CN107177557B

CN107177557B - 可分泌抗h-fabp单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107177557B
Application number: CN201710309459.3A
Authority: CN
Inventors: 钟少霞; 刘德荣; 韩日才; 杨耿周; 孙康成
Original assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority date: 2017-05-04
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2037-05-04
Also published as: CN107177557A

Abstract

本发明涉及一种可分泌抗H‑FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用。该杂交瘤细胞为两株，保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号是CCTCC No：C2016220和CCTCC No：C2016219。上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗H‑FABP的单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在心脑血管疾病诊断的检测领域。

Description

可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

脂肪酸结合蛋白(FABP)是一组多源性的小分子细胞内蛋白质，分子质量约为12kDs～15kDs，广泛存在于哺乳动物的心肌、小肠、肝脏、脂肪组织、脑、表皮等组织细胞中。目前已发现的FABP有9种不同的亚型，常见的有心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、肾脏型脂肪酸结合蛋白(K-FABP)、骨骼肌型脂肪酸结合蛋白(S-FABP)等。

其中，H-FABP大量的存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白的 5％～15％，属于细胞内小的疏水基配体结合蛋白家族，是细胞内重要的载体蛋白，可与心肌细胞内作为能源的难溶性长链脂肪酸的疏水部分相结合，起着将上述物质从细胞质膜向脂化和氧化部位运输的作用。H-FABP的相对分子量约为 14kDs～15kDs，等电点(PI)约为5.1。H-FABP在正常人的血液中含量很小，当心肌细胞受损时可快速释放到血液中。

心脑血管疾病是全球头号死因，每年死于心脑血管疾病的人数多于任何其他死因。而急性心肌梗死(AMI)是心血管疾病的主要类型，心梗发病极为迅速，在所有死亡病例中，有2/3是在送医途中病逝的。所以早发现早疏通一直都是治疗的关键。在临床上，若病人出现胸骨后剧烈疼痛和12导联心电图ST段升高，则可初步诊断为心肌梗死，需要做血管疏通治疗，但具有上述症状而最终确诊为心肌梗死的患者仅占总数的约5％。此外，大部分心梗发病者不出现明显的症状或症状不明显，容易被患者忽视，而一旦察觉则已危及性命。

利用传统的物理检测手段，一方面无法排除有梗死症状但实际上不是心肌梗死的病人，另一方面无法确诊没有症状而实际上是心肌梗死的病人。基于上述原因，心肌损伤标记物检测则成为诊断的重要条件。一般临床上应用最较多的心肌损伤标志物包括脑钠肽(BNP)或N端脑钠肽前体(NT-proBNP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)或肌钙蛋白T(cTnT)和肌红蛋白 (MYO)等。全球心肌梗死定义推荐使用cTnI/T和CK-MB这两类标志物，但是它们都是发病后6小时以后的指标，不适用于早期诊断。相比于cTnI/T或 CK-MB，心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和MYO都是小分子，心梗发生后释放速度非常快，因而特别适合于心肌梗死的早期诊断。相较MYO而言， H-FABP在心肌的含量要远高于骨骼肌，因而它指示心肌损伤时特异性会优于 MYO。

然而，正常人血液中的H-FAPB浓度很低(一般小于<10ng/ml)，虽然心肌损伤后浓度会升高，但依然无法用常规的化学定量方法测出。传统的酶联免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、胶体金免疫层析法等也无法准确检测极微量 H-FAPB含量的样本。且上述检测方法存在一些缺陷，限制了它们在临床诊断中的大规模应用。例如ELISA检测耗时长，操作步骤繁琐，重复性较差。RIA需要特定的仪器，且操作人员会接触放射性物质，会损害操作人员的身体，同时使用完成后的放射性材料的处置也是个严重问题。而目前免疫层析法产品虽多，但普遍存在特异性不高、性能不稳定等问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种特异性较高、性能稳定的H-FABP检测试剂盒，以及可应用在该H-FABP检测试剂盒中的可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法、单克隆抗体及应用。

一种可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No： C2016220。

在一个实施例中，上述杂交瘤细胞分泌的抗H-FABP单克隆抗体标记为 1F38。

上述杂交瘤细胞或上述抗H-FABP单克隆抗体在制备H-FABP的检测试剂或H-FABP的检测设备中的应用。

一种可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No： C2016219。

在一个实施例中，上述杂交瘤细胞分泌的抗H-FABP单克隆抗体标记为 6F20。

一种可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括如下步骤：

用H-FABP抗原免疫小鼠；

收集免疫后的小鼠的脾细胞，并将所述脾细胞与小鼠瘤细胞进行融合得到融合细胞；

采用HAT培养基对所述融合细胞进行选择培养；以及

用H-FABP抗原检测所述融合细胞的培养上清中的抗体含量，筛选获得一株稳定分泌1F38的杂交瘤细胞以及一株稳定分泌6F20的杂交瘤细胞。

一种H-FABP检测试纸，所述检测试纸上标记有上述的1F38和上述的6F20。

在一个实施例中，该H-FABP检测试纸包括支撑片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑片的一端向另一端依次设置在所述支撑片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有1F38包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为6F20，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。

一种H-FABP检测试剂盒，包括如上述的H-FABP检测试纸。

上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗H-FABP的单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在心脑血管疾病诊断的检测领域，如 H-FABP检测试剂或H-FABP检测设备的制备领域等。

上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗H-FABP的单克隆抗体具有高特异性且性能稳定等优点，可广泛应用在制备H-FABP检测试剂或H-FABP 检测设备中。可以实现准确、快速地检测出血液中H-FABP的含量，有利于对心肌损伤作出早期诊断，为病人赢取宝贵的治疗时间。且在特异性、稳定性等方面较之传统的检测方法具有显著的优势，可以应用于H-FAPB的快速检测。

附图说明

图1为一实施方式的可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法的流程图；

图2为一实施方式的H-FABP检测试纸的示意图；

图3为一实施方式的H-FABP检测试剂盒的示意图；

图4为如图3的H-FABP检测试剂盒的一个使用状态示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞于2016年12月 22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2016220，分类命名：杂交瘤细胞株1F38。该杂交瘤细胞可分泌出抗H-FABP的单克隆抗体，记为1F38，1F38可以作为检测抗体。1F38 可以应用于H-FABP检测试剂或H-FABP检测设备的制备领域中。

另一实施方式的可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞于2016年12 月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2016219，分类命名：杂交瘤细胞株6F20。该杂交瘤细胞可分泌出抗H-FABP的单克隆抗体，记为6F20，6F20可以作为检测抗体。6F20 可以应用于H-FABP检测试剂或H-FABP检测设备的制备领域中。

请参阅图1，一实施方式的可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括如下步骤S110～S140。

S110、用H-FABP抗原免疫小鼠。

本实施方式中，H-FABP抗原为重组心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)，由深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：K1-FAB。

具体可采用H-FABP抗原与弗氏完全佐剂混合后皮下注射至小鼠腹腔内，并采尾血进行效价检测，追加免疫至效价达到融合要求。

S120、收集S110中得到的免疫后的小鼠的脾细胞，并将脾细胞与小鼠瘤细胞进行融合得到融合细胞。

小鼠末次免疫后，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，制成细胞悬液。将小鼠瘤细胞与免疫脾细胞按1:10细胞数量比例混合。

S130、采用HAT培养基对S120中得到的融合细胞进行选择培养。

细胞融合后，培养至适宜的浓度，通过HAT培养基筛选出融合细胞。

S140、用H-FABP抗原检测所述融合细胞的培养上清中的抗体含量，筛选获得一株稳定分泌1F38的杂交瘤细胞以及一株稳定分泌6F20的杂交瘤细胞。

将融合细胞培养至适宜的细胞浓度后，加入不同的重组心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)抗原，筛选出能够分泌特定抗体的融合细胞并用有限稀释法克隆，筛选获得一株稳定分泌1F38的杂交瘤细胞以及一株稳定分泌6F20的杂交瘤细胞。

本实施方式中，筛选获得一株稳定分泌1F38的杂交瘤细胞保藏号为CCTCC No：C2016220。一株稳定分泌6F20的杂交瘤细胞保藏号为CCTCC No： C2016219。

上述的可分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法操作简单，筛选获得的杂交瘤细胞分泌产量高，分泌得到的抗H-FABP的单克隆抗体效价高、具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在心脑血管疾病诊断的检测领域，如H-FABP检测试剂或H-FABP检测设备的制备领域等。

一实施方式的H-FABP检测试剂盒包括H-FABP检测试纸。当然，H-FABP 检测试剂盒还可以包括包装盒、标准品、对照品等。

请参阅图2，本实施方式的H-FABP检测试纸100包括支撑片110、样品垫 120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、检测线160及质控线170。样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑片110的一端向另一端依次设置在支撑片110上。样品垫120与金标垫130部分重叠，金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠，硝酸纤维素膜140与吸收垫150部分重叠。检测线160及质控线170设在硝酸纤维素膜140上，且检测线160设在靠近金标垫130的一端，质控线170设在靠近吸收垫150的一端。支撑片110采用不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。金标垫130上涂覆有1F38包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的1F38。检测线160为6F20。质控线170为羊抗鼠IgG抗体。

本实施方式中，1F38作为检测抗体，6F20为捕获抗体。在其他的实施方式中，也可以选择6F20作为检测抗体，1F38为捕获抗体。

请参阅图3和图4，H-FABP检测试纸100可置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测线160及质控线170裸露于观察窗220中，方便观察。

其他检测试剂可以根据需要制备。

上述H-FABP检测试剂盒利用双抗体夹心法来检测样品中的心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的含量。检测时，样品中的H-FABP先和金标垫130上的抗体1F38结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，到达检测线 160，若样品含中有H-FABP，会被设在硝酸纤维素膜140上的检测线160上的抗体6F20捕获，形成单抗-H-FABP-金标记单克隆抗体复合物，富集在检测线 160上，形成红色沉淀线。未结合的金标记单克隆抗体则通过检测线，被羊抗鼠 IgG抗体捕获，富集在质控线170上，形成红色沉淀线。当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线(如图3所示)时判为阳性。若样品中H-FABP含量 <10ng/ml，样品到达检测线160时，遇到捕获单抗就不会形成双单抗夹抗原反应复合物，仅富集在质控线170上形成红色沉淀线(如图4所示)，此时判为阴性结果。

在其他实施方式中，H-FABP检测试剂盒的结构不限于上文描述。上述单克隆抗体除应用在上述胶体金标记的单抗H-FABP检测试剂盒外，还可以用于其他心肌梗死检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本实施方式的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等)，或将本实施方式的单克隆抗体作为包被抗体(例如ELISA)，则可用于其他形式的 H-FABP检测试剂或设备。故本实施方式所制备得到的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可广泛适用于制备诊断或检测心肌梗死的试剂或设备。

通过使用上述杂交瘤细胞分泌的抗H-FABP单克隆抗体，在提高灵敏度的同时改善特异性。在标记物为较大的纳米颗粒如胶体金、乳胶或其他纳米颗粒类标记物时，间接标记可以降低标记抗原的使用量，在提高灵敏度的同时改善特异性。间接标记相对于传统双抗原夹心法的两部特异识别而言相对于多了一步特异识别，即三步特异识别，可以提高检测试剂盒的特异性，而且相对标记抗原的纯度要求降低又可以降低检测试剂盒的成本。通过使用上述抗H-FABP 单克隆抗体，制备得到的试剂盒与现有心肌梗死检测试剂盒相比，在特异性、灵敏度及检出率方面都具有显著的优势。且上述H-FABP检测试剂盒放在室温下每周抽检样品，经验证H-FABP检测试剂盒在室温下保存18个月，检测结果仍符合要求，性能稳定。

以下为具体实施例。

实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

杂交瘤细胞株的建立与抗H-FABP单克隆抗体的制备。

1、抗原免疫。

将重组心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)抗原(1.2mg/mL，深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：K1-FABP)与弗氏完全佐剂(SIGMA，F5881) 等体积混合，得到油状乳液。将该乳液以每只0.2毫升的剂量皮下施给BALB/c 小鼠(广东省医学实验动物中心：广东省佛山市南海黄岐鄱阳路119号，6周龄雌性，5只)背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(抗原与弗氏不完全佐剂(SIGMA，F5506)等体积混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。

融合前3天，用相同剂量抗原与等体积0.9％氯化钠注射液混合腹腔注射追加免疫。

2、杂交瘤细胞系的制备。

(1)饲养细胞的制备。

以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡5分钟，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI 1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，180μL/ 孔，37℃，5％CO₂培养过夜。

(2)免疫脾细胞的制备。

小鼠末次免疫后第三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640 基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。

(3)小鼠瘤细胞的制备。

小鼠瘤细胞经筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，计数。

(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤。

将小鼠瘤细胞与免疫脾细胞按1:10细胞数量比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次，1,200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1,000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的 RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2 培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养液)两次。

(5)抗体的检测。

用0.05M pH9.5碳酸缓冲溶液稀释重组心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP) 抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：K 1-FABP)，使其终浓度为2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小时或4℃过夜，接着用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01M pH7.4PBS，0.12mL/孔，37℃孵育2小时，用于检测。重组融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37℃孵育30分钟，水洗六次后加入10000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：羊抗鼠IgG)，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V) 双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔 50μL，测450nm吸收值。RPMI1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值得比≧2.0为阳性细胞孔。

分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆四次，扩大培养后，用含10％DMSO的完全培养液冻存，细胞密度为106个/mL。细胞融合一次共获得2株能稳定分泌抗体的细胞株。于2016年12月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国. 武汉.武汉大学。保藏号分别为CCTCC No：C2016220、CCTCC No：C2016219。保藏号为CCTCC No：C2016220的细胞系分泌的抗体即为1F38，保藏号为 CCTCC No：C2016219的细胞系分泌的抗体即为6F20。

3、单克隆抗体的制备。

选6～8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的弗氏不完全佐剂；10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒死之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5mL～15mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。

取腹水上清，用2倍体积的0.06M pH4.0的醋酸缓冲液稀释。向混合液中加原腹水体积3％正辛酸沉淀杂质。12000rpm离心20min沉淀杂质，取上清过滤。用1M的NaOH调滤液pH至7.4。向所得的滤液中加等体积的饱和硫酸铵，沉淀IgG。12000rpm离心20min后，弃上清，沉淀用0.01M pH7.4的PBS复溶。

4、效价测定。

用0.05M pH9.5碳酸缓冲溶液稀释重组心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP) 抗原，使其终浓度为2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2 小时或4℃过夜。后用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01M pH7.4PBS， 0.12mL/孔，37℃孵育2小时，用于检测。

(1)细胞上清效价的检测：用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01M pH7.4 PBS稀释1F38、6F20细胞培养上清依次至10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、 320倍和640倍。向已包被抗原的96孔板中每孔依次加入0.1mL的不同稀释倍数的细胞培养上清，37℃孵育30分钟，水洗六次后加入10000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：羊抗鼠IgG)，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。2株细胞在640倍稀释细胞培养上清时，吸收值大于0.5。1F38、6F20细胞培养上清效价可达到1:640。

(2)小鼠腹水效价的检测：用上述方法检测1F38和6F20单克隆抗体的杂交瘤细胞所制备的腹水抗体效价。1F38和6F20腹水效价分别为1：640000，1： 640000。

实施例2

H-FABP检测试纸的制备。

1、硝酸纤维素膜的制备。

包被缓冲液的配制：含6％甲醇的0.01M pH为7.2的PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期一周。1000mL 6％甲醇的0.01M pH 7.2 的PBS缓冲液配方：NaCL 8g，KCL 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，甲醇60mL，双蒸去离子水定容至1000mL。

硝酸纤维素膜的制备：用包被缓冲液将抗心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP) 单克隆抗体1F38稀释到1mg/mL～5mg/mL，调整机器，划线为T1线，T1线即为检测线，T1线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm。用包被缓冲液将羊抗鼠IgG 抗体(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：羊抗鼠IgG)稀释到 1mg/mL～5mg/mL，调整机器，划线为C线，C线即为质控线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约5mm。37℃烘干，封装备用。

2、胶体金、金标记单克隆抗体的制备。

(1)溶液的配制。

①氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000mL 1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸：双蒸去离子水定容至 1000mL。

②柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1％溶液，，0.22μ 膜滤过，置4度备用，有效期容至1000mL。

③0.1M碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000mL。

④2％PEG-20000的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL 2％PEG-20000溶液配方：20g PEG-20000；双蒸去离子水定容至1000mL。

⑤标记洗涤保存液的配制：2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％叠氮钠(NaN3)， 0.01MpH7.2PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL标记洗涤保存液配方：20gBSA，0.5g NaN3、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000mL。

(2)胶体金的制备：

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100mL 0.01％氯金酸加入2mL 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。

(3)胶体金标记单克隆抗体的制备：

用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按8μg～10μg抗体/mL胶体金加入实施例1中制备得到的抗心脏型脂肪结合蛋白单抗，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％，静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。

3、金标垫的制备。

(1)封闭液的配制：

2％BSA，0.1％TritonX-100、0.05％NaN3，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN3、 1mL TritonX-100、0.01M PH7.2PBS溶液定容至1000mL。

(2)金标垫的制备：

将金标垫浸泡于封闭液中30min后好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。

4、试纸条样品垫的制备。

(1)封闭液的配制：

2％BSA，0.1％TrtionX-100、0.05％NaN3，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μ 膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN3、 1mL TrtionX-100、0.01M PH7.2PBS溶液定容至1000mL。

(2)样品垫的制备：

将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。

5、试纸条的组装。

将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠设置在不吸水的支撑PVC胶板上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到H-FABP检测试纸。

实施例3

H-FABP检测试剂盒

1、H-FABP检测试剂盒包括：

①试纸条一包(10条/包)

②样品稀释液一瓶(10mL/瓶)

Claims

1.一种H-FABP检测试纸，其特征在于，所述检测试纸上标记有1F38和6F20，所述1F38是保藏号为CCTCC No：C2016220的杂交瘤细胞分泌的抗H-FABP单克隆抗体，所述6F20是保藏号为CCTCC No：C2016219的杂交瘤细胞分泌的抗H-FABP单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的H-FABP检测试纸，其特征在于，包括支撑片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑片的一端向另一端依次设置在所述支撑片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有1F38包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述检测线为6F20，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。

3.一种H-FABP检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的H-FABP检测试纸。