CN110595860A - 一种微量细胞的透射电镜包埋法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微量细胞的透射电镜包埋法，包括以下步骤：将1.5ml的EP管中的细胞漂洗后进行离心；在室温下向EP管中加入戊二醛对细胞进行固定后，对细胞进行漂洗，离心后弃上清；向EP管中加入锇酸对细胞进行固定，对细胞进行漂洗，离心后弃上清；对细胞进行脱水；使用Spurr包埋剂与丙酮对细胞浸透，然后对细胞离心；使用纯Spurr包埋剂对细胞浸透，然后对细胞离心；将细胞转入至0.5ml的EP管中，并将0.5ml的EP管放入至盛有热水的1.5ml的EP管中，对细胞进行离心；取出0.5ml的EP管，分别放置在37℃以及60℃的环境。本发明离心后的细胞集中成块比较牢固，近似于组织块，便于包埋切块。
Description
技术领域
本发明属于医疗技术领域，更具体地，涉及一种微量细胞的透射电镜包埋法。
背景技术
微量细胞数量比较少，常规透射电镜样品的固定、脱水、浸透，每步都需要离心。浸透剂和包埋剂通常采用环氧树脂Epon812与硅胶包埋模进行包埋。由于Epon812粘度较高，细胞不易集中，无法进行超薄切片。
发明内容
本发明为克服上述现有技术细胞不易集中的缺陷，提供一种微量细胞的透射电镜包埋法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种微量细胞的透射电镜包埋法,包括以下步骤:
S1:将细胞收集在1.5ml的EP管中,用生理盐水或0.1M的PBS对细胞进行漂洗,然后将EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min；
S2：在室温条件下向EP管中加入3％的戊二醛对细胞进行固定，固定时间为30min；加入戊二醛后禁止摇动细胞，以免细胞分散后不成团块；使用0.1M的PBS对细胞进行漂洗，然后将EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min，弃上清；
S3：在室温条件下向EP管中加入1％的锇酸对细胞进行固定，固定时间为30min；使用PBS对细胞漂洗，然后对EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min，弃上清；
S4：利用50％乙醇、70％乙醇、80％丙酮、90％丙酮、95％丙酮、100％丙酮对细胞进行脱水；
S5:在室温条件下，使用Spurr包埋剂与丙酮按1:1的比例对细胞浸透，时间为30min；然在对EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min；
S6:使用纯Spurr包埋剂对细胞浸透，时间为40min，然后对EP管中的细胞在2500-3000r/min的转速下离心3-4min；
S7：将细胞转入0.5ml的EP管中，在60℃的环境下放置5min；在1.5ml的EP管的底部放入一定量的棉花和60℃的热水；将0.5ml的EP管套入1.5ml的EP管中；然后对1.5ml的EP管、0.5ml的EP管以及0.5ml的EP管中的细胞在2500-3000r/min的转速下离心5min；热水的作用是降低包埋剂的粘度，便于细胞的离心沉淀；在0.5ml的EP管套入1.5ml的EP管中，棉花对0.5ml的EP管的起到一定的支撑固定作用，防止在离心过程中，0.5ml的EP管在1.5ml的EP管中出现转动等问题，从而影响离心的效果；
S8：将0.5ml的EP管从1.5ml的EP管中取出；将0.5ml的EP管在37℃的环境下放置4小时，然后将0.5ml的EP管在60℃的环境下放置60小时；
S9：用刀片将装有包埋块的0.5ml的EP管外套切开，取出包埋块。
优选地，在所述步骤S1中，PBS的ph值为7.2；漂洗次数为2次，每次漂洗时间为1min。
优选地，在所述步骤S2中，PBS的ph值为7.2，漂洗次数为2次，每次漂洗时间为5min。
优选地，在所述步骤S7中，1.5ml的EP管中热水的界面不能超过0.5ml EP管的四分之三位置。这样设置可以防止在离心过程中，热水从1.5ml的EP管中飞溅出来。
与现有技术相比，有益效果是：
本发明采用Spurr低粘度包埋剂和用EP管加温离心沉降的方法，效果很理想；此方法优点是离心后的细胞集中成块比较牢固，近似于组织块，便于包埋切块。本发明避免了使用常规的硅胶包埋模具进行细胞包埋时，存在的细胞数量少，难以集中，加之传统的Epon812包埋剂粘度高，细胞离心时不易沉降难以进行后续的修块和超薄切片的问题。
附图说明
图1为利用本发明方法得到的包埋块示意图；
图2为利用传统方法得到的包埋块示意图。
具体实施方式
附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。附图中描述位置关系仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制。
本发明实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”“长”“短”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体描述：
实施例1
一种微量细胞的透射电镜包埋法,包括以下步骤:
S1:将细胞收集在1.5ml的EP管中,用生理盐水或0.1M的PBS对细胞进行漂洗,然后将EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min；
S2：在室温条件下向EP管中加入3％的戊二醛对细胞进行固定，固定时间为30min；加入戊二醛后禁止摇动细胞，以免细胞分散后不成团块；使用0.1M的PBS对细胞进行漂洗，然后将EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min，弃上清；
S3：在室温条件下向EP管中加入1％的锇酸对细胞进行固定，固定时间为30min；使用PBS对细胞漂洗，然后对EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min，弃上清；
S4：利用50％乙醇、70％乙醇、80％丙酮、90％丙酮、95％丙酮、100％丙酮对细胞进行脱水；
S5:在室温条件下，使用Spurr包埋剂与丙酮按1:1的比例对细胞浸透，时间为30min；然在对EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min；
S6:使用纯Spurr包埋剂对细胞浸透，时间为40min，然后对EP管中的细胞在2500-3000r/min的转速下离心3-4min；
S7：将细胞转入0.5ml的EP管中，在60℃的环境下放置5min；在1.5ml的EP管的底部放入一定量的棉花和60℃的热水；将0.5ml的EP管套入1.5ml的EP管中；然后对1.5ml的EP管、0.5ml的EP管以及0.5ml的EP管中的细胞在2500-3000r/min的转速下离心5min；热水的作用是降低包埋剂的粘度，便于细胞的离心沉淀；在0.5ml的EP管套入1.5ml的EP管中，棉花对0.5ml的EP管的起到一定的支撑固定作用，防止在离心过程中，0.5ml的EP管在1.5ml的EP管中出现转动等问题，从而影响离心的效果；
S8：将0.5ml的EP管从1.5ml的EP管中取出；将0.5ml的EP管在37℃的环境下放置4小时，然后将0.5ml的EP管在60℃的环境下放置60小时；
S9：用刀片将装有包埋块的0.5ml的EP管外套切开，取出包埋块，如图1所示。
在图1中，离心后的细胞集中在包埋块的底部，细胞集中成块比较牢固，近似于组织块，便于后续切块。图2为利用传统方法得到的包埋块，细胞位于包埋块的左部处，细胞数量少，且细胞不集中，细胞不集中导致后续切块困难。
其中，在步骤S1中，PBS的ph值为7.2；漂洗次数为2次，每次漂洗时间为1min。
另外，在步骤S2中，PBS的ph值为7.2，漂洗次数为2次，每次漂洗时间为5min。
其中，在步骤S7中，1.5ml的EP管中热水的界面不能超过0.5ml EP管的四分之三位置。这样设置可以防止在离心过程中，热水从1.5ml的EP管中飞溅出来。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种微量细胞的透射电镜包埋法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:将细胞收集在1.5ml的EP管中,用生理盐水或0.1M的PBS对细胞进行漂洗,然后将EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min；
S2：在室温条件下向EP管中加入3％的戊二醛对细胞进行固定，固定时间为30min；加入戊二醛后禁止摇动细胞，以免细胞分散后不成团块；使用0.1M的PBS对细胞进行漂洗，然后将EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min，弃上清；
S3：在室温条件下向EP管中加入1％的锇酸对细胞进行固定，固定时间为30min；使用PBS对细胞漂洗，然后对EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min，弃上清；
S4：利用50％乙醇、70％乙醇、80％丙酮、90％丙酮、95％丙酮、100％丙酮对细胞进行脱水；
S5:在室温条件下，使用Spurr包埋剂与丙酮按1:1的比例对细胞浸透，时间为30min；然在对EP管中的细胞在2000r/min的转速下离心3min；
S6:使用纯Spurr包埋剂对细胞浸透，时间为40min，然后对EP管中的细胞在2500-3000r/min的转速下离心3-4min；
S7：将细胞转入0.5ml的EP管中，在60℃的环境下放置5min；在1.5ml的EP管的底部放入一定量的棉花和60℃的热水；将0.5ml的EP管套入1.5ml的EP管中；然后对1.5ml的EP管、0.5ml的EP管以及0.5ml的EP管中的细胞在2500-3000r/min的转速下离心5min；
S8：将0.5ml的EP管从1.5ml的EP管中取出；将0.5ml的EP管在37℃的环境下放置4小时，然后将0.5ml的EP管在60℃的环境下放置60小时；
S9：用刀片将装有包埋块的0.5ml的EP管外套切开，取出包埋块。
2.根据权利要求1所述的一种微量细胞的透射电镜包埋法,其特征在于，在所述步骤S1中，PBS的ph值为7.2；漂洗次数为2次，每次漂洗时间为1min。
3.根据权利要求1所述的一种微量细胞的透射电镜包埋法,其特征在于，在所述步骤S2中，PBS的ph值为7.2，漂洗次数为2次，每次漂洗时间为5min。
4.根据权利要求1所述的一种微量细胞的透射电镜包埋法,其特征在于，在所述步骤S7中，1.5ml的EP管中热水的界面不能超过0.5ml EP管的四分之三位置。
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| GR01 | Patent grant | ||
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