CN105510106B - 一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法 - Google Patents
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Abstract
一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法，本发明属于腔肠动物组织切片制备技术领域，它的步骤包括取样处理、第一次固定、足囊穿刺、第二次固定、足囊收集、超声清洗、琼脂凝集及第三次固定。本发明在保证组织形态完整的前提下，使海蜇足囊彻底固定，该方法实用性强，操作简单，足囊固定效果好，更利于海蜇足囊的石蜡切片制作等后续研究的开展。
Description
技术领域
本发明属于腔肠动物组织切片制备技术领域，具体的涉及一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法。
背景技术
海蜇是我国沿海特有的大型可食用水母，也是我国水产养殖业中重要的养殖品种之一，其生殖生物学研究一直受到相关科研人员的重视。足囊是海蜇无性繁殖关键生活史阶段，可抵御低氧、饵料匮乏等恶劣环境，并能防止敌害生物捕食及有害微生物侵染，对保持海蜇自然资源和实现人工繁育具有重要意义。
石蜡切片技术广泛应用于组织形态的观察,在海蜇足囊研究方面具有重要意义。海蜇足囊紧紧附着在附着基表面(人工繁育附着基为聚乙烯波纹板)，在制作海蜇足囊石蜡切片的实验研究过程中，若直接用镊子、解剖针等取样，会直接破坏足囊组织结构，导致切片制作成功率在5％以下；足囊周围包裹一层几丁质外膜，通透性差，不能直接用固定液固定；足囊体积极小(直径200-500μm，厚度20-50μm)，采用传统蜡块制备方法，足囊分散于蜡块中，在海蜇足囊组织切片时，难以对足囊位置进行固定。
发明内容
本发明的目的是针对海蜇足囊石蜡切片固定过程中存在的技术问题，提供一种适用于海蜇足囊组织结构特点的固定方法。
本发明要解决的技术问题是克服海蜇足囊难以与附着基剥离、不易固定、体积小操作不方便的缺陷，提供一种海蜇足囊石蜡切片的前期处理方法，既能实现足囊的完整固定，又能对足囊位置进行定位。
为了达到上述目的，本发明是通过采用如下技术方案实现的：
一种海蜇足囊石蜡切片的前期处理方法，包括如下步骤：
1、取样处理：用海水冲洗带有海蜇足囊的聚乙烯波纹板，选择足囊较多的部位，将带有足囊的波纹板剪成长、宽为1-3cm的小片。
2、第一次固定：将上述步骤1中带有足囊的波纹板放置于50ml的离心管中，加入Bouin氏固定液固定30-60min。
3、足囊穿刺：将上述步骤2固定后的足囊用磷酸缓冲液轻轻清洗3-5次，放置于体视镜下，用细针从足囊侧面，斜向下将一侧几丁质外膜刺穿。
4、第二次固定：将上述步骤3处理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定1-2h。
5、足囊收集：将上述步骤4处理的足囊用磷酸缓冲液清洗2-3次后，放置于体视镜下，用解剖针将波纹板上的足囊小心的铲下，收集。
6、超声清洗：将上述步骤5收集的足囊置于超声管中，清洗1-3min，之后用磷酸缓冲液清洗3-5次。
7、琼脂凝集：将上述步骤6清洗的足囊收集到1.5ml离心管中，弃去上清，加入50-150μl冷却至35-40℃的1.5％低熔点琼脂，混匀静置5-10min，冷凝后去除多余琼脂。
8、第三次固定：将包含有足囊的琼脂块转入Bouin氏固定液中固定10-20h，后续操作与常规石蜡切片相同。
本发明的有益效果：本发明首次提供了一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法，通过样品处理、足囊穿刺、多次固定、超声清洗及琼脂凝集等步骤，在保证组织形态完整的前提下，使足囊彻底固定，该方法实用性强，操作简单，足囊固定效果好，更利于海蜇足囊的石蜡切片制作等后续研究的开展。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但是这些实例并不限制本发明的范围。此外相关领域的普通技术人员对本发明做的任何改动，只要不脱离本发明的实质，都将等价落在本发明权利要求书所限定的范围内。
实施例1
1、取样处理：用海水冲洗带有海蜇足囊的聚乙烯波纹板，选择足囊较多的部位，将带有足囊的波纹板剪成长、宽为1.5cm的小片。
2、第一次固定：将上述步骤1中带有足囊的波纹板放置于50ml的离心管中，加入Bouin氏固定液固定60min。
3、足囊穿刺：将上述步骤2固定后的足囊用磷酸缓冲液轻轻清洗5次，放置于体视镜下，用细针从足囊侧面，斜向下将一侧几丁质外膜刺穿。
4、第二次固定：将上述步骤3处理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定1h。
5、足囊收集：将上述步骤4处理的足囊用磷酸缓冲液清洗2次后，放置于体视镜下，用解剖针将波纹板上的足囊小心的铲下，收集。
6、超声清洗：将上述步骤5收集的足囊置于超声管中，清洗3min，之后用磷酸缓冲液清洗5次。
7、琼脂凝集：将上述步骤6清洗的足囊收集到1.5ml离心管中，弃去上清，加入100μl冷却至35-40℃的1.5％低熔点琼脂，混匀静置8min，冷凝后去除多余琼脂。
8、第三次固定：将包含有足囊的琼脂块转入Bouin氏固定液中固定10h。
实施例2
1、取样处理：用海水冲洗带有海蜇足囊的聚乙烯波纹板，选择足囊较多的部位，将带有足囊的波纹板剪成长、宽为1cm的小片。
2、第一次固定：将上述步骤1中带有足囊的波纹板放置于50ml的离心管中，加入Bouin氏固定液固定30min。
3、足囊穿刺：将上述步骤2固定后的足囊用磷酸缓冲液轻轻清洗3次，放置于体视镜下，用细针从足囊侧面，斜向下将一侧几丁质外膜刺穿。
4、第二次固定：将上述步骤3处理的足囊再次放入Bouin氏固定液中固定2h。
5、足囊收集：将上述步骤4处理的足囊用磷酸缓冲液清洗3次后，放置于体视镜下，用解剖针将波纹板上的足囊小心的铲下，收集。
6、超声清洗：将上述步骤5收集的足囊置于超声管中，清洗1min，之后用磷酸缓冲液清洗3次。
7、琼脂凝集：将上述步骤6清洗的足囊收集到1.5ml离心管中，弃去上清，加入150μl冷却至35-40℃的1.5％低熔点琼脂，混匀静置10min，冷凝后去除多余琼脂。
8、第三次固定：将包含有足囊的琼脂块转入Bouin氏固定液中固定20h。
Claims (1)
1.一种海蜇足囊石蜡切片前期处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、取样处理：将带有足囊的波纹板清洗后，剪成长、宽为1-3cm的小片；
b、第一次固定：带有足囊的波纹板小片经Bouin氏固定液固定30min-60min；
c、足囊穿刺：固定后的足囊用磷酸缓冲液清洗3-5次，用细针从足囊侧面，斜向下将一侧几丁质外膜刺穿；
d、第二次固定：将上述步骤处理的足囊由Bouin氏固定液固定1-2h；
e、足囊收集：将上述步骤处理的足囊用磷酸缓冲液清洗2-3次后，用解剖针将波纹板上的足囊小心的铲下，收集；
f、超声清洗：将上述步骤收集的足囊置于超声管中，清洗1-3min，之后用磷酸缓冲液清洗3-5次；
g、琼脂凝集：将上述步骤清洗的足囊收集到1.5ml离心管中，弃去上清，加入50-150μl冷却至35-40℃的1.5％低熔点琼脂，混匀静置5-10min，冷凝后去除多余琼脂；
h、第三次固定：将包含有足囊的琼脂块转入Bouin氏固定液中固定10-20h，后续操作与常规石蜡切片相同。
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