CN112913833B - 一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞程序降温方法，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法。一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。细胞冻存复苏后，活性更高，其存活率为95％以上。

Description

一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法
技术领域
本发明涉及一种细胞程序降温方法，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，它能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞，因此已成为细胞治疗的重要候选种子细胞。
由于干细胞治疗的应用越来越多，人脐带间充质干细胞作为间充质干细胞的一种，其是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。目前对研究主要在人脐带间充质干细胞的液氮保存，人脐带间充质干细胞主要采用非程控温冷冻法和程序降温冷冻法，非程控温冷冻法是直接将人脐带间充质干细胞冷冻鱼-196℃的液氮下，这种方法保存的最大缺点在于，冷冻过程中有大量冰晶产生，影响复苏后细胞的存活率；而程序降温冷冻法存在冷冻时间过长、冻存液不选择与程序接不相匹配，也会在一定程度上影响细胞复苏后的存活率。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：
(1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；
(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；
(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。
作为本发明一种优选的技术方案，所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：(1.2～1.3)。
作为本发明一种优选的技术方案，所述DMSO占冷存液体积的9～11％。
作为本发明一种优选的技术方案，所述人血白蛋白的浓度为10～20％。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤(1)的预冷温度为2～8℃；预冷温度时间至少30min。
作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在2～8℃低温运输，运输时间控制在15min内。
作为本发明一种优选的技术方案，所述细胞加入细胞悬浮液的细胞密度为8×106/ml～1.2×107/ml。
作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存管中细胞悬液的灌装量为3～4mL。
作为本发明一种优选的技术方案，所述程序降温所用的时间为50～54min。
作为本发明一种优选的技术方案，所述程序降温的步骤包括：
第一步，4℃等待2～3min；
第二步，以1℃/min的速度降温至-8℃；
第三步，以25℃/min的速度降温至-48℃；
第四步，以10℃/min的速度升温至-18℃；
第五步，以1℃/min的速度降温至-48℃；
第六步，以10℃/min的速度降温至-90℃。
有益效果：
1.建立了人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，经过本发明的程序降温步骤后，细胞可以比较好的冻存在液氮中；
2.本发明程序降温的时间小于54min，缩短了程序降温的周期，减小了细胞的损伤，从而提高了冻存后细胞的存活率；
3.在本发明的冻存液中选择了合适浓度的DMSO和人血白蛋白结合程序降温后，复苏后的细胞具有较好的细胞活力和存活率；
4.当细胞悬浮液的细胞密度一定时，结合冻存液和程序降温选择了合适的细胞悬液的灌装量，使得冻存液能够很好的对细胞进行保护；
5.细胞冻存复苏后，活性更高，其存活率为95％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图中：图1指的是实施例1中A2与A3的生长曲线图。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
本发明的第一个方面提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：
(1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；
(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；
(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。
在一种实施方式中，所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：(1.2～1.3)。
在一种优选的实施方式中，所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：1.25。
在一种实施方式中，所述DMSO采购于WAK-Chemie。
在一种实施方式中，所述DMSO占冷存液体积的9～11％。
在一种优选的实施方式中，所述DMSO占冷存液体积的10％。
冷存液中添加DMSO可以防止细胞解冻过程中可以防止细胞在降温冻存和细胞复苏解冻过程中出现冰晶等物理损伤，但DMSO不但具有皮肤渗透性和毒性，对操作者的健康造成危害，而且在本体系的降温程序和冻存液的影响下含量过多的DMSO在冷存液体积大于11％时，其冻存后细胞浓度并没有DMSO在冷存液体积小于11％时的高，申请人猜测，一方面这可能与本发明中的降温程序有关，另一方面可能是因为浓度较大的DMSO会抑制细胞的生长。
在一种实施方式中，所述DMSO指的二甲基亚砜，其具有高剂性、高沸点、热稳定性好的特点。
在一种实施方式中，所述间充质干细胞无血清基础培养基为MSC
Figure BDA0002924977290000051
XFBasal Medium，其无血清、不含异源动物成分、不含抗生素，为BI品牌。
在一种实施方式中，所述人血白蛋白的浓度为10～20％。
在一种优选的实施方式中，所述人血白蛋白的浓度为20％。
在一种实施方式中，所述人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司。
在一种实施方式中，所述人血白蛋白的浓度指的是体积浓度。
申请人发现当冷存液中配方的人血白蛋白的浓度为10～20％，特别是20％时，高浓度的人血白蛋白更有利于本发明体系中的细胞复苏。但是如果当浓度过高，在本发明中也会影响细胞复苏后的活力和存活率。可能是因为人血白蛋白的浓度还会在一定程度上影响细胞冻存和复苏时的渗透性。
在一种实施方式中，所述步骤(1)的预冷温度为2～8℃；预冷温度时间至少30min，比如说30min、35min、40min等。
在一种实施方式中，所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在2～8℃低温运输，运输时间控制在15min内。
在一种实施方式中，所述脐带间充质干细胞来源于P2代细胞的复苏培养。
在一种实施方式中，所述细胞加入细胞悬浮液的细胞密度为8×106/ml～1.2×107/ml。
在一种优选的实施方式中，所述细胞悬浮液的细胞密度为1×107/ml。
在一种实施方式中，所述冻存管的体积根据细胞悬液的灌装量来选择，能装下细胞悬液的体积即可。
在一种实施方式中，所述冻存管中细胞悬液的灌装量为3～4mL。
在一种优选的实施方式中，所述冻存管中细胞悬液的灌装量为3mL。
申请人发现，在本发明中，在冻存密度一定时，灌装量为3～4mL/管，尤其是灌装量为3mL/管时的细胞的存活率和细胞个数浓度同时达到最佳。可能是因为，可能是因为灌装量太多，冷冻液不能够很好的对其作用，而当灌装量太少，冷冻液中的DMSO对每毫升细胞的作用力就更强，可能会影响其复苏的效果。
在一种实施方式中，程序降温仪可以同时放置大于等于1个冷存管，比如说2个、3个、4个、5个、6个、7个等。
在一种实施方式中，所述程序降温所用的时间为50～54min。
在一种实施方式中，所述程序降温的步骤包括：
第一步，4℃等待2～3min；
第二步，以1℃/min的速度降温至-8℃；
第三步，以25℃/min的速度降温至-48℃；
第四步，以10℃/min的速度升温至-18℃；
第五步，以1℃/min的速度降温至-48℃；
第六步，以10℃/min的速度降温至-90℃。
申请人发现，在本发明体系中，第五步的降温速率对细胞复苏后的增值和存活率效果尤为重要，在与冻存液的相互作用下，降温速率为1℃/min时效果较佳。可能是因为，当降温速率低于1℃/min，可能因为降温速率过慢存在一定的溶液效应，而当降温速率高于1℃/min，可能导致了细胞内有轻微的结冰现象。
为了验证经过程序降温后细胞的活力和存活力，对细胞冻存前和冻存后的细胞数和存活率进行了测试。
在一种实施方式中，冻存前：分别在最后一次离心前、在加入入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
在一种实施方式中，冻存后：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液上Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
在一种实施方式中，冻存后：取复苏后的样本0.4×106个细胞，以6000个/cm2接种于培养板中，接种7孔，每孔加3ml完全培养基，培养7天，每隔24h消化1个孔取样计数，最后以培养时间为横坐标、细胞数为纵坐标绘制生长曲线。
在一种实施方式中，根据细胞生长曲线，取对数期线性部分的3～4个点计算。Td＝T×lg2/lg(Nt/N0)。Td：倍增时间(h)；T：细胞数由N0增至Nt所用时间(h)；Nt为对数生长期任一点的细胞数观察值，N0对数生长期细胞数初始值。
在一种实施方式中，所述细胞复苏的操作步骤为：取冻存后的第3天复苏细胞。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。
在一种实施方式中，所述完全培养基配方为BI基础培养基+10v/v％Elite血替。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例
实施例1
本发明的实施例1具体提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：
(1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。
所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：2.5；
所述DMSO占冷存液体积的10％；
所述间充质干细胞无血清基础培养基为MSC
Figure BDA0002924977290000071
XF Basal Medium；
所述人血白蛋白的浓度为20％；
所述步骤(1)的预冷温度为5℃；预冷温度时间为40min；
所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在5℃低温运输，运输时间小于15min；
所述脐带间充质干细胞来源于P2代细胞的复苏培养；
所述细胞悬浮液的细胞密度为1×107/ml；
所述冻存管的体积为5.5ml；
所述程序降温所用的时间为52.8min；
所述程序降温的步骤包括：第一步，4℃等待2min；第二步，以1℃/min的速度降温至-8℃；第三步，以25℃/min的速度降温至-48℃；第四步，以10℃/min的速度升温至-18℃；第五步，以1℃/min的速度降温至-48℃；第六步，以10℃/min的速度降温至-90℃；
所述冻存管中细胞悬液的灌装量分别为2mL、3mL、4mL、5mL，分别即为A1、A2、A3、A4。
所述DMSO采购于WAK-Chemie；MSC
Figure BDA0002924977290000081
XF Basal Medium为BI品牌；人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司。
实施例2
本发明的实施例2具体提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：
(1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。
所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：2.5；
所述DMSO占冷存液体积的15％；
所述间充质干细胞无血清基础培养基为MSC
Figure BDA0002924977290000082
XF Basal Medium；
所述人血白蛋白的浓度为20％；
所述步骤(1)的预冷温度为5℃；预冷温度时间为40min；
所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在5℃低温运输，运输时间小于15min；
所述脐带间充质干细胞来源于P2代细胞的复苏培养；
所述细胞悬浮液的细胞密度为1×107/ml；
所述冻存管的体积为5.5ml；
所述程序降温所用的时间为52.8min；
所述程序降温的步骤包括：第一步，4℃等待2min；第二步，以1℃/min的速度降温至-8℃；第三步，以25℃/min的速度降温至-48℃；第四步，以10℃/min的速度升温至-18℃；第五步，以1℃/min的速度降温至-48℃；第六步，以10℃/min的速度降温至-90℃；
所述冻存管中细胞悬液的灌装量分别为3mL，记为B；
所述DMSO采购于WAK-Chemie；MSC
Figure BDA0002924977290000091
XF Basal Medium为BI品牌；人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司。
实施例3
本发明的实施例3具体提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：
(1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。
所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：2.5；
所述DMSO占冷存液体积的5％；
所述间充质干细胞无血清基础培养基为MSC
Figure BDA0002924977290000092
XF Basal Medium；
所述人血白蛋白的浓度为20％；
所述步骤(1)的预冷温度为5℃；预冷温度时间为40min；
所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在5℃低温运输，运输时间小于15min；
所述脐带间充质干细胞来源于P2代细胞的复苏培养；
所述细胞悬浮液的细胞密度为1×107/ml；
所述冻存管的体积为5.5ml；
所述程序降温所用的时间为52.8min；
所述程序降温的步骤包括：第一步，4℃等待2min；第二步，以1℃/min的速度降温至-8℃；第三步，以25℃/min的速度降温至-48℃；第四步，以10℃/min的速度升温至-18℃；第五步，以1℃/min的速度降温至-48℃；第六步，以10℃/min的速度降温至-90℃；
所述冻存管中细胞悬液的灌装量分别为3mL，记为C；
所述DMSO采购于WAK-Chemie；MSC
Figure BDA0002924977290000101
XF Basal Medium为BI品牌；人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司。
实施例4
本发明的实施例4具体提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：
(1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。
所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：2.5；
所述DMSO占冷存液体积的10％；
所述间充质干细胞无血清基础培养基为MSC
Figure BDA0002924977290000102
XF Basal Medium；
所述人血白蛋白的浓度为20％；
所述步骤(1)的预冷温度为5℃；预冷温度时间为40min；
所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在5℃低温运输，运输时间小于15min；
所述脐带间充质干细胞来源于P2代细胞的复苏培养；
所述细胞悬浮液的细胞密度为1×107/ml；
所述冻存管的体积为5.5ml；
所述程序降温所用的时间为42.8min；
所述程序降温的步骤包括：第一步，4℃等待2min；第二步，以1.5℃/min的速度降温至-8℃；第三步，以25℃/min的速度降温至-48℃；第四步，以10℃/min的速度升温至-18℃；第五步，以1.5℃/min的速度降温至-48℃；第六步，以10℃/min的速度降温至-90℃；
所述冻存管中细胞悬液的灌装量分别为3mL，记为D；
所述DMSO采购于WAK-Chemie；MSC
Figure BDA0002924977290000112
XF Basal Medium为BI品牌；人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司。
实施例5
本发明的实施例5具体提供了一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，步骤包括：
(1)冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；(2)脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；(3)程序降温完成后，转入液氮罐中保存。
所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：2.5；
所述DMSO占冷存液体积的10％；
所述间充质干细胞无血清基础培养基为MSC
Figure BDA0002924977290000111
XF Basal Medium；
所述人血白蛋白的浓度为20％；
所述步骤(1)的预冷温度为5℃；预冷温度时间为40min；
所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在5℃低温运输，运输时间小于15min；
所述脐带间充质干细胞来源于P2代细胞的复苏培养；
所述细胞悬浮液的细胞密度为1×107/ml；
所述冻存管的体积为5.5ml；
所述程序降温所用的时间为60.3min；
所述程序降温的步骤包括：第一步，4℃等待2min；第二步，以1.5℃/min的速度降温至-8℃；第三步，以25℃/min的速度降温至-48℃；第四步，以10℃/min的速度升温至-18℃；第五步，以0.8℃/min的速度降温至-48℃；第六步，以10℃/min的速度降温至-90℃；
所述冻存管中细胞悬液的灌装量分别为3mL，记为E；
所述DMSO采购于WAK-Chemie；MSC
Figure BDA0002924977290000121
XF Basal Medium为BI品牌；人血白蛋白采购于奥克特珐玛AB公司。
性能测试
1.按照本发明中的具体实施方式中的测试方法测试实施例1～5中细胞的存活率和细胞浓度，测试结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002924977290000122
2.按照本发明中的具体实施方式中的测试方法测试实施例1中A2和A3的生长曲线及倍增时间，其生长曲线如图1所示，不同时间点下的细胞数如表2所示。
表2
Figure BDA0002924977290000123
Figure BDA0002924977290000131
由表2可知，冻存后A1组细胞在24h～96h群体倍增时间为：15.54±0.32，B2组细胞在24h～96h群体倍增时间为：16.93±0.93；两组无显著性差异，并且两者无显著性差异。
由图1可知2组的生长曲线趋势相近，在24h前处于缓冲期，细胞增殖缓慢；24h～96h，细胞处于对数生长期；96h后逐步进入平台期，细胞增殖能力下降
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (1)

1.一种人脐带间充质干细胞工作细胞库的程序降温方法，其特征在于，步骤包括：
（1）冻存液配制：离心管中加入DMSO和间充质干细胞无血清基础培养基，摇晃混合均匀后加入人血白蛋白，摇晃混合均匀，预冷；
（2）脐带间充质干细胞的冻存：收集细胞于离心管中，计数，加入预冷的冻存液，重悬后，吸取细胞悬浮液于冻存管中，然后在程序降温仪中进行程序降温；
（3）程序降温完成后，转入液氮罐中保存；
所述间充质干细胞无血清基础培养基与人血白蛋白的体积比为1：2.5；
所述DMSO占冷存液体积的10%；
所述间充质干细胞无血清基础培养基为MSC NutriStem
Figure 846966DEST_PATH_IMAGE001
XF Basal Medium；
所述人血白蛋白的浓度为20%；
所述步骤（1）的预冷温度为5℃；预冷温度时间为40min；
所述冻存管在放入程序降温仪的运输过程中，冻存管在5℃低温运输，运输时间小于15min；
所述脐带间充质干细胞来源于P2代细胞的复苏培养；
所述细胞悬浮液的细胞密度为1×107/ml；
所述冻存管的体积为5.5ml；
所述程序降温所用的时间为52.8min；
所述程序降温的步骤包括：第一步，4℃等待2min；第二步，以1℃/min的速度降温至-8℃；第三步，以25℃/min的速度降温至-48℃；第四步，以10℃/min的速度升温至-18℃；第五步，以1℃/min的速度降温至-48℃；第六步，以10℃/min的速度降温至-90℃；
所述冻存管中细胞悬液的灌装量分别为3mL、4mL，分别即为A2、A3。
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