CN109141959A - 一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，采用延长锇酸固定时间和梯度渗透法达到切片完整，没有碎裂，透射电镜下观察结构清晰，细胞器结构完整，用于马铃薯块茎超微结构的研究。其步骤包括：（1）样品采集与固定；（2）漂洗；（3）后固定；（4）漂洗；（5）脱水；（6）浸透；（7）包埋；（8）聚合；（9）超薄切片；（10）双重染色。本发明提高了马铃薯块茎细胞超微结构的保存效果；提高了块茎样品的渗透效果；本发明中块茎样品的纯包埋剂浸透过程是放置在干燥器中进行的，可以使丙酮被彻底挥发掉，增加了树脂的切割性能，避免了由于树脂受潮发软而导致切片上出现波浪型条纹。
Description
技术领域
本发明涉及超薄切片制作技术领域，具体地说是一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法。
背景技术
马铃薯（Solanum tuberosum L.）块茎既是无性繁殖器官，又是营养储藏器官。马铃薯块茎形成和发育的形态结构变化不仅是其生物学特性的重要内容，也对块茎产量和品质性状的形成具有重要影响。目前，运用透射电镜是观察生物超微结构最常用的方法，其中透射电镜超薄切片样品的制备是生物超微结构研究的关键，但是从取材到染色涉及多个步骤，任何环节出现问题都会影响到样品制备质量甚至导致样品制备失败。拥有一套最佳的关于马铃薯块茎的透射电镜样品制备方法，可以为块茎形成和发育的形态学研究提供技术支撑和理论依据，对马铃薯生产中产量和品质形成管理和控制具有重要意义。
现有技术存在的问题：有关马铃薯块茎形态学方面的研究，前人所用方法基本停留在光镜水平，偶有涉及透射电镜，也只是对所用方法大概的描述，步骤较为繁琐且效果不理想。作为植物材料，马铃薯块茎细胞含有细胞壁，富含淀粉，组织坚硬，包埋剂不易渗透，很难制备出高分辨的透射电镜样品，往往导致切片易破碎、细胞结构模糊或细胞器丢失等现象，从而限制了透射电镜在马铃薯研究中的应用。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，采用延长锇酸固定时间和梯度渗透法达到切片完整，没有碎裂，透射电镜下观察结构清晰，细胞器结构完整，用于马铃薯块茎超微结构的研究。
为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片的制作方法。以解决切片完整，没有碎裂，透射电镜下观察结构清晰，细胞器结构完整，用于马铃薯块茎超微结构的研究。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片的制作方法，其主要特点在于包括以下步骤：
（1）样品采集与固定：用双面刀片切取马铃薯块茎上待研究部位处1 mm3大小的电镜样品，将其迅速放入2.5%戊二醛固定液中，置于4℃，固定24-48 h。
（2）漂洗：将步骤（1）固定好的块茎样品用0.2 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min。
（3）后固定：将步骤（2）漂洗好的块茎样品放入1%锇酸中进行后固定，置于4℃，固定5 h。
（4）漂洗：将步骤（3）1%锇酸固定后的样品，用0.2 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。
（5）脱水：先用50%、70%、80%、90%和100%乙醇进行逐级脱水，每次15 min；再用纯丙酮脱水2次，每次15 min。
（6）浸透：用包埋剂和纯丙酮混合液（1:3）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（2:3）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（1:1）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（3:2）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（3:1）室温浸透1 h，然后用纯包埋剂室温浸透过夜，纯包埋剂的浸透放置在干燥器中进行。
所使用包埋剂的配方：包埋剂总体积为30 mL，其中NMA（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）7.05 mL，SPI-PON 812（环氧树脂812）13.68 mL， DDSA（十二烷基琥珀酸酐）9.22mL，DMP-30（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚）0.45 mL。
（7）包埋：用牙签将步骤（6）浸透好的块茎样品根据切向挑入包埋板样品槽中的合适位置，然后用装有纯包埋剂且去除针头的注射器向样品槽中加满纯包埋剂。
（8）聚合：将步骤（7）包埋有块茎样品的包埋板放入烘箱中进行聚合，35℃聚合12h，45℃聚合12 h，68℃聚合48 h。
（9）超薄切片：用LEICA EM UC6超薄切片机进行切片，切片厚度为50-70 nm。
（10）双重染色：先用5%醋酸铀-乙醇溶液染色30 min，再用铅液染色8 min。
所使用5%醋酸铀-乙醇溶液的配方：将5 g醋酸铀溶解于100 mL70%乙醇溶液中。
所使用铅液的配方：硝酸铅1 g；醋酸铅 0.5 g；枸橼酸钠 1.75 g；1 M NaOH溶液9mL；双蒸水定容至20 mL。
有益效果：
（1）本发明通过延长锇酸固定时间（锇酸固定5 h），提高了马铃薯块茎细胞超微结构的保存效果。
（2）本发明通过采用梯度渗透法，提高了块茎样品的渗透效果，与常规梯度渗透法相比，本申请的梯度比例以及每个梯度的处理时间都是针对马铃薯块茎材料做了调整，仅适用于马铃薯块茎，提高了块茎样品的渗透效果。
（3）本发明中块茎样品的纯包埋剂浸透过程是放置在干燥器中进行的，可以使丙酮被彻底挥发掉，增加了树脂的切割性能，避免了由于树脂受潮发软而导致切片上出现波浪型条纹。
（4）关于包埋剂配方中四种试剂的比例，发明人通过大量实验最终发现总体积为30 mL，其中NMA（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）7.05 mL，SPI-PON 812（环氧树脂812）13.68 mL，DDSA（十二烷基琥珀酸酐）9.22 mL，DMP-30（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚）0.45mL时，对马铃薯块茎包埋效果最好。
附图说明
图1是本发明一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法流程示意图。
图2是本发明一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法中马铃薯块茎超微结构图（×6000）。
图3是本发明一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法中马铃薯块茎超微结构图（×8000）。
图4是本发明一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法中马铃薯块茎超微结构图（×20000）。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供了一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其包括如下步骤：
（1）样品采集与固定：用双面刀片切取马铃薯块茎上待研究部位处1 mm3大小的电镜样品，将其迅速放入2.5%戊二醛固定液中，置于4℃，固定24-48 h。
（2）漂洗：将步骤（1）固定好的块茎样品用0.2 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min。
（3）后固定：将步骤（2）漂洗好的块茎样品放入1%锇酸中进行后固定，置于4℃，固定5 h。
（4）漂洗：将步骤（3）1%锇酸固定后的样品，用0.2 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。
（5）脱水：先用50%、70%、80%、90%和100%乙醇进行逐级脱水，每次15 min；再用纯丙酮脱水2次，每次15 min。
（6）浸透：用包埋剂和纯丙酮混合液（1:3）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（2:3）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（1:1）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（3:2）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（3:1）室温浸透1 h，然后用纯包埋剂室温浸透过夜，纯包埋剂的浸透放置在干燥器中进行。
所使用包埋剂的配方：包埋剂总体积为30 mL，其中NMA（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）7.05 mL，SPI-PON 812（环氧树脂812）13.68 mL， DDSA（十二烷基琥珀酸酐）9.22mL，DMP-30（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚）0.45 mL。
（7）包埋：用牙签将步骤（6）浸透好的块茎样品根据切向挑入包埋板样品槽中的合适位置，然后用装有纯包埋剂且去除针头的注射器向样品槽中加满纯包埋剂。
（8）聚合：将步骤（7）包埋有块茎样品的包埋板放入烘箱中进行聚合，35℃聚合12h，45℃聚合12 h，68℃聚合48 h。
（9）超薄切片：用LEICA EM UC6超薄切片机进行切片，切片厚度为50-70 nm。
（10）双重染色：先用5%醋酸铀-乙醇溶液染色30 min，再用铅液染色8 min。
所使用5%醋酸铀-乙醇溶液的配方：将5 g醋酸铀溶解于100 mL70%乙醇溶液中。
所使用铅液的配方：硝酸铅1 g；醋酸铅 0.5 g；枸橼酸钠 1.75 g；1 M NaOH溶液9mL；双蒸水定容至20 mL。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）样品采集与固定；（2）漂洗；（3）后固定；（4）漂洗；（5）脱水；（6）浸透；（7）包埋；（8）聚合；（9）超薄切片；（10）双重染色。
2.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（1）样品采集与固定：用双面刀片切取马铃薯块茎上待研究部位处1 mm3大小的电镜样品，将其迅速放入2.5%戊二醛固定液中，置于4℃，固定24-48 h。
3.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（2）漂洗：将步骤（1）固定好的块茎样品用0.2 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。
4.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（3）后固定：将步骤（2）漂洗好的块茎样品放入1%锇酸中进行后固定，置于4℃，固定5 h。
5.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（4）漂洗：将步骤（3）1%锇酸固定后的样品，用0.2 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min。
6.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（5）脱水：先用50%、70%、80%、90%和100%乙醇进行逐级脱水，每次15 min；再用纯丙酮脱水2次，每次15 min。
7.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（6）浸透：用包埋剂和纯丙酮混合液（1:3）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（2:3）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（1:1）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（3:2）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（3:1）室温浸透1 h，然后用纯包埋剂室温浸透过夜，纯包埋剂的浸透放置在干燥器中进行；所使用包埋剂的配方：包埋剂总体积为30mL，其中NMA（甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐）7.05 mL，SPI-PON 812（环氧树脂812）13.68mL， DDSA（十二烷基琥珀酸酐）9.22 mL，DMP-30（2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚）0.45 mL。
8.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（7）包埋：用牙签将步骤（6）浸透好的块茎样品根据切向挑入包埋板样品槽中的合适位置，然后用装有纯包埋剂且去除针头的注射器向样品槽中加满纯包埋剂。
9.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（9）超薄切片：用LEICA EM UC6超薄切片机进行切片，切片厚度为50-70 nm。
10.根据权利要求1所述的一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，其特征在于，所述（10）双重染色：先用5%醋酸铀-乙醇溶液染色30 min，再用铅液染色8 min；所使用5%醋酸铀-乙醇溶液的配方：将5 g醋酸铀溶解于100 mL70%乙醇溶液中；所使用铅液的配方：硝酸铅1 g；醋酸铅 0.5 g；枸橼酸钠 1.75 g；1 M NaOH溶液9 mL；双蒸水定容至20mL。
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