CN107884585B - 缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用 - Google Patents

缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107884585B
CN107884585B CN201711000221.9A CN201711000221A CN107884585B CN 107884585 B CN107884585 B CN 107884585B CN 201711000221 A CN201711000221 A CN 201711000221A CN 107884585 B CN107884585 B CN 107884585B
Authority
CN
China
Prior art keywords
myocardial infarction
hypoxia inducible
mitogenic factor
himf
protein detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201711000221.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107884585A (zh
Inventor
刘杰
郑娜
董鸣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen University
Original Assignee
Shenzhen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen University filed Critical Shenzhen University
Priority to CN201711000221.9A priority Critical patent/CN107884585B/zh
Publication of CN107884585A publication Critical patent/CN107884585A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107884585B publication Critical patent/CN107884585B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用，该蛋白检测试剂盒包括特异性缺氧诱导的有丝分裂因子抗体包被的酶标板、酶标试剂、洗涤缓冲液、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、缺氧诱导的有丝分裂因子标准品，所述缺氧诱导的有丝分裂因子抗体起诊断作用的活性成分。本发明经过细胞水平及动物水平实验得到不但能够参与心肌梗死性疾病的发生，而且能够与心肌梗死的程度密切相关的生物标记物HIMF蛋白检测ELISA试剂盒，该HIMF蛋白检测ELISA试剂盒，对于多种心肌梗死性疾病，如急性心肌梗死、陈旧性心肌梗死等具有明显的诊断效果；对于心肌梗死引起的心室重构表现出优异的诊断作用。

Description

缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及检测试剂盒的技术领域，更具体地说，涉及一种缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用。
背景技术
近年来，我国心血管疾病死亡一直占城乡居民总死亡原因的首位，其中，心肌梗死患病率及死亡率总体处于持续上升态势。心肌梗死是一个极其复杂的病理生理过程，在发展为心力衰竭的过程中，左心室大小、形态、组织结构、功能状态发生进行性的梗死后心室重构，贯穿于整个病程的始终，是影响心血管疾病患者预后的主要因素之一。临床上心肌梗死的死亡率极高，早期诊断是及时治疗、改善预后的首要前提。
近20年来，临床上主要利用多普勒超声设备结合高频探头来评价个体的心血管生理功能及心脏结构特征，并且作为心功能评价的金标准。但是，凡是利用多普勒超声诊断心功能障碍的患者，其心功能受损程度必须达到一定水平，心功能受损发展过程中尚且需要经历相当长一段时间，而该时间段内心功能的临床诊断尚处于空白阶段，因此了解心肌梗死性疾病的分子特征并根据分子病理特征筛选出有效的生物标记物，对于心肌梗死性疾病的有效诊断意义重大。
在现有技术中众多的心血管生物标记物之中，何种生物标记物既可以特异性地表达于心肌梗死的早期阶段，同时还能够与心肌梗死的程度密切相关，本领域需要进一步的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用，解决了现有技术中早期心肌梗死无法有效诊断的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)的蛋白检测试剂盒，包括特异性缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)抗体包被的酶标板、酶标试剂、洗涤缓冲液、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)标准品，所述缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)抗体起诊断作用的活性成分。
在本发明的蛋白检测试剂盒中，所述蛋白检测试剂盒包括其诊断学上可接受的ELISA试剂盒。
本发明还提供一种上述的蛋白检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
S1、加入缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)标准品和样本至对应的特异性缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)抗体包被的酶标板的微孔内，使缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)标准品和样本中的缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)蛋白与酶标板中的抗体充分结合，并洗去未结合的杂质；
S2、加入酶标试剂，使已经结合的缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)与辣根过氧化物酶(HRP)标记的缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)单克隆抗体结合，洗去未结合酶标抗体的杂质；
S3、加入显色剂A液和显色剂B液，充分混匀，加入终止液终止反应，利用酶标仪检测OD值。
本发明还提供一种缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)的蛋白检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
S1、使用生物传感器对抗缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)单克隆抗体识别的表位进行鉴定，确定抗体识别的抗原表位的空间位置关系；
S2、选择两株识别不同抗原表位的单克隆抗体，分别将其标记上辣根过氧化物酶(HRP)，包被其中一株未标记抗体于96孔板，缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)融合蛋白为标准品，辣根过氧化物酶(HRP)标记的另外一株抗体作为第二抗体；检测批内、批间变异系数，验证检测系统的稳定性；
S3、将第二抗体交互用碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对蛋白质充分透析；在该溶液中加入DMSO溶解的生物素蛋白；经过分子筛柱，以PBS洗脱，收集生物素标记的抗体；将原试剂盒与标记生物素后的试剂盒进行敏感性对照；
S4、得出缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)蛋白检测ELISA试剂盒的标准品浓度对数值的标准曲线。
在本发明的制备方法中，在步骤S1中，分别在生物传感器的样品反应池中加入乙酸缓冲液，随即加入缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)融合蛋白和市售小鼠IgG标准品；其中，真核表达缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)融合蛋白的制备主要过程为：以缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)cDNA为模板，用引起扩增cDNA，克隆的缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)插入载体中，构建出真核表达载体，转染细胞系，克隆出稳定分泌缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)融合蛋白的转染细胞系，培养该转染细胞，并纯化融合蛋白；观察缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)和IgG标准品与样品反应池的结合量，用PBS/T洗涤一次，开始收集数据信息，获得5-10分钟缓冲液基线数据，混合N-羟基琥珀酰亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，立即将样品池中的缓冲液更换为市售的活化CM-葡萄糖的羧基基团的上述混合液200μl，作用10分钟后移除活化液，PBS/T洗涤，乙酸包被缓冲液洗涤，分别加入缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)或IgG标准品，交联；PBS/T洗涤，计算交联分子的总量；PBS洗涤，获取基线，加入抗缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)单克隆抗体，获取结合曲线；共作用4个mAB反应浓度，其余缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)mAb亲和力的检测同上；获取数据信息后，利用生物传感器软件包FASTfit分析计算亲和力值；采用mAb配对方式表位分析方法分析缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)mAb识别的表位。
在本发明的制备方法中，在步骤S2中，标记辣根过氧化物酶(HRP)的具体方法为：称取辣根过氧化物酶(HRP)5mg溶解于双蒸水中，加入0.1M Na2O溶液，室温下避光搅拌20分钟，装入透析袋中，使用1mM PH 4.4的醋酸钠缓冲液进行透析，4℃过夜；加入20μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入10mg待标记抗体，在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光搅拌2小时；加入0.1ml新配制的4mg/ml NaBH溶液，混匀，静置于4℃条件下2小时，装入透析袋中，使用0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
上述的蛋白检测试剂盒在制备用于诊断心肌梗死性疾病的医疗器械中的应用。
在本发明的应用中，所述心肌梗死性疾病包括急性心肌梗死、陈旧性心肌梗死中的至少一种，但不限于此。
在本发明的应用中，所述心肌梗死性疾病为心肌梗死、心肌梗死致心室重构中的至少一种，但不限于此。
实施本发明的缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用，具有以下有益效果：本发明经过细胞水平及动物水平实验得到不但能够参与心肌梗死性疾病的发生，而且能够与心肌梗死的程度密切相关的生物标记物HIMF蛋白检测ELISA试剂盒，该HIMF蛋白检测ELISA试剂盒，对于多种心肌梗死性疾病，如急性心肌梗死、陈旧性心肌梗死等具有明显的诊断效果；对于心肌梗死引起的心室重构表现出优异的诊断作用。
附图说明
图1为HIMF蛋白检测ELISA试剂盒的标准品浓度对数值的标准曲线图；
图2为缺氧心肌细胞与正常心肌细胞的MTT检测对比图；
图3为缺氧心肌细胞与正常心肌细胞的WB检测对比图；
图4为缺氧心肌细胞与正常心肌细胞的HIMF检测的对比图；
图5A为假手术小鼠组与心肌梗死小鼠组关于IVS的对比图；
图5B为假手术小鼠组与心肌梗死小鼠组关于LVDd的对比图；
图5C为假手术小鼠组与心肌梗死小鼠组关于LVDs的对比图；
图5D为假手术小鼠组与心肌梗死小鼠组关于LVPW的对比图；
图5E为假手术小鼠组与心肌梗死小鼠组关于FS的对比图；
图5F为假手术小鼠组与心肌梗死小鼠组关于EF的对比图；
图6为假手术小鼠组与心肌梗死小鼠组TCC染色后冠脉结扎缺血心脏梗死面积的对比图像；
图7为心肌梗死小鼠的血清样本中的HIMF与心肌梗死面积比的相关图；
图8为术后存活组与术后死亡组的血清样本中HIMF表达的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用作进一步说明：
经前期研究发现，在心肌梗死动物血清中检测到缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)含量明显增加，与心肌梗死面积呈正相关，与心功能损害的严重程度亦有显著相关性。在心肌梗死病人中，也检测到该因子增加，表明HIMF可作为一种预测心肌梗死发生发展的新的生物标记物，为临床心肌梗死的发生、严重程度的预测以及相应的治疗提供依据。
本发明提供了一种缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)的蛋白检测试剂盒，该蛋白检测试剂盒包括特异性缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)抗体包被的酶标板、酶标试剂、洗涤缓冲液、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)标准品。
其中，缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)抗体起诊断作用的活性成分。该缺氧诱导的有丝分裂因子，英文名为hypoxia-induced mitogenic factor，即HIMF，是一种细胞因子样蛋白，属于发现于炎症区域FIZZ或抵抗素样分子RELM家族成员，该家族成员的共同特征为可分泌蛋白，分子结构富含半胱氨酸。
其中，蛋白检测试剂盒包括其诊断学上可接受的ELISA试剂盒。
实施例1：对于缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)蛋白检测ELISA试剂盒的制备
S1、使用生物传感器对抗缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)单克隆抗体识别的表位进行鉴定，确定抗体识别的抗原表位的空间位置关系。
在步骤S1中，分别在生物传感器的样品反应池中加入乙酸缓冲液，随即加入缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)融合蛋白和市售小鼠IgG标准品；其中，真核表达缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)融合蛋白的制备主要过程为：以缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)cDNA为模板，用引起扩增cDNA，克隆的缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)插入载体中，构建出真核表达载体，转染细胞系，克隆出稳定分泌缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)融合蛋白的转染细胞系，培养该转染细胞，并纯化融合蛋白；观察缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)和IgG标准品与样品反应池的结合量，用PBS/T洗涤一次，开始收集数据信息，获得5-10分钟缓冲液基线数据，混合N-羟基琥珀酰亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，立即将样品池中的缓冲液更换为市售的活化CM-葡萄糖的羧基基团的上述混合液200μl，作用10分钟后移除活化液，PBS/T洗涤，乙酸包被缓冲液洗涤，分别加入缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)或IgG标准品，交联；PBS/T洗涤，计算交联分子的总量；PBS洗涤，获取基线，加入抗缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)单克隆抗体，获取结合曲线；共作用4个mAB反应浓度，其余缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)mAb亲和力的检测同上；获取数据信息后，利用生物传感器软件包FASTfit分析计算亲和力值；采用mAb配对方式表位分析方法分析缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)mAb识别的表位。
S2、选择两株识别不同抗原表位的单克隆抗体，分别将其标记上辣根过氧化物酶(HRP)，包被其中一株未标记抗体于96孔板，缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)融合蛋白为标准品，辣根过氧化物酶(HRP)标记的另外一株抗体作为第二抗体；检测批内、批间变异系数，验证检测系统的稳定性。
在步骤S2中，标记辣根过氧化物酶(HRP)的具体方法为：称取辣根过氧化物酶(HRP)5mg溶解于双蒸水中，加入0.1M Na2O溶液，室温下避光搅拌20分钟，装入透析袋中，使用1mM PH 4.4的醋酸钠缓冲液进行透析，4℃过夜；加入20μl 0.2M pH 9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入10mg待标记抗体，在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光搅拌2小时；加入0.1ml新配制的4mg/ml NaBH溶液，混匀，静置于4℃条件下2小时，装入透析袋中，使用0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜。
ELISA方法：包被其中一株未标记抗体于96孔板，HIMF融合蛋白为标准品，HRP标记的另外一株抗体作为第二抗体；检测批内、批间变异系数，验证检测系统的稳定性。
S3、将第二抗体交互用碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对蛋白质充分透析；在该溶液中加入DMSO溶解的生物素蛋白；经过分子筛柱，以PBS洗脱，收集生物素标记的抗体；将原试剂盒与标记生物素后的试剂盒进行敏感性对照。
S4、根据ELISA检测结果，得出HIMF蛋白检测ELISA试剂盒的标准品浓度对数值的标准曲线如图1所示，其中X轴为OD值强度，Y轴为标准品浓度。
实施例2：缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)蛋白检测试剂盒的检测方法
S1、加入缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)标准品和样本至对应的特异性缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)抗体包被的酶标板的微孔内，使缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)标准品和样本中的缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)蛋白与酶标板中的抗体充分结合，并洗去未结合的杂质；
S2、加入酶标试剂，使已经结合的缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)与辣根过氧化物酶(HRP)标记的缺氧诱导的有丝分裂因子(HIMF)单克隆抗体结合，洗去未结合酶标抗体的杂质；
S3、加入显色剂A液和显色剂B液，充分混匀，加入终止液终止反应，利用酶标仪检测OD值。
实施例3：对于小鼠心肌细胞的心肌缺血诊断实验
(1)方法：
取出生2-3天小鼠，无菌操作下开胸取心脏，剪碎、胰酶消化，获得的细胞在含5％FBS和1％的Penicillin-Streptomycin的DMEM培养基在37℃，5％CO2培养箱中培养1.5小时以纯化心肌细胞(差速贴壁法，贴壁的为成纤维细胞，未贴壁的为心肌细胞)，将上清(含未贴壁心肌细胞)转入新的培养皿继续培养，培养基中另加入bromodeoxyuridine(1:100,抑制成纤维细胞生长)。原代培养2-3天后部分细胞开始搏动，第3天开始呈现有规律、不同步搏动，细胞融合形成细胞簇或团，细胞呈现同步搏动，其搏动由周缘向心搏动，收缩明显而有力。
将原代心肌细胞铺96孔板，每孔细胞数为5×104个/ml，部分细胞5％CO2 37℃条件下培养，部分细胞换成混合气(95％CO2+5％N2)预饱和过的无糖DMEM培养基在缺氧小室中培养24小时，每孔100μl培养基中加入10μl MTT试剂，放入5％CO2 37℃培养箱中孵育3-4小时，加入DMSO继续培养1小时至结晶完全溶解，用450nm波长检测各孔的吸光度值，计算细胞的活性。
按上述方法培养心肌细胞，至细胞融合形成细胞簇或团，细胞呈现同步搏动，其搏动由周缘向心搏动，收缩明显而有力。按照正常供氧条件及上述缺氧条件分别培养细胞，待心肌细胞缺氧培养24小时后，应用适量RIPA lysis溶液加入1％PMSF及1％磷酸酶抑制剂等复合溶液提取细胞蛋白，冰上混匀30分钟后4℃13000rpm高速低温离心10分钟，应用市售HIMF多克隆抗体检测HIMF蛋白表达。同时，提取培养基应用HIMF蛋白检测ELISA试剂盒进行检测。
(2)结果：
如图2所示，MTT检测结果提示，与正常心肌细胞相比，缺氧小鼠心肌细胞的活性显著下降，即缺氧诱导心肌细胞的死亡。
如图3所示，应用市售HIMF多克隆抗体进行WB检测，结果显示与正常心肌相比，缺氧小鼠心肌细胞HIMF蛋白表达显著增加。
如图4所示，应用ELISA试剂盒进行检测，检测样本OD值代入方程后两组对比结果显示，与正常心肌细胞相比，缺氧小鼠心肌细胞HIMF蛋白表达显著增加。
实施例4：对于小鼠心肌梗死性疾病的诊断实验
(1)方法
心肌梗死心肌梗死模型复制：小鼠麻醉后行气管插管进行人工通气，开胸行冠状动脉左前降支结扎术，以左心耳与肺动脉圆锥交界处的左冠状静脉为标志，在左心耳下缘1mm左右结扎，同时行心电图检查，确认结扎后心电图表现为一过性ST段弓背向上抬高。结扎后立即可见结扎线远端心肌活动度减弱，左室前壁苍白后紫绀，表明模型制作成功。关闭胸腔，放回笼中任其自行从麻醉中苏醒。假手术组除不做冠状动脉左前降支结扎术外，其余操作相同。术后28天应用小动物超声心动图(VEVO2100)对心脏结构和功能进行检测，具体采集室间隔(IVS)、左室舒张末期内径(LVDd)、左室收缩末期内径(LVDs)、左室后壁(LVPW)、短轴缩短率(FS)、射血分数(EF)等指标验证心肌梗死的发生，以及心功能减退。
超声心动图检测后，将假手术小鼠及心肌梗死小鼠处死，术后死亡小鼠立即采集血液，小鼠血液冰上静置10分钟后4℃3500rpm高速低温离心10分钟，分离血清备用，应用ELISA试剂盒检测；同时，将心脏取出用生理盐水洗净血块，浸泡于TCC溶液中，观察梗死部位染色情况，对比心肌梗死面积。
(2)结果
如图5A、5B、5C、5D、5E、5F所示，小鼠的超声心动图检测结果显示，与假手术组小鼠相比，冠脉结扎致心肌梗死组小鼠IVS、LVDd、LVDs及LVPW均增高，FS及EF均降低，即提示心肌梗死组小鼠心肌室间隔及左心室显著增厚，心功能降低。
如图6所示，小鼠心脏组织进行TCC染色，与假手术组小鼠相比，冠脉结扎缺血心脏梗死面积较为显著(白色区域)。
计算梗死面积与左心室厚度的比值，并根据小鼠血清样本中HIMF的ELISA试剂盒检测结果，建立两者的关系如图7所示，该结果显示心肌梗死的严重程度与小鼠血清HIMF表达呈正相关，梗死严重的小鼠，其血清中HIMF表达较高。
根据小鼠血清样本中HIMF的ELISA试剂盒检测结果，具体如图8所示，心肌梗死小鼠的血清样本中HIMF表达显著高于假手术组；而且，心肌梗死组部分小鼠术后发生死亡，对比术后存活小鼠及术后死亡小鼠，术后死亡小鼠的血清样本中HIMF表达显著高于术后存活小鼠。该结果提示血清中HIMF表达过高，与心肌梗死预后密切相关。
综上所述，相对于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明成功应用荧光标记抗鼠HIMF单克隆抗体，对心肌梗死及其所致左心室重构进行有效的生化诊断。
(2)本发明成功应用荧光标记抗鼠HIMF单克隆抗体，对心肌梗死的预后推断进行有效的生化诊断。
(3)本发明利用ELISA试剂盒对心肌梗死进行诊断的定量标准；
(4)本发明将HIMF单克隆抗体两两结合进行夹心ELISA试验，找到最佳组合；
(5)本发明利用生物素亲和素标记技术提高试剂盒的敏感性；
(6)本发明利用检测到的HIMF血清水平对心肌梗死及心室重构程度进行评估，经济、方便、依从性好，能快速诊断，从而降低因心肌梗死导致的死亡。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒在制备用于诊断心肌梗死性疾病的医疗器械中的应用，所述蛋白检测试剂盒包括特异性缺氧诱导的有丝分裂因子抗体包被的酶标板、酶标试剂、洗涤缓冲液、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、缺氧诱导的有丝分裂因子标准品，所述缺氧诱导的有丝分裂因子抗体起诊断作用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白检测试剂盒为ELISA试剂盒。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述心肌梗死性疾病包括急性心肌梗死、陈旧性心肌梗死中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述心肌梗死性疾病为心肌梗死、心肌梗死致心室重构中的至少一种。
CN201711000221.9A 2017-10-24 2017-10-24 缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用 Expired - Fee Related CN107884585B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711000221.9A CN107884585B (zh) 2017-10-24 2017-10-24 缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711000221.9A CN107884585B (zh) 2017-10-24 2017-10-24 缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107884585A CN107884585A (zh) 2018-04-06
CN107884585B true CN107884585B (zh) 2019-09-27

Family

ID=61782291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711000221.9A Expired - Fee Related CN107884585B (zh) 2017-10-24 2017-10-24 缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107884585B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004071573A2 (en) * 2003-02-07 2004-08-26 The Johns Hopkins University Hypoxia induced mitogenic factor
WO2008077022A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 The Johns Hopkins University Himf and btk in pulmonary, cardiac, and inflammation disorders
CN105510584A (zh) * 2015-11-27 2016-04-20 吉林大学 一种cd306夹心elisa试剂盒的建立方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004071573A2 (en) * 2003-02-07 2004-08-26 The Johns Hopkins University Hypoxia induced mitogenic factor
WO2008077022A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 The Johns Hopkins University Himf and btk in pulmonary, cardiac, and inflammation disorders
CN105510584A (zh) * 2015-11-27 2016-04-20 吉林大学 一种cd306夹心elisa试剂盒的建立方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIMF在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的作用;朱昊;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20150215(第2015/02期);第19-20页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107884585A (zh) 2018-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LeRoy Increased collagen synthesis by scleroderma skin fibroblasts in vitro a possible defect in the regulation or activation of the scleroderma fibroblast
SCHOLZ et al. Age-related changes in normal human hearts during the first 10 decades of life. Part I (Growth): A quantitative anatomic study of 200 specimens from subjects from birth to 19 years old
CN107765014B (zh) 一种检测人sST2蛋白的方法以及试剂盒
CN106265740B (zh) 脐带间充质干细胞联合黄芪多糖在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用
Johnson et al. Development of human embryonic and fetal dermal vasculature
CN108823172A (zh) 大熊猫促黄体素β亚基单克隆抗体的制备及应用
CN105349642A (zh) 一种急性心肌梗死标志物及其应用
CN112274108A (zh) 一种靶向ckip-1的用于检测骨质疏松症的荧光探针及其在活体检测中的应用
CN107884585B (zh) 缺氧诱导的有丝分裂因子的蛋白检测试剂盒及其应用
CN109212239A (zh) 一种大熊猫促黄体素胶体金免疫层析试纸条、其制备方法及应用
CN108048525A (zh) 一种检测溶栓后出血风险的试剂盒
POLLAK et al. Enzyme Activity in the Nephron: Quantitative Study by Ultramicrochemical Techniques
CN107557332A (zh) Cd29+人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途
CN103235127A (zh) 马立克氏病病毒快速检测试纸条
CN110161226A (zh) 一种检测衰老细胞用的抗体、试剂盒及检测方法
CN103271943B (zh) 干细胞在制备治疗帕金森病的制剂中的用途
CN109432428A (zh) 一种pde10a抑制剂在制备成纤维细胞活性抑制药物中的应用
Jensen et al. Simultaneously recorded oscillations in membrane potential and isometric contractile force from cardiac muscle
CN114533853A (zh) Ctrp15在制备促进血管新生改善缺血相关的心功能产品中的应用
CN110261598A (zh) eEF2K作为筛选促进或抑制血管新生的药物靶点的用途
CN101812427A (zh) 一种大鼠气道平滑肌细胞的培养方法
CN108152503A (zh) 酶联免疫斑点印迹的自身免疫检测试剂盒及其操作流程
CN111289335A (zh) 一种hdn染色液及其用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒
CN104807788B (zh) 一种用于监测血管重构现象的方法与试剂盒
CN110433175A (zh) 心梗条件下的血清外泌体在制备治疗心肌梗死药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190927

Termination date: 20211024

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee