CN103751844B - 一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质制备方法及其应用 - Google Patents

一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质制备方法，包括以下步骤：1）使用京尼平交联猪小肠粘膜脱细胞基质，然后漂洗干燥；2）将步骤1）得到的经京尼平交联的猪小肠粘膜脱细胞基质置于多巴胺溶液中浸泡，然后漂洗干燥；3）将经过步骤2）处理的猪小肠粘膜脱细胞基质置于硝酸银溶液中浸泡，然后漂洗干燥。本发明还公开了所述的抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质在高应力部位组织修复中的应用。本发明同时对猪小肠粘膜脱细胞基质进行了抗降解和抗菌改性，并且证明了其抗降解性能和抗菌性能均相对于天然的猪小肠粘膜脱细胞基质显著增强，仍然保持良好的生物相容性，能够在高应力部位组织修复中应用。

Description

一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质制备方法及其应用
技术领域
本发明属于组织修复材料技术领域，涉及一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质的制备方法及其应用。
背景技术
天然生物材料猪小肠粘膜脱细胞基质是目前临床应用最为广泛的异种生物材料，因为其具有与人体细胞外基质类似的组成和结构，且通过脱细胞处理技术除去了主要免疫原性成分，因此生物相容性好，免疫原性低，能较好的调控细胞的粘附、迁移、增殖和分化，是组织再生修复理想的支架材料。但现有的猪小肠粘膜脱细胞基质存在以下两个缺陷，限制了其在再生医学领域的进一步使用：
第一，天然的猪小肠粘膜脱细胞基质降解速度较快，在某些高应力部位，如在疝气修补和妇科盆底修补术中，新生的基质材料尚未完全成熟而植入的猪小肠粘膜脱细胞基质发生降解，导致生物力学性能下降，因此对于盆底等高应力部位的使用不能提供足够的力学支撑。
第二，天然的猪小肠粘膜脱细胞基质本身不具备主动抗菌性能，而材料植入相关的感染是目前临床一个重要的并发症，常导致需要进行再次手术。
针对第一个问题，目前采用物理交联和化学交联是改善材料降解性能的常用方法，但物理交联程度有限，难以达到理想效果，常规化学交联虽能改善交联效果，但常用的化学交联剂如戊二醛，其残留和其与材料反应生成的新的物质结构，常引起材料生物相容性的改变，使材料从植入适应转为排斥(OwenTJ,JSurgRes.Aug1997;71(2):179-186)。因此使用天然物质提取的化学交联剂成为最近的研究重点，最近，丛敬（专利CN201010552527）等利用从栀子花中提取的京尼平用于交联猪小肠粘膜脱细胞基质，但未见交联后的抗降解效果的说明。范雪梅等（第三军医大学学报，2012；19：1985-1988）报道了利用京尼平交联猪脱细胞膀胱基质，取得较好的抗降解效果，并且体外细胞毒性评价显示为0-1级细胞毒性。但上述报道仅显示体外试验的报道，而未涉及体内植入的评价，因为即使相同的材料在不同植入部位的反应效果也不尽相同(JansenRG,ArchOralBiol.2008;53(4):376–387)，因此不能简单类推相同生物材料的应用范围。而目前经过京尼平交联改性后的猪小肠粘膜脱细胞基质能否用于高应力部位尚不清楚。
针对第二个问题，Zhou等(AnnSurg.May2011;253(5):1033-1041)将纳米银与猪小肠粘膜脱细胞基质进行混合，显示出良好的主动抗菌效果。但由于其采用混合法，因此纳米银与猪小肠粘膜脱细胞基质结合不够紧密，在较短时间内会释放大量纳米银，使得后期的抗菌效果有限，需要进一步改进。
总体而言，尽管在猪小肠粘膜脱细胞基质的抗降解和抗菌改性方面都有一定的前期研究，但目前还未见同时对猪小肠粘膜脱细胞基质进行抗降解和抗菌的改性研究，尤其是缺乏改性后材料在高应力部位的反应特性的资料（这是评价改性后材料是否具有应用价值的主要指标）。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质的制备方法及其应用，同时对猪小肠粘膜脱细胞基质进行抗降解和抗菌改性，并对改性后的材料进行一系列体外功能评价，并进行体内植入评价，突破天然猪小肠粘膜脱细胞基质的应用范围。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明公开了一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质的制备方法，包括以下步骤：
1）使用京尼平交联猪小肠粘膜脱细胞基质，然后漂洗干燥；
2）将步骤1）得到的经京尼平交联的猪小肠粘膜脱细胞基质置于多巴胺溶液中浸泡，然后漂洗干燥；
3）将经过步骤2）处理的猪小肠粘膜脱细胞基质置于硝酸银溶液中浸泡，然后漂洗干燥，即得到抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质。
进一步，所述步骤1）的具体参数为：使用质量浓度0.5%~1.5%的京尼平溶液在30~40℃下浸泡猪小肠粘膜脱细胞基质48~72小时，然后用酒精漂洗，再用PBS缓冲液漂洗，干燥。
进一步，所述步骤2）的具体参数为：将经京尼平交联的猪小肠粘膜脱细胞基质置于多巴胺溶液中搅拌浸泡8~12小时，然后用超纯水漂洗，干燥；所述多巴胺溶液为用pH8.5、10mM的Tris-HCl缓冲液配置的浓度为1~5mg/mL的多巴胺溶液。
进一步，所述步骤3）的具体参数为：将经过步骤2）处理的猪小肠粘膜脱细胞基质置于浓度为10~50mM的硝酸银溶液中搅拌浸泡12~24小时，然后用超纯水漂洗，干燥。
本发明还公开了所述的抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质在高应力部位组织修复中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明采用京尼平交联改善猪小肠粘膜脱细胞基质的降解性能，同时采用多巴胺作为还原剂还原纳米银，由于多巴胺同时还具有良好的粘附性，使纳米银更为牢固的结合在材料上，纳米银在材料表面可以长期存在，因此其抗菌时效更长，增强了材料的抗菌效果和持续抗菌能力。
将本发明同时抗降解和抗菌改性的猪小肠粘膜脱细胞基质进行的一系列体外功能评价和体内植入评价证明，其抗降解性能和抗菌性能均相对于天然的猪小肠粘膜脱细胞基质显著增强，并且未产生有毒有害物质，仍然保持良好的生物相容性，并且从植入高应力部位的抗降解性和生物相容性试验结果证明，本发明的抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质能够在高应力部位组织修复中应用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质的SEM图；
图2为抗菌抗降解改性后的猪小肠粘膜脱细胞基质的元素分析图谱；
图3为改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质的降解曲线；
图4为改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌试验结果；
图5为改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质的体外相容性试验结果；
图6为植入的改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质的外观变化；
图7为植入的改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质的HE结果；
图8为植入的改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质的免疫组化结果（1）；
图9为植入的改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质的免疫组化结果（2）。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1制备抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质，包括以下步骤：
1）使用质量浓度1%的京尼平溶液在37℃下浸泡猪小肠粘膜脱细胞基质72小时，然后用75%的酒精漂洗2小时，再用PBS缓冲液漂洗72小时，干燥；
2）将步骤1）得到的经京尼平交联的猪小肠粘膜脱细胞基质置于多巴胺溶液中搅拌浸泡12小时，然后用超纯水漂洗，干燥；所述多巴胺溶液为用pH8.5、10mM的Tris-HCl缓冲液配置的浓度为2mg/mL的多巴胺溶液；
3）将经过步骤2）处理的猪小肠粘膜脱细胞基质置于浓度为30mM的硝酸银溶液中搅拌浸泡18小时，然后用超纯水漂洗，干燥，即得到抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质。
实施例2SEM确认纳米银
图1中，a为未经改性的猪小肠粘膜脱细胞基质的SEM图，b为抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质的SEM图，可见，抗菌抗降解改性后的猪小肠粘膜脱细胞基质纤维表面变粗糙，经元素分析为银元素（见图2）。
以下图和表格中的PSIS指未经改性的猪小肠粘膜脱细胞基质，genipin-PSIS指经京尼平交联的猪小肠粘膜脱细胞基质（实施例1步骤1得到的经京尼平交联的猪小肠粘膜脱细胞基质），genipin-NS-PSIS指经京尼平和纳米银改性后的猪小肠粘膜脱细胞基质（实施例1最终得到的抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质）。
实施例3机械力学性能
用INSTRON5965力学试验机检测改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质，结果见表1，可见改性后的猪小肠粘膜脱细胞基质力学性能明显改善。
实施例4体外降解性能
将改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质浸泡于60ug/ml的1型胶原酶中，每3天更换消化液，取样品检测，结果见图3，可见改性后的猪小肠粘膜脱细胞基质抗降解性能大幅改善，30天后仍保留85%左右，而未经改性的猪小肠粘膜脱细胞基质9天即降解90%以上，12天时完全降解。
实施例5抗菌性能
将改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质进行大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌试验，结果见图4，可见实施例1得到的抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质能对大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）产生明显的抑菌圈，说明有较好的抑菌效果。
实施例6体外相容性
3×104cells/cm2的骨髓间充质干细胞接种于不同处理材料表面，24小时后用细胞活性/毒性试剂盒进行染色，荧光显微镜下观察细胞生长形态，结果见图5，可见改性后的猪小肠粘膜脱细胞基质表面细胞生长良好，仍保持良好的相容性。
实施例7体内植入试验
将改性前后的猪小肠粘膜脱细胞基质植入到高应力部位（大鼠阴道粘膜下），1、4周每周取材看材料的大体变化，HE切片观测验证反应，免疫组化检测免疫排斥分型，结果见图6、图7、图8和图9，可见，4周后未经改性的猪小肠粘膜脱细胞基质已基本降解完全，不能分辨，而改性后的猪小肠粘膜脱细胞基质仍明显可辨；HE结果各组在1周时有轻微的炎症反应，此后转为正常；免疫组化结果显示各种免疫细胞分型在各组间无显著差异，无显著的免疫排斥反应。以上结果表明，本发明的抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质能够在高应力部位组织修复中应用。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）使用京尼平交联猪小肠粘膜脱细胞基质，然后漂洗干燥；
2）将步骤1）得到的经京尼平交联的猪小肠粘膜脱细胞基质置于多巴胺溶液中浸泡，然后漂洗干燥；
3）将经过步骤2）处理的猪小肠粘膜脱细胞基质置于硝酸银溶液中浸泡，然后漂洗干燥，即得到抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质；
所述步骤2）的具体参数为：将经京尼平交联的猪小肠粘膜脱细胞基质置于多巴胺溶液中搅拌浸泡8~12小时，然后用超纯水漂洗，干燥；所述多巴胺溶液为用pH8.5、10mM的Tris-HCl缓冲液配置的浓度为1~5mg/mL的多巴胺溶液；
所述步骤3）的具体参数为：将经过步骤2）处理的猪小肠粘膜脱细胞基质置于浓度为10~50mM的硝酸银溶液中搅拌浸泡12~24小时，然后用超纯水漂洗，干燥。
2.根据权利要求1所述的抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质的制备方法，其特征在于：所述步骤1）的具体参数为：使用质量浓度0.5%~1.5%的京尼平溶液在30~40℃下浸泡猪小肠粘膜脱细胞基质48~72小时，然后用酒精漂洗，再用PBS缓冲液漂洗，干燥。
3.权利要求1至2任意一项所述的抗菌抗降解的猪小肠粘膜脱细胞基质在高应力部位组织修复中的应用。
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