部分和作为能量吸收部分起作用的CHCA部分。

[0148]SELDI的另一种形式称作表面增强的光不稳定性附着和释放(SEPAR)，其涉及使用具有附着于可以共价结合分析物的表面的部分的探针，然后通过在暴露于光，如激光后打断该部分中的光不稳定性键而释放分析物(参见美国专利No.5,719,060)。SEPAR和SELDI的其它形式适于根据本发明检测生物标志物谱。

[0149]其它质谱法

[0150]在另一种质谱法中，首先可以将生物标志物捕获在具有结合生物标志物的色谱特性的色谱树脂上。在本实例中，这可以包括多种方法。例如，可以将生物标志物捕获在诸如CM Ceramic HyperD F树脂的阳离子交换树脂上，洗涤树脂，洗脱生物标志物，并且通过MALDI检测。或者，可以在施加阳离子交换树脂前在阴离子交换树脂上对样品分级分离，从而进行该方法。再或者，可以在阴离子交换树脂上分级分离，并且通过MALDI直接检测。在另一方法中，可以将生物标志物捕获在含有结合生物标志物的抗体的免疫色谱树脂上，洗涤树脂以除去未结合的材料，从树脂洗脱生物标志物，并且通过MALDI或通过SELDI检测洗脱的标志物。

[0151]数据分析

[0152]通过飞行时间质谱对分析物进行的分析产生了飞行时间谱。最终分析的飞行时间谱通常不代表来自对样品的电离能量的单一脉冲的信号，而是代表来自多个脉冲的信号总和。这减少了噪音，并且增加了动态范围。然后对该飞行时间数据进行数据处理。在Ciphergen的ProteinChip软件中，数据处理通常包括飞行时间到M/Z的转化，以产生质谱，扣除基线以除去仪器偏差，并且过滤高频噪音，以减少高频噪音。

[0153]可以用可程序化的数字计算机分析生物标志物的解吸和检测产生的数据。该计算机程序分析数据，以显示检测的生物标志物的数目，并任选显示信号的强度和确定检测的每种生物标志物的分子质量。数据分析可以包括确定生物标志物的信号强度和除去偏离预定统计分布的数据的步骤。例如，可以通过计算相对于一些参照物的每个峰的高度，对观察到的峰进行归一化。参照物可以是由仪器和诸如能量吸收分子的化学物质产生的背景噪音，其在标尺中设定为0。

[0154]计算机可以将得到的数据转化为多种展示形式。可以展示标准质谱，但在一种有用的形式中，仅仅从质谱展示中保留峰高度和质量信息，产生更清晰的图像并且使得能够更容易观察到分子量几乎相同的生物标志物。在另一种有用的形式中，比较了两个或多个质谱，方便地加强了独特的生物标志物和在样品之间上调和下调的生物标志物。采用任何所述形式，可以容易地确定特定生物标志物是否存在于样品中。

[0155]分析通常包括鉴定代表来自分析物的信号的质谱中峰的鉴定。可以肉眼选择峰，但也可以使用软件，其是Ciphergen的ProteinChip软件包中的一部分，可以自动检测峰。概言之，该软件是通过鉴定信噪比高于选定的阈值的信号，并且标出在峰信号质心处的峰质量而起作用的。在一种有用的应用中，比较了很多质谱，以鉴定出存在于质谱的一些选定百分比中的相同峰。一种形式的该软件簇集出现在确定质量范围中的多个质谱中的所有峰，并且给所有接近质量(M/Z)簇中点的峰赋予质量(M/Z)。

[0156]用于分析数据的软件可以包括将算法用于信号分析的代码，所述分析确定了信号是否代表信号中相应于本发明的生物标志物的信号中的峰。该软件也可以使关于观察到的生物标志物峰的数据进入分类树或ANN分析，以确定是否存在表明检验的特定临床参数的状态的生物标志物峰或生物标志物峰的组合。数据分析可以直接或间接从样品的质谱分析“键入”多个获得的参数。这些参数包括但不限于一个或多个峰的存在与否、峰或一组峰的形状、一个或多个峰的高度、一个或多个峰的高度的对数，和峰高度数据的其它算数操作。

[0157]血小板相关生物标志物的SELDI检测的通用程序

[0158]如上文提到的，SELDI质谱法是本发明考虑的用于检测生物标志物的优选程序。采用SELDI检测生物标志物的通用程序优选以含有进行分级分离的生物标志物的样品开始，从而至少部分将目的生物标志物与样品的其它成分分离。样品的早期分级分离是优选的，因为该方法通常改变本发明的灵敏度。预先分级分离的优选方法包括使样品与阴离子交换色谱材料如Q HyperD(BioSepra，SA)接触。然后用pH9、pH7、pH5和pH4的缓冲液对结合的材料进行逐步pH洗脱，收集含有生物标志物的级分。

[0159]然后使要检测的(优选预先分级分离的)样品与包含阳离子吸附剂(优选WCX ProteinChip阵列(Ciphergen Biosystems，Inc.))或IMAC吸附剂(优选IMAC3ProteinChip阵列(Ciphergen Biosystems，Inc.))的亲和探针接触。然后用缓冲液洗涤探针，保留了生物标志物而洗去了未结合分子。通过激光解吸/电离质谱检测生物标志物。

[0160]或者，如果可以得到识别生物标志物的抗体，如PF4和CTAPIII的情况下，可以构建生物特异性探针。可以通过使抗体与官能化探针如预先活化的PSI0或PS20ProteinChip阵列(Ciphergen Biosystems，Inc.)的表面接触而形成所述探针。一旦附着于探针的表面，然后可以将探针用于将生物标志物从样品捕获到探针表面。然后可以通过例如激光解吸/电离质谱法检测生物标志物。

[0161]通过免疫测定进行检测

[0162]在另一实施方案中，可以通过免疫测定法测量本发明的生物标志物。免疫测定需要生物特异性捕获试剂，如抗体，以捕获生物标志物。可以通过本领域公知的方法，如通过用生物标志物免疫动物而制备抗体。可以基于结合特征从样品分离生物标志物。或者，如果已知多肽生物标志物的氨基酸序列，可以合成多肽，并且用于通过本领域公知的方法制备抗体。

[0163]本发明涉及常规的免疫测定，包括，例如包括ELISA或基于荧光的免疫测定的夹心免疫测定，以及其它酶免疫测定。在基于SELDI的免疫测定中，将生物标志物的生物特异性捕获试剂附着于MS探针，如预先活化的ProteinChip阵列的表面。然后通过该试剂将生物标志物特异性捕获在生物芯片表面，通过质谱法检测捕获的生物标志物。

[0164]将生物标志物表达的改变与血管发生状态进行关联

[0165]采用本发明，使得实施者能够诊断个体中与血管发生活性增加相关的代谢状态的改变。这是通过监测由与要检测的代谢状态改变相关的血管发生活性导致的血小板相关生物标志物表达水平的改变而实现的。因此，本发明的优选生物标志物与血管发生或血管静止(angiostasis)相关，但合适的生物标志物的精确鉴定不是用这些生物标志物实施本发明的先决条件。可以用单个可检测标志物或单独或作为一组表现出表达水平改变的多个可检测标志物以描述的方法进行本发明的实施，所述表达水平改变是反应于与诸如癌症、感染、妊娠、组织损伤等生理改变相关的血管发生活性的改变。

[0166]可以通过多种途径监测生物标志物表达。例如，可以分析单一样品中的生物标志物表达水平，随后将该水平与对代表性对照群体取样确定的对照阈值进行比较。或者可以将来自在一个时程中从单一患者获得的多个样品进行比较，以确定生物标志物表达水平是增加还是减少。当评估治疗影响生物标志物表达的疾病后患者的预后时，该方法特别有用。本领域技术人员可以理解其它生物标志物评估，他们可以在不进行过多实验的前提下进行分析。

[0167]单标志物

[0168]对于本发明考虑了各个生物标志物的检测，前提是所述生物标志物满足上文指出的标准，特别是与要通过采用本发明检测的疾病或代谢状态改变相关。可以将单一生物标志物用于诊断测试，以评估受试者中的血管发生状态，如，诊断影响患者中血管发生活性的癌症的存在或诸如某些癌症的病程中的改变。“血管发生状态”包括但不限于区分疾病与无病状态，特别是血管发生性癌症与非血管发生性静息癌症。此外，血管发生状态可以包括多种类型的癌症。基于该状态，可以提示其它程序，包括其它诊断测试或治疗程序或方案。

[0169]表1A和1B和表2中的每一种生物标志物和由本发明的方法鉴定的其它生物标志物均可用于辅助确定血管发生状态。本发明的一些实施方案涉及例如测量血小板制剂中选定的生物标志物的表达水平。通过比较生物标志物的表达水平与早期确定的相同个体中的表达水平，本领域技术人员可以确定病程或疾病对治疗的反应。或者，可以将检测到的生物标志物表达水平与例如通过研究展示合适已知表现的个体群而确定的一种或多种疾病状态的阈值进行比较。可能适于通过用本发明单独检测的诊断或治疗目的的已知生物标志物的实例包括VEGF、PDGF、bFGF、PF4、CTAPIII、内皮抑制素、肿瘤抑制素、金属蛋白酶的组织抑制剂、载脂蛋白A1、IL8、TGF、NGAL、MIP、金属蛋白酶、BDNF、NGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素和血小板反应蛋白。

[0170]将各个生物标志物用作血管发生活性改变的指示剂通常涉及检测生物标志物，然后将确定的生物标志物表达水平与相关于特定疾病或代谢状态改变的阈值水平进行关联。例如，捕获在SELDI生物芯片上，然后通过质谱法检测，其次，比较测量值与区分阳性血管发生状态与阴性血管发生状态的诊断量或截止值。诊断量代表高于或低于将受试者分类为具有特定血管发生状况的测量到的生物标志物量。例如，如果与肿瘤形成过程中的正常量相比生物标志物被上调，则测量到的高于诊断截止值的量提供了癌症的诊断。或者，如果生物标志物在迅速发展的肿瘤治疗过程中被下调，则测量到的低于诊断截止值提供了肿瘤消退或肿瘤变为静息状态的诊断。

[0171]测量的生物标志物水平也可以用于促进特定类型癌症的诊断，或区分不同类型的癌症。例如，如果生物标志物或生物标志物的组合在某些癌症类型中与其它标志物相比上调到特定水平，测量到的高于诊断截止值的生物标志物量提供了存在特定类型癌症的指示。此外，可以用标志物的组合提供额外的诊断信息，如下文的描述。可以用此处描述的生物标志物和技术鉴定并且彼此区分的癌症类型的一些实例包括乳腺癌、肝癌、肺癌、成血管细胞瘤、成神经细胞瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、脑癌和结肠癌。也可以用此处描述的生物标志物和方法区分癌、肉瘤、淋巴瘤和肌瘤。此外，不同类型的癌症表达不同的生物标志物模式，并且可以由此彼此区分。可以按照此处的描述确定每种癌症类型的特征模式，如通过用学习算法分析每种癌症类型的样品，以产生可以基于癌症类型对样品分类的分类算法。

[0172]如本领域技术人员公知，通过调节用于测定中的特定诊断截止值，可以根据诊断者的偏好增强诊断测定的灵敏度或特异性。例如，可以通过测量来自具有不同血管发生状态的受试者的统计学显著数目的样品中生物标志物的量，确定特定的诊断截止值，如此处这样，并且画出截止值，以适合诊断者需要的特异性和灵敏度水平。

[0173]标志物的组合

[0174]尽管单个标志物是有用的诊断性生物标志物，发现生物标志物的组合可以比单个生物标志物提供特定状态的更有预测性的值。具体地，样品中多个生物标志物的检测可以增加测试灵敏度和/或特异性。在本发明的内容中，在疾病或代谢状态的改变的诊断中确定至少两种，优选3、4、5、6或7种，更优选10、15或20种不同生物标志物的表达水平。可以组合使用的生物标志物的实例包括PF4、VEGF、PDGF、bFGF、PDECGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素、内皮抑制素和血小板反应蛋白。本发明的一种优选实施方案检测包括bFGF的多种生物标志物和至少一种选自下组的其它生物标志物：VEGF、PDGF、PDECGF、CTGF、血管生成素、促血管生成素、PF4、制管张素、内皮抑制素和血小板反应蛋白。一种替代的优选实施方案检测包括PF4的多种生物标志物和至少一种选自下组的其它生物标志物：VEGF、PDGF、bFGF、PDECGF、血管生成素、促血管生成素、制管张素、内皮抑制素和血小板反应蛋白。

[0175]建立用于确定肿瘤状态的分类算法

[0176]如上文的讨论，可以人工或用计算机软件自动进行检测的生物标志物表达水平的分析。可以进行单样品分析，或可以进行多样品分析，其中多个样品种的每一种样品都是在治疗或评估过程中的合适时间取自进行接受研究的个体。分析的准确性是特别重要的，因为该测定可以用于在疾病或代谢状态改变的治疗中监测进展，并且用于诊断疾病或代谢状态改变。在本发明的一种优选实施方案中，基于分类的表达水平控制患者治疗，以便准确反应评估的患者的疾病或代谢状态。

[0177]适用于本发明的很多不同分类策略是本领域公知的。优选的策略随着疾病进展的不同阶段鉴定生物标志物的不同表达水平。例如，在肿瘤生长中，肿瘤可能经过一系列从阶段，从新形成到转移。因此，合适的分类方案可以包括“迅速进展”，其特征在于肿瘤生长和/或转移活性；静息，其确定不生长或活跃转移的肿瘤；消退，其确定肿瘤缩小，例如，化疗后；和无肿瘤。

[0178]在一些实施方案中，用诸如“已知样品”的样品产生的谱(如质谱或飞行时间谱)所得到的数据可以用于“训练”分类模型。“已知样品”是已经预先分类的样品。来源于所述谱，并且用于形成分类模型的数据可以称作“训练数据组”。一旦得到训练，分类模型可以识别来自用已知样品建立的谱的数据中的模式。然后可以用分类模型将未知样品分类。这可以用于，例如，预测特定生物样品是否与某些生物状况(如患病与无病)相关。

[0179]用于形成分类模型的训练中的数据组可以包含原始数据或预处理过的数据。在某些实施方案中，可以直接从飞行时间谱或质谱直接获得原始数据，然后可以任选按照上文所述进行“预处理”。

[0180]可以用任何合适的统计学分类(或学习)方法形成分类模型，所述方法试图基于数据中存在的目标参数将数据体分类。分类方法可以是监督的或非监督的。监督或非监督的分类方法的实例描述于″Statistical Pattern Recognition：A Review″，IEEE Transactions onPattern Analysis and Machine Intelligence，Vol.22，No.1，January2000，在此引入其教导作为参考。

[0181]在监督分类中，已知类目的含有训练数据的实例进行学习机制，其学习确定每一已知类的一组或多组关系。然后可以将新数据用于学习机制，其然后用学习到的关系对新数据分类。监督分类处理的实例包括线性回归处理(如多重线性回归(MLR)、部分最小方差(PLS)回归和主要成分回归(PCR))、二元判断树(如回归分配方法，如CART-分类和回归树)、人工神经网络，如回馈网络、判别分析(如Bayesian分类器或Fischer分析)、对数分类器和支持载体分类器(支持载体机制)。

[0182]优选的监督分类法是回归分配处理。回归分配处理采用回归分配树对来源于已知样品的谱进行分类。关于回归分配处理的进一步的细节提供于Paulse等的美国专利申请No.20020138208A1“Methodfor analyzing mass spectra″。

[0183]在其它实施方案中，建立的分类模型可以用监督学习法形成。未监督的分类试图基于训练数据组中的相似性学习分类，而不对训练数据组所来源的谱进行预分类。非监督学习法包括簇分析。簇分析试图将数据分为“簇”或组，其理想地应该具有彼此非常相似，但与其它簇的成员非常不相似的成员。然后用一些距离度量测量相似性，该度量测量数据项之间的距离，并且将彼此接近的数据项簇集在一起。簇集技术包括MacQueen的K-平均值算法和Kohonen的Self-Organizing Map算法。

[0184]用于对生物信息进行分类的学习算法描述于，例如PCT国际公开No.WO01/31580(Barnhill et al.，″Methods and devices foridentifying patterns in biological systems and methods of use thereof”)，美国专利申请No.2002 0193950A1(Gavin et al.；″Method or analyzingmass spectra″)，美国专利申请No.2003 0004402A1(Hitt et al.，″Processfor discriminating between biological states based on hidden patternsfrom biological data″)和美国专利申请No.2003 0055615A1(Zhang andZhang，″Systems and methods for processing biological expressiondata″)。

[0185]可以在任何合适的数字计算机上形成和使用分类模型。合适的数字计算机包括采用任何标准或特定操作系统，如Unix，Windows^TM或Linux^TM的小型、微型或大型计算机。使用的数字计算机可以与用于建立目的质谱的质谱仪物理上分开，或它可以与质谱仪连接。

[0186]可以通过数字计算机执行或使用的计算机代码实现根据本发明实施方案的训练数据组和分类模型。计算机代码可以储存于任何合适的计算机可读介质上，包括光盘、磁盘、记忆棒、磁带等，并且可以用任何合适的计算机编程语言编写，所述语言包括C、C++、visualbasic等。

[0187]上述学习算法可以用于开发已经发现的生物标志物的分类算法，或用于发现确定血管发生状态的新的生物标志物。随后，分类算法通过提供单独或组合使用的生物标志物的诊断值(如截止点)，形成了诊断测试的基础。

[0188]管理患者的治疗

[0189]在提供用于疾病状态诊断和评估愈后的方法，试剂盒和装置中，本发明可以用于提供管理患者的治疗的工具。具体地，本发明可以用于对导致患者中血管发生活性改变的多种疾病进行诊断和评估其治疗。所述状况可以包括，例如，癌症、妊娠、感染(如肝炎)、损伤和关节炎状况。在本发明的某些实施方案中，提供了确定血管发生状态的方法，该方法进一步包括基于该状态管理受试者的治疗。所述管理包括在确定疾病状态后医生或临床人员的行为。例如，如果医生诊断出迅速进展的癌症，则可能需要遵照某些治疗方案，如化疗或手术。或者，可以作出无肿瘤或静息肿瘤的诊断，随后进一步测试，以确定影响患者的具体疾病。

[0190]本发明特别有用的一方面是提供如上文所述可能威胁生命的状况的早期检测。早期诊断使得能够早期治疗该状况，以促进恢复的愈后。例如，早期检测癌症，使得能够进行更早和使虚弱减少的化疗或在转移前手术除去肿瘤。关节炎的早期检测使得能够在关节损伤发生前用药物干预以控制炎症，缓解疾病症状。

[0191]诊断后，用本发明检测生物标志物，使得能够评估采用的治疗方案的有效性。例如，在癌症中，检测到静息肿瘤治疗后CTAPIII生物标志物的表达的减少，这与肿瘤表型改变为迅速进展肿瘤相关。相反，检测到CTAPIII随后的增加，与肿瘤表型从迅速进展改变为静息或无肿瘤相关。

[0192]本发明的其它实施方案涉及将测定结果或诊断或这两者传达给例如技术人员、医生或患者。在某些实施方案中，用计算机将测定结果或诊断或这两者传达给感兴趣一方，如医生及其患者。在某些实施方案中，在一个国家或管辖区进行测定或分析测定结果，该国家或管辖区不同于传达结果或诊断的国家或管辖区。

[0193]在本发明的一种优选实施方案中，在获得诊断后尽快将其传达给受试者，所述诊断基于测试受试者中指示疾病或代谢状态的生物标志物的存在与否。可以由治疗受试者的医生传递诊断结果。或者，可以通过电子邮件发送给测试受试者，或通过电话传达给受试者。可以用计算机，通过电子邮件或电话传达诊断结果。在某些实施方案中，可以得到包含诊断测试结果的信息，并且用电话通讯领域技术人员公知的计算机硬件和软件的组合自动送递给受试者。针对保健领域的通讯系统的一个实例描述于美国专利No.6,283,761；但是，本发明不限于利用该特定通讯系统的方法。在本发明方法的某些实施方案中，可以在多个(如外国)管辖区进行所有或一些步骤，包括测定样品、诊断疾病，和传达测定结果或诊断结果。

[0194]诊断系统

[0195]本发明也涉及用于检测生物标志物的诊断系统，所述生物标志物的表达反应于患者中血管发生活性的改变而改变。本发明的诊断系统优选以单步操作，但不限于此。例如，一些实施方案包括多个吸附表面，其结合多种血小板相关生物标志物。优选地，吸附剂是特异性吸附目的生物标志物的生物特异性吸附剂。本发明的诊断系统也具有检测目的生物标志物的工具，其可以是质谱仪。

[0196]例如，本发明的一个优选实施方案在烧结的玻璃料上接受血浆匀浆物。玻璃料与能够支持液体的毛细流的吸水材料处于流体连通。吸水材料中含有试剂，包括特异性识别待检测的生物标志物的可流动的生物特异性吸附剂。优选地，可流动的生物特异性吸附剂包括可检测标记，更优选是可视标记。吸水材料更下游是识别待检测生物标志物的固定的生物特异性吸附剂。

[0197]采用简单装置，如上文描述的装置，可导入烧结的玻璃料的血浆匀浆物经过过滤，不含细胞碎片。剩余的液体进入吸水材料，其通过毛细作用吸入液体，最终使液体沿其长度分布。在穿过吸水材料时，可流动的生物特异性吸附剂被溶解，并且结合于待检测的生物标志物，形成复合物。随着液体进一步通过吸水材料，复合物遇到并结合固定的生物特异性吸附剂。随着复合物结合固定的生物特异性吸附剂，其在固定的生物特异性吸附剂附着于吸水材料的点浓缩，在此可以检测它。在复合物结合后可以任选用洗涤缓冲液洗涤该装置以除去最初的匀浆物中存在的可能是干扰性的材料。

[0198]本领域技术人员容易理解，存在一些变化的装置形式，其以与此处描述的优选装置基本相同的方式工作。例如，该装置可以采用与微量滴定板孔底偶联的生物特异性试剂，以ELISA型方式工作。以此方式，将匀浆物加入孔。然后除去过量的匀浆物，用洗涤缓冲液洗涤孔。最后，加入标记的可移动抗体，检测得到的复合物。

[0199]本领域技术人员容易理解，上述装置的形式是公知的，其很多变化形式也落在本发明的范围内。例如，相似的装置描述于美国专利Nos：5,409,664、6,146,589、4,960,691、5,260,193、5,202,268和5,766,961。

[0200]癌症的生物标志物在筛选测定和癌症治疗方法中的用途

[0201]本发明的方法也具有其它应用。例如，可以用生物标志物筛选体外或体内调节生物标志物表达的化合物，所述化合物随后可以用于治疗或预防患者的癌症，或治疗或预防肿瘤从静息肿瘤转变为迅速进展的肿瘤。在另一种实例，可以用生物标志物监测对癌症治疗的反应。在另一实例中，可以将生物标志物用于遗传研究，以确定患者是否具有发生癌症的风险。

[0202]因此，例如，本发明的试剂盒可以包括具有疏水功能的固体基质，如蛋白生物芯片(如Ciphergen H50 ProteinChip阵列，如ProteinChip阵列)和用于洗涤基质的醋酸钠缓冲液，以及提供在芯片上测量本发明的血小板相关生物标志物和用这些测量值诊断例如癌症的方案的说明书。

[0203]最初可以通过鉴定与表1A和1B以及表2中列出的一种或多种生物标志物相互作用的化合物而筛选适于治疗测试的化合物。例如，筛选可能包括重组表达表1A和1B以及表2中所列的标志物，纯化标志物，和将生物标志物固定于基质。然后可以使测试化合物与基质接触，通常在含水条件下接触，并通过例如测量作为盐浓度函数的洗脱速度测量测试化合物和生物标志物之间的相互作用。某些蛋白可以识别和裂解表1A和1B以及表2的一种或多种生物标志物，在此情况下可以通过在标准测定中监测一种或多种生物标志物的消化而检测蛋白，所述监测例如是通过蛋白电泳。

[0204]在相关实施方案中，可以测量测试化合物抑制表1A和1B以及表2的一种或多种生物标志物的活性的能力。本领域技术人员可以理解，用于测量特定生物标志物活性的技术将根据生物标志物的功能和特性而改变。例如，可以测定生物标志物的酶活性，前提是能够得到合适的底物，并且前提是底物浓度和反应产物的外观是容易测量的。可能的治疗性测试化合物抑制或增强特定生物标志物活性的能力可以通过测量测试化合物存在或不存在的条件下的催化速度而确定。也可以测量测试化合物干扰表中生物标志物之一的非酶促(如结构)功能或活性的能力。例如，可以在测试化合物存在或不存在的条件下通过质谱监测包含表中生物标志物之一的多蛋白复合物的自组装。或者，如果生物标志物是转录的非酶增强剂，可以通过测量测试化合物存在或不存在的条件下的体内或体外生物标志物依赖性转录水平而鉴定干扰生物标志物增强转录的能力的测试化合物。

[0205]可以给患有癌症或有发生癌症的风险的患者施用能够调节表中任意生物标志物活性的测试化合物。例如，如果特定生物标志物的体内活性防止癌症蛋白的积累，施用增加特定生物标志物活性的测试化合物可以减少患者发生癌症的风险。相反，如果生物标志物活性的增加至少部分导致癌症的发病，施用减少特定生物标志物活性的测试化合物可以减少患者发生癌症的风险。

[0206]另一方面，本发明提供了鉴定用于治疗诸如癌症的病症的化合物的方法，所述病症与表中的血小板相关生物标志物的修饰形式的水平增加相关。例如，在一种实施方案中，可以筛选细胞提取物或表达文库，得到催化全长生物标志物的裂解以形成截短形式的化合物。在所述筛选测定的一种实施方案中，可以通过将荧光团附着于生物标志物而检测生物标志物的裂解，当生物标志物未裂解时该荧光团保持淬灭，但当生物标志物裂解时，该荧光团发出荧光。或者，可以施用经过修饰使得某些氨基酸之间的酰胺键不可裂解的全长形式的生物标志物选择性结合或“捕获”在该位点体内裂解全长生物标志物的细胞蛋白酶。筛选和鉴定蛋白酶及其靶的方法详细记录于科学文献中，如Lopez-Ottin et al.(Nature Reviews，3：509-519(2002))。

[0207]在另一种实施方案中，本发明提供了治疗与截短的生物标志物的水平增加相关的疾病如癌症，或减少其进展的可能性的方法。例如，在鉴定了裂解表中的全长生物标志物一种或多种蛋白后，可以筛选组合文库，得到抑制鉴定的蛋白的裂解活性的化合物。筛选所述化合物的化学文库的方法是本领域公知的。参见，例如，Lopez-Otin et al.(2002)。或者，可以基于血小板相关生物标志物的结构设计抑制性化合物。

[0208]在临床水平，筛选测试化合物包括在受试者暴露于测试化合物之前和之后从测试受试者获得样品。可以测量和分析列于表中的一种或多种血小板相关生物标志物在样品中的水平，以确定暴露于测试化合物后生物标志物的水平是否改变。可以通过此处描述的质谱法分析样品，或者可以通过本领域技术人员公知的合适方法分析样品。例如，可以采用放射或荧光标记的特异性结合于生物标志物的抗体，通过蛋白印迹直接测量表中列出的一种或多种生物标志物的水平。

实施例

[0209]循环血小板含有多种能够修饰血管发生过程的调节剂。血小板附着于异常表面并且将其内容物释放在局部环境中的能力使得它们是局部血管发生因子送递的高度需要的形式。在血管发生的生理状况中，生长因子的这种严格局部释放代表了伤口愈合或再生的高度灵活、安全和有效的系统；但是在病理状况中，如在癌症、慢性炎性病症或血管异常中，它代表了生长的关键旁分泌放大环。

[0210]血小板具有许多针对该受控的、高度排序和局部反应性活动的机制：

i)血小板微粒(PMPs)在肿瘤进展中脱落：肿瘤血管系统使得血小板活化是公知的，这主要是因为它的开口和高度不规则的内皮细胞表面；含有VEGF、bFGF和其它生长因子的PMPs释放到系统循环中，而没有任何明显的赘生物周围的血栓形成事件。

ii)α-颗粒储存能够反应于局部刺激而释放的生长因子和抑制剂：血小板颗粒的内容物依赖于宿主的局部环境，因此反应“肿瘤记录”。

iii)一种以上的过程参与肿瘤进展和播散：PMPs保持生长因子的低水平连续送递，α-颗粒提供促血管发生信号的快速和局限的放大。

[0211]我们将血管发生生长因子的血小板谱和抑制剂称作“血小板记录(register)”。该血小板记录可以用于诊断和治疗目的。

[0212]我们的实验目的是：

1.鉴定由血小板转移的血管发生或肿瘤相关生长因子或抑制剂，即肿瘤谱。

2.鉴定血小板中的储存系统，即，颗粒、致密颗粒或膜颗粒。

3.研究运输这些化合物的机制(即确定颗粒释放的刺激物)。

4.确定PMP是血小板活性的主要机制的临床状况和血小板聚集和脱颗粒对局部因子释放是必须的状况。

研究阶段：

[0213]第1阶段：分离来自不携带肿瘤的SCID和C57B1小鼠的血小板样品，并且进行谱分析。

[0214]第2阶段：将来自不携带肿瘤的SCID小鼠的血小板分离成膜和细胞质级分，并且将因子含量与全血小板提取物比较，以确定特定蛋白的转运系统。

[0215]第3阶段：将携带肿瘤的SCID小鼠的蛋白谱与纯肿瘤细胞提取物的蛋白谱进行比较，以便将转运的生长因子和抑制剂进行关联。

[0216]第4阶段：将来自携带静息(非血管发生性)肿瘤的SCID小鼠的血小板样品与来自携带快速生长(血管发生性)肿瘤的SCID小鼠的血小板样品与相同背景的年龄匹配的不携带肿瘤的小鼠进行比较。

[0217]第5阶段：将来自携带静息(非血管发生性)肿瘤的SCID小鼠的血浆与来自携带快速生长(血管发生性)肿瘤的SCID小鼠的血浆与相同背景的年龄匹配的不携带肿瘤的小鼠进行比较(血浆用作连续释放到循环中，即没有血小板聚集和脱颗粒的因子的替代物)。

[0218]第6阶段：将来自携带静息(非血管发生性)肿瘤的SCID小鼠的血清与来自携带快速生长(血管发生性)肿瘤的SCID小鼠的血清与相同背景的年龄匹配的不携带肿瘤的小鼠进行比较(血清用作在活化的血小板聚集和脱颗粒时释放的因子的替代物)。

[0219]以前的报道提示了血小板包含并转运蛋白，并且该蛋白沿着浓度梯度从血浆进入血小板。但是，我们的结果显示，相对小的VEGF来源，如Matrigel团或显微水平(0.5-1mm³)的肿瘤可以将它们的VEGF直接贡献到血小板，而不升高VEGF的血浆水平。最重要的是，显微水平的、临床不能检测的肿瘤的存在足以诱导携带人脂肪肉瘤的SCID小鼠的血小板挑选特异性血管发生调节剂，并且将“静息”蛋白谱改变为“反映肿瘤的”谱。

[0220]我们进一步证实i)在肿瘤生长存在下螯合在血小板中蛋白主要是血管发生调节剂，如VEGF、bFGF、PDGF、PF4、内皮抑制素、制管张素和肿瘤抑制素；而不是最丰富的血浆蛋白，如白蛋白，和ii)血小板中的血管发生调节剂的水平根据肿瘤或其它血管发生因子源的存在而改变。

[0221]我们假设当疏乎肿瘤标志物的血浆和血清水平时，在肿瘤发生早期，由致癌转变导致的过量血管发生生长因子反映在血小板中。在此处提出研究中，我们证实了血小板在体内和体外积累选定蛋白的能力，并且显示用一种血管发生调节剂选择性替代另一种血管发生调节剂。由于诸如生长因子、抑制剂、辅因子和细胞因子的多种调节剂参与肿瘤进展，我们采用了高通量SELDI-ToF MS(表面增强激光解吸/电离-飞行时间质谱)来分析纯化的血小板和血浆的蛋白谱。该技术使得能够在一个时间对大量临床样品进行质谱分析，并且提供了用于比较完整血小板蛋白组的有效、高度可再现的途径。

[0222]比较携带人类脂肪肉瘤的肿瘤异种移植物的年龄匹配的健康SCID小鼠同窝动物与假注射的不携带肿瘤的动物的血小板谱。与许多关于包含在血小板中的蛋白的报道一致(10-12)，我们发现血小板中共同存在内皮增殖和迁移的至少21种正调节剂和内皮增殖和迁移的至少15种负调节剂。对来自携带人类肿瘤异种移植物的小鼠的相应血浆样品的分析证明在这些调节蛋白中没有显著差异。

[0223]该研究的新发现是肿瘤存在下血小板谱的定制。我们示出了数据，表明血小板具有检测亚临床肿瘤生长的能力，通过选择性摄取血管发生调节剂在肿瘤发生早期反应于肿瘤存在，螯合这些蛋白并且保护其在循环中免受降解，并且很可能促进这些蛋白转运到肿瘤部位。血小板作用的这种定位可能增强肿瘤血管发生而避免许多宿主监督控制，或，例如在肿瘤静息的情况下，保持血管发生抑制剂的必要水平，以使肿瘤生长停滞。

[0224]血小板代表了运输血管发生调节剂的非常精密的系统，并且它们的蛋白谱的临床可行分析给我们提供了比目前更早诊断癌症的能力。

[0225]方法

[0226]由新分离的血小板体外摄取内皮抑制素

[0227]通过在200g将柠檬酸化的全血离心20分钟，从健康人类志愿者的血液中分离富含血小板的血浆(PRP)。将富含血小板的血浆转移到新的聚乙烯试管中，在室温下在轻柔的摇杆上与浓度增加的人重组内皮抑制素(EntreMed Inc.，Rockville，MD)一起温育1小时。温育后，在800g离心PRP，以沉淀血小板，保留上清液(含很少血小板的血浆[PPP])用于随后通过ELIZA进行分析。然后将血小板轻柔重悬于含有1U/ml PGE2的Tyrodes缓冲液中，再次沉淀。以此方式重复洗涤两次，然后通过用Triton X离心除去血小板的膜级分，裂解血小板以进行标准SDS-PAGE分析。用50mM Tris HCL，100-120mM NaCl，5mMEDTA，1％Igepal和蛋白酶抑制剂片(完全的TM混合物，BoehringerManheim，Indianopolis，IN)裂解血小板。用标准Bradford法(Bio-RadLaboratories Inc.，Hercules，CA)使蛋白浓度相等，然后将等量的内皮抑制素蛋白标准物或血小板蛋白裂解物与样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)混合，并且加载到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。转移到PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)上之后，用7％的乳封闭混合物，与以下抗体一起温育：抗人内皮抑制素(courtesy of Kashi Javaherian，Childrens Hospital，Boston)，抗人VEGF(1∶1000，Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA)，或抗人bFGF(1∶1000，Upstate USA Inc.，Charlottesville，VA)。然后用Super SignalWest Pico化学发光试剂盒(Pierce Biotechnology inc.，Rockford，IL)和放射自显影术检测阳性信号。

[0228]血小板对¹²⁵I标记的VEGF的体内摄取

[0229]根据以前建立的方法进行VEGF蛋白的碘化。简言之，将用10μl磷酸钠缓冲液(SPB，0.2M NaHPO4，pH7.2)预温育的IodoBeads(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)与10μg不含载体的rmVEGF(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)和1mCu的¹²⁵碘一起温育。用150μl磷酸钠缓冲液进一步稀释样品，通过含有PBS中的2％明胶的15ml的预平衡的NAD^TM5柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。然后收集15个250μl的级分。在Gamma 5000Beckman Iodine 125(Beckman Instruments，Fullerton，CA)上对每个级分的放射性进行定量，合并含有最大量¹²⁵I标记的VEGF(共500μl)的两个级分，用于实验当天进行的Matrigel测定中。简言之，在植入Matrigel团前一天将C57Bl/6小鼠的左胁腹去毛，以避免微弱的皮肤炎症反应。实验当天，500μl溶于缓冲液的125I-VEGF与500μl不含生长因子的Matrigel(B & D Biosciences，Bedford，MA)混合，并且将100μl该混合物皮下注射到每只小鼠的左胁腹。三天后用吸入麻醉法(1L氧气中的2％异氟烷)麻醉小鼠，通过直接心脏穿刺将1ml全血直接吸入柠檬酸化的注射器(1％的柠檬酸钠终浓度，1/10v/v)，而不打开胸腔。

[0230]以两个离心步骤分离血小板：第一个步骤是在200g，以分离富含血小板的血浆(PRP)，然后在800g离心，以产生血小板沉淀和含很少血小板的血浆级分(PPP)。在γ计数器上对每个血小板样品的放射性进行定量。校正所得值的组织重量差异，并且表示为每克组织每分钟的计数[cpm/g组织]。

[0231]肿瘤细胞和异种移植物模型

[0232]将在免疫缺陷小鼠中形成非血管发生性、显微水平、静息肿瘤或血管发生性快速生长肿瘤的非血管发生性和血管发生性人脂肪肉瘤(SW872)亚克隆的肿瘤异种移植物用作体内实验系统7。也将其它的人类肿瘤，包括乳腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤和骨肉瘤亚克隆到非血管发生和血管发生性肿瘤细胞群。所有的人类非血管发生性肿瘤亚克隆在预定的时间都在体内进行了向血管发生表型的转变，所述预定时间对于脂肪肉瘤是133天的中值±2周，对于乳腺癌是80天。但是，仅仅在脂肪肉瘤中，血管发生转变发生在100％的非血管发生性肿瘤中，此处用该肿瘤证明差异。脂肪肉瘤(SW872)肿瘤细胞系亚克隆均来自单细胞：克隆4是非血管发生性的，并且在变成血管发生性并且进行迅速肿瘤扩展前保持在静息和显微水平的中值是大约133天。克隆9在植入时是血管发生性的，并且迅速扩展。克隆4和克隆9的体内和体外肿瘤细胞增殖速度是相同的。但是，肿瘤细胞在体内的凋亡速度在非血管发生性克隆4中是很高的，在血管发生性克隆9中是很低的(Folkman/Almog，提交用于发表)。

[0233]37℃下在潮湿的5％CO2温育器中在含有5％热灭活的胎牛血清(HyClone，Logan，UT)、1％抗生素(青霉素、链霉素)和0.29mg/mlL-谷氨酰胺的DMEM中培养所有细胞系。对于注射到小鼠中，在磷酸缓冲盐水(PBS)(Sigma，St.Louis，MO)中漂洗80-90％汇合的肿瘤细胞，短暂胰蛋白酶消化，并且悬浮于无血清的DMEM中。在DMEM中洗涤细胞两次，将它们的最终浓度调节到5×10⁶个活细胞/200μl。

[0234]在来自Massachusetts General Hospital(MGH)，Boston，MA的六周龄雄性SCID小鼠胁腹部皮下注射来自单克隆的5×10⁶个细胞(在0.2ml中)。所有实验都是采用研究动物护理和使用委员会批准的方案，按照波士顿儿童医院指南进行的。

[0235]血小板、血浆和肿瘤处理和蛋白谱分析

[0236]通过直接心脏穿刺到柠檬酸化的聚乙烯试管(1％的柠檬酸钠终浓度，1/10v/v)从麻醉的小鼠收集血液，立即在200g离心。然后将上面的相，即PRP转移到新试管，通过在800g进一步离心而分离血小板。用SELDI-TOF技术(Ciphergen，Freemont，California)独立地分析分离的血小板沉淀(P)和含很少血小板的血浆(PPP)上清液。

[0237]在9M脲(U9)，2％CHAPS(3-[(3-氯酰氨基苯基)二甲基氨基]-1-丙磺酸酯)，50mM TrisHCl，pH9中处理来自每只小鼠的血小板沉淀；在4℃以10,000g离心1分钟，按照下文对血小板提取物进行分级分离。对于每只小鼠，用40μlU9缓冲液(9M脲，2％CHAPS，50mMTrisHCl，pH9)使20μlPPP变性，通过在表达差异作图(EDM)血清分级分离方案(Ciphergen，Fremont，CA)后改良的阴离子交换色谱对纯血浆提取物进行分级分离。在装有DPCMicromix 5振荡器的Beckman Biomek2000实验室工作台上的96孔过滤板上进行分级分离。将20μl血小板和肿瘤提取物的等分物和用100μl50mM Tris-HClpH9稀释的60μl变性血浆转移到过滤底96孔微量滴定板中，所述微量滴定板中预先加入了BioSepra Q CeramicHyperD F吸附珠，所述珠用50mM TrisHCl，pH9再水化，并且用50mM Tris-HCl，pH9预平衡。用多屏幕真空汇集管(Millipore，Bedford，MA)从过滤板除去所有液体。4℃下温育30分钟后，将流通液收集为级分I。用2×100μl以下缓冲液温育过滤板，以产生以下级分：1M脲，0.1％CHAPS，50mMNaCl，2.5％乙腈，50mM Tris-HCl(pH7.5，级分II)；1M脲，0.1％CHAPS，50mM NaCl，2.5％乙腈，50mM醋酸钠(pH5.0，级分III)；1M脲，0.1％CHAPS，50mM NaCl，2.5％乙腈，50mM醋酸钠(pH4.0，级分IV)；1M脲，0.1％CHAPS，500mM NaCl，2.5％乙腈，50mM柠檬酸钠(pH3.0，级分V)和33.3％异丙醇/16.7％乙腈/8％甲酸(有机相，级分VI)。

[0238]用弱阳离子交换色谱蛋白阵列(WCX2 ProteinChip^TM阵列；Ciphergen，Fremont，CA)进行ProteinChip阵列上的表达差异作图(EDM)，这是通过将样品级分加载到96孔生物处理器上，并且用50mM醋酸钠，0.1％辛基葡糖苷(Sigma，St.Louis，MO)，pH5.0平衡。将每个阵列点上在100μl相同缓冲液中的40μl阴离子交换色谱级分的进一步稀释液温育1小时。用100μl 50mM醋酸钠，0.1％辛基葡糖苷pH5.0洗涤阵列点。用水漂洗后，在每个阵列点加入2×1μl芥子酸基质溶液。

[0239]对于蛋白谱分析，将所有在各自的缓冲液中以1∶2.5稀释的级分用于预平衡ProteinChip阵列。该步之后是用Protein BiologySystem II SELDI-ToF质谱仪(Ciphergen，Fremont，CA)读数。用蛋白标准物(Ciphergen，Fremont，CA)作为校准物，对读数器进行每日外部校准。用ProteinChip软件Biomarker Edition3.2.0版(Ciphergen，Fremont，CA)处理谱。扣除基线后，通过总离子电流法对谱进行归一化。用Biomark Wizard软件(Ciphergen，Fremont，CA)，在信噪比为3的条件下进行峰检测。

[0240]通过在IgG旋转柱上进行亲和色谱和通过反相色谱进一步纯化候选蛋白生物标志物。采用正常相(NP)ProteinChip阵列监测每个步骤的纯度。用5mM DTT pH9还原主级分，用50mM碘乙酰胺在暗处烷基化2小时。最终的分离是在16％Tricine SDS-PAGE凝胶上进行。用胶体蓝染色试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)对凝胶进行染色。切下选定的蛋白带，室温下在剧烈振荡下用200μl 50％甲醇/10％乙酸洗涤30分钟，用100μl乙腈(ACN)脱水15分钟，用70μl 50％甲酸、25％ACN、15％异丙醇和1.0％水提取2小时。通过在正常相ProteinChip阵列上分析2ul而在此证实提取物中的候选生物标志物。37℃下用20μl溶于50mM碳酸氢铵(pH8)的100ng/μl的修饰的胰蛋白酶(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)消化剩余的提取物3小时。在装有Ciphergen PCI-1000ProteinChip界面的QSTAR质谱仪上获得单MS和MS/MS谱。在CHCA存在下，在NP20 ProteinChip阵列上分析1μl每种蛋白酶消化物的等分物。以单MS模式收集从0.9-3kDa的谱。观察谱后，选择特定离子，并且导入碰撞室以进行CID片段化。使CID谱数据进入数据库采集工具Mascot(Matrix Sciences)以进行鉴定。

[0241]免疫荧光显微镜

[0242]从Becton Dickinson Biosciences获得抗VEGF小鼠单克隆抗体，以5μg/ml使用。兔抗β1微管蛋白抗血清(由Brigham and Women′sHospital，Boston的Nicholas Cowan馈赠)以1∶1000的稀释度使用。从Jackson Immuno Research Laboratories(West Grove，PA)购买具有最小跨物种反应性的Alexa 488抗兔和Alexa 568抗小鼠第二抗体。在装有100X目镜(NA 1.4)和100-W汞灯的Zeiss Axivert 200显微镜上分析细胞。用Orca II冷却的带电耦合装置(CCD)照相机(Hamamatsu)采集图像。在Metamorph软件控制下进行电子栅和图像采集。

[0243]通过加入3.7％的甲醛将静息血小板在悬浮液中固定20分钟。将血小板附着于放置在12孔微量滴定板的孔中的聚赖氨酸包被的盖玻片上，并且在250g离心5分钟。对于激动剂诱导的活化，将血小板以相同方式沉淀在盖玻片上，加入1U/ml凝血酶5分钟。在3.7％的甲醛中将活化的血小板固定20分钟。在含有0.5％Triton X-100的Hank溶液中透化样品，并且用PBS洗涤。在PBS+1％BSA中封闭标本过夜，室温下在第一抗体中温育2-3小时，洗涤，用合适的第二抗体处理1小时，在1％PBS中再次重复洗涤。以PBS+1％BSA中的1mg/ml使用第一抗体，以相同缓冲液中的1∶500稀释度使用第二抗体。相同地处理了对照，但是省略了第一抗体。

结果：

[0244]血小板在体外对血管发生调节蛋白的活跃和选择性摄取。

[0245]用浓度增加的人重组内皮抑制素温育的血小板以剂量依赖性方式摄取蛋白(图1，上面的印迹)。半定量SDS-PAGE分析发现，随着内皮抑制素在血小板中的加载增加，它导致其它天然血小板蛋白如VEGF和bFGF的细胞质重新分布(图1，下面的两个印迹)。由于血小板表面表达高水平的非特异性蛋白结合位点，通过在蛋白裂解前用Triton-X100离心除去血小板膜级分。为了发现血小板对蛋白的摄取过程是随机现象还是螯合的内在机制，我们随后通过以预定的序贯方式加入指定蛋白而攻击血小板。我们发现，用内皮抑制素预先加载的血小板在加入测定时表现出受限制的VEGF摄取，导致内皮抑制素的细胞质水平的一些，但不是完全的减少。相反，内皮抑制素能够导致预先加载的VEGF的更完全的再分布(图2)。

[0246]血小板在体内对血管发生调节蛋白的活跃和选择性摄取。

[0247]为了证明蛋白血小板加载的过程不是体外伪迹，并且为了证明它准确模拟体内现象，我们将含有125I标记的VEGF的Matrigel团(每100μl Matrigel 50-600ng标记的VEGF)皮下植入小鼠中，然后¹²⁵I-VEGF摄取到血小板中(图12)。¹²⁵I-VEGF以剂量依赖性方式优先在血小板内聚集，而血浆中不出现标记的细胞因子(图29)。尽管鼠血小板的短半衰期大约是4-7天，但在最多达3周的时间中在血小板但没有在血浆中检测到¹²⁵I-VEGF(数据未示出)。

[0248]在显微水平的肿瘤存在下血小板在体内对血管发生调节蛋白的活跃和选择性摄取。

[0249]为了确定由小鼠皮下组织中的显微水平的肿瘤分泌的血管发生调节蛋白是否能够被血小板摄取(类似于血小板从植入的Matrigel团摄取VEGF)，按照上文和以前报道的7所述使用人脂肪肉瘤(SW872)的亚克隆。因此，我们在肿瘤植入后32天使用表达差异作图系统(Ciphergen，Fremont，CA)表征和证实候选蛋白标志物。我们比较了注射了200μl无血清培养基(载体)或脂肪肉瘤细胞系的非血管发生或血管发生克隆的5×10⁶个细胞的细胞悬浮液的5只小鼠的血小板和血浆蛋白组。为了比较独立分析的表达图，将实验重复两次。(图30描述了凝胶观形式中血小板血管发生蛋白组的典型分析，以及峰强度的各个统计学分析)。VEGF、bFGF、PDGF、内皮抑制素、制管张素、肿瘤抑制素和血管发生的其它调节剂在来自携带非血管发生性、静息的、显微大小的脂肪肉瘤的小鼠的血小板中显著增加(图30)。血小板相关蛋白以选择性和可定量的方式摄取，明确表明血小板裂解物中VEGF、bFGF、PDGF和血小板因子4的浓度增加，但相应血浆中没有增加。只要存在肿瘤，血小板保持高浓度的螯合的血管发生调节蛋白血小板。尽管在第32天时血管发生性脂肪肉瘤(约1cm³)比非血管发生性静息脂肪肉瘤(＜1mm³)大约100倍，携带非血管发生性肿瘤的小鼠的血小板含有相似地增加水平的血管发生调节蛋白。此时，来自任意肿瘤类型的血浆都不含这些蛋白。但是在大约30天中，随着血管发生性肿瘤进展性生长到大约2cm³，血管发生调节蛋白也开始出现在血浆级分中。相反，这些蛋白从不出现在携带非血管发生性显微水平肿瘤的血浆中。

[0250]用ANOVA检验平均峰强度+/-SE，得到组间差异。对VEGF、bFGF和PDGF的峰强度值的分析发现无肿瘤和携带脂肪肉瘤的动物之间这些蛋白的血小板浓度的显著差异。此外，来自携带非血管发生性脂肪肉瘤的小鼠的血小板含有比在来自携带人类乳腺癌的小鼠的血小板中积累的血管发生调节蛋白高水平的不同血管发生调节蛋白。

[0251]血小板中的VEGF分布

[0252]在该研究开始时，不知道与血小板相关的血管发生调节蛋白是在血小板的膜上平均分布，还是在血小板体的细胞质中分布，还是它们组织在特定颗粒储存体中。为了区别这些可能性并建立VEGF的亚细胞定位，我们在用微管蛋白和VEGF的抗体染色的固定和透化的静息血小板上使用了双标记免疫荧光显微镜。如所预期的，微管蛋白在静息血小板中的边缘微管带中浓集，该结构限定了血小板外周。但是，抗VEGF抗体一致地标记了在血小板细胞质中分布的具点的、小泡样结构(图7，A-C)。共焦显微镜图像的4μm切片的连续堆积发现了血小板细胞质内的具点模式，并且支持免疫活性材料的颗粒性质。

[0253]我们对从凝血酶活化的血小板释放的分析表明，通过用内皮抑制素(图28)或用诸如ADP的温和激活剂(图4)加载血小板，VEGF不释放到血浆中。凝血酶(而不是ADP)能够释放一些，但不是全部的血小板相关VEGF(图4，上图)。这两种激活剂(凝血酶或ADP)都不能释放bFGF。因此我们假设，在激动剂诱导的血小板活化过程中，血小板相关的生长因子是重新分布的，但继续保留在血小板中。为了检验该概念，我们用荧光标记的毒伞素和VEGF双染色了活化的血小板。通过板足和丝足的形成明确显示了预期的血小板形状改变。VEGF保持可见的，其是作为活化的伸展的血小板中的具点形式，与甚至在激动剂诱导的活化后其保持与血小板缔合的概念一致(图7，F)。血小板活化后，VEGF优先沿着丝足并且沿着板足外周重新分布。

[0254]讨论：

[0255]这些结果表明，循环血小板摄取小鼠中的人肿瘤产生的血管发生调节蛋白。这些条件下摄取的蛋白与正常血小板中包含的大约30种血管发生调节蛋白，即bFGF、VEGF、内皮抑制素、制管张素等基本相同。我们将该选定的蛋白组命名为“血小板血管发生蛋白组”以强调生理条件下反应蛋白浓度的稳定性。在正常条件下，该蛋白组的成员似乎改变非常小。但是，在携带肿瘤的小鼠中，肿瘤诱导的血管发生调节蛋白的摄取显著改变血小板血管发生蛋白组，并且只要宿主中存在存活的肿瘤，螯合的肿瘤来源的血管发生调节蛋白(即VEGF或bFGF等)的增加的浓度保持升高。

[0256]循环血小板可以摄取和螯合从小肿瘤团块，即，小于1mm³的癌释放的血管发生调节蛋白。这相当于重量超过20,000毫克的宿主小鼠中小于1毫克的肿瘤团块。这种大小的肿瘤至少目前不能临床检测。实验上，它可以用生物发光进行鉴定，即，用植入前用绿色荧光蛋白基因转染或感染了荧光素酶的肿瘤细胞进行鉴定。这些肿瘤是从皮下或原位植入的克隆的非血管发生性人类癌细胞产生的，并且可以在立体照相放大时手术暴露。它们在数月或一年以上的时间中保持静息和无害，直到在可预测的时间，它们的可预测的百分比转变为血管发生表型，并且开始以与它们的血管发生对应物相似的速度生长。非血管发生性肿瘤从不自发代谢，但其中的肿瘤细胞在注射到尾静脉中时将在肺中形成显微水平的良性静息转移灶。相反，在血管发生转变后，自发转移不是非常见的(20)。这些非血管发生性静息肿瘤中的肿瘤细胞进行高速增殖，其由高速凋亡平衡，这与我们的发现一致，即与血管发生对应物相比，非血管发生克隆中的内皮抑制素水平增加(图30)。以前描述过由于阻断血管发生而导致的肿瘤静息(21，22)。

[0257]由非血管发生性显微水平的肿瘤分泌的血管发生调节蛋白螯合在血小板中，不出现在血浆中，并且只要肿瘤存在，就持续加入血小板血管发生蛋白组中的蛋白基线水平。当非血管发生性肿瘤转变为血管发生性表型并且开始扩展其肿瘤团块时，由肿瘤分泌的血管发生调节蛋白也可以出现在血浆中。

[0258]肿瘤来源的血管发生调节蛋白的血小板螯合涉及一个过程，通过该过程，这些蛋白被循环血小板内化，并且通过仍然有待阐明的机制重新分布到血小板内的不同区室。血小板储存区室由α-颗粒、致密颗粒和溶酶体组成，其中α-颗粒形成最大的区室。很多血小板蛋白在巨核细胞中合成，其它明显存在于外周。诸如PF4和血小板反应蛋白的血小板特异性蛋白由包括巨核细胞的很多细胞合成，并且以400倍的浓度在血小板中浓集。其它如因子V、血小板反应蛋白或P-选择蛋白由非巨核细胞合成，并且由血小板摄取。最明确的血小板非选择性蛋白是纤维蛋白原，其由肝细胞合成，并且由血小板α-颗粒摄取(14-16)。血小板储存区室的显著灵活性使我们确信血小板参与肿瘤的扩增和维持。我们发现，大浓度的VEGF、bFGF或内皮抑制素可以被血小板摄取、内化和浓集。新的血小板暴露于浓度增加的内皮抑制素，替代来自它们的细胞质储存的内皮生长因子，如bFGF和VEGF(图1)，表明这些蛋白的流体的、高度可接受的运输。

[0259]蛋白的血小板摄取的调节存在至少两种可能性。血小板的储存区室可能能力有限，并且必须替代蛋白以容纳新蛋白的摄取，或更可能地，由特定的血小板调节的对因子的亲和力控制摄取。后一模型将更符合以下发现，即血小板的顺序加载导致选择性摄取，并表示所有蛋白都以相等的效力被替代。尽管内皮抑制素在预先加载了VEGF的血小板中摄取是完全的、不受阻碍的(图2的第1道)，并且导致预先加载的VEGF的重新分布(图2的第2道)，相反的实验导致了预先加载的内皮抑制素的不完全的重新分布。

[0260]一个重要的发现是携带肿瘤的小鼠的血浆中血管发生调节蛋白的相对缺乏。这种最常见的临床分析物表明血管发生蛋白的最小差异或无差异。这表明，与通常的观点相反，血小板可能不进行生长调节剂不受控制地释放到循环中的脱颗粒过程，而是在肿瘤或伤口部位在严格控制下释放这些调节剂。这与我们用VEGF和bFGF ELISA对从活化的血小板的释放速度的体外分析一致，其中在激动剂诱导的血小板活化中释放了最小量的VEGF，bFGF则完全没有释放(图28)。

[0261]如果如此，我们预测显著量的VEGF将在活化后保持定位在活化的血小板。采用利用了抗固定和透化的静息血小板的微管蛋白和VEGF的抗体和活化的血小板的毒伞素和VEGF的双标记免疫荧光显微术，我们检验了VEGF的细胞内定位。抗VEGF一致地标记了静息血小板的细胞质中具点的、小泡样结构，表明免疫活性材料的颗粒性质。在活化的血小板的双标记免疫荧光上，VEGF沿着丝足和沿着板足的外周重新分布(图7)，与甚至在激动剂诱导的活化后其保持与血小板缔合的概念一致。通过板足和丝足的形成明确显示了预期的血小板形状改变，并且通过荧光毒伞素显现。这种重新分布的模式指出了VEGF在血小板的边缘，以便随组织直接交换这些蛋白的可能性，并且可以解释组织蛋白酶在肿瘤中的导入。还不清楚哪些特异性蛋白酶可以作用于从肿瘤相关血小板聚集物释放血管发生调节剂。

[0262]我们已经证明了血管发生调节剂的血小板摄取过程是高度特异性的，反映了肿瘤状态，即静息与临床扩展，并且在临床可检测的肿瘤之前就充分存在。我们认为，系统循环中的这种新的区室优于血管发生标志物的血浆和血清分析，并且提供了用于非常早期癌症诊断的稳定、灵敏和可靠方法。“血小板血管发生蛋白组”可以用作肿瘤血管发生转变的早期记录，非常类似脂质谱用于鉴定具有动脉粥样硬化和心肌梗塞的风险的患者。这种预测的生物标志物可以筛选具有发生癌症的风险的患者。与其它生物标志物一起使用(23)，我们可以在临床症状前诊断癌症复发年，或改进患有BRCA癌症基因突变和发生乳腺癌的高风险的女性的监测。

[0263]最近对相对无毒的血管发生抑制剂的开发可以给我们提供“处理生物标志物”而不“看见”肿瘤的机会，也就是说，治疗具有无病癌症的患者的机会(24)。在美国和27个其它国家已经批准了一些血管发生抑制剂，其它的也已经处于晚期临床试验。医学实践(其中血液或尿指导治疗，而不需要解剖定位)中的类似性包括治疗怀疑的感染或用降脂药剂防止将来的心肌梗塞。

[0264]此处报道的结构揭示了新的血小板生物，其可以用于了解很多血管发生依赖性疾病的再现、发生、修复，和理解所述疾病。

[0265]在肿瘤或创伤对内皮细胞，即血管衬进行分布后，循环血小板在该位点定位、扩增和持续到促凝反应。血管损伤部位的血小板附着和聚集不仅仅临时栓塞受损的血管，也将随后的促凝事件定位到损伤部位，并且防止凝血的系统活化。令人感兴趣的是，我们发现一些定位作用在肿瘤部位对血管发生刺激物进行定位、扩增和持续。

[0266]血小板储存区室由α-颗粒、致密颗粒和溶酶体组成，其中α-颗粒形成最大的区室。储存的蛋白在巨核细胞中合成(血小板特异性蛋白如PF4和血小板反应蛋白)，由包括巨核细胞的很多细胞合成，并且以最多400倍的浓度在血小板中浓集(血小板选择性蛋白，如因子V、血小板反应蛋白或P选择蛋白)，或由其它细胞合成，并且由血小板摄取(血小板非选择性蛋白如纤维蛋白原(14-16))。后一区室的显著灵活性使我们确信在临床出现癌症前，血小板可能在肿瘤进展早期参与肿瘤的扩增和维持。

[0267]我们首先通过用血管发生调节剂离体“加载”血小板检验了该假设，并且发现大浓度的VEGF、bFGF或内皮抑制素可以摄取、内化和浓集在血小板中。仅仅通过SDS-PAGE测定在高于生理水平的内皮抑制素中暴露1小时的新血小板的细胞质部分，我们发现随着血小板中内皮抑制素浓度增加，诸如bFGF和VEGF的内源生长因子水平减少(图1)。我们进行了努力，消除以下可能性，即血小板裂解物中内皮抑制素水平的增加是由于通过排出膜蛋白而对血小板表面进行的非特异性结合。我们假定了调节这些蛋白的血小板摄取存在至少两种可能性。血小板的储存区室可能具有有限的能力，必须替代一些蛋白，以便新蛋白被摄取，或者通过一些特异性血小板调节的亲和力控制摄取。后者，即更具有选择性的机制，似乎是更有可能的过程，因为用蛋白对血小板的序贯加载似乎不受蛋白浓度梯度的影响，并且因为并不是所有蛋白都以相同效力替代。例如，与内皮抑制素加载对照相比，内皮抑制素在预先加载了VEGF的血小板中的摄取不仅是完全的、不受阻碍的(图2的第1道)，并且导致预先加载的VEGF的完全替代(图2的第2道)。相反的实验，即，VEGF在预先加载了内皮抑制素的血小板中的加载与对照相比也增强，但导致预先加载的内皮抑制素的较不完全的替代。

[0268]我们然后继续证明体内模型中血小板对生长因子的选择性摄取。我们将¹²⁵I标记的富含VEGF的不含生长因子的Matrigel团植入健康的未处理的免疫活性小鼠，并且比较¹²⁵I在高度血管化的器官如肾、脾和肝中的分布，已知这些器官组成型表达VEGF，其分布在血液中。如图3所示，碘化的VEGF以比其在血浆中浓度过量多倍的浓度在血小板中浓集。这表明血小板实际上可以通过送递血管发生调节剂局部增强血管发生。这种送递在诸如创伤和组织修复的生理状况(其中完整的反馈机制迅速灭活功能性血管发生)和在肿瘤发生(其中在转化后，促血管发生刺激物持续存在)很可能是不同的。

[0269]为了在不采用预先察觉或已知的生物系统的条件下分析很多参与血管发生的起始和维持的因子，我们采用了蛋白组方法。与时间上恒定的基因组相反，细胞特异性蛋白表达依赖于细胞内和细胞外参数，并且保持显著反应性和可变性。在血小板的情况下，我们需要使用高通量蛋白组分析如SELDI-ToF，所述血小板除了从巨核细胞中基因的可变剪接得到的复杂蛋白产物和血小板天然蛋白的翻译后修饰外，其内容物也反应于组织需要而改变。该技术迅速代替了常规的二维电泳和随后的基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)的组合(17；18)，因为它允许准确和可再现地分析实验组内和之间的血小板蛋白组。我们采用了确立的人脂肪肉瘤SW-872的非血管发生性(静息)和血管发生性变体的模型(18)，其中血管发生驱动力的增加与从静息的逃离相关。随后，我们比较了注射了200μl无血清培养基(载体)或脂肪肉瘤细胞系的静息或血管发生克隆的5×10⁶个细胞的细胞悬浮液的5只小鼠的血小板和血浆蛋白组。非血管发生变体保持静息80-100天，此时100％的肿瘤开始以与血管发生对应物相似的速度生长。比较了32天时的血小板和血浆蛋白谱，此时静息肿瘤平均0.8-1mm³，它们的血管发生性对应物是18-30mm³。从该分析得到了两个重要发现。首先，血浆样品，即临床监测中最常测定的体液没有发现血管发生蛋白谱中的任何显著差异。令人感兴趣的是，发现许多血管发生调节剂在携带肿瘤的小鼠的血小板中差异表达。令人感兴趣的是，图21中选定蛋白表达图的实例明确证明了这些因子在携带小的静息肿瘤的小鼠血小板中相似的上调程度。这可能最初看起来是组成型的，但如果重新考虑我们以前推定的假设，即血小板增强局部血管发生，则可能提示血小板对静息肿瘤分泌的相对小量蛋白的螯合可能随后受到保护，避免血浆丝氨酸蛋白酶的降解，并且促进有效送递到肿瘤生长部位。假注射对照、非血管发生性和血管发生性肿瘤的表达峰强度的统计学分析发现生长因子的血浆和血小板水平之间以及假注射动物和携带肿瘤的动物的血小板之间存在显著差异。尽管静息克隆中VEGF和bFGF的增加从未达到统计学显著性，这一发现在三个独立实验中是一致的，并且早在肿瘤植入后19天就变得明显(图23C)。

[0270]如果血浆不作为血小板携带的调节剂分泌的中间相，可能需要推断替代的机制。我们采用了VEGF的实例，即肿瘤发生的一种最重要的引发剂，并且在血小板活化之前、过程中和之后用免疫荧光检测其细胞内分布。在静息血小板中，大多数VEGF定位于血小板的细胞内、细胞质部分(图6，左下图片)，沿着细胞膜移动到VEGF的环形排列(图6，参见右下图片的插图)，然后沿着活化血小板的伪足(图6，右下图片)。活化诱导的血小板胞吐作用的模式更加表明血小板的细胞内容物与组织的直接交换，而不是常规采用的血小板的细胞内容物“释放”到循环中。

[0271]此外，血小板相关血管发生调节剂似乎受到“保护”而避免降解，因为它们在循环中比它们的血浆或血小板对应物持续更长时间。例如，即使在数分钟内就测量到了报道的VEGF的循环半衰期，由血小板从植入的Matrigel中挑选的¹²⁵I标记的VEGF在循环中持续存在数日(数据未示出)。这可以解释为什么在我们的大多数寻找在血清或血浆水平浓集的早期诊断或治疗反应标志物的临床试验中迄今没有产生任何显著进展。甚至这些循环因子在愈后中的使用似乎限于鉴定具有大肿瘤体积并因此愈后很差的患者亚组。

[0272]基于我们的研究，我们提出(1)血小板直接摄取血管发生调节剂，而各个蛋白的血浆水平没有相应增加；(2)血小板保护这些调节剂免受丝氨酸蛋白酶的降解，导致它们的循环半衰期延长；和(3)血小板可以将这些生长因子送递到活化的内皮(肿瘤)部位，而不需要升高这些蛋白的血浆水平。这可以代表诸如伤口愈合的生理状况下生长因子送递的非常有效的机制，并且对严重应激或创伤过程中缺乏这些细胞因子的副作用提供解释。以相同的方式，这种机制也可以提供具有在宿主中“寄生”并且避免用目前可获得的临床工具(19)进行的早期检测的能力的肿瘤。

[0273]我们的数据表明，血小板能够在癌症发生的非常早期和静息过程中“检测”血管发生调节性蛋白要求，并且它们能够通过选择性“摄取”血管发生调节剂而“应答”该要求。很可能这是血管发生调节剂保持“受保护”而免受血浆蛋白酶降解的机制，因此可以以增加的浓度“送递”到肿瘤部位。

[0274]结论：

[0275]目前正在理解血小板送递生长因子的灵活性和特异性，这可能是因为它们被认为是导致物而不是效应物。我们已经证明血管发生调节剂摄取到血小板中的过程是高度特异性的，反应了肿瘤状态(即静息与临床扩展)，并且在临床可检测的肿瘤之前发生。系统循环中的这种新的区室(其中的生长因子受到保护而免受降解)的鉴定提供了用于早期癌症诊断的稳定、灵敏和可靠方法。此外，作为肿瘤发生的早期“记录”的血小板的鉴定提示，它们应该被用于肿瘤生长的早期检测。

[0276]令人感兴趣的是，内皮细胞生长的调节剂和/或血管发生的促进剂代表了由血小板运输的大多数蛋白，该血小板中有限数目的其它蛋白被差异表达。

[0277]F4是第一种被发现并测序的趋化因子，其是血小板特异性的，并且仅仅在巨核细胞中合成。PF4并不像经典趋化因子那样起作用。与原型CXC趋化因子IL-8不同，它(1)不诱导白细胞趋化；(2)不导致溶酶体颗粒的脱颗粒；(3)通过IFA-1然后是MAC-1促进的IL-8附着导致更强的对内皮的附着；和(4)是TNF-α存在下继发颗粒胞吐作用的选择性诱导剂(IL-8不具有的作用)(Brant et al，2000)。中性粒细胞反应于PF-4对内皮的牢固粘附可以是在血液湍流存在下维持细胞-细胞接触的系统，并且牢固粘附后胞吐作用的诱导可以使血管发生调节剂避免被冲洗掉。

[0278]当三肽ELR存在于第一个CXC结构域之前时，CXCR趋化因子总体上是促血管发生的，但当该基序不存在时，是抗血管发生的(Strieter R，Polverini JBC 1995)。令人感兴趣的是，全长四聚体(ELR阴性的)PF-4的施用抑制肿瘤生长和转移(Sharpe et al.，J Nat Can Inst1990 & Kolber et al.，J Nat Can Instit，1995)，其抗血管发生作用主要是由于干扰FGF-2和VEGF与其各自受体结合的能力(Perollet et al.，Blood 91：3289-3299，1998 & Gengrinovitch et al.，JBC 270，15059-15065，1995)。

[0279]最差异表达的蛋白之一是结缔组织活化肽(CTAPIII，也称作低亲和力PF4)。CTAPIII、中性粒细胞活化肽-2(NAP-2)和β-血小板反应蛋白都通过蛋白水解产生自血小板碱性蛋白，其在携带静息和血管发生性脂肪肉瘤的小鼠中的血小板中以高浓度存在。在人类脂肪肉瘤的静息和血管发生性克隆中对该血小板相关乙酰肝素酶的水平增加的鉴定，支持了血小板乙酰肝素酶在癌症的早期局部侵入以及维持肿瘤生长和转移播散中的重要作用。

[0280]硫酸乙酰肝素，即CTAPIII的靶，是细胞外基质和脉管系统基底层的一种重要成分，其作为转移和炎性细胞向外侵入的屏障。令人感兴趣的是，CTAPIII在pH5-7时起最佳作用(5.8时具有峰值最佳活性)，这使其成为在相对酸性的肿瘤环境中高度适合的乙酰肝素酶。

[0281]采用血小板的SELDI-ToF质谱，我们发现可以用血小板的新特性检测目前存在的诊断方法不能检测到的显微水平的肿瘤。血小板血管发生谱比单一生物标志物范围更广，因为它可以检测多种肿瘤类型和肿瘤大小。血小板血管发生谱的相对改变使得能够在肿瘤发展中对其运输，所述发展从原位癌早期开始。

[0282]引入在此引用的参考文献作为参考。

表1A：血管发生的刺激剂

血管发生调节剂(生物标志物)	在血小板中的位置	参考文献
			VEGF	α-颗粒	Angiogenesis.2001；4(1)：37-43.；Am.J.Physiol.1998；275，H1054-H1061；J.Physiol.Paris 2000；94，77-81；Proc.Natl.Acad.Scl.USA 1997；94：663-668；Thromb Haemost.1998 Jul；80(1)：171-5
PDGF	α-颗粒	Proc.，Natl.Acad.Sci.USA 1997；76，4107-4111；Endocrinology，1989Apr；124(4)：1841-8；Biochem J.1981Mar1；193(3)：907-13
			bFGF	α-颗粒	Blood.1993；82(2)：430-5；Blood.1993Feb1；81(3)：631-8
肝细胞生长因子(HGF)	α-颗粒	Proc Natl Acad Sci USA.1986Sep；83(17)：6489-93
			促血管生成素-1	α-颗粒
胰岛素样生长因子(IGF)-1和2	α-颗粒	Blood.1989 Aug 15；74(3)：1084-92；Blood.1989 Aug 15；74(3)：1093-1100
			表皮生长因子(EGF)	α-颗粒	Am J Pathol.1990 Oct；137(4)：755-9.；Regul Pept.1992 Jan 23；37(2)：95-100
鞘氨醇-1磷酸	α-颗粒	Biochem Biophys Res Commun.1999 Nov2；264(3)：743-50.Biochem Biophys ResCommun.1999 Nov 2；264(3)：743-50.
			BDNF	未知	Thromb Haemost.2002 Apr；87(4)：728-34；Biochem Pharmacol.1997 Jul1；54(1)：207-9.；J Neurosci.1990Nov；10(11)：3469-78.
胸苷磷酸化酶	α-颗粒
			玻连蛋白	α-颗粒
纤连蛋白	α-颗粒
			纤维蛋白原	α-颗粒
乙酰肝素酶	α-颗粒
			VEGFR2
PDGFR

表1B：血管发生的抑制剂

血管发生调节剂(生物标志物)	在血小板中的位置	参考文献
			TSP-1	α-颗粒	FEBS Lett.1996；386(1)：82-6.
TSP-2		Blood.2003 May 15；101(10)：3915-23.
			内皮抑制素	未知	Cell 1997；88，277-285；Proc Natl Acad Sci USA.2001；98(11)：6470-5
TGF-β1	α-颗粒	Platelets.2003 Jun；14(4)：233-7
			HGF片段	α-颗粒	Oncogene.1998 Dec；17(23)：3045-3054
PF-4	α-颗粒	Science.1990 Jan 5；247(4938)：77-9
			纤溶酶原(制管张素)	α-颗粒
纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)-1	α-颗粒	Blood.1996 Jun 15；87(12)：5061-73
			α-2抗纤溶酶	α-颗粒	Circ Res.2000 May 12；86(9)：952-9
α-2巨球蛋白	α-颗粒	J Biol Chem.1993 Apr 15；268(11)：7685-91；Blood.2001 Jun 1；97(11)：3450-7
			TIMPS	α-颗粒
HMK结构域5	α-颗粒
			纤连蛋白片段	α-颗粒
EGF片段	α-颗粒
			肿瘤抑制素	未知

表2：其它生物标志物

标志物	P值	ProteinChip测定
			10.7，34-39kD血管内皮生长因子(VEGF)	＜0.05	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤
20-25.7kD血小板来源的生长因子(PDGF)	＜0.05	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤
			11，14.7，15，16.5kD碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)	＜0.05	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤
8206Da血小板因子4(PF4)	＜0.01	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤
				＜0.01	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在CM10上，用50mMTrisHCl pH7.5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤
13.8，20.3kD内皮抑制素	＜0.05	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤
			13.8，27.4kD肿瘤抑制素	＜0.05	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤

13.6，20.6，23.9-24.7kD 金属蛋白酶的组织抑制剂	＜0.05	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤
				＜0.05	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤直接在IMA C30-Cu上，用50mM TrisHCl pH7.5洗涤直接在Q10上，用50mMTrisHCl pH7.5洗涤
8.7，8.9kD IL8	＜0.05	级份1和2，WCX，用50mM醋酸钠pH5洗涤

参考文献

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24.Folkman，J.& Kalluri，R.Cancer without disease.Nature 427，787(2004).

[0283]引入在此引用的参考文献作为参考。

Claims (33)

1.检测个体中的血管发生疾病或病症的方法，包括以下步骤：

a.在第一时间点从所述个体分离血小板；

b.分析所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；

c.在第二时间点从所述个体分离血小板，所述第二时间点在所述第一时间点之后；

d.分析来自所述第二时间点的所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；和

e.将来自第一时间点的所述血管发生调节剂水平与来自第二时间点的所述血管发生调节剂水平进行比较，其中来自所述第二时间点的血小板中所述至少一种血管发生正调节剂的水平增加或来自所述第二时间点的血小板中至少一种血管发生负调节剂的水平减少，表示存在血管发生疾病或病症。

2.检测个体中的癌症的方法，包括以下步骤：

a.在第一时间点从所述个体分离血小板；

b.分析所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；

c.在第二时间点从所述个体分离血小板，所述第二时间点在所述第一时间点之后；

d.分析来自所述第二时间点的所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；和

e.将来自第一时间点的所述血管发生调节剂水平与来自第二时间点的所述血管发生调节剂水平进行比较，其中来自所述第二时间点的血小板中所述至少一种血管发生正调节剂的水平增加或来自所述第二时间点的血小板中至少一种血管发生负调节剂的水平减少，表示存在癌症。

3.治疗患有血管发生疾病或病症的个体的方法，包括以下步骤：

a.在第一时间点从所述个体分离血小板；

b.分析所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；

c.在第二时间点从所述个体分离血小板，所述第二时间点在所述第一时间点之后；

d.分析来自所述第二时间点的所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；

e.将来自第一时间点的所述血管发生调节剂水平与来自第二时间点的所述血管发生调节剂水平进行比较，其中来自所述第二时间点的血小板中所述至少一种血管发生正调节剂的水平增加或来自所述第二时间点的血小板中至少一种血管发生负调节剂的水平减少，表示存在血管发生疾病或病症；和

f.给表明具有血管发生疾病或病症的个体施用治疗。

4.权利要求3的方法，进一步包括：(g)在第三时间点从所述个体分离血小板，所述第三时间点在所述第二时间点之后并且在治疗开始之后；(h)分析来自所述第三时间点的所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；和(i)将来自第二时间点的所述血管发生调节剂水平与来自所述第三时间点的所述血管发生调节剂水平进行比较，其中与所述第二时间点的水平相比，来自所述第三时间点的血小板中所述至少一种血管发生正调节剂的水平减少或来自所述第三时间点的血小板中至少一种血管发生负调节剂的水平增加，表示治疗有效。

5.权利要求1、2或3的方法，其中所述血小板分离自血液样品。

6.权利要求1、2或3的方法，其中血管发生正调节剂选自VEGF-A(VPC)、VEGF-C、bFGF、HGF、促血管生成素-1、PDGF、EGF、IGF-1、IGF BP-3、BDNF、基质金属蛋白酶(MMPs)、玻连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、乙酰肝素酶和鞘氨醇-1 PO₄。

7.权利要求1、2或3的方法，其中血管发生负调节剂选自PF-4、血小板反应蛋白-1和2、HGF的NK1、NK2、NK3片段、TGF-β-1、纤维蛋白原(制管张素)、纤维蛋白原激活剂抑制剂1、α-2抗纤溶酶及其片段、α-2巨球蛋白、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)、β-血小板球蛋白、内皮抑制素、肿瘤抑制素和可溶性VEGFR2。

8.权利要求1、2或3的方法，其中用选自下组的方法分析血小板中至少一种血管发生调节剂的存在：蛋白阵列、ELISA、蛋白印迹、表面增强激光解吸电离谱(SELDI)和质谱法。

9.权利要求1、2或3的方法，其中个体具有对癌症的遗传倾向。

10.权利要求9的方法，其中对癌症的遗传倾向是肿瘤阻抑基因的突变。

11.权利要求10的方法，其中肿瘤阻抑基因选自BRCAl、BRCA2、p53、p10、LKBl、MSH2和WTl。

12.权利要求1、2或3的方法，其中个体以前进行过癌症或血管发生疾病或病症的治疗。

13.权利要求1、2或3的方法，其中个体被认为是健康、无病个体。

14.权利要求1、2或3的方法，其中所述第二时间点是所述第一时间点后至少1个月。

15.权利要求1、2或3的方法，其中所述第二时间点是所述第一时间点后至少2个月。

16.权利要求1、2或3的方法，其中所述第二时间点是所述第一时间点后至少6个月。

17.权利要求1、2或3的方法，其中所述第二时间点是所述第一时间点后至少10个月。

18.权利要求1、2或3的方法，其中所述第二时间点是所述第一时间点后至少1年。

l9.权利要求1、2或3的方法，其中癌症选自胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系统癌和膀胱癌。

20.权利要求3的方法，其中所述治疗选自血管发生抑制剂、放疗、化疗和手术治疗。

21.权利要求20的方法，其中所述血管发生抑制剂选自制管张素、Bevacizumab(Avastin)、美替克仑、Canstatin、Caplostatin、Combretastatin、内皮抑制素、NM-3、血小板反应蛋白、肿瘤抑制素、2-甲氧基雌二醇、Vitaxin、ZD1839(Iressa)、ZD6474、OSI774(Tarceva)、CI1033、PKI1666、IMC225(Erbitux)、PTK787、SU6668、SU11248、Herceptin和IFN-α、CELEBREX^(塞来昔布)、THALOMID(沙立度胺)和IFN-α。

22.权利要求2和3的方法，其中所述血管发生疾病或病症选自视网膜病、糖尿病视网膜病、黄斑变性、再狭窄、炎性疾病、关节炎、类风湿关节炎、牛皮癣、克隆氏病、良性肿瘤、血管瘤、神经纤维瘤和肉芽肿。

23.检测个体中的血管发生疾病或病症的方法，包括以下步骤：

a.从个体分离血小板；

b.分析所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；和

e.将来自个体的所述血管发生调节剂水平与来自标准物的所述血管发生调节剂水平进行比较，其中与标准物相比，来自个体的血小板中所述至少一种血管发生正调节剂的水平增加或来自个体的血小板中所述至少一种血管发生负调节剂的水平减少，表示存在血管发生疾病或病症。

24.权利要求23的方法，进一步包括给表明具有血管发生疾病或病症的个体施用治疗。

25.权利要求23的方法，其中血管发生疾病或病症选自胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系统癌、膀胱癌、视网膜病、糖尿病视网膜病、黄斑变性、再狭窄、炎性疾病、关节炎、类风湿关节炎、牛皮癣、克隆氏病、良性肿瘤、血管瘤、神经纤维瘤和肉芽肿。

26.确定抗血管发生治疗在个体中有效的可能性的方法，包括：

a.在第一时间点从个体分离血小板；

b.分析所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；

c.给所述个体施用抗血管发生治疗；

d.在第二时间点从所述个体分离血小板，所述第二时间点在所述第一时间点之后并且在治疗开始之后；

e.分析来自所述第二时间点的所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；和

f.将来自第一时间点的所述血管发生调节剂水平与来自所述第二时间点的所述血管发生调节剂水平进行比较，其中来自所述第二时间点的血小板中所述至少一种血管发生正调节剂的水平减少或来自所述第二时间点的血小板中至少一种血管发生负调节剂的水平增加，表示治疗有效。

27.确定测试治疗在调节血小板血管发生调节剂水平中的有效性的方法，包括：

a.在第一时间点从宿主分离血小板；

b.分析所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；

c.给所述宿主施用测试治疗；

d.在第二时间点从所述宿主分离血小板，所述第二时间点在所述第一时间点之后并且在测试治疗开始之后；

e.分析来自所述第二时间点的所述血小板，得到至少一种血管发生正调节剂或至少一种血管发生负调节剂的水平；和

f.将来自第一时间点的所述血管发生调节剂水平与来自所述第二时间点的所述血管发生调节剂水平进行比较，其中来自所述第二时间点的血小板中所述至少一种血管发生正调节剂的水平减少或来自所述第二时间点的血小板中至少一种血管发生负调节剂的水平增加，表明测试治疗在调节血小板血管发生调节剂水平中的有效性。

28.权利要求27的方法，进一步包括确定哪些血管发生调节剂受到了调节。

29.建立血管发生疾病或病症的血小板记录或血小板谱的方法，包括：

a.从两组个体分离血小板，一组患有已知的血管发生疾病或病症(血管发生组)，第二组没有血管发生疾病或病症(对照组)；

b.分析来自血管发生组和对照组的所述血小板，得到血小板相关生物标志物的水平；

c.计算每组中每种血小板相关生物标志物的平均水平；

d.评估每组中的生物标志物以确定差异；和

e.建立特定血管发生疾病或病症的血小板记录，其中该记录是在血管发生组与对照组中差异表达的生物标志物列表。

30.权利要求28的方法，其中血管发生疾病或病症选自胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系统癌、膀胱癌、视网膜病、糖尿病视网膜病、黄斑变性、再狭窄、炎性疾病、关节炎、类风湿关节炎、牛皮癣、克隆氏病、良性肿瘤、血管瘤、神经纤维瘤和肉芽肿。

31.检测个体中的血管发生疾病或病症的方法，包括以下步骤：

a.在第一时间点从所述个体分离血小板；

b.分析所述血小板，得到至少一种血小板相关生物标志物的水平；

c.在第二时间点从所述个体分离血小板，所述第二时间点在所述第一时间点之后；

d.分析来自所述第二时间点的血小板，得到至少一种血小板相关生物标志物的水平；和

e.将来自第一时间点的所述血小板相关生物标志物水平与来自第二时间点的所述血小板相关生物标志物水平进行比较，其中来自所述第二时间点的血小板中所述血小板生物标志物的水平增加或减少，表示存在血管发生疾病或病症。

32.权利要求31的方法，进一步包括给表明具有血管发生疾病或病症的个体施用治疗。

33.权利要求31的方法，其中血管发生疾病或病症选自胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖-泌尿系统癌、膀胱癌、视网膜病、糖尿病视网膜病、黄斑变性、再狭窄、炎性疾病、关节炎、类风湿关节炎、牛皮癣、克隆氏病、良性肿瘤、血管瘤、神经纤维瘤和肉芽肿。

34.监测进行治疗的患有血管发生疾病或病症的个体中治疗的有效性的方法，包括：

a.在第一时间点从正在进行血管发生疾病或病症治疗的个体分离血小板；

b.分析所述血小板，得到至少一种血小板相关生物标志物的水平；

c.在第二时间点从所述个体分离血小板，所述第二时间点在所述第一时间点之后；

d.分析来自所述第二时间点的所述血小板，得到至少一种血小板相关生物标志物的水平；和

e.将来自第一时间点的所述血小板相关生物标志物水平与来自第二时间点的所述血小板相关生物标志物水平进行比较，其中来自所述第二时间点的血小板中所述血小板生物标志物的水平增加或减少，表示治疗有效。

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