CN114910542A - 基于血小板膜的电化学抗污传感器及构建方法与其在检测cd44中的应用 - Google Patents

基于血小板膜的电化学抗污传感器及构建方法与其在检测cd44中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于血小板膜的电化学抗污传感器及其在检测CD44中的应用，属于新型纳米复合材料、免疫分析和防污生物传感器技术领域。制备步骤包括：V2C MXene的制备，MB@NH2‑Fe‑MOF‑Zn/Ab2的制备，PM的提取，电极的修饰和基于血小板膜的电化学抗污传感器的构建。本发明以血小板膜/金纳米颗粒/单层V2C纳米片(PM/AuNPs/d‑V2C)修饰电极作为传感界面基底，以亚甲基蓝/胺基化金属有机框架化合物(MB@NH2‑Fe‑MOF‑Zn)为电化学信号探针构建了三明治型的防污免疫分析平台。该传感器将细胞膜的优良防污性能与负载AuNPs的V2C MXene的高导电性完美结合，有效防止了蛋白质的非特异性吸附，提高了电化学传感性能，从而实现了对细胞表面标志物CD44快速、灵敏地检测。

Description

基于血小板膜的电化学抗污传感器及构建方法与其在检测 CD44中的应用
技术领域
本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和防污生物传感器技术领域，具体涉及一种基于血小板膜的电化学抗污传感器及构建方法与其在检测CD44中的应用。
背景技术
近几年，电化学技术已成为一种广泛应用的检测疾病标志物的分析方法，具有超灵敏、高稳定性和低成本的内在优势。然而，这些生物传感器在复杂背景下，尤其是在实际的生物介质中，面临着生物分子非活性吸附和干扰的持续挑战。这种非特异性蛋白质吸附减少令靶向传感界面的扩散，从而降低传感器的性能。为了克服这些问题，基于能够防止非特异性蛋白质吸附的功能材料制造防污传感界面是一个有吸引力的策略。近年来，各种防污材料，如聚乙二醇(PEG)、两性离子聚合物和防污肽已广泛用于电化学生物传感器，并在复杂环境中表现出良好的选择性。然而，PEG和OEG对氧化条件敏感，两性离子聚合物的合成过程耗时且复杂，这限制了它们的长期应用。与其试图综合复制复杂的生物界面特征，不如转向大自然寻求灵感，直接从生物系统中获得设计线索，从而创造出新的解决方案。
细胞膜在自我识别、信号转导和生物接口中起着重要作用。利用天然细胞膜涂层是一种自上而下的新技术，赋予合成材料各种生物效益和细胞样功能。基于这一新兴方法，各种细胞膜衍生材料继承了理想的特征，并被成功创造出来。因此，利用细胞膜提供的污染保护，基于天然细胞膜的电化学平台可以有效减少非特异性生物分子的吸附，并为检测细胞表达提供良好的生物相容性界面。然而，关于血小板膜功能化检测界面在生物传感器构建和复杂介质分析中的应用，目前鲜有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于构建一种基于血小板膜的电化学抗污传感器，所构建的传感器，可以用于细胞表面标志物CD44的快速灵敏检测。基于此目的，本发明以新型二维碳化物纳米材料(V2C MXene)为基础，通过电沉积获得贵金属纳米粒子(AuNPs)进行电极的修饰，提高传感器灵敏度和选择性。
且本发明合成了骨架内封装大量亚甲基蓝信号分子的氨基化双金属有机框架复合材料(MB@NH2-Fe-MOF-Zn)作为信号探针，提取并负载血小板膜(PM)修饰电极表面的新型仿生传感平台，不仅具有良好的抗蛋白吸附性，还能提高生物相容性，保证传感器的高灵敏度检测。
以及，本发明利用抗原-抗体的特异性结合和MB的电化学行为产生电化学传感器的响应信号，以实现细胞表面标志物CD44的精准检测。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种基于血小板膜的电化学抗污传感器的构建方法，所述方法具体包括如下步骤：
(1)d-V2C MXene的制备
在40-50％HF溶液中加入V2AlC粉体，在20-65℃条件下以700-800r/min速度磁力搅拌下反应36-96h；对上述腐蚀产物用去离子水不断清洗直至以10000-20000r/min速度离心后的上清液pH为6.0-7.0；用无水乙醇清洗5-7次后将产物在真空烘箱中烘干，即可得到V2C基体材料；
将0.25-1g上述腐蚀产物加入到10-30mL四丁基氢氧化铵中搅拌24-72h，在3500-4500r/min的转速下高速离心0.5-1h，即可得到剥离的单层V2C纳米片(d-V2C)的稳定胶态悬浮液；
(2)MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2的制备
将FeCl3、Zn(NO3)2·6H2O和氨基对苯二甲酸加入到50-70mL DMF中，搅拌后置于120℃下反应4-6h；降至室温后，以8000-10000r/min离心5min，用DMF和无水乙醇各离心洗涤1-2次后将产物在真空烘箱中烘干(60-70℃，10-12h)，即可得到NH2-Fe-MOF-Zn基体材料；
将10-15mg上述产物和25-30mg MB加入到5mL水中，在4℃条件下以700-800r/min速度磁力搅拌下反应8-10h；用DMF和无水乙醇各离心洗涤4-6次后将产物置于真空烘箱中烘干(60-70℃，6-8h)，得到蓝色固体即MB@NH2-Fe-MOF-Zn复合材料；
取2-5mg上述制备的材料加入到0.5-1mL NHS(2-4mM)和0.5-1mL EDC(5-10mM)中(用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)，再加入1mL CD44-Ab2(8-10μg/mL)溶液。将混合溶液在4℃条件下轻微搅拌10-12h。即得MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2混合溶液；
(3)血小板膜的提取
将10-20mL牛全血在1780r/min的转速下离心4-6min，取上清液在1780r/min的转速下离心4-6min，再取上清液在4590-5000r/min的转速下离心3-5min，得到沉淀即血小板；将沉淀重悬浮于水中，置于-80℃存储4-6h。将血小板悬液从-80℃环境取出后于室温中解冻，解冻后在12980-14000r/min的转度下离心4-5min，取沉淀再悬浮于水中，置于-80℃存储4-6h，反复冻融三次后即可得到血小板膜悬液；
(4)玻碳电极(GCE)的修饰
将步骤(1)制得的剥离的d-V2C纳米片的稳定胶态悬浮液超声处理30-35min，用移液枪移取5-7μL的d-V2C悬浮液，滴涂到玻碳电极表面并晾干；将负载单层V2C纳米片的玻碳电极置于5mL浓度为0.2M HAuCl4的电解池中，采用循环伏安法进行扫描8-10圈得到AuNPs/d-V2C/GCE；
取4-6μL步骤(3)制得的PM悬浮液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1-2h，取出电极后滴加4-6μL CD44-Ab1(8-10μg/mL)溶液在4℃条件下孵育10-12h，即得到Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
在电极表面电极孵育4-6μL不同浓度的CD44溶液或不同浓度的MD-MBA-231细胞(均用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)在37℃条件下孵育45-60min；
最后，将4-6μL步骤(2)制得的MB@NH2-Fe-Zn-MOF/Ab2混合溶液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1h，即得到MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
(5)基于血小板膜的电化学抗污传感器在检测CD44中的应用
以所述MB@NH2-Fe/Zn-MOF/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/V2C/GCE为工作电极，构建所述基于血小板膜的电化学抗污传感器。
优选的，步骤(2)中，FeCl3、Zn(NO3)2·6H2O和氨基对苯二甲酸的质量分别是146-204mg、30-42mg和181-253mg。
优选的，步骤(4)中，所述CD44的系列浓度为0.5-500ng/mL，及所述MD-MBA-231细胞的系列浓度为103-106cell/mL。
本发明还请求保护一种利用上述方法构建的基于血小板膜的电化学抗污传感器，所述传感器以血小板膜/金纳米颗粒/单层V2C纳米片(PM/AuNPs/d-V2C)修饰电极作为传感界面基底，以亚甲基蓝/胺基化金属有机框架化合物(MB@NH2-Fe-MOF-Zn)为电化学信号探针；
且，所述传感器利用血细胞膜的抗蛋白吸附特性能使其具有优异的抗污性能。
此外，本发明保护一种由上述方法构建的基于血小板膜的电化学抗污传感器在检测CD44中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种基于血小板膜的电化学抗污传感器及构建方法与其在检测CD44中的应用，具有如下优异效果：
1、本发明公开的d-V2C MXene/AuNPs作为电极基底材料，采用简单的制备方法，制备的剥离单层d-V2C纳米片具有更高的比表面积，电沉积AuNPs具有优异的电化学活性和较低的电荷转移电阻，通过Au-NH2的相互作用提高抗体的固定能力，以提高CD44检测的灵敏度。
2、本发明公开的MB@NH2-Fe-MOF-Zn作为信号探针，由于大量的MB信号分子通过共价键均匀分布在整个金属框架内，避免了信号分子的泄漏，同时氨基化的金属有机框架也大大提高了与抗体的结合，使传感器具有高灵敏度的电化学响应和良好的稳定性。
3、本发明中采用血小板膜作为新型仿生传感平台，具有优异的生物相容性和良好的抗蛋白吸附性，能够有效抵抗蛋白质溶液甚至血清样品中的生物污染，增强电化学免疫传感器对真实生物样品检测的选择性、准确性。
4、本发明制得的电化学免疫传感器具有优异重现性与稳定性，适用于细胞表面标志物CD44的检测，对肿瘤的早期诊断具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一制备的风琴状V2C MXene、d-V2C-MXene和NH2-Fe-MOF-Zn的SEM图和XRD图、PM的TEM图。
图2是本发明实施例一制备的(i)d-V2C/GCE，(ii)AuNPs/d-V2C/GCE，(iii)PM/AuNPs/d-V2C/GCE，(iv)Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE，(v)CD44/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE，(vi)
MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE的阻抗图，其中电解质溶液为含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的水溶液，扫速为100mV/s。
图3是本发明实施例一制备的在不同浓度的FBS样品中孵育前后，GCE、d-V2C/AuNPs/GCE和PM/d-V2C/AuNPs/GCE的生物传感器在PBS缓冲液(0.1M，pH＝7.0)中的示差脉冲伏安响应曲线和防污性能分析直方图(其中，FBS的浓度分别为10％、20％、50％和100％)。
图4是本发明实施例二制备的MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE和
MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/cell/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE在pH＝7.0的PBS缓冲液中的示差脉冲伏安曲线和峰电流和对应CD44、MD-MBA-231细胞浓度的线性拟合关系图(其中，CD44的浓度自下而上分别为0.5、1、5、10、20、50、100、250和500ng/mL；MD-MBA-231细胞的浓度自下而上分别为103、104、105和106cell/mL)。
图5是本发明实施例二制备的MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE检测CD44的重复性和稳定性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种对细胞表面标志物CD44快速、灵敏检测的基于血小板膜的电化学抗污传感器及构建方法。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
实施例一：
(1)d-V2C MXene的制备
在40％HF溶液中加入V2AlC粉体，在25℃条件下以800r/min速度磁力搅拌下反应24h；对上述腐蚀产物用去离子水不断清洗直至以10000r/min速度离心后的上清液pH为7.0；用无水乙醇清洗5次后将产物在真空烘箱中烘干(60℃，12h)，即可得到V2C基体材料。
将1g上述腐蚀产物加入到10mL四丁基氢氧化铵中搅拌72h，在3500r/min的转速下高速离心1h，即可得到剥离的单层V2C纳米片(d-V2C)的稳定胶态悬浮液。
图1为本发明实施例一制得的多层和单层V2C MXene的电子显微镜图(图1a、1b)和X射线衍射图(图1c)。如图1所示，多层V2C-MXene呈现风琴状的二维层状结构，单层V2C-MXene呈现单层片状形貌，具有较大的比表面积。V2C材料的主要的衍射峰出现在(002)晶面上，说明V2C-MXene的成功制备。
(2)MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2的制备
将146mg FeCl3、30mg Zn(NO3)2·6H2O和181mg氨基对苯二甲酸加入到50mL DMF中，搅拌溶清，置于120℃下反应4h；降至室温后，以8000r/min离心5min，用DMF和无水乙醇各离心洗涤1次后将产物在真空烘箱中烘干(60℃，12h)，即可得到NH2-Fe-MOF-Zn基体材料。
图1为本发明实施例一制得的NH2-Fe-MOF-Zn的扫描电子显微镜图(图1d)和X射线衍射图(图1e)。由图1可以看出，NH2-Fe-MOF-Zn呈现十二面体结构。NH2-Fe-MOF-Zn材料的主要的衍射峰和MIL-88的模拟图案的峰相匹配，说明NH2-Fe-MOF-Zn的成功制备。
将10mg上述产物和25mg MB加入到5mL水中，在4℃条件下以800r/min速度磁力搅拌下反应8h；用DMF和无水乙醇各离心洗涤4次后将产物置于真空烘箱中烘干(60℃，6h)，得到蓝色固体即MB@NH2-Fe-MOF-Zn复合材料。
取5mg上述制备的材料加入到0.5mL 2mM NHS和0.5mL 10mM EDC中(用pH＝7.0的PBS溶液配制)，再加入1mL CD44-Ab2(10μg/mL)溶液。将混合溶液在4℃条件下轻微搅拌12h。即得MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2混合溶液。
(3)PM的提取
将10mL牛全血在1780r/min的转速下离心5min，取上清液在1780r/min的转速下离心5min，再取上清液在4590r/min的转速下离心5min，得到沉淀即血小板。将沉淀重悬浮于水中，置于-80℃存储5h。将血小板悬液从-80℃环境取出后于室温中解冻，解冻后在12980r/min的转度下离心4min，取沉淀再悬浮于水中，置于-80℃存储5h。反复冻融三次后即可得到PM悬液。
图1f为本发明实施例一制得的PM的透射电子显微镜图像，显示出良好的球形形貌，证明PM提取成功。
(4)GCE的修饰
将步骤(1)制得的剥离的单层V2C纳米片的稳定胶态悬浮液超声处理30min；用移液枪移取6μL的d-V2C MXene悬浮液，滴涂到玻碳电极表面并晾干；将负载单层V2C纳米片的玻碳电极置于5mL浓度为0.2M HAuCl4的电解池中，采用循环伏安法进行扫描10圈，扫描电位为-0.9-0.3V，扫描后取出电极即是AuNPs/V2C/GCE；
取5μL步骤(3)制得的PM悬浮液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1h，取出电极后滴加5μL CD44-Ab1(10μg/mL)溶液在4℃条件下孵育12h，即得到Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
在电极表面电极孵育5μL不同浓度的CD44溶液或不同浓度的MD-MBA-231细胞(均用pH＝7.0的PBS溶液配制)在37℃条件下孵育60min；
最后，将5μL步骤(2)制得的MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2混合溶液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1h，即得到MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE。
图2给出了实施例一中不同修饰电极的阻抗谱。如图2所示，由于d-V2C/GCE具有优异的导电性，因此其对应于较低半圆直径的Ret值(曲线i)非常小。在该表面修饰AuNPs后(曲线ii)，由于AuNPs增强了电子转移，Ret值显著小于d-V2C/GCE。PM成功固定在电极表面，表面电阻显著增加(曲线iii)。当PM/AuNPs/d-V2C/GCE被Ab1(曲线iv)、CD44(曲线v)和MB/NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2(曲线vi)修饰时，Ret值显著降低，这归因于免疫复合物(抗体抗原)在电极表面的屏蔽作用，证明了电化学免疫传感器的成功制备。
(5)基于血小板膜仿生传感平台的电化学免疫传感器的构建
以上述所述MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE为工作电极，铂丝为对电极，银/氯化银电极为参比电极，在PBS缓冲溶液(pH＝7.0)中，采用示差脉冲伏安法进行扫描测试，扫描电位为-0.6-0.1V。
为了评价传感表面的防污能力，GCE、d-V2C/AuNPs/GCE和PM/d-V2C/AuNPs/GCE在胎牛血清(FBS)中孵育30min，用示差脉冲伏安法比较不同界面的非特异性吸附能力。如图3所示，在FBS中孵育后，通过分析电化学信号的变化，裸电极的生物传感器的DPV信号明显比PM修饰的生物传感器降低的更多，这些结果证明了PM具有良好的抗非特异性吸附能力。
实施例二：
(1)d-V2C MXene的制备
在50％HF溶液中加入V2AlC粉体，在20℃条件下以700r/min速度磁力搅拌下反应20h；对上述腐蚀产物用去离子水不断清洗直至以20000r/min速度离心后的上清液pH为6.0；用无水乙醇清洗6次后将产物在真空烘箱中烘干(70℃，10h)，即可得到V2C基体材料。
将0.25g上述腐蚀产物加入到10mL四丁基氢氧化铵中搅拌24h，在3500r/min的转速下高速离心0.5h，即可得到剥离的单层V2C纳米片(d-V2C)的稳定胶态悬浮液。
(2)MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2的制备
将204mg FeCl3、42mg Zn(NO3)2·6H2O和253mg氨基对苯二甲酸加入到70mL DMF中，搅拌溶清，置于120℃下反应5h；降至室温后，以9000r/min离心5min，用DMF和无水乙醇各离心洗涤2次后将产物在真空烘箱中烘干(70℃，10h)，即可得到NH2-Fe-MOF-Zn基体材料。
将15mg上述产物和30mg MB加入到5mL水中，在4℃条件下以700r/min速度磁力搅拌下反应8h；用DMF和无水乙醇各离心洗涤5次后将产物置于真空烘箱中烘干(70℃，6h)，得到蓝色固体即MB@NH2-Fe-MOF-Zn复合材料。
取5mg上述制备的材料加入到0.5mL 2mM NHS和0.5mL 10mM EDC中(用pH＝7.0的PBS溶液配制)，再加入1mL CD44-Ab2(8μg/mL)溶液。将混合溶液在4℃条件下轻微搅拌10h。即得MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2混合溶液。
(3)PM的提取
将15mL牛全血在1780r/min的转速下离心6min，取上清液在1780r/min的转速下离心6min，再取上清液在4590r/min的转速下离心5min，得到沉淀即血小板。将沉淀重悬浮于水中，置于-80℃存储6h。将血小板悬液从-80℃环境取出后于室温中解冻，解冻后在12980r/min的转度下离心5min，取沉淀再悬浮于水中，置于-80℃存储6h。反复冻融三次后即可得到PM悬液。
(4)GCE的修饰
将步骤(1)制得的剥离的单层V2C纳米片的稳定胶态悬浮液超声处理35min；用移液枪移取5μL的d-V2C MXene悬浮液，滴涂到玻碳电极表面并晾干；将将负载d-V2C纳米片的玻碳电极置于5mL浓度为0.2M HAuCl4的电解池中，采用循环伏安法进行扫描8圈，扫描电位为-0.9-0.3V。扫描后取出电极即是AuNPs/d-V2C/GCE。取6μL步骤(3)制得的PM悬浮液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1.5h，取出电极后滴加6μL CD44-Ab1(9μg/mL)溶液在4℃条件下孵育10h，即得到Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE。在电极表面电极孵育6μL不同浓度的CD44溶液或不同浓度的MD-MBA-231细胞(均用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)在37℃条件下孵育45min。最后，将6μL步骤(2)制得的MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2混合溶液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1h，即得到MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE。
(5)基于血小板膜仿生传感平台的电化学免疫传感器的构建
以上述所述MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE为工作电极，铂丝为对电极，银/氯化银电极为参比电极。在PBS缓冲溶液(pH＝7.0)中，采用示差脉冲伏安法进行扫描测试，扫描电位为-0.6-0.1V。
图4为MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE的示差脉冲伏安响应曲线。由图可见，随着CD44浓度的不断增加，峰值电流随之增加。由图可知，CD44检测表现出较宽的线性浓度范围(0.5-500ng/mL)，其线性回归方程表示为：IlogCD44＝107.57+59.24logC(ng/mL)，检出限(S/N＝3)为1.4pg/mL(图5a，b)；细胞检测的线性浓度范围(102-106cell/mL)，其线性回归方程表示为：Ilogcell＝-93.58+59.42log C(cell/mL)，检出限(S/N＝3)为1.4cell/mL(图5c，d)。
图5给出了MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE的重复性与稳定性。采用实施例二中的制备方法制备5组NS-Nb2C-MXene/Nafion/GCE进行检测，如图5a所示在五次测定所得到的结果相对标准偏差为2.82％。采用实施例二中所制备的MB@NH2-Fe/Zn-MOF/Ab2/CD44/Ab1/PM/AuNPs/V2C/GCE进行检测，检测使用过后清洗干净并在室温条件储存15天，15天内每天使用该电极进行测定，氧化峰响应电流保持在初始测定峰电流值的96.4％以上(图5b)。
实施例三：
(1)d-V2C MXene的制备
在45％HF溶液中加入V2AlC粉体，在45℃条件下以800r/min速度磁力搅拌下反应72h；对上述腐蚀产物用去离子水不断清洗直至以15000r/min速度离心后的上清液pH为6.5；用无水乙醇清洗6次后将产物在真空烘箱中烘干，即可得到V2C基体材料；
将0.75g上述腐蚀产物加入到20mL四丁基氢氧化铵中搅拌72h，在4000r/min的转速下高速离心1h，即可得到剥离的单层V2C纳米片(d-V2C)的稳定胶态悬浮液；
(2)MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2的制备
将FeCl3、Zn(NO3)2·6H2O和氨基对苯二甲酸加入到60mL DMF中，搅拌后置于120℃下反应5h；降至室温后，以9000r/min离心5min，用DMF和无水乙醇各离心洗涤2次后将产物在真空烘箱中烘干(70℃，10h)，即可得到NH2-Fe-MOF-Zn基体材料；
将12mg上述产物NH2-Fe-MOF-Zn基体材料和25mg MB加入到5mL水中，在4℃条件下以750r/min速度磁力搅拌下反应9h；用DMF和无水乙醇各离心洗涤5次后将产物置于真空烘箱中烘干(65℃，6h)，得到蓝色固体即MB@NH2-Fe-MOF-Zn复合材料；
取3mg上述制备的复合材料加入到1mL NHS(3mM)和1mL EDC(8mM)中(用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)，再加入1mL CD44-Ab2(9μg/mL)溶液。将混合溶液在4℃条件下轻微搅拌10h。即得MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2混合溶液；
(3)血小板膜的提取
将15mL牛全血在1780r/min的转速下离心5min，取上清液在1780r/min的转速下离心5min，再取上清液在4600r/min的转速下离心5min，得到沉淀即血小板；将沉淀重悬浮于水中，置于-80℃存储5h。将血小板悬液从-80℃环境取出后于室温中解冻，解冻后在13000r/min的转度下离心5min，取沉淀再悬浮于水中，置于-80℃存储5h，反复冻融三次后即可得到血小板膜悬液；
(4)玻碳电极(GCE)的修饰
将步骤(1)制得的剥离的d-V2C纳米片的稳定胶态悬浮液超声处理30min，用移液枪移取5μL的d-V2C悬浮液，滴涂到玻碳电极表面并晾干；将负载单层V2C纳米片的玻碳电极置于5mL浓度为0.2M HAuCl4的电解池中，采用循环伏安法进行扫描8-10圈得到AuNPs/d-V2C/GCE；
取5μL步骤(3)制得的PM悬浮液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1h，取出电极后滴加5μL CD44-Ab1(8μg/mL)溶液在4℃条件下孵育10h，即得到Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
在电极表面电极孵育5μL不同浓度的CD44溶液或不同浓度的MD-MBA-231细胞(均用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)在37℃条件下孵育45-60min；
最后，将5μL步骤(2)制得的MB@NH2-Fe-Zn-MOF/Ab2混合溶液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1h，即得到MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
(5)基于血小板膜的电化学抗污传感器在检测CD44中的应用
以所述MB@NH2-Fe/Zn-MOF/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/V2C/GCE为工作电极，构建所述基于血小板膜的电化学抗污传感器。
实施例四：
(1)d-V2C MXene的制备
在50％HF溶液中加入V2AlC粉体，在35℃条件下以700r/min速度磁力搅拌下反应48h；对上述腐蚀产物用去离子水不断清洗直至以15000r/min速度离心后的上清液pH为7.0；用无水乙醇清洗5次后将产物在真空烘箱中烘干，即可得到V2C基体材料；
将0.5g上述腐蚀产物加入到15mL四丁基氢氧化铵中搅拌36h，在4250r/min的转速下高速离心1h，即可得到剥离的单层V2C纳米片(d-V2C)的稳定胶态悬浮液；
(2)MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2的制备
将FeCl3、Zn(NO3)2·6H2O和氨基对苯二甲酸加入到65mL DMF中，搅拌后置于120℃下反应5h；降至室温后，以10000r/min离心5min，用DMF和无水乙醇各离心洗涤2次后将产物在真空烘箱中烘干(60℃，12h)，即可得到NH2-Fe-MOF-Zn基体材料；
将12mg上述产物NH2-Fe-MOF-Zn基体材料和25mg MB加入到5mL水中，在4℃条件下以800r/min速度磁力搅拌下反应9h；用DMF和无水乙醇各离心洗涤6次后将产物置于真空烘箱中烘干(70℃，8h)，得到蓝色固体即MB@NH2-Fe-MOF-Zn复合材料；
取4mg上述制备的复合材料加入到0.8mL NHS(3mM)和0.5mL EDC(8mM)中(用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)，再加入1mL CD44-Ab2(9μg/mL)溶液。将混合溶液在4℃条件下轻微搅拌11h。即得MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2混合溶液；
(3)血小板膜的提取
将18mL牛全血在1780r/min的转速下离心6min，取上清液在1780r/min的转速下离心5min，再取上清液在4800r/min的转速下离心5min，得到沉淀即血小板；将沉淀重悬浮于水中，置于-80℃存储6h。将血小板悬液从-80℃环境取出后于室温中解冻，解冻后在1350r/min的转度下离心5min，取沉淀再悬浮于水中，置于-80℃存储5h，反复冻融三次后即可得到血小板膜悬液；
(4)玻碳电极(GCE)的修饰
将步骤(1)制得的剥离的d-V2C纳米片的稳定胶态悬浮液超声处理30min，用移液枪移取6μL的d-V2C悬浮液，滴涂到玻碳电极表面并晾干；将负载单层V2C纳米片的玻碳电极置于5mL浓度为0.2M HAuCl4的电解池中，采用循环伏安法进行扫描10圈得到AuNPs/d-V2C/GCE；
取6μL步骤(3)制得的PM悬浮液滴加到电极表面在37℃条件下孵育2h，取出电极后滴加5μL CD44-Ab1(10μg/mL)溶液在4℃条件下孵育12h，即得到Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
在电极表面电极孵育6μL不同浓度的CD44溶液或不同浓度的MD-MBA-231细胞(均用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)在37℃条件下孵育50min；
最后，将6μL步骤(2)制得的MB@NH2-Fe-Zn-MOF/Ab2混合溶液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1h，即得到MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
(5)基于血小板膜的电化学抗污传感器在检测CD44中的应用
以所述MB@NH2-Fe/Zn-MOF/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/V2C/GCE为工作电极，构建所述基于血小板膜的电化学抗污传感器。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种基于血小板膜的电化学抗污传感器的构建方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)d-V2C MXene的制备
在40-50％HF溶液中加入V2AlC粉体，在20-65℃条件下以700-800r/min速度磁力搅拌下反应36-96h；对上述腐蚀产物用去离子水不断清洗直至以10000-20000r/min速度离心后的上清液pH为6.0-7.0；用无水乙醇清洗5-7次后将产物在真空烘箱中烘干，即可得到V2C基体材料；
将0.25-1g上述腐蚀产物加入到10-30mL四丁基氢氧化铵中搅拌24-72h，在3500-4500r/min的转速下高速离心0.5-1h，即可得到剥离的单层V2C纳米片(d-V2C)的稳定胶态悬浮液；
(2)MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2的制备
将FeCl3、Zn(NO3)2·6H2O和氨基对苯二甲酸加入到50-70mL DMF中，搅拌后置于120℃下反应4-6h；降至室温后，以8000-10000r/min离心5min，用DMF和无水乙醇各离心洗涤1-2次后将产物在真空烘箱中烘干(60-70℃，10-12h)，即可得到NH2-Fe-MOF-Zn基体材料；
将10-15mg上述产物NH2-Fe-MOF-Zn基体材料和25-30mg MB加入到5mL水中，在4℃条件下以700-800r/min速度磁力搅拌下反应8-10h；用DMF和无水乙醇各离心洗涤4-6次后将产物置于真空烘箱中烘干(60-70℃，6-8h)，得到蓝色固体即MB@NH2-Fe-MOF-Zn复合材料；
取2-5mg上述制备的复合材料加入到0.5-1mL NHS(2-4mM)和0.5-1mL EDC(5-10mM)中(用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)，再加入1mL CD44-Ab2(8-10μg/mL)溶液。将混合溶液在4℃条件下轻微搅拌10-12h。即得MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2混合溶液；
(3)血小板膜的提取
将10-20mL牛全血在1780r/min的转速下离心4-6min，取上清液在1780r/min的转速下离心4-6min，再取上清液在4590-5000r/min的转速下离心3-5min，得到沉淀即血小板；将沉淀重悬浮于水中，置于-80℃存储4-6h。将血小板悬液从-80℃环境取出后于室温中解冻，解冻后在12980-14000r/min的转度下离心4-5min，取沉淀再悬浮于水中，置于-80℃存储4-6h，反复冻融三次后即可得到血小板膜悬液；
(4)玻碳电极(GCE)的修饰
将步骤(1)制得的剥离的d-V2C纳米片的稳定胶态悬浮液超声处理30-35min，用移液枪移取5-7μL的d-V2C悬浮液，滴涂到玻碳电极表面并晾干；将负载单层V2C纳米片的玻碳电极置于5mL浓度为0.2M HAuCl4的电解池中，采用循环伏安法进行扫描8-10圈得到AuNPs/d-V2C/GCE；
取4-6μL步骤(3)制得的PM悬浮液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1-2h，取出电极后滴加4-6μL CD44-Ab1(8-10μg/mL)溶液在4℃条件下孵育10-12h，即得到Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
在电极表面电极孵育4-6μL不同浓度的CD44溶液或不同浓度的MD-MBA-231细胞(均用pH＝7.0的PBS缓冲液配制)在37℃条件下孵育45-60min；
最后，将4-6μL步骤(2)制得的MB@NH2-Fe-Zn-MOF/Ab2混合溶液滴加到电极表面在37℃条件下孵育1h，即得到MB@NH2-Fe-MOF-Zn/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/d-V2C/GCE；
(5)基于血小板膜的电化学抗污传感器在检测CD44中的应用
以所述MB@NH2-Fe/Zn-MOF/Ab2/CD44(cell)/Ab1/PM/AuNPs/V2C/GCE为工作电极，构建所述基于血小板膜的电化学抗污传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于血小板膜的电化学抗污传感器的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，FeCl3、Zn(NO3)2·6H2O和氨基对苯二甲酸的质量分别是146-204mg、30-42mg和181-253mg。
3.根据权利要求1所述的一种基于血小板膜的电化学抗污传感器的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述CD44溶液的浓度为0.5-500ng/mL，及所述MD-MBA-231细胞的浓度为103-106cell/mL。
4.一种如权利要求1所述方法构建的基于血小板膜的电化学抗污传感器，其特征在于，所述传感器以血小板膜/金纳米颗粒/单层V2C纳米片(PM/AuNPs/d-V2C)修饰电极作为传感界面基底，以亚甲基蓝/胺基化金属有机框架化合物(MB@NH2-Fe-MOF-Zn)为电化学信号探针；
且，所述传感器利用血细胞膜的抗蛋白吸附特性能使其具有优异的抗污性能。
5.一种如权利要求1所述方法构建的基于血小板膜的电化学抗污传感器在检测CD44中的应用。
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