CN111289335A

CN111289335A - 一种hdn染色液及其用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒

Info

Publication number: CN111289335A
Application number: CN202010124925.2A
Authority: CN
Inventors: 舒斯云
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2040-02-27
Also published as: CN111289335B

Abstract

本发明属于细胞染色以及试剂盒的技术领域，具体涉及一种HDN染色液及其用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒。所述试剂盒包括HDN染色液，所述HDN染色液包括双氧水、缓冲液、硫酸镍铵、3,3’二氨基联苯胺以及氯化铵；所述试剂盒的免疫组织化学的方法如下：1）取被检活性组织切片，固定；2）用一抗检测欲发现的抗原或抗体；3）染色：将所得组织切片浸入HDN染色液中，待组织切片的阳性检测物呈现深紫蓝色；4）清洗组织切片；5）封片，观察组织切片。采用HDN染色液进行染色，得到的试剂盒的敏感度相比常法高10倍以上，可以显示常法染不出的物质，可以减少假阴性结果，避免漏诊。非阳性物质不染色，可以避免假阳性结果。

Description

一种HDN染色液及其用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒

技术领域

本发明属于细胞染色以及试剂盒的技术领域，具体涉及一种HDN染色液及其用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒。

背景技术

免疫组织化学或免疫细胞化学是用标记的抗体(或抗原)对动植物组织内的抗原或抗体、蛋白、核酸分子、神经递质和受体的分布及性质进行组织原位显示的技术，还可用于检测因伤病产生的变化，追踪神经联系和对病原体及毒物进行检测等，具有抗原抗体结合的高度特异性和组织原位显示的精确性。

免疫组织化学技术自1941年首次成功应用以来，发展迅速，先后建立了酶标抗体技术，如PAP、ABC、SPA等技术以及免疫电镜等技术，能在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察，免疫组织化学技术成为当今生物学、病理学和医学领域中显示细胞和组织的形态、功能、代谢综合研究的有力工具。

辣根过氧化酶(HRP)是一种比较常用的标记酶，主要应用于生物界和医学界，用于检测蛋白质、抗体、抗原、病原体、病毒等物质，其本身无色，要通过染色使其呈现颜色才能显示被标记的物质，现有技术常用的由DAB染色法，采用DAB染色液对辣根过氧化酶染色，其存在不敏感的问题，且特异性不强，染色组织的背地很深，会出现假阴性和假阳性的结果；而采用传统的免疫荧光染色的组织，会由于时间关系荧光减弱，在显微镜下一边观察一边褪色、不便于观察，且不能保存做复查使用，更不能做电镜观察超微结构。

本专利发明人舒斯云教授曾于国际杂志上发表了一篇论文，介绍了一种GDN染色方法，且该法被美国Imunostar的公司收入公司的免疫细胞化学手册，向全世界学界推荐。GDN染色方法的染色液包含硫酸镍铵、3,3’二氨基联苯胺、β-D葡萄糖以及葡萄糖氧化酶等物质，而该染色液中采用的β-D葡萄糖以及葡萄糖氧化酶不稳定，成本较高，操作步骤较为繁杂，因此，本发明在GDN染色法的技术上加以改进，并制成试剂盒，节省了费用，而且便于操作，以促进我国免疫细胞化学的研究发展以及推广应用。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的在于提供一种HDN染色液及其用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒，采用HDN染色液进行染色，得到的试剂盒的敏感度相比常法高10倍以上，效果稳定，可以显示常法染不出的物质，可以减少假阴性结果。而且背地很浅，可避免假阳性结果。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种HDN染色液用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒，所述试剂盒包括HDN染色液，所述HDN染色液包括双氧水以及缓冲液；

所述HDN染色液还包括硫酸镍铵、3,3’二氨基联苯胺以及氯化铵；

所述HDN的制备如下：硫酸镍铵和3,3’二氨基联苯胺溶于缓冲液加入氯化铵和双氧水即得到HDN染色液，所述缓冲液包括醋酸缓冲液，pH＝6；

所述试剂盒的快速免疫组织化学的方法如下：

1)固定：取被检活性组织切片，固定；

2)用一抗检测欲发现的抗原或抗体：将组织切片中滴入HRP标记的抗原或抗体(不包括在试剂盒中，根据需要采购)；

3)染色：将步骤2)所得组织切片浸入HDN染色液中，约5～10分钟，待组织切片中呈现深紫蓝色之后，于缓冲液中清洗终止反应；

4)清洗：将步骤3)所得组织切片采用缓冲液清洗3次，再用蒸馏水清洗；

5)封片，观察组织切片：清洗完将组织切片脱水封片，即可于显微镜下观察组织结构；

所述步骤3)的组织切片中为含阳性抗原或抗体的部分呈现深紫蓝色，增加阳性率，避免假阴性结果。阴性部分完全不着色，避免假阳性结果。增加研究以及病理诊断的准确性；

步骤3)、步骤4)所述缓冲液包括醋酸缓冲液。

一种辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒染出的组织切片，还可用于电镜观察超微结构。

本发明还提供了一种辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒，可用于科学研究以及病理组织检测，可用于批量检测，适用于病理检测和法医检测，且可用于复查。

本发明还提供了一种HDN染色液，所述HDN染色液包括硫酸镍铵、3,3’二氨基联苯胺、氯化铵、双氧水以及缓冲液；所述缓冲液包括醋酸缓冲液，所述HDN染色液的制备包括如下步骤：硫酸镍铵和3,3’二氨基联苯胺溶于缓冲液，加入氯化铵和双氧水即得到HDN染色液，所述缓冲液包括醋酸缓冲液，pH＝6。

本发明的有益效果如下：

本发明的HDN染色液，其染色的敏感度高，因此可以减少假阴性结果。比常规的DAB法敏感十倍以上，特异性强，对阴性组织完全不着色，因此可以避免假阳性结果。稳定性好，染成的组织切片可保存5年不褪色，适用于病理检测和法医检测，便于复查；可以做超微结构观察，可用于电镜观察超微结构，在亚细胞水平鉴定观察研究结构和病理诊断结构；

本发明的HDN染色液用于辣根过氧化酶HRP特异性显色的试剂盒，相比现有技术中的免疫荧光法和DAB染色法，其敏感度高、特异性强，观察组织结构可以看到完整的神经细胞和树突棘；稳定性强，不易褪色，染色的组织切片可长期保存，可以达到保持五年不褪色，采用HDN染色能够降低假阴性和假阳性表达；经过HDN染色后的组织切片，能够选取所需部分，做免疫电镜观察超微结构；本发明的试剂盒所用试剂成本价格低，且操作过程快速；

本发明的HDN染色液用于辣根过氧化酶HRP特异性显色的试剂盒应用学科多，可广泛用于生物学、解剖学、神经科学、免疫学、心理学、医学和药学等学科；应用范围广，可对抗原、抗体、蛋白、核酸分子、神经递质和受体等的定性、定位和定量研究，可用于追踪神经联系和对病原体及毒物进行检测等，也可用于检测心理变化后的脑组织内的蛋白或神经递质和受体的变化。

附图说明

图1为经HDN染色的PHA-L标记的组织切片；

图2为经HDN染色的海马脑组织切片；

图3为经HDN染色的组织切片的电镜观察图；

图4为经HDN染色的组织切片的免疫印迹分析图；

图5为经HDN染色的病变组织切片图；

图6为HDN染色显示小鼠呼吸道发育过程的神经元一氧化氮合酶分布图；

图7为HDN染色的细胞显示神经肽类物质的分布图；

图8为HDN法与HRP法的双标细胞内不同类物质的追踪图；

图9为HDN法与HRP法的双标标记大脑皮层神经元的追踪图；

图10为HDN法标记和显示神经联系的追踪图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例1

一种HDN染色液：

取0.5g-1.5g的硫酸镍铵和100mg-150mg的3,3’二氨基联苯胺溶于0.2M 100mL的醋酸缓冲液(pH＝6)，加入10-30mg氯化铵和3～10mL的0.1％双氧水，即得到HDN染色液。

实施例2

一种HDN染色液用于辣根过氧化酶HRP特异性显色的试剂盒及其免疫组织化学的方法：

1)固定：取被检活性组织切片，用4％多聚甲醛固定，进行恒冷箱冰冻切片，或石蜡切片；

2)用一抗检测欲发现的抗原或抗体：将组织切片中滴入HRP标记的抗原或抗体(HRP标记的抗原或抗体为购买产品)；

3)染色：将步骤2)所得组织切片浸入HDN染色液中，约5～10分钟，待组织切片中呈现深紫蓝色之后，于醋酸缓冲液中清洗终止反应；

4)清洗：将步骤3)所得组织切片采用醋酸缓冲液(或磷酸缓冲溶液)清洗3次，再用蒸馏水清洗；

5)封片，观察组织切片：清洗完将组织切片脱水封片，即可于显微镜下观察组织结构。

将本实施例采用的HDN染色法与荧光免疫组化染色法相比较，结果如下表：

表1 HDN染色与荧光免疫组化染色的优势比较

试验例

采用HDN染色的组织切片以及含有HDN染色液的试剂盒的应用如下所示：

1.经HDN染色的组织切片，如图1所示，其为用PHA-L标记的神经细胞，染色后为蓝紫色，可以看到完整的神经细胞和树突棘，表明其敏感度高、特异性强。

2.经HDN染色的组织切片，如图2所示，用HDN法染色刺激纹状体边缘区MrD后，海马及杏仁核的神经元核内被激活的c-fos表达，可以显示神经环路的功能联系，已保存超过5年的海马脑组织切片，其依然保持染色(紫色)，表明经过HDN染色的组织切片具有很强的稳定性。

3.经HDN染色的组织切片(脑纹状体边缘区内)，可用于做电镜观察超微结构，选取部分组织切片做免疫电镜观察超微结构，如图3所示，图中显示纹状体边缘区内的2个(a、a₂)含阳性P物质轴突终末和一个树突(d₁、d₂)形成的复合型突触。

4.可以标记和和显示不同组织细胞的形态和内含物质，也可用于免疫印迹实验：

如图4所示，采用HDN染色，可以显示C图免疫印迹分析，可见突变体中αCaMKII(α)和突触素(S)的正常表达；

HDN显示αCaMKII在海马神经元胞体及树突中表达，D野生型、E突变型。

5.可用于检测在糖尿病人神经病变中，皮肤组织NT-3增加：如图5所示，采用HDN染色组织切片，可显示，正常人(A)和糖尿病性神经病变患者(B)小腿皮肤角质细胞中NT-3免疫反应性。

其中，黑色箭头表示表皮基底膜，白色箭头表示NT-3阳性的角质层细胞。

6.HDN法显示小鼠呼吸道发育过程中神经元一氧化氮合酶(nNOS)分布，如图6所示：

孕15天(a)鼠肺细支气管旁nNOS阳性神经细胞；

孕16天(b)靠近肺门血管处nNOS阳性神经细胞，(c)局部放大；

出生后(d/e/f)肺组织nNOS阳性细胞；

(e)冰冻切片，(f)石蜡切片；

成年鼠(g–i)呼吸道中nNOS阳性细胞；

注：B＝支气管、C＝软骨环、b＝细支气管、m＝气道平滑肌。

7.可以标记和和显示不同的神经肽类物质在生物体内的定位分部。

如图7所示，采用HDN染色，可在单细胞原生动物棘尾虫体内发现多种神经肽的定位分布。

8.可以和DAB法进行双标，显示不同类物质在细胞内的共存。

1)用HDN法和HRP神经联系追踪法，显示脊神经后根节内含P物质的感觉神经元，如图8(A)所示；

2)用HDN法和DAB法双标，显示出血热病毒感染的脑内含5-羟色胺的神经元，如图8(B)所示；

3)用HDN法和DAB法双标，显示丘脑下部视上核内生长抑素和催产素在神经元内的共存，如图8(C)所示；

4)双标记法研究标记大脑皮层神经元的性质，如图9所示：

双标记法研究标记神经元的性质，在表达神经胶质标志物的细胞/胶质细胞中从未发现ERβ或ERα阳性(A–C)；

几乎所有的受体阳性细胞都表达NSE(D–H)，但大中型锥体细胞不含受体阳性细胞核(D)；

对ERβ/NSE免疫反应的细胞呈双极(G)，多极(E)或更不规则形态(F)；大多数ERβ免疫反应性细胞也表达PV；

几乎所有ERα阳性的细胞，CB(M)和PV(O)均阴性，总之，ERβ和ERα在不同细胞中表达。

9.可以标记和和显示神经联系的追踪，如显示由病毒跨突触传递，显示的支配食道的脑干和大脑皮层神经元。

1)在食道注射PRV后，用HDN法染色，如图10(A)所示，显示的脑干延髓疑核内支配食管运动的阳性标记细胞；

2)食道注射伪狂犬病毒(PRV)后，用HDN法染色，如图10(B)所示，显示的大脑皮层内支配食管运动的阳性标记细胞。

Claims

1.一种HDN染色液用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括HDN染色液，所述HDN染色液包括双氧水以及缓冲液。

2.由权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HDN染色液还包括硫酸镍铵、3,3’二氨基联苯胺以及氯化铵。

3.由权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述HDN染色液的制备如下：硫酸镍铵和3,3’二氨基联苯胺溶于缓冲液，加入氯化铵和双氧水即得到HDN染色液。

4.由权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的快速免疫组织化的方法如下：

1）固定：取被检活性组织切片，固定；

2）用一抗检测欲发现的抗原或抗体：将组织切片中滴入HRP标记的抗原或抗体；

3）染色：将步骤2）所得组织切片浸入HDN染色液中，待组织切片中呈现深紫蓝色；

4）清洗所得组织切片；

5）封片，观察组织切片。

5.由权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤3）的组织切片中为含阳性抗原或抗体的部分呈现深紫蓝色，阴性部分完全不着色。

6.一种HDN染色液用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒染出的组织切片用于电镜观察超微结构。

7.一种HDN染色液用于辣根过氧化酶特异性显色的试剂盒用于科学研究以及病理组织检测。

8.一种HDN染色液，其特征在于，所述HDN染色液包括硫酸镍铵、3,3’二氨基联苯胺、氯化铵、双氧水以及缓冲液。

9.由权利要求8所述的HDN染色液，其特征在于，所述HDN染色液的制备包括如下步骤：硫酸镍铵和3,3’二氨基联苯胺溶于缓冲液，加入氯化铵和双氧水即得到HDN染色液。

10.由权利要求8或9所述的HDN染色液，其特征在于，所述缓冲液包括醋酸缓冲液。