CN101623518A - 一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料及制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料及制备和应用,组成包括厚度为80μm-100μm的小肠粘膜下层脱细胞基质(SIS),纳米银颗粒,在SIS中植入纳米银颗粒;制备方法:将纳米银颗粒制成工作液,浓度50ppm-500ppm,平面浸入SIS,工作液/SIS两者体积比为100-120∶1,温度37℃,CO2浓度5%;SIS翻面1次/30分钟,得纳米银SIS。该修复材料具有安全无毒、抗感染、高组织亲和性、可吸收、组织再生快、粘连轻、疝复发率低等优点,抗感染特点是高效持久、抗菌谱广、无耐药性等,此复合材料可应用于伴有污染或感染的体壁创面、筋膜缺损或疝的修复。
Description
技术领域
本发明涉及疝和体壁修复材料及其制备和应用领域,特别是涉及一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料及制备和应用。
背景技术
重大灾害时危重伤员容易发生“腹腔间隙综合征(ACS)”,初期剖腹手术后难以关腹,需用修复材料关闭腹腔;后期许多伤员易发生巨大切口疝,更需要合适的人工材料进行修复。此外,腹壁缺损也是现代战争中的常见创伤类型,这类缺损均伴有污染,部分已发生严重感染,而目前国内已有修复材料包括硅胶膜、聚酯、聚丙烯、膨化聚四氟乙烯以及复合补片等,均难以胜任污染或感染伤口,因为其都是细菌良好的粘附载体,细菌粘附于其上后即可产生使其免受宿主免疫防御机制和抗生素作用的生物被膜,从而得以在局部长期成活并可导致伤口的慢性感染。
生物衍生材料是当前国外疝和体壁修复材料研究的新进展,包括各类脱细胞基质,如猪小肠粘膜下层(small intestinal submucosa,SIS)、人工脱细胞真皮(acellular dermal matrix,ADM)等。生物衍生材料拥有与合成材料类似的修复疗效,最突出的是拥有一定的抗微生物活性。研究发现,醋酸消化制备的SIS细胞外基质浸出液具有抑制革兰阴性大肠杆菌和革兰阳性金黄色葡萄球菌的作用。SIS在有金黄色葡萄球菌定植时亦可实现良好的组织再塑,植入SIS伤口的感染性低于合成材料。但同时国外研究也发现生物衍生材料应用于修复污染或潜在感染的腹壁缺损时失败率>50%。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗感染生物衍生复合疝和体壁修复材料及制备和应用,该材料具有安全无毒、抗感染、高组织亲和性、可吸收、组织再生快、粘连轻、疝复发率低等优点,抗感染特点是高效持久、抗菌谱广、无耐药性等;应用于污染或感染体壁创面、筋膜缺损或疝的修复。
本发明的一种抗感染生物衍生复合疝和体壁修复材料,包括厚度为80μm-100μm的猪小肠粘膜下层脱细胞基质SIS,纳米银颗粒,在SIS中植入纳米银颗粒,银含量1±0.048μg/cm2。
所述纳米银颗粒直径为15nm-100nm。
本发明的一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料的制备方法,包括:
采用自组装技术将纳米银微粒植入生物衍生材料-猪小肠粘膜下层脱细胞基质构建新型抗感染复合疝和体壁修复材料。
具体过程:将纳米银颗粒加入去离子水混匀形成工作液,以火焰原子光谱吸收仪确定浓度50ppm-500ppm,平面浸入猪小肠粘膜下层(SIS)(厚度80um-100um),工作液/SIS两者体积比为100-120∶1,温度37℃,CO2浓度5%;SIS翻面1次/30分钟,通过气相色谱-质谱联用分析、火焰原子质谱分析和扫描/投射电镜测定出该浓度下特定直径纳米银颗粒于小肠粘膜下层中弥散和吸附速率,从而能够针对特定颗粒大小、特定浓度的纳米银工作液,设定不同的时间(2h-10h)即可得到不同银含量的纳米银SIS。
质量控制采用分光光度计比较法检测吸附后工作液中剩余银浓度,计算工作液中初始银量减去剩余银量即得到SIS中吸附银量。
原理:小肠粘膜下层为三维胶原支架结构,孔隙率大,浸于纳米银溶液中后,银微粒自动进入SIS孔隙中;由于胶原具有较强的黏附性,能吸附银微粒,从而使银不断于SIS中蓄积。
银作为抗菌剂,具有高效、安全无毒、抗菌谱广、无耐药性等优点,能杀灭细菌、真菌和霉菌甚至病毒。银杀菌机制主要与银离子有关,银离子可与细菌内巯基酶结合从而使后者失活,阻断微生物的能量代谢及细胞壁合成,起到杀灭细菌、病毒及真核微生物的作用。也有研究表明纳米银颗粒可以和病原体的DNA碱基结合,形成交叉链接,置换嘌呤和嘧啶中相邻氮之间的氢键,使DNA变性,不能复制,致细菌失活。近年来,利用纳米技术将金属银加工成纳米级的银微粒后,其比表面积极大,显示明显的表面效应、小尺寸效应和宏观隧道效应,抗菌活性大大增强,效力更持久。此外,银还有促进伤口愈合的功能。研究发现,涂抹纳米银乳膏可抑制变应性接触性皮炎鼠伤口局部炎症因子如TNF-α/IL-2/IL-6的表达、诱导炎性细胞调亡。动物毒性实验和临床应用均证实银杀菌剂属实际无毒级。文献报道,纳米银对小鼠经口灌喂剂量2000mg/kg和5000mg/kg时,小鼠安全,对兔皮肤刺激性积分为0,属于实际无毒级。纳米银作为抗菌材料已应用于创伤敷料等方面。
有益效果
(1)本发明的复合生物衍生疝和体壁修复材料具有安全无毒、抗感染、高组织亲和性、可吸收、组织再生快、粘连轻、疝复发率低等优点,抗感染特点是高效持久、抗菌谱广、无耐药性等。
(2)利用银作为无机抗菌剂的特性,结合纳米技术新进展,将其植入生物衍生材料,为改进疝和体壁修复材料抗感染性的研究提供新的思路。
附图说明
图1(a).制作过程中的生物衍生材料猪小肠粘膜下层
图1(b).冻干消毒后真空包装的生物衍生材料猪小肠粘膜下层
图1(c).生物衍生材料猪小肠粘膜下层切面HE染色-提示无细胞成分
图1(d).生物衍生材料猪小肠粘膜下层切面Masson染色-提示均为胶原成分
图2.纳米银微粒透射电镜图
图3.纳米银微粒植入小肠粘膜下层前后微观结构对比图,a.单纯SIS(放大10000倍),纳米银SIS(放大30000倍)
图4.纳米银SIS、单纯SIS、合成材料体外抗菌效果对比
图5.纳米银SIS、单纯SIS、合成材料修复大鼠巨大全层伴有感染腹壁缺损实验效果对比
图5(a).鼠巨大腹壁缺损
图5(b).材料修复
图5(c).纳米银SIS修复
图5(d).单纯SIS修复
图5(e).Proceed补片修复
图5(f).单纯SIS可维持鼠腹壁抗张力
图5(g)(1).腹腔注水试验证实术后2月SIS修复区抗张力高于腹股沟区,并与粘连无关
图5(g)(2).腹腔注水试验证实术后2月SIS修复区抗张力高于腹股沟区,并与粘连无关
图5(h).SIS修复交界区HE染色
图5(i).SIS修复中央区HE染色
图6.纳米银SIS、单纯SIS、合成材料修复大鼠污染腹壁缺损后腹腔粘连情况对比
图7.纳米银SIS、单纯SIS修复大鼠污染腹壁缺损后血液中银含量变化情况
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1.利用Abraham法制备猪小肠粘膜下层来源生物性腹壁修复材料SIS
具体流程如下:
第一步机械方法处理
①所需药品
过氧乙酸(Peracetic acid),叠氮化钠(sodium azide),磷酸缓冲溶液(PBS),乙醇,去离子水。
②制备
(1)根据需要选取一段新鲜的猪空肠,若需短时间保存和运输可用手术纱布包裹并浸泡在生理盐水中。
(2)将小肠用水反复冲洗,清除小肠内外壁粘附的物质。
(3)用手术刀柄和湿纱布将浆膜和肌层沿小肠的纵向褪下。
(4)将剩下的小肠翻转,使粘膜向外,用同样的方法将粘膜褪下。
由此得到的小肠粘膜下基质约100μm厚,呈半透明状。仔细检查是否有剩余组织粘连在基质上,用水冲洗彻底清除基质中的细胞和细胞残骸。可根据需要将管状的基质切成不同形状,如沿纵向切开成片状。
第二步化学方法处理
上述机械方法制得的小肠粘膜下基质仍含有一定的内皮细胞,需化学方法清除剩余的细胞。
①所需药品
乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA),过氧乙酸(Peracetic acid),NaOH,NaCl,HCl,叠氮化钠,磷酸缓冲液(PBS),去离子水。
②制备
(1)将用机械方法制得的小肠粘膜下基质浸泡于含100mmol/L EDTA和10mmol/LNaOH的溶液中(PH11~12)。溶液和基质的体积比为100∶1。
(2)用去离子水冲洗干净,在含1mol/LHCl和1mol/LNaCl的溶液中浸泡6~8h。
(3)用去离子水冲洗基质,然后在含1mol/L NaCl的PBS溶液中(PH 7~7.4)浸泡16h。
(4)用去离子水冲洗基质,然后在PBS溶液中浸泡2h。
(5)用去离子水冲洗基质2h。
经过上述处理的小肠粘膜下基质厚度约80μm,90%为I型和III型胶原。显微观察和力学测试表明,上述处理未明显改变胶原结构和材料的强度。
第三步交联
对上述获得的小肠粘膜下基质进行交联处理,可降低材料的抗原性,增加对蛋白分解的抵抗性,并能提高其机械强度。
①所需药品
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺[N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidehydrochloride,EDC],丙酮,过氧乙酸(peracetic acid),叠氮化钠(sodium azide),去离子水。
②方法
(1)在90%丙酮溶液中溶解适量EDC配制成10mmol/L EDC溶液,将基质在其中浸泡8h。
(2)在0.1%过氧乙酸中浸泡8h,然后用含0.05%叠氮化钠的去离子水冲洗2h。
(3)γ射线照射,剂量250~350Gy。
最终得到的SIS厚度为80-100μm,HE染色证实无细胞,Masson染色证实材料成分为胶原,如图1(a),图1(b),图1(c),图1(d)所示。适当调整EDC和丙酮浓度以及处理时间可以调节材料的强度,韧性和在体内的降解速度。
2.自组装技术植入纳米银颗粒(直径15nm、25nm或100nm)于SIS后构建纳米银SIS并通过扫描电镜证实,银含量1±0.048ug/cm2(SIS厚度100μm),如图2、图3所示。
具体过程:将直径15nm、25nm或100nm的纳米银颗粒粉剂加入去离子水混匀制成工作液,以火焰原子光谱吸收仪确定特定浓度(根据需要可选50ppm-500ppm中任一浓度),平面浸入小肠粘膜下层,工作液/SIS两者体积比为100-120∶1,温度37℃,CO2浓度5%。SIS翻面1次/30分钟,通过联用气相色谱-质谱联用分析、火焰原子质谱、扫描/投射电镜测定出特定颗粒大小和浓度的纳米银于小肠粘膜下层中弥散和吸附速率,之后根据需要设定不同的时间即可得到不同银含量的纳米银SIS。质量控制采用分光光度计比较法检测工作液中剩余银浓度,计算工作液中初始银量减去剩余银量即得到SIS中吸附银量。
3.单轴力学测量结果证实植入纳米银后SIS力学强度无改变
预实验对未交联SIS,交联SIS,以及交联复合纳米银SIS进行了单轴力学测量,结果表明交联SIS的弹性模量小于未交联SIS(P=0.0007),最大值载荷大于未交联SIS(P=0.0001),提示交联SIS力学性能优于未交联SIS;而交联复合纳米银SIS的弹性模量及最大值载荷与交联SIS无显著性差异(P>0.05),提示交联SIS复合纳米银后,力学性能无明显改变;如表1所示。
表1未交联SIS、交联SIS、纳米银SIS单轴力学测量结果
弹性模量(自动)(MPa) | 最大值载荷(N) | |
未交联SIS | 11.79±1.84 | 6.96±0.44 |
交联SIS | 6.84±0.97 | 9.24±0.45 |
交联复合纳米银SIS | 7.24±0.78 | 8.70±0.35 |
4.预实验证实纳米银SIS具有较强的体外抗菌作用
如图4所示,将纳米银SIS(直径15nm、2nm)和单纯SIS分别置于接种有标准菌株的培养皿上,37℃培养24小时,观察抑菌环大小。证实直径15nm的纳米银颗粒具有最好的抗菌效果,单纯SIS无抗菌效果。
采用纳米银不同浓度、不同作用时间进行抑菌率试验,结果证实500ppm纳米银溶液(纳米银颗粒直径15nm)作用15min以上对大肠埃希杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌抑菌率均达到100%(表2、表3)。采用KB法证实纳米银SIS对国际标准菌株金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌具有明显杀菌作用。
表2不同浓度纳米银(15nm)对抑菌效果影响试验结果
表3纳米银(15nm,500ppm)不同作用时间对抑菌效果影响试验结果
5.采用纳米银SIS、单纯SIS、合成材料分别修复Wistar大鼠巨大全层伴有感染腹壁缺损,结果证实纳米银SIS具有较强的体内抗菌作用。
如图5(a)所示,①制备大鼠巨大全层腹壁缺损,缺损范围自剑突下到耻骨上,约4×2cm大小,予以缺损面积同样大小纳米银SIS、单层SIS、强生Proceed补片修补(每组24只),6-0丝线缝合,修复区涂抹0.3ml浓度为107菌落/ml的金葡菌,皮下组织刮除,皮肤丝线缝合。术后3天因动物自我咬断缝线,纳米银SIS、单纯SIS组部分鼠切口裂开至术后8周完全愈合,期间动物生存良好,无腹壁疝发生。腹腔注水试验显示术后2月修复区腹壁结构强度超过正常腹股沟区、生物材料与腹腔脏器粘连较合成材料轻,组织切片显示修复区均为纤维组织所代替。
②不同材料修复术后的第1、3、5、7天分别取修复区分泌物送细菌培养,证实纳米银SIS修复区感染率明显较低(P<0.01),感染时限较短(P<0.05)。
③术后1周腹腔粘连情况对比,证实纳米银SIS较单纯SIS不会加重腹腔粘连,两者明显轻于合成高分子补片,如图6所示,(a)为纳米银-SIS,(b)为强生Proceed补片,(c)为单纯SIS
6.纳米银体内生物安全性评价
术后第1、3、5、7、15、30天自大鼠尾静脉取血,采用原子吸收光谱仪检测其中银含量,结果证实其中银含量远低于文献报道的银安全浓度,如表5、图7所示。
表4采用不同材料修复后大鼠腹壁细菌培养试验结果(阳性率,%)
表5不同材料修复组大鼠血液中银含量(μg/ml,X±s)
Claims (5)
1.一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料,包括厚度为80μm-100μm的小肠粘膜下层脱细胞基质SIS,纳米银颗粒,在SIS中植入纳米银颗粒,银含量1±0.048μg/cm2。
2.根据权利要求1所述的一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料,其特征在于:所述纳米银颗粒直径为直径15-100nm。
3.一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料的制备方法,包括:将纳米银颗粒加入去离子水混匀形成工作液,以火焰原子光谱吸收仪确定浓度50ppm-500ppm,平面浸入厚度为80μm-100μm小肠粘膜下层SIS,工作液/SIS两者体积比为100-120∶1,温度37℃,CO2浓度5%;SIS翻面1次/30分钟,得纳米银SIS。
4.根据权利要求3所述的一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料的制备方法,其特征在于:对于特定颗粒大小、特定浓度的纳米银工作液,设定不同的时间即可得到不同银含量的纳米银SIS。
5.一种抗感染生物衍生疝和体壁修复材料应用领域为伴有污染或感染的体壁创面、筋膜缺损或疝的修复。
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