CN101810883B - 高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料及制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料，其组分包括：脱细胞基质和可吸收抗感染纳米微粒，脱细胞基质中植入可吸收抗感染纳米微粒量根据无机抗菌剂含量计算范围为100～1000μg/cm³；其制备包括：(1)可吸收无机抗菌剂纳米微粒的制备；(2)生物衍生材料脱细胞的改性处理；(3)自组装技术构建纳米改性生物衍生材料。本发明的生物衍生材料具有可直接接触腹腔，长效抗感染，高组织相容性，促细胞增殖能力强，能用于污染或感染伤口等优点，无机抗菌纳米颗粒植入体内后在短期(≤2h)内突释药物，迅速达到有效浓度，使有效血液浓度维持续时间达到2周～3月甚至更长，在各种组织器官修复治疗中具有良好的应用前景。

Description

高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料及制备和应用

技术领域

本发明属生物衍生材料及制备和应用领域，特别是涉及一种高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料及制备和应用。

背景技术

目前外科临床迫切需要具有较强抗感染能力、能用于污染或感染伤口、高组织相容性的修复材料，但合成材料具有较多先天缺陷，难以适任这一需求。因为合成材料提高抗感染性一般采用表面增加抗感染成分，无法内部植入，原因是抗菌剂分子掺入合成材料高分子结构中会影响高分子结构的稳定性从而降低其力学强度，而表面增加抗感染成分一则吸附抗生素量的少，使用后有效作用持续时间短，二则抗生素均有一定的耐药菌群并且局部应用更易发生过敏反应、也更易产生耐药菌，此外涂层抗菌剂会大大增加纤维直径、限制材料编织结构。

生物衍生材料主要成分(约90％)是胶原(主要为I型和III型胶原纤维)，其余部分有糖蛋白、粘蛋白和氨基葡聚糖(透明质酸、硫酸软骨素A、皮肤素、肝素和硫酸肝素)等糖类和一些脂质，无抗原作用，具有良好的组织相容性、可降解性和降解速率可控性；含有丰富的细胞生长因子，包括成纤维细胞生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子等，易于细胞粘附并促进组织再生。其制备方法是将组织经物理和化学工艺处理去除组织中的可溶性蛋白和细胞成分，保留完整细胞外基质的三维框架结构。动物实验和临床应用均证实生物材料除了拥有与合成材料一样的低疝复发率、更低的并发症率，此外还天然具有一定的抗微生物活性。因此，生物衍生材料代表着修复材料的发展方向。

生物衍生材料目前在国内作为修复材料应用还不多，原因包括：①抗感染性仍有待提高，生物衍生材料虽是迄今对创伤等伴有污染或感染组织缺损修复疗效最佳的材料，但抗感染性仍无法令人满意，如国外研究显示生物衍生材料应用于修复污染或感染的体壁缺损时失败率仍＞50％；②因生物衍生材料取材自人或动物机体组织，其机械力学性能和组织相容性受到多因素影响，包括具体的脱细胞方法、源材的品系、年龄、部位(如利用猪小肠制备生物材料包括空肠、回肠)等，故不同批次间产品性能差异较大(如厚度、力学参数和组织相容性等)，有必要提高标准。

目前，关于具有高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料及制备尚未见相关文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料及制备和应用，该医用生物衍生材料具有可直接接触腹腔，长效抗感染，高组织相容性，促细胞增殖能力强，能用于污染或感染伤口等优点，器官修复治疗中具有良好的应用前景。

本发明的一种高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料，其组分包括：脱细胞基质和包含无机抗菌剂的可吸收抗感染纳米微粒，其中，可吸收抗感染纳米微粒中无机抗菌剂载药量10～30％，脱细胞基质中植入可吸收抗感染纳米微粒量，根据无机抗菌剂含量计算范围为100～1000μg/cm³。

所述的脱细胞基质选自羊膜、猪小肠粘膜下层、人脱细胞真皮、猪牛心包、牛腹膜中的一种构成的单层脱细胞基质或几种材料复合而成的多层脱细胞基质，交联或非交联制备的；

所述的可吸收无机抗菌剂纳米微粒是以可吸收医用高分子聚合物为载药基质，装载有无机抗菌剂的纳米微粒，纳米微粒的直径范围是10-500nm；

所述的可吸收医用高分子聚合物为聚乳酸、聚羟基乙酸或聚乳酸-聚乙醇酸共聚物等可生物降解、高组织相容性的医用高分子聚合物；

优选的载药基质为聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，其中PLA与PGA的质量比为9∶1；

所述的无机抗菌剂为三氯生、庆大霉素等；

所述的无机抗菌剂占生物衍生材料比例为100～1000μg/Gm³。

本发明的一种高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料的制备，包括：

(1)可吸收无机抗菌剂纳米微粒的制备

在溶有上述载药基质的有机溶液中，加入无机抗菌剂，采用超声复乳化-溶剂挥发法处理后，离心弃上清液，收集沉淀后蒸馏水冲洗，除掉游离的三氯生及聚乙烯醇后，冷冻干燥保存，制备得到可吸收无机抗菌剂纳米微粒；

(2)生物衍生材料的改性制备

采用Abraham法等方法制备脱细胞基质，并采用1mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC进行化学交联，实现对生物衍生材料的改性处理；

(3)自组装技术构建纳米改性生物衍生材料

将步骤(1)制备的可吸收无机抗菌剂纳米微粒加去离子水混匀制成工作液，将脱细胞基质平面浸入工作液中，工作液与脱细胞基质的体积比为100-120∶1，反应环境温度37℃，CO₂浓度5％，脱细胞基质翻面1次/30分钟，持续12h；然后取出脱细胞基质经真空冷冻干燥，γ射线照射消毒后，于-80℃保存，即可。

所述步骤(1)中的有机溶液使用的溶剂为二氯甲烷；

所述步骤(2)中的工作液中无机抗菌剂的浓度为10ppm-500ppm；

所述步骤(2)中的工作液与脱细胞基质的体积比为100-120∶1；

本发明的医用生物衍生材料可应用于临床上战创伤、腹腔间隙综合征临时关腹，伴有污染或感染危险因素的疝和体壁缺损的修复，肌腱重建或各种组织器官修复等领域。

本发明利用生物衍生材料的三维网状支架结构、胶原带有负电荷、抗感染微粒的纳米级大小、微粒带正电荷及微粒可填塞生物材料网孔等特点，实现了医用生物衍生材料的自组装制备。通过纳米级微粒化技术制备了包含有无机抗菌剂的可降解高分子聚合物(组织工程支架材料)纳米微粒，实现抗菌药物迅速达到有效浓度和持久缓慢释放，无机抗菌剂早期呈爆发式释放，之后缓慢持续释放，从而能够高效、广谱、长期抗感染；再将此纳米微粒通过自组装技术植入生物材料三维支架内，对生物衍生材料网孔的填塞进一步提高材料的促细胞增殖能力，从而提高了组织相容性。

本发明的设计原理如下：

1.生物衍生材料具有三维支架结构、一定的天然抗微生物活性、孔隙率高、可吸收等优点，是制备新型修复材料的合适载体。生物衍生材料超微结构为规则的三维网状支架结构，具有较大的孔隙率并且胶原成分粘滞性高；基于细胞可自行进入生物材料基质内，完全可以利用生物材料基质吸附纳米微粒(自组装技术)，依靠纳米微粒的抗感染力和高组织相容性来改性生物材料。修复腹壁缺损后生物材料快速的再血管化既利于抗感染纳米微粒接触血液、也易于吞噬细胞进入。

2.可降解生物纳米载药控释系统使制备具有长效抗感染能力和高组织相容性的生物衍生材料成为可能。(1)可降解生物纳米载药控释系统近10多年来被大量用作纳米载药控释颗粒的骨架材料，部分制剂已获FDA批准应用于临床。如聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，一种可生物降解性合成高分子材料，易于合成、质量稳定，具有生物惰性、生物可降解性、降解速度可调节性和良好的可塑性。PLGA纳米载药控释系统可在植入体内短期(≤2h)内“突释”药物，迅速达到有效浓度，并在几周或几个月时间内以一定速率持续释放药物、维持有效血液浓度，符合抗生素给药早期足量、长程的原则。此外，PLGA还可以改善生物材料的组织相容性，提高促细胞增殖能力；(2)无机抗菌剂具有高效、广谱、无耐药菌、安全无毒等优点，适合植入生物材料。如医学领域应用最广泛的三氯生，应用于人体已经超过30年，化学成分为2，4，4”-三氯-2羟基-二苯醚。作为强生抗菌薇乔缝线涂层的活性成分，三氯生的安全性已经被很好的评估和确认，临床实践证实其无毒、无刺激、无化学致热源性、组织反应轻，无致畸性、无致癌性；三氯生可有效抑制引起外科部位感染的常见致病菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)以及耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的生长。

有益效果

本发明的医用生物衍生材料具有可直接接触腹腔，长效抗感染，高组织相容性，促细胞增殖能力强，能用于污染或感染伤口等优点，无机抗菌纳米颗粒植入体内后在短期(≤2h)内突释药物，迅速达到有效浓度，使有效血液浓度维持续时间达到2周～3月甚至更长，在各种组织器官修复治疗中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是医用生物衍生材料-猪小肠粘膜下层改性前的扫描电镜图；

图2是我们制备的具有高组织相容性和长效抗感染能力的新型医用生物衍生材料的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.生物衍生材料组分：

载药基质：聚乳酸-聚乙醇酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA]；.

无机抗菌剂：三氯生(2，4，4”-三氯-2羟基-二苯醚)；

脱细胞基质：猪小肠粘膜下层；

其中，PLA与PGA的质量比为9∶1。

2.生物衍生材料的制备：

超声复乳化-溶剂挥发法制备粒径300nm的Triclosan-PLGA-NPs

三氯生加入PLGA二氯甲烷溶液，冰浴下探头式超声仪超声乳化制成悬液，加聚乙烯醇水溶液，超声乳化制成复乳液，通风、常压下用磁力搅拌器搅拌、挥发有机溶剂，23000r/min转速下离心20min，弃上清液，收集沉淀后蒸馏水冲洗，除掉游离的三氯生及聚乙烯醇后，冷冻干燥保存；

(2)Abraham方法制备猪小肠粘膜下层脱细胞基质，化学交联叠加

物理方法处理：小肠取自封闭饲养的猪，体重不轻于200kg。在运输过程中将小肠冰冻冷藏，在4h内完成清洁过程。用裹有纱布的刀柄去除小肠的浆膜层和肌层，其间持续用40℃水冲洗；

化学方法处理(室温下，材料与溶液体积的比例都保持在1∶100)：沿纵轴切开经物理方法处理的小肠，切成每段15cm长，①在含有乙二胺四乙酸(100mmol/L)和氢氧化钠(10mmol/L)的溶液(pH值为11～12)中浸泡16h；②用去离子水冲洗干净，置于含盐酸(1mmol/L)和氯化钠(1mmol/L)的溶液(pH值为0～1)中浸泡6～8h；③用去离子水冲洗后在氯化钠(1mmol/L)磷酸缓冲液(PBS)中浸泡16h；④用去离子水冲洗后在PBS溶液(pH值为7～7.4)中浸泡2h；⑤再用去离子水冲洗基质2h；⑥杀菌：将SIS在含0.1％过氧乙酸的20％乙醇溶液中浸泡8h，用含0.05％叠氮化钠的PBS溶液清洗2h，程序性降温到一80~C，冻干后用^y射线照射(1～3kGy)消毒。

化学交联：室温下，将上述制备的小肠粘膜下层置入已过滤灭菌的1mmol/l的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺[N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC]丙酮溶液进行化学交联反应6～8h，进一步降低材料的抗原性、增加对蛋白分解的抵抗性、并提高其机械强度；

(3)自组装技术植入于小肠粘膜下层SIS构建纳米改性生物衍生材料

将粒径300nm的Triclosan-PLGA-NPs粉剂加入去离子水混匀制成工作液，以高效液相色谱法测定其浓度，使浓度控制在10ppm-500ppm的范围内，小肠粘膜下层平面浸入工作液中，工作液/SIS两者体积比为100-120∶1，温度37℃，CO₂浓度5％，SIS翻面1次/30分钟，持续12h；

取出SIS真空冷冻干燥，γ射线照射消毒，剂量250～350Gy，储存于-80℃，即得。

3.材料性能检测

(1)Triclosan-PLGA-NPs性能数据测定

a.观察Triclosan-PLGA-NPs表征

采用光子相关光谱仪、BI-9000AT相关器、BI200SM光度计、Innova304氩离子激光器行激光光散射实验测定Triclosan-PLGA-NPs的粒径及分布；

b.扫描电镜观察纳米粒子表面形态，透射电镜观察纳米粒子结构

c.测定平均载药量、抽提率及包封率

Triclosan母液按比例倍比稀释，于波长277nm处用紫外分光光度计分别测定吸光度值得标准曲线，计算Triclosan-PLGA-NPs中三氯生量、抽提率及包封率；

包封率计算方法为：

包封率＝1-m₁/m₀×100％，

m1(mg)：上清液以及洗涤液中三氯生量；

m0(mg)：制备时加入三氯生总量；

d.检测药物体外释放释放曲线

采用双室扩散池/高效液相色谱法，观察达到三氯生有效浓度时间和维持有效浓度时间；

(1)观察材料超微结构，检测力学性能、体外抗菌能力

扫描/透射电镜观察材料超微结构，双轴力学测量仪测定抗张强度和弹性系数，体外抗菌试验标准菌株选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、厌氧菌；

(2)检测SIS植入Triclosan-PLGA-NPs前后通透性变化

尿素渗透法：容箱1和2间以SIS间隔，在容箱1中加入尿素浓度550mM的PBS液，容箱2中加入单纯PBS液再定时取样测定其中尿素浓度，根据公式计算出材料的通透性；

(3)检测SIS植入Triclosan-PLGA-NPs前后组织相容性变化

促内皮细胞增殖试验：材料表面种植血管内皮细胞，通过定量PCR测定细胞总DNA含量来确定细胞增殖情况，绘制曲线，比较SIS植入Triclosan-PLGA-NPs前后促进细胞生长能力变化以及材料间差异度的大小。

(4)检测材料中三氯生含量

采用胶原酶完全降解生物材料后，采用原位衍生分散液相微萃取-气相色谱/质谱测定。

Claims (3)

1.一种高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料的制备，所述生物衍生材料其组分包括：脱细胞基质和包含抗菌剂的可吸收抗感染纳米微粒，其中，可吸收抗感染纳米微粒中抗菌剂载药量10～30％，脱细胞基质中植入可吸收抗感染纳米微粒量，根据抗菌剂含量计算范围为100～1000μg/cm³；具体步骤包括：

（1）可吸收抗菌剂纳米微粒的制备

在溶有载药基质的有机溶液中，加入抗菌剂，所述抗菌剂为三氯生，采用超声复乳化-溶剂挥发法处理后，离心弃上清液，收集沉淀后蒸馏水冲洗，除掉游离的三氯生及聚乙烯醇后，冷冻干燥保存，制备得到可吸收抗菌剂纳米微粒；

（2）生物衍生材料的改性制备

采用Abraham法制备脱细胞基质，并采用1mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC进行化学交联，实现对生物衍生材料的改性处理；

（3）自组装技术构建纳米改性生物衍生材料

将步骤（1）制备的可吸收抗菌剂纳米微粒加去离子水混匀制成工作液，将脱细胞基质平面浸入工作液中，工作液与脱细胞基质的体积比为100-120：1，反应环境温度37℃，CO₂浓度5％，脱细胞基质翻面1次/30分钟，持续12h；然后取出脱细胞基质经真空冷冻干燥，γ射线照射消毒后，于-80℃保存，即可。

2.根据权利要求1所述的一种高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料的制备，其特征在于：所述步骤（1）中的有机溶液使用的溶剂为二氯甲烷。

3.根据权利要求1所述的一种高组织相容性、长效抗感染的生物衍生材料的制备，其特征在于：所述步骤（2）中的工作液中，抗菌剂的浓度为10ppm-500ppm，工作液与脱细胞基质的体积比为100-120：1。

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