CN107281215A - 硫化氢供体硫氢化钠在制药中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属药物制药领域，涉及硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在制药中的用途，本发明使用硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在子宫内膜间质细胞系、C57小鼠内异症模型、Wistar大鼠子宫角粘连模型进行了H2S对子宫内膜异位症及其粘连的作用实验。结果显示，硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)能有效的抑制IL‑1β诱导的子宫内膜间质细胞炎症反应；能明显改善内异症模型小鼠的热痛觉过敏，使病灶缩小，减轻纤维化，和能抑制子宫角粘连模型大鼠的术后粘连形成；所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)可进一步用于制备治疗子宫内膜异位症及其并发症的药物。

Description

硫化氢供体硫氢化钠在制药中的用途

技术领域

本发明属药物制药领域，涉及硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在制药中的用途，具体涉及硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在制备治疗子宫内膜异位症及其粘连药物中的用途。

背景技术

现有技术公开了子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是育龄期妇女的常见疾病，其发病率在育龄妇女中高达10-15％，该疾患主要临床表现为盆腔痛和不孕，严重影响了妇女的生活质量。该病的发病机制至今尚未明确，临床治疗实践面临巨大的困难和挑战，目前干预措施中所采取的手术去除病灶和抗雌激素药物治疗能在一定程度上改善病情、缓解症状，但仍难以避免再次复发；其中盆腹腔粘连是内异症最常见的并发症之一，是造成患者疼痛、不孕等的常见原因，也是造成手术困难和手术风险升高的重要原因。内异症及其粘连的形成机制目前尚不完全明确，业内公认的是炎症反应在疾病的发生发展中起重要作用。有研究显示气体信号分子硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)在众多病理生理状态下发挥重要的作用，有研究表明H2S在心血管系统有抑制心肌炎症、减轻氧化应激、减少促纤维化因子、抑制胶原和心肌纤维化的作用。迄今，尚未见H2S在子宫内膜异位症模型中同样发挥抗炎、抗纤维化的作用以及抑制病灶生长和粘连形成的作用的报道。

目前众多研究表明，子宫内膜异位症是一种炎性疾病。子宫内膜异位症发病机制中的炎性学说认为，内异症是腹腔微环境中各种免疫细胞与细胞因子功能失常引发的盆腔局部免疫反应。有研究发现内异症患者腹腔液中多种巨噬细胞趋化因子如MCP-1、RANTES含量显著增高，IL-1、2、4、6、8等水平等均增高，且IL-6和IL-8含量随病情严重程度而增加；与健康的妇女相比，子宫内膜异位症患者腹腔内的数目和活性增加，而其分泌的一些与炎症有关的因子如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1，MMP-9等也有明显的上升；这些细胞因子通过自分泌或旁分泌发挥细胞间的通讯作用，对巨噬细胞、单核细胞、白细胞等免疫细胞产生趋化作用，并与炎性细胞之间产生正反馈效应，其中IL-1β是一个关键分子，它能刺激子宫内膜细胞多种因子的表达，在细胞生长、细胞迁移及组织重塑中发挥重要作用，对于子宫内膜的种植极为重要；此外IL-1β还能诱导子宫内膜细胞表达环氧合酶-2(COX-2)，而COX-2又通过正反馈循环增加局部的前列腺素和雌激素，加重炎症并促进增殖。

现有技术还公开了盆腹腔粘连是子宫内膜异位症最常见的表现之一，是造成内异症患者疼痛、不孕等的常见原因，也是造成手术困难和手术风险升高的重要原因。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟利用经典的子宫角粘连模型研究探索硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)对粘连的影响，用低分子肝素钠作为阳性药，以PAG作为抑制剂，提供硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在制备治疗子宫内膜异位症及其粘连药物中的用途观察硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在经典的子宫角粘连模型中是否同样有抑制粘连的作用。

发明内容

本发明的目的是提供硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在制药中的新用途。尤其是硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在制备治疗子宫内膜异位症及其粘连药物中的用途。

本发明采用外源型H2S供体(硫氢化钠)，在子宫内膜间质细胞系、C57小鼠内异症模型、Wistar大鼠子宫角粘连模型中，进行了H2S对子宫内膜异位症及其粘连的作用实验，包括硫氢化钠抗IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞炎症反应作用，以及硫化氢供体硫氢化钠对子宫内膜间质细胞活力、凋亡、细胞运动方面的影响等试验，以及用自体子宫缝合模型和异体子宫注射模型验证药物对硫氢化钠对内异症及其粘连的影响，以及使用热板仪观测小鼠的热板痛阈时间等，结果显示，所述的外源性H2S供体能有效的抑制IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞炎症反应；能明显改善内异症模型小鼠的热痛觉过敏，使病灶缩小，减轻纤维化和能抑制子宫角粘连模型大鼠的术后粘连形成；进一步，所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)可用于制备治疗子宫内膜异位症及其粘连的药物

更具体的，本申请中，进行了下述实验：

1.采用IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞模型，使用ELISA检测硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)对IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞分泌IL-6的影响；Transwell模型检测细胞运动；CCK8检测细胞活力；流式细胞仪检测细胞凋亡；

2.制备自体子宫内膜缝合小鼠模型，建模2周后随机分组，给予不同浓度的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)，以PDTC为阳性药物。在建模前、建模2周干预治疗前以及干预治疗3周后，使用热板仪检测小鼠的热板痛阈时间；干预治疗3周后取材，测量病灶大小，记录粘连病灶数目；制备异体子宫内膜注射法小鼠模型，采用EGFP小鼠做为供体小鼠，C57小鼠做为受体小鼠，给予硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)；在建模前、干预治疗2周后，使用热板仪观测小鼠的热板痛阈时间；干预治疗2周后取材，小动物活体成像检测病灶的荧光值；

3.制备Wistar大鼠子宫角粘连模型，给予硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)，以低分子肝素钠(Low-molecular-weight Heparin Sodium，LMWH)为阳性药，干预治疗2周后取材，对粘连情况进行评分；

本发明的一个实施例中，所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)用于抗IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞炎症反应。可剂量依赖性的抑制IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞IL-6的分泌；与细胞毒作用无关；

本发明的另一个实施例中，所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)能有效抑制子宫内膜异位症小鼠模型中内异症及其粘连。并明显改善小鼠热痛觉过敏现象；缩小异位病灶；降低异位病灶和周围组织的粘连率；

本发明的另一个实例中，所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)能有效减轻子宫角粘连模型大鼠的术后粘连。

实验结果显示：

1.所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)剂量依赖性的抑制IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞IL-6的分泌；所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)剂量依赖性的抑制细胞运动；

2.自体子宫内膜缝合小鼠模型中，所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)的各个剂量的干预治疗组小鼠热痛觉过敏明显改善；异位病灶缩小；异位病灶和周围组织的粘连率降低；异体子宫内膜注射小鼠模型中，所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)的干预治疗组小鼠热痛觉过敏明显改善；异位病灶荧光值降低；

3.所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)减轻子宫角粘连模型大鼠的术后粘连，与降低炎症因子。

实验研究表明：所述的外源性H2S供体能有效的抑制IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞炎症反应，其机制与细胞毒作用无关；所述的外源性H2S供体能明显改善内异症模型小鼠的热痛觉过敏，使病灶缩小，减轻纤维化，是治疗内异症极具潜力的前景药物；所述的外源性H2S供体能抑制子宫角粘连模型大鼠的术后粘连形成；所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)可用于制备治疗子宫内膜异位症及其粘连的药物。

本发明所述的硫化氢的化学供体还包括除硫氢化钠(NaHS)以外的其他H₂S的化学供体，所产生的H₂S具有治疗子宫内膜异位症及其粘连作用。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施方式对本发明进行详细地描述。

附图说明

图1-1.NaHS对子宫内膜间质细胞活力的影响，※代表和未处理组相比p＜0.05。

图1-2.NaHS对子宫内膜间质细胞凋亡没有显著影响，不同浓度的NaHS作用24小时，对子宫内膜间质细胞的凋亡没有明显影响(P＞0.05)；

图1-3.NaHS抑制IL-1β诱导子宫内膜间质细胞IL-6的分泌，IL-1β(0.25ng/ml)刺激子宫内膜间质细胞后IL-6分泌显著提高。细胞用NaHS预处理30min，然后加入IL-1β(0.25ng/ml)，6h后检测细胞培养上清中的IL-6浓度，#代表和未刺激组相比p＜0.05；※代表和未处理组相比p＜0.05。

图1-4.NaHS抑制子宫内膜间质细胞的运动，不同浓度的SPRC和NaHS作用24小时，对子宫内膜间质细胞的细胞运动有抑制作用，※代表和未处理组相比p＜0.05。

图2-1.C57自体子宫缝合小鼠腹壁内异症样病灶，其中，左图为内异症样病灶肉眼观；右图为内异症样病灶HE染色；

图2-2.C57自体子宫缝合小鼠模型异位病灶体积，其中，(A)箱式图，与模型组相比，三个剂量组的NaHS治疗可以缩小病灶(p＜0.05)；(B)为(A)转化成的柱状图。

图2-3.C57自体子宫缝合小鼠腹壁内异症样病灶和周围组织粘连，其中，(A)内异症样病灶和肠系膜粘连；(B)内异症样病灶和膀胱粘连。

图2-4.C57自体子宫缝合小鼠腹壁内异症样病灶和周围组织粘连率，其中显示，NaHS高、中、低剂量组的治疗可以明显降低病灶和周围组织的粘连率降低(p＜0.05)。

图2-5.C57自体子宫缝合小鼠热板反应时间，其中显示，与模型组相比，三个剂量组的NaHS治疗可以改善小鼠热痛觉过敏(p＜0.05)；0w：手术前；2w：术后2周；5w：术后5周(给药3w)。

图2-6.C57自体子宫缝合小鼠内异症样病灶，其中，左图为内异症样病灶肉眼观；右图为内异症样病灶HE染色。

图2-7.C57自体子宫缝合小鼠内异症样病灶荧光值。

图2-8.自体缝合小鼠热板反应时间。

图3.大鼠子宫角粘连模型评分示意图。

具体实施方式

实施例1 硫氢化钠抗IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞炎症实验

1.细胞活力测定，按照Dojindo的CCK8说明书方法进行，取对数生长期的细胞，胰酶消化后吹打成单细胞悬液；按照5000个细胞/孔的浓度接种至96孔板；待细胞贴壁(隔夜)稳定后，加入不含血清的不同浓度的NaHS(10-500μM)或SPRC(0.1-100μM)继续培养；选取6h、12h、24h、36h、48h时间点，按照每孔培养基总体积的10％加入CCK-8溶液(注意孔中不要产生气泡，以免影响OD值的读数)。同时在不含细胞的培养基中加入CCK8即为空白对照。37℃5％CO₂培养箱中孵育2h后酶标仪检测450nm波长的吸光度。

2.流式检测凋亡，按照BD的ANNEXIN V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书方法进行，取对数生长期的细胞，胰酶消化后吹打成单细胞悬液，接种至6孔板中；待细胞达到80％丰度时，加入不含血清的不同浓度的NaHS(10-100μM)或SPRC(1-10μM)继续培养24h；把细胞培养液吸出至合适离心管内，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，加入收集的细胞培养液，将细胞转移到离心管内，1000rpm，4℃离心5分钟；弃上清，加入预冷的PBS轻柔清洗细胞2次，将细胞重悬于Binding Buffer中，调整细胞的浓度为1×10⁶个/ml；取100ul细胞悬液，加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟；设置阴性对照(不加Annexin V-FITC和PI)、单阳1(不加Annexin V-FITC，只加PI)、单阳2(不加PI，只加Annexin V-FITC)三个对照组；加入200ul Binding Buffer，在半小时内上机检测。注意事项：旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光。在细胞洗涤时请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变。

3.ELISA检测IL-6的分泌，3.1试剂的准备，提前30分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温，3.2标准品和工作液的稀释在标准品管中加入标准品/标本稀释液1.0ml，待溶解后，静置15分钟混匀(浓度为1000pg/ml)，取出250μl标准加入到有750μl的标准品/标本稀释液的管中，混匀后(浓度为250pg/ml)，然后根据需要进行倍比稀释。(标准曲线使用一下浓度：250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9、0pg/ml)，复溶标准品若未用完请放入-20℃保存，倍比稀释的标准品不得重复使用，生物素化抗体工作液的准备：在使用前1小时内准备。根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实际配置时应多配置0.1-0.2ml)，按1μl浓缩生物素化抗体加99μl生物素化抗体稀释液的比例配置。轻轻混匀。酶结合物的工作液的准备：在使用前30分钟准备。根据没空需要0.1ml计算总的用量(实际配制时应多配0.1-0.2ml)，按1μL浓缩酶结合物加99μl酶结合物稀释液的比例配置，混匀，浓缩洗涤液20×的稀释：用双蒸水1∶20稀释，未用的放回4℃保存，3.3洗板方法自动洗板机：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μL，静置30秒后甩尽液体，在厚吸水纸上拍干，洗板5次，3.4操作程序1)从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，并增加1孔作为空白显色孔，其它板条密封放回4℃；2)除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟，洗板4次；3)除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟，洗板4次；4)除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟，洗板4次；5)加入显色剂(100μl/孔)，避光37℃孵箱孵育10-20分钟；6)加入终止液(100μl/孔)，混匀后，用酶标仪在450nm测定O.D.值。(5分钟内)，4.5结果分析1)每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值；2)绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点；通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度；3)若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

4.Transwell细胞迁移实验，1)24孔板下室加入600μl含8％FBS的DMEM/F12培养基，预先加入20min以达到PH值平衡；2)取对数生长期的细胞，胰酶消化细胞，含8％FBS的DMEM/F12培养基悬浮，计数，稀释至密度为2×105/ml。3)24孔板上室每孔加250μl细胞悬液，即5×104个细胞/上室；4)待细胞贴壁后(6h后)，加入不含血清的不同浓度的NaHS(10-100μM)继续培养；5)36h后，弃去孔中培液，PBS轻柔洗2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，倒置晾干，每个小室滴加0.1％结晶紫染色30ul，染色30min，用PBS轻柔洗3遍，倒置晾干；6)显微镜下每个小室随机拍取3个视野观察细胞，计数；

实验结果显示：

细胞活力测定结果：NaHS浓度从10μM-200μM；作用6至48小时，对子宫内膜间质细胞的生长均没有明显影响(p＞0.05，如图1-1所示)；

细胞凋亡检测结果：NaHS浓度从10μM-100μM，作用24小时，对子宫内膜间质细胞的凋亡无明显影响(P＞0.05，如图1-2所示)；

硫氢化钠对IL-1β诱导细胞炎症反应的作用结果：IL-1β是实验中最常用的子宫内膜间质细胞的细胞因子诱导剂，IL-1β处理细胞后，IL-6分泌显著提高，且呈明显的时间、剂量依赖性，结果显示，IL-1β(0.25ng/ml)刺激子宫内膜间质细胞6h后IL-6分泌显著提高，细胞用NaHS预处理30min，然后加入IL-1β(0.25ng/ml)，6h后检测细胞培养上清中的IL-6浓度，结果显示，药物处理组的IL-6分泌降低(P＜0.05)，且有较为明显的剂量依赖性(如图1-3所示)；NaHS可以抑制子宫内膜间质细胞的运动，不同浓度的NaHS作用24小时，对子宫内膜间质细胞的细胞运动有抑制作用(p＜0.05)；

结果证实，本发明中NaHS剂量依赖性的抑制IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞IL-6的分泌；NaHS能剂量依赖性抑制子宫内膜间质细胞的细胞运动，与细胞毒作用无关。

实施例2 硫氢化钠减轻子宫内膜异位症小鼠模型中内异症及其粘连

1.自体子宫内膜缝合法小鼠模型

1.1模型的建立

用1％戊巴比妥钠(0.1ml/20g)腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉后，胶带固定四肢，仰卧位固定在鼠板上。剃去腹部鼠毛，碘酒消毒，75％乙醇脱碘。下腹部正中切口1cm，打开腹腔，暴露双侧子宫。分离一侧子宫，上下端结扎，游离出中间段约1-1.2cm，沿上下端剪下置于无菌生理盐水中，轻轻漂洗，除去脂肪组织和浆膜面，将宫腔沿纵轴剖开，平均分成3-4块，每块约3*3mm大小，7-0号带针缝线将子宫小段缝合到小鼠腹壁(内膜面和腹壁贴合)四个象限腹膜上。切口缝合、消毒。术中给予青霉素钠肌注(16000U/只)预防感染，后置于无菌鼠笼中。假手术组除不缝合子宫内膜外，其余操作相同。标准啮齿类动物饲料喂养，室温22-24℃，相对湿度50-60％，常规饮水及照明；

1.2分组、检测、给药及取材

雌性C57小鼠只，20-22g。造模前进行行为学检测，检测后给与雌二醇0.1mg/kg，肌肉注射以提高造模的成功率。肌肉注射雌二醇36-48小时内造模。造模2周，每周2次注射雌二醇。2周后进行行为学检测并随机分为以下5组：(1)硫氢化钠模型组(n＝10)，给予生理盐水，皮下注射0.2ml/20g；(2)硫氢化钠高剂量组(n＝10)，给予NaHS(112uM/kg)，皮下注射0.2ml/20g；(3)硫氢化钠中剂量组(n＝10)，给予NaHS(56uM/kg)，皮下注射0.2ml/20g；(4)硫氢化钠低剂量组(n＝10)，给予NaHS(28uM/kg)，皮下注射0.2ml/20g；造模后2周开始进行各自药物干预，连续3周；

2.异体子宫内膜注射法小鼠模型

2.1模型的建立

子宫内膜供体组EGFP小鼠给予雌二醇3ug/只肌注一周(一周2次)，一周后进行子宫内膜注射建模。取2只供体小鼠颈椎脱臼法处死，75％乙醇腹部消毒，正中切口进腹，分离子宫，剪下双角子宫，2只小鼠双角子宫置于装有无菌生理盐水的培养皿中，注意子宫旁系膜组织需要玻璃干净，将宫腔沿纵轴剖开，剪碎组织至1mm3左右，用生理盐水轻柔洗涤子宫内膜碎片，将内膜碎片重悬于1ml生理盐水，吸入1ml注射器，水平放置轻轻弹匀，接上7号针头，取受体建模组小鼠每组同编号各一只(做到平行建模比较)，共4只，腹腔注射250ul内膜/只；受体建模组小鼠在接受建模前3天进行体重测定，热板实验，并开始接受各种不同的干预处理；建模后14天复测体重，热板实验，小动物活体成像，常规处理小鼠；

2.2分组、检测、给药及取材

雌性C57小鼠只，20-22g。随机分为以下3组：(1)模型组(n＝9)，给予生理盐水；(2)假手术组(n＝9)，给予给予生理盐水；(3)硫氢化钠组(n＝9)，给予NaHS(28uM/kg)，皮下注射0.2ml/20g；造模前3天开始进行各自药物干预，连续2周；

3.热板实验

在无风、恒温环境中，将热板温度设置为55℃，快速、轻柔地将小鼠置于热板，观察小鼠反应，以舔后足、剧烈煽动后足或跳跃反应为阳性反应，记录反应出现的时间作为热板痛阈时间(hotplate latency，HL)；

4.HE染色

切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，苏木精液染色5min，流水稍洗去苏木精液，置于1％盐酸乙醇分化3s，水洗30s，0.5％伊红液染色2min。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，

5.数据分析

数据采用SPSS13.0统计软件分析。根据数据的特征和分组方法，使用的统计方法有：单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)；Student’s t检验；卡方检验；秩和检验。如果p＜0.05则表示组间有显著性差异；

自体子宫缝合法小鼠模型实验结果：

1.自体子宫缝合法小鼠模型实验结果

模型的建立结果：药物干预3周后，小鼠取材时，可见其腹壁上有2-3个囊泡样病灶，异位病灶形态各异，大小差异大，有的病灶和周围组织形成粘连，如图2-1所示，并经HE染色证实为内膜组织，手术建模成功；

NaHS对异位病灶生长的影响结果：与模型组相比，各药物处理组病灶体积明显缩小，且具有一定的剂量依赖性，如图2-2所示，箱式图用于多组数据平均水平和变异程度的直观分析比较，每组数据均可呈现其上四分位数和下四分位数、中位数、异常值，可以反应数据的变异程度，其中(A)为NaHS治疗组的箱式图，与模型组相比，三个剂量组的NaHS治疗可以缩小病灶(p＜0.05)；(B)为(A)转化成的柱状图；

NaHS对异位病灶粘连的影响结果：异位病灶形态各异，大小差异大，有病灶组织与周围组织发生不同程度的粘连，主要是脏器旁脂肪组织、肠和膀胱(如图2-3所示)，与模型组相比，各药物处理组病灶和周围组织的粘连率明显降低(p＜0.05)，且具有剂量依赖性(如图2-4所示)；

NaHS对模型小鼠痛觉的影响结果：除假手术组外，手术2周后，小鼠热痛觉耐受力明显下降，术后5周(给药3周)后，与模型组相比，各药物处理组小鼠痛觉过敏明显改善(p＜0.05)；如图2-5所示，除假手术组外，手术2周后，小鼠热痛觉耐受力明显下降，术后5周(给药3周)后，与模型组相比，各药物处理组小鼠痛觉过敏明显改善(p＜0.05)；

2.异体子宫内膜注射法小鼠模型实验结果：均可见取材小鼠其腹腔内有1-3个囊泡样病灶，并经HE染色证实为内膜组织(如图2-6所示)，表明子宫内膜注射法小鼠模型建模成功；2周后，使用小动物活体成像系统检测病灶的荧光值(如图2-7所示)，图2-8显示了与模型组相比，各药物处理组小鼠异位病灶荧光值明显降低(p＜0.05)，各药物处理组小鼠痛觉过敏明显改善(p＜0.05)；

实验结果显示，在两种内异症小鼠模型中，NaHS的干预治疗组均能明显改善小鼠热痛觉过敏现象；缩小异位病灶；降低异位病灶和周围组织的粘连率。

实施例3 硫氢化钠在子宫角粘连模型大鼠中的作用

1.大鼠子宫角粘连模型的建立：7％水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定在鼠板上，剃除下腹部鼠毛，碘酒消毒。大鼠下腹部正中切口约3cm，先用刀片损伤双侧腹壁，急性分离SD大鼠心肌细胞：保持均一力度上下刮蹭10次，有轻微渗血为宜，380度电烙铁灼伤双侧子宫角9-10处，将损伤两端的子宫角缝合到腹壁上，上下各一针，间隔约1cm左右，双层关腹，14天后开腹评估。假手术组除不损伤组织外，其余操作相同。SPF级啮齿类动物饲料喂养，室温18-22℃，相对湿度55-65％，常规饮水和照明；

2.分组及给药：模型组和假手术组，给予生理盐水；高剂量组，给予NaHS(112uM/kg)；中剂量组，给予NaHS(56uM/kg)；低剂量组，给予NaHS(28uM/kg)；阳性药组，给予低分子肝素(1.5mg/kg)；硫化氢生成酶抑制剂组，给予PAG(10mg/kg)；

3.大鼠子宫角粘连评价标准：

A.粘连程度评分 0分：无粘连；1分：微小的薄膜样的粘连，非常容易分离，几乎不需要拉力；2分：粘连，比较容易分离，但需要一定的拉力；3分：粘连，在分离过程中会造成子宫外层的损伤，或者需要剪刀辅助分离；4分：粘连，和其他器官形成混合物；

B.粘连程度评分 0分：无粘连；1分：创面范围内粘连比例达到1-25％；2分：创面范围内粘连比例达到26-50％；3分：创面范围内粘连比例达到51-75％；4分：创面范围内粘连比例达到76-100％；

C.粘连总分评分 程度和范围评分之和；

表1显示了各处理组大鼠子宫角粘连模型评分，其中，NaHS有效降低粘连的范围和程度(P＜0.05)，并具有剂量依赖性；单独应用PAG没有加重粘连形成；证实NaHS能减轻子宫角粘连模型大鼠的术后粘连。

表1.各处理组大鼠子宫角粘连模型评分

Claims (5)

1.硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在用于制备治疗子宫内膜异位症及其粘连药物中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)剂量依赖性的抑制IL-1β诱导的子宫内膜间质细胞IL-6的分泌；所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)剂量依赖性的抑制细胞运动。

3.按权利要求1或2的用途，其特征在于，所述的硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)降低异位病灶和周围组织的粘连率。

4.硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)在用于制备减轻子宫粘连药物中的用途。

5.按权利要求1或4的用途，其特征在于，所述的H₂S供体由包括除NaHS以外的其他硫化氢化学供体产生。