CN110261598A - eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途 - Google Patents

eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110261598A
CN110261598A CN201910536520.7A CN201910536520A CN110261598A CN 110261598 A CN110261598 A CN 110261598A CN 201910536520 A CN201910536520 A CN 201910536520A CN 110261598 A CN110261598 A CN 110261598A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
eef2k
growth factor
minutes
hours
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910536520.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110261598B (zh
Inventor
沈凯凯
许世豪
谢建凌
朱紫依
李姚婷
周蓥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201910536520.7A priority Critical patent/CN110261598B/zh
Publication of CN110261598A publication Critical patent/CN110261598A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110261598B publication Critical patent/CN110261598B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及医药学领域，特别是涉及eEF2K及其基因作为药物靶点在筛选促进或者抑制血管新生的药物中的应用。本发明还涉及eEF2K抑制剂或激动剂在制备抑制或促进血管新生的药物中的应用。

Description

eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及eEF2K的医药用途。
背景技术
血管新生是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管网，是机体严格控制的一个多因素、级联、整体、动态的过程。在病理因素作用下，促血管生成因子异常表达，打破了机体对血管形成的动态调控平衡，原来静止的血管内皮细胞将迅速增生。
真核细胞肽链延伸因子-2激酶(eEF2K)是一种公认的钙调素依赖性蛋白激酶。eEF2K能够使其唯一底物真核延伸因子-2(eEF2)序列50RAGETRFTDTRKD62中的Thr56位点磷酸化，降低eEF2与核糖体的结合能力，是近年来医药界研究靶点之一。
发明内容
本发明的目的旨在提供eEF2K的新的医药用途。
具体地说，本发明的第一方面是提供了eEF2K作为药物靶点在筛选促进或者抑制血管新生的药物中的应用。
较优选地，所述促进或者抑制血管新生的药物不用于防治肿瘤。
本发明的第二方面是提供了eEF2K抑制剂在制备抑制血管新生的药物中的应用。
较优选地，所述抑制血管新生的药物不用于防治肿瘤。
本发明的第三方面是提供了eEF2K激动剂在制备促进血管新生的药物中的应用。
本发明的第四方面是提供了eEF2K的基因作为药物靶点在筛选促进或者抑制血管新生的药物中的应用。
较优选地，所述促进或者抑制血管新生的药物不用于防治肿瘤。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1体现了内皮细胞经基因编辑技术后，敲除eEF2K蛋白表达及下调其下游蛋白p-eEF2Thr56表达
图2体现了eEF2K基因沉默后，减缓血管内皮细胞生长、迁移和管腔形成。a：敲除血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白后，减缓内皮细胞生长速率；b：敲除血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白后，减缓内皮细胞迁移能力；c：敲除血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白后，减缓内皮细胞管腔形成率。与对照组比较，***P<0.001
图3体现了eEF2K基因沉默后，抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管内皮细胞生长、迁移和管腔形成。a：敲除血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白后，抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞生长速率；b：敲除血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白后，抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞迁移能力；c：敲除血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白后，抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞管腔形成率。与对照组比较，***P<0.001；与VEGF刺激的对照组相比，###P<0.001
图4体现了eEF2K基因沉默后，抑制血管内皮细胞生长因子的分泌和生长因子受体的表达。a：敲除血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白后，抑制内皮细胞分泌生长因子能力；b：敲除血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白后，抑制内皮细胞生长因子受体表达。与对照组比较，***P<0.001
图5体现了血管内皮细胞经基因编辑技术后，促进eEF2K蛋白及其下游蛋白p-eEF2Thr56表达，其中，E.V.为空质粒；WT为eEF2K质粒；K170M为eEF2K突变质粒，作为阴性对照
图6体现了eEF2K基因高表达后，促进血管内皮细胞的生长、迁移和管腔形成。a：经转染eEF2K质粒后，血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白呈高表达状态后，促进内皮细胞生长速率；b：经转染eEF2K质粒后，血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白呈高表达状态后，促进内皮细胞迁移能力；c：经转染eEF2K质粒后，血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白呈高表达状态后，促进内皮细胞管腔形成率。与对照组比较，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05
图7体现了eEF2K基因高表达后，促进HUVEC生长因子分泌和生长因子受体表达。a：经转染eEF2K质粒后，血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白呈高表达状态后，促进内皮细胞分泌生长因子能力；b：经转染eEF2K质粒后，血管内皮细胞eEF2K基因/蛋白呈高表达状态后，促进内皮细胞生长因子受体表达。与对照组比较，***P<0.001
图8体现了抑制eEF2K基因/蛋白表达的化合物15抑制体内外血管新生。a：化合物15抑制eEF2K蛋白及其下游蛋白p-eEF2Thr56表达；b：化合物15作用24小时后，抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞生长率；c：化合物15作用24小时后，抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞迁移能力；d：化合物15作用24小时后，抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞管腔形成率。e：化合物15与VEGF混悬在基质胶内，注射入小鼠腹中线皮下层，7天后取材拍照；f：采用免疫组化，观察基质胶中血管新生标志物CD-31表达；g：采用Image J，分析基质胶中血管新生标志物CD-31表达量。与对照组比较，***P<0.001；与VEGF刺激的对照组相比，###P<0.001
图9体现了促进eEF2K基因/蛋白表达的化合物25促进体内外血管新生。a：化合物25促进eEF2K蛋白及其下游蛋白p-eEF2Thr56表达；b：化合物25作用24小时后，促进内皮细胞生长率；c：化合物25作用24小时后，促进内皮细胞迁移能力；d：化合物25作用24小时后，促进内皮细胞管腔形成率。e：化合物25与基质胶混悬，注入小鼠腹中线皮下层，7天后取材拍照；f：采用免疫组化，观察基质胶中血管新生标志物CD-31表达；g：采用Image J，分析基质胶中血管新生标志物CD-31表达量。与对照组比较，***P<0.001
具体实施方式
本发明的问世部分是基于这样一个意外发现：eEF2K基因沉默或高表达后，可以显著性地调控血管新生。因此，eEF2K有望作为药物靶点用于筛选促进或者抑制血管新生的药物。
本发明的eEF2K抑制剂、eEF2K小干扰RNA、eEF2K质粒均可通过商业途径从Sigma化学公司、Santa Cruz公司等处购买获得，其纯度均符合药用标准。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1 eEF2K基因沉默后抑制内皮细胞生长迁、迁移和管腔形成
1.1实验材料：
新生儿脐带由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。
明胶(美国Sigma公司)；溴化-3(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二甲苯基四氮唑(MTT，美国Sigma公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；M199培养液(美国Gibco公司)；0.25％胰蛋白酶(美国Gibco公司)；基质胶(Matrigel，美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS，美国Gibco公司)；血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF，美国PeproTech公司)；肝素(上海中医药大学曙光医院)；GAPDH(美国Cell SignalingTechnology公司)，eEF2K(美国Cell Signaling Technology公司)，p-eEF2(美国CellSignaling Technology公司)，eEF2(美国Cell Signaling Technology公司)，实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
1.2实验方法：
1.2.1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF，30ng/ml ECGS和5U/ml肝素，于37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。
1.2.2细胞转染实验
按shRNA转染试剂说明书操作，实验步骤如下：
(1)需进行转染的HUVEC于无双抗的完全培养基中培养，取对数生长期的细胞用消化液消化后，接种到培养皿中，次日融合率达到50％-60％，即可进行转染。
(2)将polybrene加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合2分钟。
(3)同时将control shRNA和eEF2K shRNA加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合5分钟。
(4)将(2)和(3)混合，室温混合20分钟。
(5)分别将(2)和(3)加入到经opti-MEM清洗的HUVEC，作用8小时，吸去转染液，换上新鲜的无双抗的完全培养基，继续培养。
(6)转染后并用倒置荧光显微镜观察转染效率，一般转染120小时后开始用于实验。
1.2.3细胞增殖实验
细胞经eEF2KshRNA干扰后，取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(1×105个/ml)，以1×104个/孔HUVECs接种到96孔板中，次日细胞贴壁后计为0天，每隔三天换液，分别在0天、1天、2天、4天、8天和12天终止细胞生长，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)，置培养箱反应4小时，弃液，加入100μl DMSO，在OD570nm处测定吸光值，细胞存活率(％)＝eEF2KshRNAOD 570nm/con shRNA OD 570nm×100％。
1.2.4细胞迁移实验
(1)于24孔板中，加入0.1％明胶(400μl/孔)，将小室浸入其中，于37℃，5％CO2培养箱中孵育2小时，然后置生物安全柜中，将小室倒扣，晾干，备用。
(2)取对数生长期的细胞(con shRNA和eEF2KshRNA细胞)，将细胞制成细胞悬液(2×105个/ml)，铺入预包被0.1％明胶的小室上室，2×104个/孔，作用24小时后，取出小室，弃培养基，用4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次，用0.1％结晶紫染色30分钟，用棉签轻轻地擦去上室未迁移细胞，并用PBS漂洗多余染，倒扣，晾干过夜。次日用10％乙酸100μl/孔抽提10分钟，用酶标仪600nm下测定OD值。
1.2.5细胞管腔实验
(1)于96孔板中，加入基质胶(40μl/孔)，于37℃，5％CO2培养箱中孵2小时，备用。
(2)取对数生长期的细胞(con shRNA和eEF2KshRNA细胞)，将细胞制成细胞悬液(4×105个/ml)，铺入预包被基质胶的96孔板中，4×104个/孔，作用8小时后，于100倍显微镜下随机选取5个视野计数。
1.2.6免疫印迹电泳实验
细胞经eEF2KshRNA干扰后，取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(2×105个/孔)接种于6孔板，48小时后，收集细胞沉淀，用RIPA裂解，提取细胞膜蛋白，存于-20℃冻存待测。根据western blotting实验步骤，配胶---上样---转膜---封闭---孵一抗---孵二抗---曝光。
1.2.7统计学处理
实验数据均用平均值±标准误表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为具有统计学显著性差异标准。
1.3实验结果
实验结果如图1所示，HUVECs经eEF2KshRNA转染后，细胞内eEF2K蛋白表达水平显著性地降低，且其下游唯一底物p-eEF2呈现低表达状态；经eEF2KshRNA敲除后的内皮细胞，显著性地减缓内皮细胞生长率(如图2a所示)；经eEF2KshRNA敲除后的内皮细胞，显著性地减缓内皮细胞迁移能力(如图2b所示)；经eEF2KshRNA敲除后的内皮细胞，显著性地减缓内皮细胞管腔形成率(如图2c所示)。结果提示：eEF2K基因沉默后可以减缓内皮细胞生长，迁移和管腔形成。
实施例2 eEF2K基因沉默后抑制血管内皮生长因子诱导的内皮细胞生长迁、迁移和管腔形成
2.1实验材料：
新生儿脐带由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。
明胶(美国Sigma公司)；溴化-3(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二甲苯基四氮唑(MTT，美国Sigma公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；M199培养液(美国Gibco公司)；0.25％胰蛋白酶(美国Gibco公司)；基质胶(Matrigel，美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS，美国Gibco公司)；血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF，美国PeproTech公司)；肝素(上海中医药大学曙光医院)；实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法：
2.2.1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF,30ng/ml ECGS和5U/ml肝素，于37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。
2.2.2细胞转染实验
按shRNA转染试剂说明书操作，实验步骤如下：
(1)需进行转染的HUVEC于无双抗的完全培养基中培养，取对数生长期的细胞用消化液消化后，接种到培养皿中，次日融合率达到50％-60％，即可进行转染。
(2)将polybrene加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合2分钟。
(3)同时将control shRNA和eEF2K shRNA加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合5分钟。
(4)将(2)和(3)混合，室温混合20分钟。
(5)分别将(2)和(3)加入到经opti-MEM清洗的HUVEC，作用8小时，吸去转染液，换上新鲜的无双抗的完全培养基，继续培养。
(6)转染后并用倒置荧光显微镜观察转染效率，一般转染120小时后开始用于实验。
2.2.3细胞增殖实验
细胞经eEF2KshRNA干扰后，取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(1×105个/ml)，以1×104个/孔HUVECs接种到96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时，弃原培养基，换含1％胎牛血清的M199培养基，加入血管内皮生长因子与细胞共孵48小时后，加入10μlMTT(终浓度0.5mg/ml)，置培养箱反应4小时，弃液，加入100μl DMSO，在OD570nm处测定吸光值，细胞存活率(％)＝eEF2KshRNAOD 570nm/con shRNAOD 570nm×100％。
2.2.4细胞迁移实验
(1)于24孔板中，加入0.1％明胶(400μl/孔)，将小室浸入其中，于37℃，5％CO2培养箱中孵育2小时，然后置生物安全柜中，将小室倒扣，晾干，备用。
(2)对数生长期的细胞(con shRNA和eEF2KshRNA细胞)饥饿2小时，将其制成细胞悬液(1×105个/ml)，铺入预包被0.1％明胶的小室上室，1×104个/孔，下室加入600μl的无血清培液，并加入VEGF(10ng/ml)，作用24小时后，取出小室，弃培养基，用4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次，用0.1％结晶紫染色30分钟，用棉签轻轻地擦去上室未迁移细胞，并用PBS漂洗多余染，倒扣，晾干过夜。次日用10％乙酸100μl/孔抽提10分钟，用酶标仪600nm下测定OD值。
2.2.5细胞管腔实验
(1)于96孔板中，加入基质胶(40μl/孔)，于37℃，5％CO2培养箱中孵2小时，备用。
(2)对数生长期的细胞(con shRNA和eEF2KshRNA细胞)饥饿2小时，将细胞制成细胞悬液(2×105个/ml)，铺入预包被基质胶的96孔板中，2×104个/孔，并加入VEGF(10ng/ml)，作用8小时后，于100倍显微镜下随机选取5个视野计数。
2.2.6统计学处理
实验数据均用平均值±标准误表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为具有统计学显著性差异标准。
2.3实验结果
经eEF2KshRNA敲除后的内皮细胞，血管内皮生长因子(VEGF)作用48小时后，结果显示，eEF2K基因沉默后显著性地抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞生长率(如图3a所示)；经eEF2KshRNA敲除后的内皮细胞，显著性地抑制血管内皮生长因子诱导的内皮细胞迁移能力(如图3b所示)；经eEF2KshRNA敲除后的内皮细胞，显著性地抑制血管内皮生长因子诱导的内皮细胞管腔形成率(如图3c所示)。结果提示，eEF2K基因沉默后能够抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞生长，迁移和管腔形成。
实施例3 eEF2K基因沉默后抑制内皮细胞分泌生长因子和生长因子受体表达
3.1实验材料：
新生儿脐带由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。
胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；M199培养液(美国Gibco公司)；0.25％胰蛋白酶(美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS，美国Gibco公司)；肝素(上海中医药大学曙光医院)；生长因子ELISA试剂盒(美国R&D公司)；血管内皮生长因子受体2(vascularendothelial growth factor receptor 2,VEGFR2，美国Cell Signaling Technology公司)、碱性成纤维细胞生长因子受体(basic fibroblast growth factor receptor,FGFR，美国Cell Signaling Technology公司)、血小板衍生生长因子受体(platelet-derivedgrowth factor receptor,PDGFR，美国Cell Signaling Technology公司)，GAPDH(美国Cell Signaling Technology公司)，实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
3.2实验方法：
3.2.1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF，30ng/ml ECGS和5U/ml肝素，于37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。
3.2.2细胞转染实验
按shRNA转染试剂说明书操作，实验步骤如下：
(1)需进行转染的HUVEC于无双抗的完全培养基中培养，取对数生长期的细胞用消化液消化后，接种到培养皿中，次日融合率达到50％-60％，即可进行转染。
(2)将polybrene加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合2分钟。
(3)同时将control shRNA和eEF2K shRNA加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合5分钟。
(4)将(2)和(3)混合，室温混合20分钟。
(5)分别将(2)和(3)加入到经opti-MEM清洗的HUVEC，作用8小时，吸去转染液，换上新鲜的无双抗的完全培养基，继续培养。
(6)转染后并用倒置荧光显微镜观察转染效率，一般转染120小时后开始用于实验。
3.2.3生长因子分泌检测
细胞经eEF2KshRNA干扰后，取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(1×105个/孔)接种于24孔板，次日，换含1％血清的M199，作用72小时后，收集培养上清，4℃，离心，1000g，5分钟，取上清于-20℃冻存待测。根据ELISA试剂盒中的相关说明进行实验。过程如下：
(1)在已包被抗体的ELISA板中加入封闭液100μl/孔，室温1小时；
(2)洗板3次，加入标准品和样品100μl/孔，室温2小时；
(3)洗板3次，加入二抗100μl/孔，室温1小时；洗板3次，加入辣根过氧化物酶100μl/孔，室温1小时；
(4)洗板3次，加入化学发光试剂，作用10分钟，用蛋白成像系统拍照。
(5)照片结果数据分析，得出样品中各生长因子含量由R&D公司完成。
3.2.4免疫印迹电泳实验
细胞经eEF2KshRNA干扰后，取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(2×105个/孔)接种于6孔板，48小时后，收集细胞沉淀，用RIPA裂解，提取细胞膜蛋白，存于-20℃冻存待测。根据western blotting实验步骤，配胶---上样---转膜---封闭---孵一抗---孵二抗---曝光。
3.2.5统计学处理
实验数据均用平均值±标准误表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为具有统计学显著性差异标准。
3.3实验结果
实验结果如图4a所示，经eEF2KshRNA敲除后的内皮细胞，能够显著性地抑制内皮细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)、胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)、血小板衍生生长因子-AA(platelet-derived growth factor-AA,PDGF-AA)、血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)；同时，经eEF2KshRNA敲除后的内皮细胞，能够显著性地抑制内皮细胞血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growthfactor receptor 2,VEGFR2)、碱性成纤维细胞生长因子受体(basic fibroblast growthfactor receptor,FGFR)、血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factorreceptorα,PDGFRα)和血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factorreceptorβ,PDGFRβ)的表达(如图4b所示)。结果提示，eEF2K基因沉默后能够显著性地抑制内皮细胞生长因子的分泌和生长因子受体的表达。
实施例4 eEF2K基因高表达后促进内皮细胞生长迁、迁移和管腔形成
4.1实验材料：
新生儿脐带由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。
明胶(美国Sigma公司)；溴化-3(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二甲苯基四氮唑(MTT，美国Sigma公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；M199培养液(美国Gibco公司)；0.25％胰蛋白酶(美国Gibco公司)；基质胶(Matrigel，美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS，美国Gibco公司)；血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF，美国PeproTech公司)；肝素(上海中医药大学曙光医院)；实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
4.2实验方法：
4.2.1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF,30ng/ml ECGS和5U/ml肝素，于37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。
4.2.2细胞质粒转染实验
按X-tremeGENETM转染试剂说明书操作，实验步骤如下：
(1)需进行转染的HUVEC于无双抗的完全培养基中培养，取对数生长期的细胞用消化液消化后，接种到培养皿中，次日融合率达到50％-60％，即可进行转染。
(2)将X-tremeGENE加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合5分钟。
(3)同时将control plasmid和eEF2K plasmid加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合5分钟。
(4)将(2)和(3)混合，室温混合20分钟。
(5)将混合后的(4)加入到进opti-MEM清洗的HUVEC，作用8小时，吸去转染液，换上新鲜的无双抗的完全培养基，继续培养。
(6)转染后并用倒置荧光显微镜观察转染效率。
4.2.3细胞增殖实验
细胞经eEF2K plasmid转染后，取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(1×105个/ml)，以1×104个/孔HUVECs接种到96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时，弃原培养基，换含1％胎牛血清的M199培养基，于0，1，2，4天检测，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)，置培养箱反应4小时，弃液，加入100μl DMSO，在OD570nm处测定吸光值，细胞存活率(％)＝eEF2K plasmid OD 570nm/con plasmid OD 570nm×100％。
4.2.4细胞迁移实验
(1)于24孔板中，加入0.1％明胶(400μl/孔)，将小室浸入其中，于37℃，5％CO2培养箱中孵育2小时，然后置生物安全柜中，将小室倒扣，晾干，备用。
(2)对数生长期的细胞(con plasmid和eEF2K plasmid细胞)饥饿2小时，将其制成细胞悬液(1×105个/ml)，铺入预包被0.1％明胶的小室上室，1×104个/孔，下室加入含1％FBS的培养基600μl，作用24小时后，取出小室，弃培养基，用4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次，用0.1％结晶紫染色30分钟，用棉签轻轻地擦去上室未迁移细胞，并用PBS漂洗多余染，倒扣，晾干过夜。次日用10％乙酸100μl/孔抽提10分钟，用酶标仪600nm下测定OD值。
4.2.5细胞管腔实验
(1)于96孔板中，加入基质胶(40μl/孔)，于37℃，5％CO2培养箱中孵2小时，备用。
(2)对数生长期的细胞(con plasmid和eEF2K plasmid细胞)饥饿2小时，将细胞制成细胞悬液(2×105个/ml)，铺入预包被基质胶的96孔板中，2×104个/孔，作用8小时后，于100倍显微镜下随机选取5个视野计数。
4.2.6统计学处理
实验数据均用平均值±标准误表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为具有统计学显著性差异标准。
4.3实验结果
实验结果如图5所示，经eEF2K基因剪辑技术后的内皮细胞，eEF2K呈现高表达状态，且其下游唯一底物p-eEF2呈现高表达状态；同时我们采用看K170M突变点，作为阴性对照。结果显示，eEF2K高表达的内皮细胞能够显著性地诱导内皮细胞生长速率(如图6a所示)；经基因编辑技术后eEF2K高表达的内皮细胞，能够显著性地诱导内皮细胞迁移速率(如图6b所示)；经基因编辑技术后eEF2K高表达的内皮细胞，能够显著性地诱导内皮细胞管腔形成率(如图6c所示)。结果提示，eEF2K基因高表达后能够促进血管内皮生长因子诱导的内皮细胞生长，迁移和管腔形成。
实施例5eEF2K基因高表达后促进内皮细胞分泌生长因子和生长因子受体表达
5.1实验材料：
新生儿脐带由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。
胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；M199培养液(美国Gibco公司)；0.25％胰蛋白酶(美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS，美国Gibco公司)；肝素(上海中医药大学曙光医院)；生长因子ELISA试剂盒(美国R&D公司)；血管内皮生长因子受体2(vascularendothelial growth factor receptor 2,VEGFR2，美国Cell Signaling Technology公司)、碱性成纤维细胞生长因子受体(basic fibroblast growth factor receptor,FGFR，美国Cell Signaling Technology公司)、血小板衍生生长因子受体(platelet-derivedgrowth factor receptor,PDGFR，美国Cell Signaling Technology公司)，GAPDH(美国Cell Signaling Technology公司)，实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
5.2实验方法：
5.2.1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF，30ng/ml ECGS和5U/ml肝素，于37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。
5.2.2细胞转染实验
细胞质粒转染实验
按X-tremeGENETM转染试剂说明书操作，实验步骤如下：
(1)需进行转染的HUVEC于无双抗的完全培养基中培养，取对数生长期的细胞用消化液消化后，接种到培养皿中，次日融合率达到50％-60％，即可进行转染。
(2)将X-tremeGENE加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合5分钟。
(3)同时将control plasmid和eEF2K plasmid加入到无血清无双抗的opti-MEM培养基中，室温混合5分钟。
(4)将(2)和(3)混合，室温混合20分钟。
(5)将混合后的(4)加入到进opti-MEM清洗的HUVEC，作用8小时，吸去转染液，换上新鲜的无双抗的完全培养基，继续培养。
(6)转染后并用倒置荧光显微镜观察转染效率。
5.2.3生长因子分泌检测
细胞经eEF2K plasmid转染后，取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(1×105个/孔)接种于24孔板，次日，换含1％血清的M199，作用72小时后，收集培养上清，4℃，离心，1000g，5分钟，取上清于-20℃冻存待测。根据ELISA试剂盒中的相关说明进行实验。过程如下：
(1)在已包被抗体的ELISA板中加入封闭液100μl/孔，室温1小时；
(2)洗板3次，加入标准品和样品100μl/孔，室温2小时；
(3)洗板3次，加入二抗100μl/孔，室温1小时；洗板3次，加入辣根过氧化物酶100μl/孔，室温1小时；
(4)洗板3次，加入化学发光试剂，作用10分钟，用蛋白成像系统拍照。
(5)照片结果数据分析，得出样品中各生长因子含量由R&D公司完成。
5.2.4免疫印迹电泳实验
细胞经eEF2K plasmid干扰后，取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(2×105个/孔)接种于6孔板，48小时后，收集细胞沉淀，用RIPA裂解，提取细胞膜蛋白，存于-20℃冻存待测。根据western blotting实验步骤，配胶---上样---转膜---封闭---孵一抗---孵二抗---曝光。
5.2.5统计学处理
实验数据均用平均值±标准误表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为具有统计学显著性差异标准。
5.3实验结果
实验结果如图7a所示，经eEF2K质粒转染后的内皮细胞，能够显著性地促进内皮细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor,bFGF)、胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)、血小板衍生生长因子-AA(platelet-derived growth factor-AA,PDGF-AA)、血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)；同时，经eEF2K质粒转染后的内皮细胞，能够显著性地增加内皮细胞血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factorreceptor 2,VEGFR2)、碱性成纤维细胞生长因子受体(basic fibroblast growth factorreceptor,FGFR)、血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factorreceptorα,PDGFRα)和血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factorreceptorβ,PDGFRβ)的表达(如图7b所示)。结果提示，eEF2K基因高表达后能够促进内皮细胞生长因子的分泌和生长因子受体的表达。
实施例6以eEF2K为药物靶点筛选eEF2K抑制剂和eEF2K激动剂
6.1实验材料：
C57小鼠，雄性，6-8周龄，体重18-20g，购自中国科学院上海实验动物中心。动物合格证编号：SYXK(沪)2014-0008。小鼠饲养于上海中医药大学SPF级动物房，至少饲养五天后使用。温度22±1℃，湿度55±5％，12小时光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有动物均严格按照国家和上海中医药大学动物中心动物实用管理条例进行实验设计和实施。
新生儿脐带由上海国际和平妇婴保健院提供。在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带，长度20cm左右，置于4℃HBSS中，1小时内送细胞培养室。
明胶(美国Sigma公司)；溴化-3(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二甲苯基四氮唑(MTT，美国Sigma公司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；M199培养液(美国Gibco公司)；0.25％胰蛋白酶(美国Gibco公司)；基质胶(Matrigel，美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS，美国Gibco公司)；血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF，美国PeproTech公司)；肝素(上海中医药大学曙光医院)；化合物通过商业途径从Sigma化学公司、Santa Cruz公司等处购买获得，其纯度均符合药用标准；实验中所用其它试剂均为国产分析纯。
6.2实验方法：
6.2.1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离与原代培养
无菌条件下取健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带置，15-20cm，4℃保存于HBSS中。脐静脉一端插入灌胃针头并固定，注入HBSS液冲洗干净静脉腔内血迹和血块；用止血钳夹闭脐静脉另一端，灌胶原酶液使管腔充盈，顶端封闭，37℃水浴15分钟，消化后取出脐带，轻柔按摩血管以增加内皮细胞脱落，消化液转入含血清的培养液中，终止胶原酶，用HBSS灌洗消化后的血管，收集并与消化液一并离心，1000r/min，5分钟，弃上清收集沉淀细胞，并用含20％胎牛血清的M199培液重悬，移入培养皿中，用2ml培液重悬，用含20％胎牛血清的M199培液基，并添加10ng/ml EGF，30ng/ml ECGS和5U/ml肝素，于37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化传代，取对数生长期细胞用于实验。对分离所得的人脐静脉内皮细胞进行鉴定，由专职老师在倒置显微镜下观察细胞形态鉴定，并通过免疫荧光检测细胞VWF表达，鉴定为原代HUVEC细胞。
6.2.2实时定量PCR(Real Time-polymerase chain reaction,RT-PCR)
取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(2×105个/孔)接种于6孔板内，次日，加入不同单体化合物(10μM)，另设相应溶媒对照，作用24小时后，根据Takara公司Trizol一步抽提法提取总RNA，存于-20℃。根据Takara公司逆转录试剂盒和Sybergreen试剂盒，检测细胞中eEF2K的基因水平。
6.2.3免疫印迹电泳实验
取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(2×105个/孔)接种于6孔板，次日，与化合物孵育24小时后，收集细胞沉淀，用RIPA裂解，提取细胞膜蛋白，存于-20℃冻存待测。根据western blotting实验步骤，配胶---上样---转膜---封闭---孵一抗---孵二抗---曝光。
6.2.4细胞增殖实验
取对数生长期的细胞，将细胞制成细胞悬液(1×105个/ml)，以1×104个/孔HUVECs接种到96孔板中，待细胞贴壁生长状态良好时，弃原培养基，换含1％胎牛血清的M199培养基，加入待测药物与细胞共孵，加入或不加入VEGF(10ng/ml)，作用24小时后，加入10μl MTT(终浓度0.5mg/ml)，置培养箱反应4小时，弃液，加入100μl DMSO，在OD570nm处测定吸光值，细胞存活率(％)＝待测组OD 570nm/对照组OD 570nm×100％。
6.2.5细胞迁移实验
(1)于24孔板中，加入0.1％明胶(400μl/孔)，将小室浸入其中，于37℃，5％CO2培养箱中孵育2小时，然后置生物安全柜中，将小室倒扣，晾干，备用。
(2)对数生长期的细胞饥饿2小时，将其制成细胞悬液(1×105个/ml)，铺入预包被0.1％明胶的小室上室，1×104个/孔，加入药物共孵；下室加入600μl的无血清培液，并加入或不加入VEGF(10ng/ml)，作用24小时后，取出小室，弃培养基，用4％多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次，用0.1％结晶紫染色30分钟，用棉签轻轻地擦去上室未迁移细胞，并用PBS漂洗多余染，倒扣，晾干过夜。次日用10％乙酸100μl/孔抽提10分钟，用酶标仪600nm下测定OD值。
6.2.6细胞管腔实验
(1)于96孔板中，加入基质胶(40μl/孔)，于37℃，5％CO2培养箱中孵2小时，备用。
(2)对数生长期的细胞饥饿2小时，将细胞制成细胞悬液(2×105个/ml)，铺入预包被基质胶的96孔板中，2×104个/孔，加入待测药物，加入或不加入VEGF(10ng/ml)，作用8小时后，于100倍显微镜下随机选取5个视野计数。
6.2.7体内血管新生实验
基质胶于4℃溶解，取基质胶500μl含肝素(5U/ml)，加或不加VEGF 10ng/ml和待测化合物，将基质胶混合液皮下注射于小鼠腹中线皮下。基质胶在体内迅速多聚化，形成一个基质胶块，1周后，颈椎脱臼，处死小鼠，取出基质胶块，于PBS中清洗2次，沾干，拍照。
6.2.8免疫组化
组织样本浸泡于4％多聚甲醛中24小时，取出固定好的组织由50％乙醇-75％乙醇-85％乙醇-95％乙醇-无水乙醇脱水，每次时间为1小时，转置石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍30分钟，再移入2个熔化的石蜡液中分别浸渍2小时，浸蜡后的组织块放在装有蜡液的容器中(摆好在蜡中的位置)，待蜡液表层凝固即迅速冷却，对其进行修块与切片，切片厚度为4μm,贴片于载玻片，60℃烤片，存于通风处。切片根据如下次序：二甲苯I 5分钟---二甲苯II 5分钟---二甲苯:无水乙醇(1:1)5分钟---无水乙醇2分钟---95％乙醇2分钟---85％乙醇2分钟---75％乙醇2分钟---蒸馏水洗2分钟，抗原修复，上一抗CD-31，4℃过夜；次日，弃一抗，洗片3次；上二抗，30分钟；弃二抗，洗片3次；上HRP生物标志链，30分钟；弃HRP生物标志链，洗片3次；DAB显色1分钟，自来水冲洗10分钟；苏木素染色10分钟，盐酸乙醇分化3秒，自来水冲洗泛蓝20分钟常规脱水，透明，封片：75％乙醇2分钟-85％乙醇2分钟-95％乙醇2分钟→无水乙醇2分钟-二甲苯：无水乙醇(1:1)5分钟-二甲苯I 5分钟-二甲苯II 5分钟→中性树脂封固。
6.2.9统计学处理
实验数据均用平均值±标准误表示，采用SPSS11.5统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用LSD法，P<0.05为具有统计学显著性差异标准。
6.3实验结果
6.3.1以eEF2K为药物靶点筛选eEF2K抑制剂和eEF2K激动剂
41个待测化合物与内皮细胞作用24小时后，收集细胞RNA，进行Realtime PCR检测，结果如表1所示，化合物1，2，9，14，15，19，22和24能够显著性地抑制细胞内eEF2K基因表达，其中化合物15抑制eEF2K表达效果最佳；化合物25和27能够显著性地促进细胞内eEF2K基因表达，其中化合物25促进eEF2K表达效果最佳。
表1化合物抑制/促进内皮细胞eEF2K表达
与对照组比较，***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05；
6.3.2化合物15抑制血管生长因子诱导体内外血管新生
化合物15作用内皮细胞24小时后，显著性地抑制细胞内eEF2K及其下游蛋白p-eEF2Thr56表达(如图8a所示)。内皮细胞经与化合物15作用24小时后，能够显著性地抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞生长率(如图8b所示)；能够显著性地抑制血管内皮生长因子诱导的内皮细胞迁移速率(如图8c所示)；能够显著性地抑制血管内皮生长因子诱导的内皮细胞管腔形成率(如图8d所示)。继而，采用体内基质胶实验，结果如图8e显示，化合物15与VEGF在基质胶内作用7天后，取材拍照；采用免疫荧光实验，结果如图8f和8g显示，化合物15能够显著性地抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导基质胶内血管新生标志物CD-31表达。结果提示，抑制eEF2K基因/蛋白表达的化合物15能够抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导体内外血管新生。
6.3.3化合物25促进体内外血管新生
化合物25作用内皮细胞24小时后，显著性地促进细胞内eEF2K及其下游蛋白p-eEF2Thr56表达(如图9a所示)。内皮细胞经与化合物25作用24小时后，能够显著性地促进内皮细胞生长率(如图9b所示)；能够显著性地促进内皮细胞迁移速率(如图9c所示)；能够显著性地促进内皮细胞管腔形成率(如图9d所示)。继而，采用体内基质胶实验，结果如图9e显示，化合物25在基质胶内作用7天后，取材拍照；采用免疫荧光实验，结果如图9f和9g显示，化合物25能够显著性地诱导基质胶内血管新生标志物CD-31的表达。结果提示，促进eEF2K基因/蛋白表达的化合物25能够促进体内外血管新生。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。

Claims (7)

1.eEF2K作为药物靶点在筛选促进或者抑制血管新生的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，所述促进或者抑制血管新生的药物不用于防治肿瘤。
3.eEF2K抑制剂在制备抑制血管新生的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，所述抑制血管新生的药物不用于防治肿瘤。
5.eEF2K激动剂在制备促进血管新生的药物中的应用。
6.eEF2K的基因作为药物靶点在筛选促进或者抑制血管新生的药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，所述促进或者抑制血管新生的药物不用于防治肿瘤。
CN201910536520.7A 2019-06-20 2019-06-20 eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途 Active CN110261598B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910536520.7A CN110261598B (zh) 2019-06-20 2019-06-20 eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910536520.7A CN110261598B (zh) 2019-06-20 2019-06-20 eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110261598A true CN110261598A (zh) 2019-09-20
CN110261598B CN110261598B (zh) 2022-09-16

Family

ID=67919743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910536520.7A Active CN110261598B (zh) 2019-06-20 2019-06-20 eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110261598B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234827A (zh) * 2021-05-17 2021-08-10 中国人民解放军总医院第五医学中心 eEF-2K蛋白及其编码基因在肝脏肿瘤诊断治疗中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001010956A (ja) * 1999-04-28 2001-01-16 Nippon Kayaku Co Ltd 新規なプロティンキナーゼ阻害剤又は癌治療剤
EP2727596A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-07 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) eEF2/eEF2K as therapeutic target for treating TNF-alpha-related diseases
CN105797142A (zh) * 2016-03-14 2016-07-27 江苏省人民医院 含eEF2K抑制剂的肿瘤放射增敏剂

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001010956A (ja) * 1999-04-28 2001-01-16 Nippon Kayaku Co Ltd 新規なプロティンキナーゼ阻害剤又は癌治療剤
EP2727596A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-07 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) eEF2/eEF2K as therapeutic target for treating TNF-alpha-related diseases
CN105797142A (zh) * 2016-03-14 2016-07-27 江苏省人民医院 含eEF2K抑制剂的肿瘤放射增敏剂

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASLAM A. KHAN 等: "Resveratrol Regulates Pathologic Angiogenesis by a Eukaryotic Elongation Factor-2 Kinase-Regulated Pathway", 《THE AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY》 *
RUI LIU 等: "Eukaryotic elongation factor 2 kinase as a drug target in cancer, and in cardiovascular and neurodegenerative diseases", 《ACTA PHARMACOLOGICA SINICA》 *
T. USUI 等: "Eukaryotic elongation factor 2 kinase controls proliferation and migration of vascular smooth muscle cells", 《ACTA PHYSIOL》 *
刘启梁: "eEF2K与肿瘤", 《生命的化学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234827A (zh) * 2021-05-17 2021-08-10 中国人民解放军总医院第五医学中心 eEF-2K蛋白及其编码基因在肝脏肿瘤诊断治疗中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110261598B (zh) 2022-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Herman et al. Microvascular pericytes contain muscle and nonmuscle actins.
Tyagi et al. Induction of tissue inhibitor and matrix metalloproteinase by serum in human heart‐derived fibroblast and endomyocardial endothelial cells
WO2020030097A1 (zh) 促进细胞生长和组织修复的方法及组合物
CN105622752B (zh) 降钙素原单克隆抗体对及其制备方法与应用
Nehls et al. Contact-dependent inhibition of angiogenesis by cardiac fibroblasts in three-dimensional fibrin gels in vitro: implications for microvascular network remodeling and coronary collateral formation
Rudland Histochemical organization and cellular composition of ductal buds in developing human breast: evidence of cytochemical intermediates between epithelial and myoepithelial cells.
CN110261598A (zh) eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途
CN108203732A (zh) Trim24在胶质瘤诊断中的应用
CN110079501A (zh) 小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法
CN109134650A (zh) 抗人plgf单克隆抗体的制备方法
Garmy‐Susini et al. Methods to study lymphatic vessel integrins
CN106075468A (zh) Gps2用于制备软组织肿瘤预后、诊断或防治的药物的用途
CN108546750A (zh) 一种将tlr9应用于治疗冠状动脉粥样硬化的研究方法
CN110412295B (zh) PTEN Nedd8修饰作为乳腺癌新型标志物及其特异性抗体的发明与应用
Terzaghi-Howe et al. Inhibition of carcinogen-altered rat tracheal epithelial cells by normal epithelial cell-conditioned medium
CN108490180B (zh) EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
CN206990609U (zh) 一种表皮生长因子抗体检测试剂盒
JPWO2007013517A1 (ja) リンパ管新生評価系
CN105920025B (zh) 托吡酯在治疗心肌梗死的药品中应用
CN103319594A (zh) 含有单克隆抗体AntiDaintain的癌症诊断试剂盒及其用途
CN110354254A (zh) 鹿茸多肽在制备用于治疗骨肉瘤转移的药物中的用途
CN109745314A (zh) 铁螯合剂Deferasirox(DFX)在治疗宫颈癌的药物中的应用
CN117805376B (zh) CD44和Lgr5作为标记物在筛选胃癌肿瘤干细胞中的应用
EP3985395A1 (en) Method for producing transplantable oral mucosa tissue
CN107884585B (zh) 缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant