CN107456599B - 抗菌大鲵分泌物生物膜及其制备方法和应用 - Google Patents

抗菌大鲵分泌物生物膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗菌大鲵分泌物生物膜及其制备方法和应用，先将大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中，得到大鲵分泌物溶液。然后将大鲵分泌物溶液冻干成膜，得到大鲵分泌物生物膜。之后使用抗菌剂润湿大鲵分泌物生物膜，得到抗菌大鲵分泌物生物膜。该抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法简便，不破坏大鲵分泌物的原有结构，形成的抗菌大鲵分泌物生物膜保留了大鲵分泌物较好的粘合性、生物相容性等优点。抗菌剂能够均匀分散吸收在大鲵分泌物生物膜中，膜的韧性和强度较好，能够作为止血膜、组织粘合膜或绷带等对创面进行覆盖或包裹，具有广阔的应用前景。

Description

抗菌大鲵分泌物生物膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料领域，特别是涉及一种抗菌大鲵分泌物生物膜及其制备方法和应用。
背景技术
大鲵，也被称为“中国大蝾螈”，属于大鲵科，是最大的现存两栖动物物种之一。它在生物多样性，遗传进化和生物化学领域显示了巨大的研究进展和宝贵的潜力。大鲵粘液是大鲵体表受刺激后的一种大鲵分泌物，前期的研究发现大鲵分泌物具有粘合性能好、生物相容性好且可降解等优点，可开发成为止血材料、粘合剂及软组织填充材料等。
然而，传统的大鲵分泌物应用形式大多为粉末状或凝胶状。在临床上，需要使用膜状材料对创面覆盖或包裹，粉末和凝胶均无法满足上述临床需求。因此急需开发大鲵分泌物生物膜。但是由于大鲵分泌物的难溶性，研究人员不断尝试将大鲵分泌物制备成膜，但都难以在不破坏大鲵分泌物本身粘合性、生物相容性等原有性能的前提下形成大鲵分泌物生物膜。此外，由于大鲵分泌物的难溶，难以在大鲵分泌物中均匀分散抗菌剂，难以在不破坏大鲵分泌物本身粘合性、生物相容性等原有性能的前提下形成具有良好抗菌效果的大鲵分泌物。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够在不破坏大鲵分泌物原有性能的基础上形成具有良好抗菌效果的大鲵分泌物生物膜的制备方法
此外，还提供一种抗菌大鲵分泌物生物膜及其应用。
一种抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，包括如下步骤：
将大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中，得到大鲵分泌物溶液，其中，所述酸性溶液选自维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液和硝酸溶液中的至少一种，所述含氟极性溶剂为含羧基或羟基的含氟有机溶剂；
将所述大鲵分泌物溶液冻干成膜或真空干燥成膜，得到所述大鲵分泌物生物膜；及
使用抗菌剂润湿所述大鲵分泌物生物膜，得到所述抗菌大鲵分泌物生物膜。
在一个实施方式中，将所述大鲵分泌物溶液冻干成膜，所述冻干成膜的步骤具体包括：
将大鲵分泌物溶液以恒定的速率降温至-50℃～-30℃冷冻0.5h～4h；及
将冷冻后的所述大鲵分泌物溶液置于绝对压强为1Pa～10Pa的条件下放置12h～48h。
在一个实施方式中，所述使用抗菌剂润湿所述大鲵分泌物生物膜的步骤具体包括：
通过涂覆、喷洒或浸渍的方式将所述抗菌剂加在所述大鲵分泌物生物膜上，所述抗菌剂足以使所述大鲵分泌物生物膜湿润。
在一个实施方式中，所述抗菌剂为硝酸银溶液，所述硝酸银溶液中硝酸银的浓度为0.1mmol/L～20mmol/L。
在一个实施方式中，所述使用抗菌剂润湿所述大鲵分泌物生物膜的步骤之前，还包括：
使用多巴胺溶液润湿所述大鲵分泌物生物膜。
在一个实施方式中，所述多巴胺溶液中多巴胺的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL。
在一个实施方式中，所述酸性溶液为维生素C溶液，所述维生素C溶液中维生素C的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为醋酸溶液，所述醋酸溶液中醋酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为硫酸溶液，所述硫酸溶液中硫酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为磷酸溶液，所述磷酸溶液中磷酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为硝酸溶液，所述硝酸溶液中硝酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L。
在一个实施方式中，所述大鲵分泌物为大鲵粘液的干燥粉，所述大鲵分泌物溶液中所述大鲵分泌物的浓度为0.001g/mL～2g/mL。
一种抗菌大鲵分泌物生物膜，通过上述任一项所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法制备得到。
上述的抗菌大鲵分泌物生物膜在制备止血膜或绷带中的应用。
上述抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，先将大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中，得到大鲵分泌物溶液。然后将大鲵分泌物溶液冻干成膜或真空干燥成膜，得到大鲵分泌物生物膜。之后使用抗菌剂润湿大鲵分泌物生物膜，得到抗菌大鲵分泌物生物膜。该抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法至少具有如下有益效果：(1)发明人经过大量的探索研究，预料不到地发现，大鲵分泌物仅在维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液和硝酸溶液特定的酸性溶液或者含氟极性溶剂中具有较高的溶解度，因此能够使用上述酸性溶液或者含氟极性溶剂溶解大鲵分泌物形成大鲵分泌物溶液，再将大鲵分泌物溶液冻干，成功获得了膜状的大鲵分泌物生物膜；(2)冻干形成的大鲵分泌物生物膜具有微小的空隙，通过抗菌剂润湿该大鲵分泌物生物膜，抗菌剂能够均匀分散吸收在大鲵分泌物生物膜中，使得大鲵分泌物生物膜具有良好抗菌效果；(3)该抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法简便，不破坏大鲵分泌物的原有结构，形成的抗菌大鲵分泌物生物膜保留了大鲵分泌物较好的粘合性、生物相容性等优点，且该抗菌大鲵分泌物生物膜质地均匀、韧性和强度较好，能够作为止血膜、组织粘合膜或绷带等对创面进行覆盖或包裹，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为一实施方式的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法的流程图；
图2为实施例1制备的抗菌大鲵分泌物生物膜的示意图；
图3为在含有实施例1制备的抗菌大鲵分泌物生物膜的培养基中培养大肠杆菌后OD值曲线以及对照组OD值曲线的对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
请参阅图1，一实施方式的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法包括如下步骤S110～S130。
S110、将大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中，得到大鲵分泌物溶液，其中，酸性溶液选自维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液和硝酸溶液中的至少一种，所述含氟极性溶剂为含羧基或羟基的含氟有机溶剂；
在一个实施方式中，大鲵分泌物为大鲵粘液的干燥粉，大鲵分泌物溶液中大鲵分泌物的浓度为0.001g/mL～2g/mL。
在一个实施方式中，大鲵分泌物溶液中大鲵分泌物的浓度为0.001g/mL～1g/mL。
具体地，大鲵分泌物溶液中大鲵分泌物的浓度为0.005g/mL～0.5g/mL。
具体地，大鲵分泌物溶液中大鲵分泌物的浓度为0.1g/mL～1g/mL。
如大鲵分泌物的浓度过高，不易溶解，较难形成混合均匀的大鲵分泌物溶液。如大鲵分泌物的浓度过低，难以冻干形成膜状生物材料。本实施方式的大鲵分泌物溶液中大鲵分泌物的浓度为0.001g/mL～2g/mL，浓度适宜，能够制备形成韧性和强度较好大鲵分泌物生物膜。
在一个实施方式中，大鲵分泌物通过如下方法制备获得：从大鲵的外表面刮取大鲵粘液，然后将收集的大鲵粘液置于温度为-30℃～-10℃的条件下冷冻0.5h～2h。将冷冻后的大鲵粘液置于温度为-50℃～-30℃、绝对压强为5Pa～20Pa的条件下真空冷冻干燥，得到大鲵分泌物。
具体地，将鲜活大鲵用清水清洗体表并去除蜕皮等杂质，然后用扁平物如勺子来回刮擦大鲵体表，待大鲵体表分泌大量乳白色粘液时，刮取收集大鲵粘液。一般每次可从5kg左右的成年大鲵上收集约5g大鲵粘液。然后将收集的大鲵粘液置于-20℃冰箱中冷冻1h。将冷冻后的大鲵粘液置于温度为-50℃～-30℃、绝对压强为5Pa～20Pa的条件下真空冷冻干燥的操作中，真空冷冻干燥的时间为12h～48h。
具体地，绝对压强为5Pa～20Pa，表示实际压强低于大气压的真空条件下去除大鲵粘液内部的水分，获得大鲵粘液的干燥粉。
本实施方式中，将冷冻后的大鲵粘液置于冻干机中，在温度为-40℃、绝对压强为10Pa的条件下，干燥48h，使得大鲵粘液干燥形成粉末状。
经过冷冻和真空冷冻干燥，使得大鲵粘液逐步冷却，避免骤冷破坏大鲵粘液内部结构。
上述方法制备的大鲵分泌物具有较好的内部结构，保留了大鲵粘液生物相容性等特征，能够溶解在特定的溶液中形成均一地大鲵分泌物溶液。
当然，在其他实施方式中，也可以直接从市场购买获得大鲵分泌物。
在一个实施方式中，真空冷冻干燥得到大鲵分泌物后，还包括将大鲵分泌物粉碎形成微小颗粒。
具体地，用低温超微粉碎机粉碎大鲵分泌物，边粉碎边加液氮，使温度保持低温，粉碎后得到微小颗粒状的大鲵分泌物，促进大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中，形成均匀分散的大鲵分泌物溶液。
在一个实施方式中，大鲵分泌物的粒径为1μm～100μm。
在一个实施方式中，大鲵分泌物的粒径为20μm～60μm。
本实施方式中，大鲵分泌物的粒径为50μm。
在一个实施方式中，将大鲵分泌物溶解在酸性溶液中，其中酸性溶液选自维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液和硝酸溶液中的至少一种。
在一个实施方式中，酸性溶液为维生素C溶液，维生素C溶液中维生素C的浓度为0.1mol/L～1mol/L。
具体地，维生素C溶液中维生素C的浓度为0.5mol/L～1mol/L。
具体地，维生素C溶液的溶剂为水。
在一个实施方式中，酸性溶液为盐酸溶液，盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.1mol/L～1mol/L。
具体地，盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.5mol/L～1mol/L。
具体地，盐酸溶液的溶剂为水。
在一个实施方式中，酸性溶液为醋酸溶液，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L。
具体地，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.5mol/L～1mol/L。
具体地，醋酸溶液的溶剂为水。
在一个实施方式中，酸性溶液为硫酸溶液，硫酸溶液中硫酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L。
具体地，硫酸溶液中硫酸的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L。
具体地，硫酸溶液的溶剂为水。
在一个实施方式中，酸性溶液为磷酸溶液，磷酸溶液中磷酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L。
具体地，磷酸溶液中磷酸的浓度为0.5mol/L～1mol/L。
具体地，磷酸溶液的溶剂为水。
在一个实施方式中，酸性溶液为硝酸溶液，硝酸溶液中硝酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L。
具体地，硝酸溶液中硝酸的浓度为0.5mol/L～1mol/L。
具体地，硝酸溶液的溶剂为水。
在另一个实施方式中，将大鲵分泌物溶解在含氟极性溶剂中得到大鲵分泌物溶液。
具体地，含氟极性溶剂为含羧基或羟基的含氟有机溶剂，例如六氟异丙醇、三氟乙醇或三氟乙酸等。
优选地，将大鲵分泌物溶解在六氟异丙醇中得到大鲵分泌物溶液。具体地，六氟异丙醇的纯度为99％以上。
在一个实施方式中，将大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中的步骤中，溶解的操作为在温度为10℃～35℃条件下搅拌处理4h～8h。
具体地，将大鲵分泌物溶解在酸性溶液中或者含氟极性溶剂的步骤中，溶解的操作为在温度为15℃～25℃条件下搅拌处理5h～7h。
溶解大鲵分泌物时的温度条件适宜，使得大鲵分泌物能够在酸性溶液或者含氟极性溶剂中溶解，且同时避免温度过高破坏大鲵粘液的内部结构。通过搅拌处理，加速大鲵分泌物的溶解，从而形成混合均匀的大鲵分泌物溶液。
大鲵分泌物难以溶解，研究人员不断尝试将大鲵分泌物制备成膜，但都难以在不破坏大鲵分泌物本身粘合性、生物相容性等原有性能的前提下形成大鲵分泌物生物膜，因此也难以使抗菌剂在大鲵分泌物生物膜中均匀分散。
发明人经过大量的探索研究，预料不到地发现，大鲵分泌物在维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液和硝酸溶液特定的酸性溶液或者含氟极性溶剂中具有较高的溶解度，因此能够将大鲵分泌物溶解在上述酸性溶液或者含氟极性溶剂中形成均匀分散的大鲵分泌物溶液，然后将大鲵分泌物溶液冻干成膜获得膜层状的大鲵分泌物生物膜。虽然酸性溶液和含氟极性溶剂为什么能够溶解大鲵分泌物的机制尚不明确，可能是跟酸性溶液中的H离子或者含氟极性溶剂中的极性F离子有关。经过实验研究证实，常温下大鲵分泌物在上述酸性溶液中的溶解度能够达到约1g/mL。常温下大鲵分泌物在六氟异丙醇中能够达到约2g/mL。因而能够在上述酸性溶液中或者含氟极性溶剂中溶解较高剂量的大鲵分泌物，形成均匀分散的大鲵分泌物溶液。
S120、将S110中得到的大鲵分泌物溶液冻干成膜或真空干燥成膜，得到大鲵分泌物生物膜。
大鲵分泌物溶液中溶解了大鲵分泌物，冻干时，溶剂被挥发，形成膜状的大鲵分泌物生物膜。
在一个实施方式中，将大鲵分泌物溶液冻干成膜的步骤具体包括以下步骤S121～S122。
S111、将大鲵分泌物溶液以恒定的速率降温至-50℃～-30℃冷冻0.5h～4h。
一般在室温下例如10℃～35℃条件下溶解大鲵分泌物，大鲵分泌物溶液以恒定的速率降温至-50℃～-30℃，逐步冷却，避免骤冷破坏大鲵分泌物内部结构。
在一个实施方式中，将大鲵分泌物溶液加入成型模具中，其中大鲵分泌物溶液在成型模具中的液体厚度为0.5cm～10cm。然后将装载有大鲵分泌物-溶液的成型模具放入冻干机中，以0.5℃/min～2℃/min的速率降温至-50℃～-30℃，冷冻0.5h～4h。
具体地，成型模具的大小以及形状可以根据实际需要调整。
在-50℃～-30℃低温条件下保持一段时间有利于提高大鲵分泌物的韧性以及强度。
S122、将S121中冷冻后的大鲵分泌物溶液置于绝对压强为1Pa～10Pa的条件下放置12h～48h。
在绝对压强为1Pa～10Pa的条件下，大鲵分泌物溶液中的溶剂被挥发，得到膜状的大鲵分泌物生物膜。
具体地，绝对压强为1Pa～10Pa的条件下放置12h～48h后，得到膜状的大鲵分泌物生物膜具有微小地孔隙，利于吸收抗菌剂或为营养物质运输提供通道，提高膜的生物相容性。
S130、使用抗菌剂润湿S120中得到的大鲵分泌物生物膜，得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
冻干的大鲵分泌物生物膜具有微小地孔隙，能够吸收抗菌剂，从而得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
在一个实施方式中，使用抗菌剂润湿大鲵分泌物生物膜的步骤具体包括：通过涂覆、喷洒或浸渍的方式将抗菌剂加在大鲵分泌物生物膜上，抗菌剂足以使大鲵分泌物生物膜湿润。上述在大鲵分泌物生物膜上加载抗菌剂的方法简便快速，使得抗菌剂能够均匀分散在膜状的大鲵分泌物生物膜中。
在一个实施方式中，抗菌剂为硝酸银溶液，硝酸银溶液中硝酸银的浓度为0.1mmol/L～20mmol/L。
进一步地，硝酸银溶液中硝酸银的浓度为1mmol/L～15mmol/L。
进一步地，硝酸银溶液中硝酸银的浓度为5mmol/L～10mmol/L。
具体地，硝酸银溶液中的溶剂为水。
若硝酸银的浓度过低，比较难达到抑菌的效果；若硝酸银的浓度过高，则可能会产生一些副作用。本实施方式的硝酸银溶液中硝酸银的浓度为0.1mmol/L～20mmol/L，浓度适宜能够达到抑菌又不产生其他副作用。
具体地，将大鲵分泌物生物膜放入硝酸银溶液中浸渍12h～48h，得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
在一个实施方式中，使用抗菌剂润湿大鲵分泌物生物膜的步骤之前，还包括：使用多巴胺溶液润湿大鲵分泌物生物膜。使用多巴胺溶液预先润湿大鲵分泌物生物膜，使得大鲵分泌物生物膜上先吸收多巴胺，多巴胺一方面能够增强大鲵分泌物生物膜的粘性，另一方面还能够使得后续加载的抗菌剂更加稳定的结合在大鲵分泌物生物膜上。
在一个实施方式中，使用多巴胺溶液润湿大鲵分泌物生物膜的步骤具体包括：通过涂覆、喷洒或浸渍的方式将多巴胺溶液加在大鲵分泌物生物膜上，多巴胺溶液足以使大鲵分泌物生物膜湿润。
在一个实施方式中，多巴胺溶液中多巴胺的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL。
具体地，多巴胺溶液中多巴胺的浓度为1mg/mL～3mg/mL。
具体地，多巴胺溶液中多巴胺的浓度为2mg/mL～4mg/mL。
多巴胺的浓度适宜，增强大鲵分泌物生物膜的粘性。
在一个实施方式中，使用多巴胺溶液润湿大鲵分泌物生物膜后，用蒸馏水冲洗1次～5次，洗去表面多余的多巴胺。
本实施方式中，先将大鲵分泌物生物膜放入多巴胺溶液中浸渍12h～48h，得到多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜。用蒸馏水冲洗1次～5次，洗去表面多余的多巴胺，然后将多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜放入硝酸银溶液中浸渍12h～48h。多巴胺能够还原硝酸银，使得硝酸银中的银离子稳定的结合在大鲵分泌物生物膜上发挥抗菌作用。
具体地，使用抗菌剂润湿大鲵分泌物生物膜后，还包括用蒸馏水冲洗1次～5次，洗去表面多余的抗菌剂，然后真空干燥得到抗菌大鲵分泌物生物膜。真空干燥的绝对压强例如为1Pa～100Pa。
在另一个实施方式中，也可以将大鲵分泌物溶液真空干燥成膜。即将大鲵分泌物溶液置于真空条件(低于大气压即可)的条件下，大鲵分泌物溶液中的溶剂挥发，形成大鲵分泌物粘性生物膜。具体地，真空干燥成膜的温度一般不超过37℃。
上述抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，先将大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中，得到大鲵分泌物溶液。然后将大鲵分泌物溶液冻干成膜或真空干燥成膜，得到大鲵分泌物生物膜。之后使用抗菌剂润湿大鲵分泌物生物膜，得到抗菌大鲵分泌物生物膜。该抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法至少具有如下有益效果：(1)发明人经过大量的探索研究，预料不到地发现，大鲵分泌物仅在维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液和硝酸溶液特定的酸性溶液或者含氟极性溶剂中具有较高的溶解度，因此能够使用上述酸性溶液或者含氟极性溶剂溶解大鲵分泌物形成大鲵分泌物溶液，再将大鲵分泌物溶液冻干，成功获得了膜状的大鲵分泌物生物膜；(2)冻干形成的大鲵分泌物生物膜具有微小的空隙，通过抗菌剂润湿该大鲵分泌物生物膜，抗菌剂能够均匀分散吸收在大鲵分泌物生物膜中，使得大鲵分泌物生物膜具有良好抗菌效果；(3)该抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法简便，不破坏大鲵分泌物的原有结构，形成的抗菌大鲵分泌物生物膜保留了大鲵分泌物较好的粘合性、生物相容性等优点，且该抗菌大鲵分泌物生物膜质地均匀、韧性和强度较好，能够作为止血膜、组织粘合膜或绷带等对创面进行覆盖或包裹，具有广阔的应用前景。
一实施方式的抗菌大鲵分泌物生物膜，通过上述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法制备得到。
上述抗菌大鲵分泌物生物膜作为止血膜或绷带的应用。
该抗菌大鲵分泌物生物膜，抗菌剂能够均匀分散吸收在大鲵分泌物生物膜中，使得大鲵分泌物生物膜具有良好抗菌效果。该抗菌大鲵分泌物生物膜保留了大鲵分泌物较好的粘合性、生物相容性等优点，且生物膜的质地均匀、韧性和强度较好，能够作为止血膜、组织粘合膜或绷带等对创面进行覆盖或包裹，具有广阔的应用前景。
下面为具体实施例(以下实施例如无特殊说明，则不含有除不可避免的杂质以外的其他未明确指出的组分)
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
将鲜活大鲵用清水清洗体表并去除蜕皮等杂质，然后用勺子来回刮擦大鲵体表，待大鲵体表分泌大量乳白色粘液时，刮取收集大鲵粘液。一般每次可从5kg左右的成年大鲵上收集约5g大鲵粘液，总共刮取获得40g大鲵粘液。将收集的大鲵粘液置于-20℃冰箱中冷冻0.5h。将冷冻后的大鲵粘液置于冻干机中，在温度为-40℃、绝对压强为10Pa的条件下真空冷冻干燥36h，得到大鲵粘液的干燥粉。用低温超微粉碎机粉碎大鲵粘液的干燥粉，边粉碎边加液氮，使温度保持低温，粉碎后得到平均粒径为50μm的大鲵分泌物。
取1g上述方法制备的大鲵分泌物加入到20mL维生素C溶液中，其中维生素C溶液中维生素C的浓度为0.5mol/L。在常温下(20℃)搅拌处理6h，形成均一的大鲵分泌物溶液。
取20mL大鲵分泌物溶液注入长×宽为4cm×1cm的成型模具中，然后将成型模具放入冻干机中，以1℃/min的速率降温至-40℃，并在-40℃温度条件下冷冻放置2h。随后将成型模具置于绝对压强为5Pa的条件下放置24h，得到质地均一、具有微孔状的膜状的大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为2mg/mL多巴胺溶液中浸渍36h，得到多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的多巴胺，然后将多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜放入浓度为10mmol/L硝酸银溶液中浸渍36h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥4h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。制备的抗菌大鲵分泌物生物膜如图2所示。
实施例2
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取0.5g大鲵分泌物加入到20mL的盐酸溶液中，其中盐酸溶液中氯化氢的浓度为1mol/L。在常温下(20℃)搅拌处理4h，形成均一的大鲵分泌物溶液。
取5mL大鲵分泌物溶液注入长×宽为1cm×1cm的成型模具中，然后将成型模具放入冻干机中，以0.5℃/min的速率降温至-30℃，并在-30℃温度条件下冷冻放置0.5h。随后将成型模具置于绝对压强为10Pa的条件下放置12h，得到质地均一、具有微孔状的膜状的大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为0.5mg/mL多巴胺溶液中浸渍48h，得到多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的多巴胺，然后将多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜放入浓度为20mmol/L硝酸银溶液中浸渍12h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥5h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
实施例3
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取0.1g大鲵分泌物加入到20mL的醋酸溶液中，其中醋酸溶液中醋酸的浓度为0.5mol/L。在25℃下搅拌处理4h，形成均一的大鲵分泌物溶液。
取20mL大鲵分泌物溶液注入长×宽为4cm×4cm的成型模具中，然后将成型模具放入冻干机中，以1℃/min的速率降温至-40℃，并在-40℃温度条件下冷冻放置0.5h。随后将成型模具置于绝对压强为8Pa的条件下放置12h，得到质地均一、具有微孔状的膜状的大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为5mg/mL多巴胺溶液中浸渍12h，得到多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的多巴胺，然后将多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜放入浓度为1mmol/L硝酸银溶液中浸渍48h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥6h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
实施例4
取1g按实施例1的方法制备保存的大鲵分泌物加入到20mL的硫酸溶液中，其中硫酸溶液中硫酸的浓度为0.1mol/L。在常温下(20℃)搅拌处理8h，形成均一的大鲵分泌物溶液。
取20mL大鲵分泌物溶液注入长×宽为10cm×2cm的成型模具中，然后将成型模具放入冻干机中，以2℃/min的速率降温至-40℃，并在-40℃温度条件下冷冻放置2h。随后将成型模具置于绝对压强为10Pa的条件下放置15h，得到质地均一、具有微孔状的膜状的大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为3mg/mL多巴胺溶液中浸渍24h，得到多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的多巴胺，然后将多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜放入浓度为0.1mmol/L硝酸银溶液中浸渍48h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥6h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
实施例5
取0.02g按实施例1的方法制备保存的大鲵分泌物加入到20mL的磷酸溶液中，其中磷酸溶液中磷酸的浓度为0.1mol/L。在常温下(20℃)搅拌处理4h，形成均一的大鲵分泌物溶液。
取20mL大鲵分泌物溶液注入长×宽为2cm×2cm的成型模具中，然后将成型模具放入冻干机中，以2℃/min的速率降温至-40℃，并在-40℃温度条件下冷冻放置4h。随后将成型模具置于绝对压强为10Pa的条件下放置48h，得到质地均一、具有微孔状的膜状的大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为4mg/mL多巴胺溶液中浸渍40h，得到多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的多巴胺，然后将多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜放入浓度为15mmol/L硝酸银溶液中浸渍36h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥8h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
实施例6
取20g按实施例1的方法制备保存的大鲵分泌物加入到20mL的硝酸溶液中，其中硝酸溶液中硝酸的浓度为0.5mol/L。在常温下(20℃)搅拌处理8h，形成均一的大鲵分泌物溶液。
取20mL大鲵分泌物溶液注入长×宽为3cm×3cm的成型模具中，然后将成型模具放入冻干机中，以2℃/min的速率降温至-50℃，并在-50℃温度条件下冷冻放置2h。随后将成型模具置于绝对压强为5Pa的条件下放置24h，得到质地均一、具有微孔状的膜状的大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为5mg/mL多巴胺溶液中浸渍12h，得到多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的多巴胺，然后将多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜放入浓度为20mmol/L硝酸银溶液中浸渍12h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥6h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
实施例7
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取10g大鲵分泌物加入到10mL的六氟异丙醇中，在常温下(20℃)搅拌处理6h，形成均一的大鲵分泌物-六氟异丙醇溶液。
取5mL大鲵分泌物-六氟异丙醇溶液注入长×宽为1cm×1cm的成型模具中，然后将成型模具放入冻干机中，以1℃/min的速率降温至-40℃，并在-40℃温度条件下冷冻放置1h。随后将成型模具置于绝对压强为5Pa的条件下放置16h，得到质地均一、具有微孔状的膜状的大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为2mg/mL多巴胺溶液中浸渍24h，得到多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的多巴胺，然后将多巴胺处理后的大鲵分泌物生物膜放入浓度为10mmol/L硝酸银溶液中浸渍15h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥4h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
实施例8
按实施例1的方法制备大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为10mmol/L硝酸银溶液中浸渍36h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥4h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
实施例9
按实施例7的方法制备大鲵分泌物生物膜。
常温下(20℃)下将大鲵分泌物生物膜放入浓度为10mmol/L硝酸银溶液中浸渍15h。用蒸馏水冲洗3次，洗去表面多余的硝酸银，真空干燥4h后得到抗菌大鲵分泌物生物膜。
对比例1
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取1g上述方法制备的大鲵分泌物加入到20mL的水中，在常温下(20℃)搅拌处理6h，大鲵分泌物在水中基本不溶解，因而无法制备大鲵分泌物生物膜。
对比例2
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取1g上述方法制备的大鲵分泌物加入到20mL的丙酮中，在常温下(20℃)搅拌处理6h，大鲵分泌物在丙酮中基本不溶解，因而无法制备大鲵分泌物生物膜。
对比例3
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取1g上述方法制备的大鲵分泌物加入到20mL的乙醇中，在常温下(20℃)搅拌处理6h，大鲵分泌物在乙醇中基本不溶解，因而无法制备大鲵分泌物生物膜。
对比例4
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取1g上述方法制备的大鲵分泌物加入到20mL的乙腈中，在常温下(20℃)搅拌处理6h，大鲵分泌物在乙腈中基本不溶解，因而无法制备大鲵分泌物生物膜。
对比例5
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取1g上述方法制备的大鲵分泌物加入到20mL的二氯甲烷中，在常温下(20℃)搅拌处理6h，大鲵分泌物在二氯甲烷中基本不溶解，因而无法制备大鲵分泌物生物膜。
对比例6
按实施例1的方法制备大鲵分泌物。
取1g上述方法制备的大鲵分泌物加入到20mL的二甲亚砜中，在常温下(20℃)搅拌处理6h，大鲵分泌物在二甲亚砜中基本不溶解，因而无法制备大鲵分泌物生物膜。
测试一
在20℃条件下，取实施例1的方法制备的大鲵分泌物分别加入到10mL的维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液、硝酸溶液、六氟异丙醇中。维生素C溶液中维生素C的浓度为0.5mol/L，盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.5mol/L，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.5mol/L，硫酸溶液中硫酸的浓度为0.5mol/L，磷酸溶液中磷酸的浓度为0.5mol/L，硝酸溶液中硝酸的浓度为0.5mol/L。加入过程中不断搅拌，直至出现沉降的现象，则停止加入大鲵分泌物，记录每种溶液中的总加入量，结果如表1所示。
表1：20℃条件下大鲵分泌物在各酸性溶液中的溶解度
溶液(10mL) 最高溶解大鲵分泌物的量(g) 溶解度(g/mL)
维生素C溶液 15.2 1.52g/mL
盐酸溶液 12.5 1.25g/mL
醋酸溶液 5.6 0.56g/mL
硫酸溶液 10.4 0.104g/mL
磷酸溶液 4.1 0.41g/mL
硝酸溶液 13.1 1.31g/mL
六氟异丙醇 25.0 2.5g/mL
以上结果表明大鲵分泌物在维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液、硝酸溶液和六氟异丙醇中具有非常好的溶解性。特别是在维生素C溶液溶解度可达1.52g/mL，在六氟异丙醇中溶解度可达2.5g/mL。
因此，将大鲵分泌物溶解在上述酸性溶液或者六氟异丙醇中形成均一的大鲵分泌物溶液，进而用于制备大鲵分泌物生物膜。
而采用其它溶剂时，如对比例1～6中的水、丙酮、乙醇、乙腈、二氯甲烷、二甲亚砜等，相同的方法测试大鲵分泌物基本不溶解。
测试二
将一块实施例1制备的大鲵分泌物粘性生物膜正反两面分别粘合在两块PDMS膜上，然后用万能拉力机上下夹头分别夹住两块PDMS膜，用万能拉力机拉伸测试大鲵分泌物粘性生物膜剪切粘附应力。采用相同的方法测试实施例2～实施例9制备的抗菌大鲵分泌物生物膜的剪切粘附应力，结果如下表2所示。
表2：抗菌大鲵分泌物生物膜的剪切粘附应力
Figure BDA0001375860910000171
Figure BDA0001375860910000181
从表2中的数据可以看出实施例1～实施例9制备的抗菌大鲵分泌物生物膜粘合力较好，且膜状材料本身具有韧性和强度较好，能够作为止血膜、组织粘合膜或绷带等对创面进行覆盖或包裹，具有广阔的应用前景。
另外，比较实施例1和实施例8的大鲵分泌物生物膜，实施例1的剪切粘附应力为34.2KPa，实施例8为17.5KPa。说明实施例1中预先用多巴胺的浸渍能够增强制备的大鲵分泌物生物膜的粘性。此外实施例7的剪切粘附应力为25.4KPa，实施例9为16.8KPa，也说明实施例7中预先用多巴胺的浸渍能够增强制备的大鲵分泌物生物膜的粘性。
测试三
止血实验：取Wistar大鼠10只，雌雄各半，体重250g±20g，分别将每只大鼠的2条后腿分为实验组和对照组。实验前，将大鼠按30mg/kg腹腔注射2％戊巴比妥钠水溶液麻醉，大鼠仰卧位固定，用电推理发器将大鼠后腿内侧剃毛，8％硫化钠脱毛，碘伏、体积分数为75％的乙醇消毒。然后用手术刀在大鼠的两后腿内侧部位切口，长30mm，深3mm，有血液流出。切开后在实验组切口部位分别用实施例1～实施例9制备的大鲵分泌物生物膜包扎，粘合牢固。对照组在切口部位用纱布包扎，并按压止血。用实施例1～实施例9制备的大鲵分泌物生物膜包扎实验组的大鼠后腿在1min内停止出血，大鲵分泌物生物膜的表面无血液渗出。而对照组按压3min后才停止出血，纱布表面有明显的血液渗出。说明大鲵分泌物生物膜止血效果明显。
以上实验结果表明实施例1～实施例9制备的抗菌大鲵分泌物生物膜，具有膜状材料的韧性和强度，且粘合性较好，制备成膜后大鲵分泌物原有性能没有被破坏，保留了大鲵分泌物较好的粘合性、生物相容性等优点。
测试四
抗菌性测试(1)
准备LB培养基，分为实验组、第一对照组、第二对照组和空白组。
实验组：将一片实施例1制备的抗菌大鲵分泌物生物膜放入50mL的LB培养基中，接种0.5mL的大肠杆菌ATCC25922，在37℃条件，150r/min的条件下培养，每隔1h取1mL培养液用紫外分光光度计测定OD值。
第一对照组：将一片按实施例1的方法制备的大鲵分泌物生物膜(但未用多巴胺溶液和硝酸银溶液浸渍)，放入50mL的LB培养基中，同样接种0.5mL的大肠杆菌ATCC25922，在37℃条件，150r/min的条件下培养，每隔1h取1mL培养液用紫外分光光度计测定OD值。
第二对照组：取50mL的LB培养基中，接种0.5mL的大肠杆菌ATCC25922，在37℃条件，150r/min的条件下培养，每隔1h取1mL培养液用紫外分光光度计测定OD值。
空白组：取50mL的LB培养基中，按实验组的条件置于在37℃条件，150r/min的条件下，每隔1h取1mL培养液用紫外分光光度计测定OD值。
实验组、第一对照组、第二对照组和空白组的OD值下表3所示。
表3：实验组、第一对照组、第二对照组和空白组的OD值
Figure BDA0001375860910000191
Figure BDA0001375860910000201
将表3中的数据制作曲线图如图3所示。
从图中可以看出，与第一对照组和第二对照组相比，实验组抗菌大鲵分泌物生物膜明显抑制大肠杆菌的生长，具有较好的抗菌效果。
此外，需要说明的是，以上实施例1制备的抗菌大鲵分泌物生物膜的抗菌数据说明。同样的方法测试的实施例2～9的抗菌大鲵分泌物生物膜也具有良好的抗菌作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中，得到大鲵分泌物溶液，其中，所述酸性溶液选自维生素C溶液、盐酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液和硝酸溶液中的至少一种，所述含氟极性溶剂为含羧基或羟基的含氟有机溶剂，所述大鲵分泌物为大鲵粘液的干燥粉，所述大鲵分泌物溶液中所述大鲵分泌物的浓度为0.001g/mL～2g/mL，所述将大鲵分泌物溶解在酸性溶液或者含氟极性溶剂中的步骤中，溶解的操作为在温度为10℃～35℃条件下搅拌处理4h～8h；
将所述大鲵分泌物溶液冻干成膜或真空干燥成膜，得到所述大鲵分泌物生物膜；及
使用抗菌剂润湿所述大鲵分泌物生物膜，得到所述抗菌大鲵分泌物生物膜。
2.根据权利要求1所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，其特征在于，将所述大鲵分泌物溶液冻干成膜，所述冻干成膜的步骤具体包括：
将大鲵分泌物溶液以恒定的速率降温至-50℃～-30℃冷冻0.5h～4h；及
将冷冻后的所述大鲵分泌物溶液置于绝对压强为1Pa～10Pa的条件下放置12h～48h。
3.根据权利要求1所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，其特征在于，所述使用抗菌剂润湿所述大鲵分泌物生物膜的步骤具体包括：
通过涂覆、喷洒或浸渍的方式将所述抗菌剂加在所述大鲵分泌物生物膜上，所述抗菌剂足以使所述大鲵分泌物生物膜湿润。
4.根据权利要求1所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，其特征在于，所述抗菌剂为硝酸银溶液，所述硝酸银溶液中硝酸银的浓度为0.1mmol/L～20mmol/L。
5.根据权利要求1所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，其特征在于，所述使用抗菌剂润湿所述大鲵分泌物生物膜的步骤之前，还包括：
使用多巴胺溶液润湿所述大鲵分泌物生物膜。
6.根据权利要求5所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，其特征在于，所述多巴胺溶液中多巴胺的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，其特征在于，
所述酸性溶液为维生素C溶液，所述维生素C溶液中维生素C的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液中氯化氢的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为醋酸溶液，所述醋酸溶液中醋酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为硫酸溶液，所述硫酸溶液中硫酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为磷酸溶液，所述磷酸溶液中磷酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L；及/或，
所述酸性溶液为硝酸溶液，所述硝酸溶液中硝酸的浓度为0.1mol/L～1mol/L。
8.根据权利要求1所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法，其特征在于，所述大鲵分泌物溶液中所述大鲵分泌物的浓度为0.001g/mL～1g/mL。
9.一种抗菌大鲵分泌物生物膜，其特征在于，通过权利要求1～8任一项所述的抗菌大鲵分泌物生物膜的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的抗菌大鲵分泌物生物膜在制备止血膜、组织粘合膜或绷带中的应用。
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