CN105510584A - 一种cd306夹心elisa试剂盒的建立方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CD306夹心ELISA试剂盒的建立方法及应用，通过鉴定抗CD306单克隆抗体表位，建立CD306夹心ELISA试剂盒，最后提高试剂盒的敏感性得到；该试剂盒用于评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系，首先确定利用流式细胞术对大肠癌进行早期诊断的定量标准，然后用CD306夹心ELISA试剂盒检测结直肠癌患者血清中CD306的水平，最后对大肠癌患者进行长期随访，记录检测指标，评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系。本发明经济、方便、依从性好，能提高早期大肠癌的检出率，降低因大肠癌导致的死亡。

Description

一种CD306夹心ELISA试剂盒的建立方法及应用
技术领域
本发明属于癌症早期诊断技术领域，尤其涉及一种CD306夹心ELISA试剂盒的建立方法及应用。
背景技术
大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率已处于恶性肿瘤的第三位，在我国恶性肿瘤中位居第五位，。随着人们健康意识的增强及医疗诊断水平的提高，预计我国大肠癌的发病率还将继续升高。大肠癌早期得到确诊的只有5％，60％～70％的大肠癌患者被发现时已是Ⅱ期或晚期，术后5年生存率约50％，术后复发率高达30％，严重影响人们的身体健康和生活质量。因为早期结直肠癌治疗方法多，预后好，所以有研究表明，如果能早期发现并治疗大肠癌，可以降低15％的死亡率。而大肠癌经过手术治疗后，长期随访及预后评估是大肠癌病人获得长期生存的必要条件，如预后评估较差，应密切观察病情发展趋势，发现有转移及复发征象时，及早采取干预措施。因此如何选择一种经济、方便、依从性好的早期诊断及预后评估方法，提高早期大肠癌的检出率，降低因大肠癌导致的死亡，是大肠癌治疗中的重中之重。
目前对于大肠癌的诊断主要包括肠镜检查，病理活检，CEA检测，腹部CT等，病人的检查过程复杂、花费较高、且诊断相对滞后。而预后评估主要依靠术后病理分期，动态观测CEA、定期检查肝、肺等转移情况，缺乏前瞻性，准确性较差。因此开发出可以对结直肠患者进行早期诊断及判断预后高灵敏性、高特异性的方法及试剂盒是大肠癌诊治技术发展的必然趋势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CD306夹心ELISA试剂盒及其建立方法。
本发明的再一目的在于提供上述CD306夹心ELISA试剂盒在评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系方面的应用，旨在提高早期大肠癌的检出率，降低因大肠癌导致的死亡。
本发明是这样实现的，一种CD306夹心ELISA试剂盒的建立方法，包括以下步骤：
(1)使用生物传感器对抗CD306单克隆抗体识别的表位进行鉴定，了解各个抗体识别的抗原表位的空间位置关系；
(2)选择其中两株识别不同抗原表位的单克隆抗体，分别将其标记上HRP(辣根过氧化物酶)，包被其中一株未标记抗体于96孔板，CD306－Fc融合蛋白为标准品，HRP标记的另一株抗体做为第二抗体；检测批内、批间变异系数，验证本检测系统的稳定性；
(3)将第二抗体交互用碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对蛋白质充分透析；向抗体溶液中加入DMSO(二甲基亚砜)溶解的生物素蛋白；将样品经过分子筛柱，以PBS(磷酸盐缓冲液)洗脱，收集生物素标记的抗体；将原试剂盒与标记生物素后的试剂盒进行敏感性对照。
本发明的再一目的在于提供上述CD306夹心ELISA试剂盒在评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系方面的应用。
本发明克服现有技术的不足，提供一种CD306夹心ELISA试剂盒的建立方法及应用，通过鉴定抗CD306单克隆抗体表位，建立CD306夹心ELISA试剂盒，最后提高试剂盒的敏感性得到。该试剂盒用于评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系，首先确定利用流式细胞术对大肠癌进行早期诊断的定量标准，然后用CD306夹心ELISA试剂盒检测结直肠癌患者血清中CD306的水平，最后对大肠癌患者进行长期随访，记录检测指标，评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系。本发明经济、方便、依从性好，能提高早期大肠癌的检出率，降低因大肠癌导致的死亡。
在本发明中，肿瘤细胞表达胶原家族中的许多成员，这些表达的胶原参与肿瘤的生长、浸润和转移。研究表明，肿瘤发生初期，其表面的胶原分子在某种不明机制下可导致免疫细胞表面抑制性受体的特异性上调，从而逃逸免疫监视。白细胞相关免疫球蛋白样受体(Leukocyteassociatedimmunoglobulinlike-receptor，LAIR)属于免疫球蛋白超家族成员，它广泛分布于外周血单个核细胞。它是1983年用大颗粒淋巴细胞免疫小鼠，制备对NK细胞杀伤有抑制作用的抗体时发现的。人LAIR家族包含LAIR-1和LAIR-2两个成员。在第八届人类白细胞分化抗原会议上分别被命名为CD305及CD306。CD305是一种抑制性受体，在大肠癌发生初期，大肠癌细胞特异性表达CD305的高亲和力配体XVII型胶原，当CD305与胶原结合可明显抑制免疫细胞的活性。因此，可应用荧光标记的抗CD305单克隆抗体，利用流式细胞术对大肠癌进行早期诊断。
CD305与胶原之间的相互作用可受到可溶性分子CD306的调控。实验发现，CD306与CD305有相同的胶原结合位点，而且CD306与胶原的亲和力远远高于CD305与胶原结合的亲和力，CD306能够以高亲和力结合胶原，并可阻断CD305与胶原的结合。体内少量的CD306的变化就可能明显地影响CD305与胶原的结合活性。在肿瘤患者血清中CD306的浓度提高可降低肿瘤细胞通过CD305分子对免疫细胞发挥的抑制活性，从而促进免疫杀伤。因此，本发明通过夹心ELISA检测患者血清中CD306的水平，从而对患者预后进行预测。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1CD306夹心ELISA试剂盒的建立
(1)使用生物传感器对抗CD306单克隆抗体识别的表位进行鉴定，了解各个抗体识别的抗原表位的空间位置关系
在步骤(1)中，分别在生物传感器的样品反应池中加入乙酸缓冲液，随即加入CD306-Fc融合蛋白(真核表达CD306融合蛋白包括以下具体过程：以CD306cDNA为模板，用引物扩增cDNA，克隆的CD306插入载体中，构建出真核表达载体，转染细胞系，克隆出稳定分泌CD306-Fc融合蛋白的转染细胞系，培养转染细胞并纯化融合蛋白)和人IgG标准品(购自Gibco公司)，观察CD306-Fc和人IgG标准品与样品反应池的结合量。用PBS/T洗涤一次，开始收集数据信息，获得5～10min缓冲液基线数据。混合NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，立即将样品池中的缓冲液更换为活化CM-葡聚糖(购自SIGMA公司)的羧基基团的NHS-EDC混合液200μl，作用7min。移去活化液，PBS/T洗涤，乙酸包被缓冲液洗涤，分别加入CD306-Fc或人IgG标准品，交联。PBS/T洗涤，计算交联分子的总量。PBS洗涤，获取基线，加入抗CD306单克隆抗体，获取结合曲线。共作用4个mAb反应浓度。其余CD306mAb亲和力的的检测同前。获取数据信息后，利用生物传感器软件包FASTfit分析计算亲和力数值。采用mAb配对方式表位分析方法分析CD306mAb识别的表位，判定LAIR-2mAb识别LAIR-2分子的表位。
(2)选择其中两株识别不同抗原表位的单克隆抗体，分别将其标记上HRP(辣根过氧化物酶)，包被其中一株未标记抗体于96孔板，CD306－Fc融合蛋白为标准品，HRP标记的另一株抗体做为第二抗体；检测批内、批间变异系数，验证本检测系统的稳定性
在步骤(2)中，标记辣根过氧化物酶的方法：称取5mgHRP(辣根过氧化物酶)溶解于蒸馏水中。加入新配的0.1MNaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入10mg待标记抗体，在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/mlNaBH溶液，混匀，再静置4℃2小时。将上述液装入透析袋中，0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜。ELISA方法：包被其中一株未标记抗体于96孔板，CD306－Fc融合蛋白为标准品，辣根过氧化物酶标记的另一株抗体做为第二抗体；检测批内、批间变异系数，验证本检测系统的稳定性。
(3)将第二抗体交互用碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对蛋白质充分透析；向抗体溶液中加入DMSO(二甲基亚砜)溶解的生物素蛋白；将样品经过分子筛柱，以PBS(磷酸盐缓冲液)洗脱，收集生物素标记的抗体；将原试剂盒与标记生物素后的试剂盒进行敏感性对照。
实施例2CD306夹心ELISA试剂盒的应用
(1)应用荧光标记的抗CD305单克隆抗体，利用流式细胞术对大肠癌进行早期诊断，确定利用流式细胞术对大肠癌进行早期诊断的定量标准
用FITC(异硫氰酸荧光素)标记抗CD306单克隆抗体制备荧光抗体FITC-抗CD306，分离大肠癌患者PBMC(外周血单个核细胞)进行胞内细胞因子染色，利用流式细胞术分析大肠癌分期与Lair表达水平的关系。
(2)用CD306夹心ELISA试剂盒检测结直肠癌患者血清中CD306的水平，利用标准品计算出血清中CD306的血清浓度
抽取结直肠癌患者抗凝血，用提高敏感性的ELISA试剂盒检测结直肠癌患者血清中CD306的水平，利用标准曲线计算出患者血清中CD306的血清浓度。
(3)对大肠癌患者进行长期随访，记录腹部CT、肺部CT、血常规、生化及CEA(癌胚抗原)等检测指标，利用统计学方法评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系。
随访时间1－5年，平均三个月行血常规、生化及CEA检查，每六个月行腹部CT及肺部CT检查，准确记录肿瘤转移复发的情况。然后利用统计学软件评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明成功应用荧光标记抗人CD305单克隆抗体，利用流式细胞术对大肠癌进行早期诊断。
(2)本发明确定利用流式细胞术对大肠癌进行早期诊断的定量标准。
(3)本发明将CD306单克隆抗体两两结合进行夹心ELISA试验，找到最佳组合。
(4)本发明利用生物素亲合素标记技术提高试剂盒的敏感性。
(5)本发明利用检测到的CD306的血清水平对结肠癌直肠癌患者预后进行评估，经济、方便、依从性好，能提高早期大肠癌的检出率，降低因大肠癌导致的死亡。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种CD306夹心ELISA试剂盒的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用生物传感器对抗CD306单克隆抗体识别的表位进行鉴定，了解各个抗体识别的抗原表位的空间位置关系；
(2)选择其中两株识别不同抗原表位的单克隆抗体，分别将其标记上HRP，包被其中一株未标记抗体于96孔板，CD306－Fc融合蛋白为标准品，HRP标记的另一株抗体做为第二抗体；检测批内、批间变异系数，验证本检测系统的稳定性；
(3)将第二抗体交互用碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液对蛋白质充分透析；向抗体溶液中加入DMSO溶解的生物素蛋白；将样品经过分子筛柱，以PBS洗脱，收集生物素标记的抗体；将原试剂盒与标记生物素后的试剂盒进行敏感性对照。
2.权利要求1所述的CD306夹心ELISA试剂盒在评估CD306的血清水平与结肠癌直肠癌患者预后的关系方面的应用。
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