CN117642493A - 人类多能干细胞及其衍生产物的大规模建库方法 - Google Patents

人类多能干细胞及其衍生产物的大规模建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及建立细胞库的方法，其包括以下步骤：提供一批包含干细胞或干细胞衍生细胞和冷冻保存介质的细胞悬液，将该批细胞悬液维持在低于15℃的温度下，以及将该批细胞悬液中的一定量的细胞悬液转移到一个或多个储存容器中，其中建立所述细胞库花费至少30分钟。

Description

人类多能干细胞及其衍生产物的大规模建库方法
技术领域
本发明总体上涉及干细胞领域，如人类多能干细胞和干细胞衍生的细胞产物的领域。具体地，提供了从人类多能干细胞(hPSC)建立细胞库如未分化hPSC库和hPSC衍生的原料药和药物产品的方法。
背景技术
使用hPSC治疗各种病状的前景似乎非常光明。随着人们不断努力使基于活细胞的治疗更接近市场，考虑大规模制备和生产设置变得越来越重要。对于某些适应症，每次治疗估计需要108个细胞。基于干细胞的产品的生产通常以hPSC的分化为起点。细胞系可以来源于早期人类胚胎或通过诱导体细胞的多能性而获得。然后培养所得细胞系以供扩增并建立细胞库，其中将细胞冷冻保存以供储存，直到它们经历进一步扩增和/或分化成特定细胞类型产物。
多年来，hPSC的冷冻保存已经取得了显著的改进。基本的冷冻保存原理源自其他哺乳动物细胞类型，其中的程序依赖于冷冻保存介质中的化学物质，如二糖蔗糖、麦芽糖、海藻糖以及其他含有和不含DMSO的物质。
细胞死亡的主要原因不是低温下长期储存本身，而是细胞在玻璃化转变温度(Tg)上发生的事件。除了诸如毒性、细胞收缩、渗透压不平衡等其他已知原因外，已知冷冻过程中的细胞内结晶和加温时的重结晶对细胞造成的损害最大。为了对抗这些对细胞、尤其是对hPSC有害的事件，已经开发了不同的冷冻保存方法(玻璃化、缓慢冷却、快速解冻等)和冷冻保存介质。
对于治疗性细胞的生产，细胞的长期稳定性和允许生成大型细胞库的方法对于成功至关重要。因此，本发明的目的是改进当前用于建立具有高细胞活力的细胞库的方法，同时符合对治疗性药物产品的要求，包括良好细胞培养规范(GCCP)和现行良好生产规范(cGMP)，特别是解决由于准备和/或大规模建库而导致建立细胞库花费时间增多所引起的问题。
发明内容
如上概述的目的通过本发明的方面来实现。另外，本发明还可以解决其他问题，这从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出。
在本发明的第一方面，提供了建立细胞库的方法，其包括以下步骤：提供一批包含干细胞或干细胞衍生细胞和冷冻保存介质的细胞悬液，将该批细胞悬液维持在低于15℃的温度下，以及将该批细胞悬液中的一定量的细胞悬液转移到一个或多个储存容器中以建立细胞库，其中建立所述细胞库花费至少30分钟。本发明人已经认识到，通过用细胞填充许多储存容器如小瓶来建立大型细胞库需要延长的时间，在此期间细胞在冷冻保存介质中的活力显著降低。建立细胞库时同样如此，其中成批细胞悬液需要额外的准备时间。通过在建立细胞库的整个过程中将成批细胞悬液维持在低于15℃的温度下，每个小瓶的质量和细胞计数将得到提高。
在另一方面，提供了用于在制备细胞库期间冷却一批细胞悬液的冷却设备，其包括壳体，所述壳体包括外壁、适于接纳制冷剂的第一隔室和适于容纳装有该批细胞悬液的容器的第二隔室，其中所述第一隔室和第二隔室由导热元件分隔开，由此当将所述制冷剂装入所述第一隔室中并将装有该批细胞悬液的容器装入所述第二隔室中时，所述制冷剂能够冷却该批细胞悬液。本发明人设计了适合在建立细胞库时将一批细胞悬液维持在低于15℃的温度下的冷却设备，其中使用该冷却设备有利于遵守GCCP和cGMP的严格要求。该冷却设备被设计成在操作过程中不生成任何颗粒，因此该设备可在A级洁净室区域分类(或者ISO指定5)内进行操作，符合以下要求：EU GMP指南附件1：无菌药用产品的制造，和美国食品药品管理局(FDA)行业指南：通过现行良好生产规范无菌加工生产的无菌药物产品。
因此，本发明的另一方面涉及所述冷却设备用于从一批细胞悬液制备细胞库的用途，其包括将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃，优选0-12℃，更优选0-10℃，更优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。
在最后一方面，提供了冷却一批细胞悬液的方法，其包括以下步骤：提供如上所述的冷却设备，将制冷剂装入所述冷却设备的第一隔室中，其中所述制冷剂的温度适合将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃，将包含该批细胞悬液的瓶装入所述冷却设备的第二隔室中，以及将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃。
附图说明
图1显示了带有分隔第一隔室和第二隔室的温度传导元件的冷却设备的壳体。
图2显示了带有分隔第一隔室和第二隔室的导热元件的冷却设备的俯视图。
图3示出了部分拆解的冷却设备，其带有盖、导热元件和壳体，该壳体安装有一个导热元件来分隔第一隔室和第二隔室。
图4显示了相对于在室温下暴露于冷冻保存介质(特别是STEM-CELLBANKER)的不同暴露时间，通过台盼蓝排除法(Tryphan blue exclusion method)测定的hESC活力。
图5显示了当细胞悬液维持在约4℃时，随着暴露于冷冻保存介质(特别是STEM-CELLBANKER)的暴露时间增加，通过台盼蓝排除法测定的hESC活力的实验。
图6显示了冷却设备中容器内的介质的温度测量曲线。
图7显示了在室温和大约4摄氏度下，对于冷冻保存介质(如StemcellBanker)的不同保持时间，通过NC-202测量的hESC衍生的β样细胞的存活率％。室温下的平均存活率％从82％降至66％，而与之相比，4℃下(5min至240min)从89％降至85％。每个时间点由3名不同的操作者解冻6-8个小瓶。进行双向ANOVA Sidak多重比较检验以比较RT与4℃。
图8显示了比较表达NKX6.1和Islet-1标志物的细胞的百分比的流式细胞术点图。49.5％共表达这两种标志物，指示β细胞。
图9显示了在室温和大约4摄氏度下，对于冷冻保存介质(如StemcellBanker)的不同保持时间，通过NC-202测量的hESC衍生的RPE细胞的存活率％。室温下的存活率％从95％降至81％，而与之相比，4℃下(0min至240min)从95％降至89％。每个时间点由3名不同的操作者解冻8-10个小瓶。进行双向ANOVA Sidak多重比较检验以比较RT与4℃。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本发明的实践中采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。
需要注意的是，本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。
除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。
一般定义
在整个本申请中，当涉及细胞分化过程时，术语“方法”和“方案”可互换使用。如本文所用的，“一个”或“一种”或“该”可表示一个或多于一个。除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。如本文所用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时，指缺少组合。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。
在下文中，通过非限制性实施方案和实例更详细地描述了本发明的方法。提供了用于建立大型干细胞库的方法。因此，该方法补偿(offset)干细胞的使用。
“干细胞”应被理解为具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新能力)但保持分化潜能的细胞。根据分化潜能，干细胞包括诸如多能干细胞、专能(multipotent)干细胞、单能干细胞等亚群。如本文所用的，术语“多能干细胞”(PSC)是指能够在体外培养并具有分化成属于三种胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的任何细胞谱系和/或胚胎外组织的能力(多能性)的干细胞。如本文所用的，术语“专能干细胞”意指具有分化成多种类型的组织或细胞(但不是所有种类)的能力的干细胞。如本文所用的，术语“单能干细胞”意指具有分化成特定组织或细胞的能力的干细胞。多能干细胞可以从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。多能干细胞(PSC)的实例包括胚胎干细胞(ESC)、EG细胞(胚胎生殖细胞)、诱导多能干细胞(iPSC)等。从间充质干细胞(MSC)获得的Muse细胞(多谱系分化持续应激细胞)和从生殖细胞(例如睾丸)产生的GS细胞也包括在多能干细胞中。如本文所用的，术语“诱导多能干细胞”(也称为iPS细胞或iPSC)意指可以直接从成体细胞生成的一种类型的多能干细胞。如本文所用的，术语“胚胎干细胞”(也称为hES细胞或hESC)意指来源于单个卵裂球或胚泡的内细胞团或来源于孤雌生殖体(如例如WO 2003/046141所述)的一种类型的多能干细胞。胚胎干细胞可从给定的组织机构获得，也可以商购获得。优选地，本发明的方法和产品基于hPSC，即衍生自诱导多能干细胞或胚胎干细胞(包括孤雌生殖体)的干细胞。
当提及活力测量时，“NC-202”意指NucleoNC-202TM自动细胞计数器(Nucleo/>NC-202TMLeading Automated Cell Counter System(chemometec.com))。
如本文所用的，术语“RPE细胞”意指视网膜色素上皮细胞。
建立细胞库的方法
在本申请的第一方面，提供了建立细胞库的方法，其包括以下步骤：a)提供一批包含干细胞或干细胞衍生细胞和冷冻保存介质的细胞悬液，b)将该批细胞悬液维持在低于15℃的温度下，以及c)将该批细胞悬液中的一定量的细胞悬液转移到一个或多个储存容器中以建立细胞库，其中建立所述细胞库花费至少30分钟。
如本文所用的，术语“细胞库”是指单个细胞池的整分部分，该细胞池通常由在限定条件下衍生的单独来源制备，分配到多个容器中，并在限定条件下储存。它还可以是不同细胞类型的池。
如本文所用的，术语“细胞悬液”意味着细胞在液体介质中自由漂浮，从而允许维持基本上均匀的细胞浓度，其中可以转移包含细胞的液体介质的整分部分。细胞悬液中的细胞可以是单细胞或细胞聚集体/球体，并且包含或不含生物材料。
如本文所用的，术语“一批细胞悬液”是指待转移到一个或多个储存容器中的细胞悬液。
如本文所用的，术语“干细胞衍生细胞”意指已分化的干细胞。关于多能干细胞的术语“分化”是指细胞从未分化状态进展到特定分化状态的过程，即从未成熟状态进展到较成熟状态或成熟状态的过程。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“成熟或完全分化”。
步骤a)中的“提供一批细胞悬液”意指通过任何合适的手段获得一批细胞悬液。在一实施方案中，通过用冷冻保存介质配制干细胞或干细胞衍生细胞来提供一批细胞悬液。在一实施方案中，这批细胞悬液中的细胞浓度为约1x105个细胞/ml至约1x108个细胞/ml。在一实施方案中，所述干细胞是PSC。在进一步的实施方案中，所述干细胞是hPSC。干细胞可以通过上文提到的任何合适的方法来提供，例如，干细胞可以通过从人类胚胎干细胞衍生来提供。本领域技术人员将会认识到用于获得或提供干细胞的合适方法，其可包括从卵裂球或胚泡的内细胞团衍生干细胞。如本文所用的，“冷冻保存介质”意指适合在冷冻期间保存细胞的液体介质组合物。在一实施方案中，冷冻保存介质包含二甲基亚砜(DMSO)。在优选的实施方案中，冷冻保存介质是化学成分确定的、无异源物的且GMP级的。合适的冷冻保存介质可商购获得，如STEM-CELLBANKER。
在步骤b)中，将这批细胞悬液维持在低于15℃的温度下。在一实施方案中，将温度维持在0-12℃，优选0-11℃，优选0-10℃，优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。在一实施方案中，将温度维持在低于15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃或4℃，优选低于8℃。然而，这批细胞悬液的温度不应低于细胞悬液的冰点。技术人员将能够容易地确定细胞悬液的冰点。在一实施方案中，将温度维持在细胞悬液的冰点以上。在进一步的实施方案中，将温度维持在高于0℃、1℃、2℃或3℃。可以通过任何合适的手段将温度维持在所述温度，例如通过冷却装有这批细胞悬液的容器或通过冷却在其中建立细胞库的周围环境。在一实施方案中，对步骤b)中的这批细胞悬液进行搅动，如振摇或搅拌。可以通过任何合适的手段，例如通过磁力搅拌来搅动这批细胞悬液。搅动可以促进均匀的细胞悬液，从而确保在步骤c)中转移到每个小瓶中的细胞浓度基本上均匀。
在步骤c)中，将这批细胞悬液中的一定量的细胞悬液转移到一个或多个储存容器中。在一实施方案中，将一定量的细胞悬液转移到至少10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个储存容器。如本文所用的，术语“储存容器”是指适合储存细胞的容器。可以使用任何适合储存细胞的容器，如玻璃或塑料器皿或瓶子或袋子。在一实施方案中，储存容器是小瓶或冷冻袋。如本文所用的，术语“量”和“整分部分”可以互换使用，并且是指小于细胞悬液的初始体积的体积。可以使用任何合适的用于转移一定量的细胞悬液的方法。转移通常通过移液器手动进行，但是也可以在机器人辅助下自动进行。在一实施方案中，转移到每个小瓶中的细胞悬液的量为0.25至1000ml。在一实施方案中，将约1ml的量转移到2ml冷冻小瓶中。在一实施方案中，将约20ml的量转移到50ml冷冻袋中。在一实施方案中，这批细胞悬液的体积为至少25ml、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml或1L。
在一实施方案中，建立细胞库花费至少一小时、至少两小时或至少三小时。将细胞悬液维持在该温度的时间取决于建立细胞库所花费的时间，即制备一定量的细胞悬液和/或将其转移到所述数目的小瓶中的每个小瓶中所花费的时间。应当容易理解，将细胞悬液的整分部分转移到储存容器的步骤是在将该批剩余的细胞悬液维持在所述温度的同时进行的。一旦将一定量的细胞悬液转移到储存容器中，就不再必须将其维持在所述温度。
在一实施方案中，所述方法进一步包括步骤d)：转移所述量的细胞悬液后立即冷冻每个储存容器。鉴于本发明人的发现，应当容易理解，在转移细胞悬液的整分部分后，各个储存容器不应在建立其余细胞库时留在例如室温下。术语“立即”意味着转移到小瓶中的细胞悬液在转移后不到10分钟内，优选地在转移后不到8、6、4或2分钟内进行冷冻。本领域技术人员将会认识到合适的冷冻方法以及推荐的用于储存的冷冻温度。
在一实施方案中，所述方法用于增加细胞悬液中细胞的活力。
在一实施方案中，所述干细胞或干细胞衍生细胞是单细胞或聚集体。在另一实施方案中，这批细胞悬液进一步包含生物材料。
在一实施方案中，将步骤a)中的这批细胞悬液配制在细胞培养转瓶中，并且将所述细胞培养转瓶放置在根据本发明的冷却设备中。
冷却设备
在另一方面，提供了用于在制备细胞库期间冷却一批细胞悬液的冷却设备100，其包括：壳体101，该壳体101包括外壁102、适于接纳制冷剂的第一隔室104、105和适于容纳装有该批细胞悬液的容器的第二隔室103，其中所述第一隔室104、105和第二隔室103由导热元件106、107分隔开，由此当将所述制冷剂装入所述第一隔室104、105中并将装有该批细胞悬液的容器装入所述第二隔室103中时，所述制冷剂能够冷却该批细胞悬液。
在一实施方案中，壳体101由尼龙制成。在一实施方案中，壳体101是使用SLS打印而3D打印的，从而产生尼龙材料，该尼龙材料是惰性且坚固的材料，可以经受用EtOH/IPA进行的频繁消毒。
在一实施方案中，冷却设备100包括在第二隔室103的相对侧上的两个第一隔室104、105。因此，在该实施方案中，这两个第一隔室104、105被导热元件106、107分隔开。这使得这批细胞悬液的冷却分布更加均匀。导热元件106、107可以是用于导热的任何合适的材料。在一实施方案中，导热元件106、107是金属块，优选不锈钢块。在一实施方案中，导热元件106、107被弯曲成紧密地配合至装有这批细胞悬液的容器。
在一实施方案中，所述冷却设备进一步包括盖200以覆盖一个或多个第一隔室104、105。
如本文所用的，术语“制冷剂”意指适合于冷却的物质。在一实施方案中，制冷剂处于密封容器中。在优选实施方案中，制冷剂处于袋中，如凝胶包中。在一实施方案中，将制冷剂预冷却至低于-20℃的温度。
如本文所用的，关于冷却设备的术语“容器”是指包含待分配到更小储存容器如小瓶中的一批细胞悬液的容器。在一实施方案中，装有这批细胞悬液的容器的容积为50ml至10L，优选1L。在一实施方案中，装有这批细胞悬液的容器是细胞培养转瓶。
在优选实施方案中，所述冷却设备符合GMP。具体来说，符合A级洁净室环境的GMP。
冷却细胞悬液的方法
因此，本发明的另一方面涉及冷却一批细胞悬液的方法，其包括以下步骤：i)提供如上所述的冷却设备100，ii)将制冷剂装入所述冷却设备100的第一隔室104、105中，其中所述制冷剂的温度适合将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃，iii)将包含该批细胞悬液的容器装入所述冷却设备100的第二隔室103中，以及iv)将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃。
在一实施方案中，所述制冷剂是冷却包。如本文所用的，术语“冷却包”意指填充有制冷剂的容器，如塑料袋。在一实施方案中，当装入第一隔室104、105中时，制冷剂的温度为-20℃至-80℃。在一实施方案中，将细胞悬液的温度维持在0-15℃，优选0-12℃，优选0-10℃，优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。
在优选实施方案中，所述方法符合GMP。
冷却设备的用途
本发明的另一方面涉及如上文所述的冷却设备用于从一批细胞悬液制备细胞库的用途，其包括将这批细胞悬液的温度维持在低于15℃，优选0-12℃，优选0-10℃，更优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。在优选实施方案中，所述细胞是干细胞或衍生自干细胞。在甚至更优选的实施方案中，所述干细胞是人类多能干细胞(hPSC)。
在一实施方案中，根据需要更换制冷剂以维持这批细胞悬液的低温。
具体实施方案
现在通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明的方面：
1.用于在制备大型细胞库期间冷却一批细胞悬液的冷却设备(100)，其包括：壳体(101)，该壳体(101)包括外壁(102)、适于接纳制冷剂的第一隔室(104)和适于容纳装有该批细胞悬液的容器的第二隔室(103)，其中所述第一隔室(104)和第二隔室(103)由导热元件(106)分隔开，由此当将所述制冷剂装入所述第一隔室(104)中并将装有该批细胞悬液的容器装入所述第二隔室(103)中时，所述制冷剂能够冷却该批细胞悬液。
2.根据前述实施方案所述的冷却设备，其中所述壳体(101)由尼龙制成。
3.根据前述实施方案中任一项所述的冷却设备，其中所述导热元件(106)是金属块，优选不锈钢块。
4.根据前述实施方案中任一项所述的冷却设备，其中所述制冷剂处于密封袋中，如凝胶包中。
5.根据前述实施方案中任一项所述的冷却设备，其中所述装有所述批细胞悬液的容器的容积为50ml至10L，优选1L。
6.根据前述实施方案中任一项所述的冷却设备，其中所述装有所述批细胞悬液的容器是细胞培养转瓶。
7.根据前述实施方案中任一项所述的冷却设备，其中所述冷却设备符合GMP。
8.根据前述实施方案中任一项所述的冷却设备，其中所述冷却设备包括位于所述第二隔室(103)的相对侧上的两个第一隔室(104，105)。
9.根据实施方案8所述的冷却设备，其中所述两个第一隔室(104，105)中的每一个均通过导热元件(106，107)与所述第二隔室(103)分隔开。
10.根据前述实施方案中任一项所述的冷却设备，其进一步包括盖(200)以覆盖一个或多个所述第一隔室(104，105)。
11.建立细胞库的方法，其包括以下步骤：
a.提供一批包含干细胞或干细胞衍生细胞和冷冻保存介质的细胞悬液，
b.将该批细胞悬液维持在低于15℃的温度下，以及
c.将该批细胞悬液中的一定量的细胞悬液转移到一个或多个储存容器中以建立细胞库，
其中建立所述细胞库花费至少30分钟。
12.根据实施方案11所述的方法，其包括以下附加步骤：
d.转移所述量的细胞悬液后立即冷冻每个所述储存容器。
13.根据实施方案11和12中任一项所述的方法，其中将一定量的所述细胞悬液转移到至少10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个储存容器。
14.根据实施方案11至13中任一项所述的方法，其中所述温度维持在0-15℃，优选0-12℃，优选0-11℃，优选0-10℃，优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。
15.根据实施方案11至14中任一项所述的方法，其中所述温度维持在低于15℃、14℃、13℃、12℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃或4℃，优选低于12℃，更优选低于8℃。
16.根据实施方案11至15中任一项所述的方法，其中所述温度维持在所述细胞悬液的冰点以上。
17.根据实施方案11至16中任一项所述的方法，其中所述温度维持在高于0℃、1℃、2℃或3℃。
18.根据实施方案11至17中任一项所述的方法，其中建立所述细胞库花费至少一小时、至少两小时或至少三小时。
19.根据实施方案11至18中任一项所述的方法，其中所述储存容器是小瓶和/或冷冻袋。
20.根据实施方案11至19中任一项所述的方法，其中所述方法用于增加所述细胞的活力。
21.根据实施方案11至20中任一项所述的方法，其中所述批细胞悬液中的细胞浓度为约1x105个细胞/ml至约1x108个细胞/ml。
22.根据实施方案11至21中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存介质包含二甲基亚砜(DMSO)。
23.根据实施方案11至22中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存介质是STEM-CELLBANKER。
24.根据实施方案11至23中任一项所述的方法，其中所述干细胞是多能干细胞(PSC)。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述干细胞是人类多能干细胞(hPSC)。
26.根据实施方案11至25中任一项所述的方法，其中所述干细胞或干细胞衍生细胞是单细胞或聚集体。
27.根据实施方案11至26中任一项所述的方法，其中所述干细胞衍生细胞是β样细胞、心肌细胞或RPE细胞。
28.根据实施方案11至27中任一项所述的方法，其中所述细胞悬液进一步包含生物材料。
29.根据实施方案11至28中任一项所述的方法，其中所述批细胞悬液的体积为至少25ml、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml或1L。
30.根据实施方案11至29中任一项所述的方法，其中转移到每个储存容器中的细胞悬液的量为0.25至1000ml。
31.根据实施方案11至30中任一项所述的方法，其中将约1ml的量转移到2ml冷冻小瓶中。
32.根据实施方案11至30中任一项所述的方法，其中将约20ml的量转移到50ml冷冻袋中。
33.根据实施方案11至32中任一项所述的方法，其中步骤a)中的所述批细胞悬液在细胞培养转瓶中配制，并且其中将所述细胞培养转瓶放置在根据实施方案1至10中任一项所述的冷却设备中。
34.根据实施方案11至33中任一项所述的方法，其中对步骤b)中的所述批细胞悬液进行搅动，如振摇或搅拌。
35.根据实施方案34所述的方法，其中用于搅拌的装置处于所述批细胞悬液中，如磁力搅拌器。
36.根据实施方案11至35中任一项所述的方法，其中至少一部分所述细胞悬液保留于在建立细胞库所花费的时间期间维持在所述温度的所述批细胞悬液中。
37.根据实施方案11至36中任一项所述的方法，其中所述方法在层流工作站或洁净室中进行。
38.根据实施方案1至10中任一项所述的冷却设备用于从一批细胞悬液制备细胞库的用途，其包括将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃，优选低于12℃，优选0-12℃，优选0-11℃，优选0-10℃，更优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。
39.根据实施方案38所述的用途，其中所述批细胞悬液包含干细胞或来源于干细胞。
40.根据实施方案39所述的用途，其中所述干细胞是人类多能干细胞(hPSC)。
41.冷却一批细胞悬液的方法，其包括以下步骤：
i.提供根据实施方案1至10中任一项所述的冷却设备，
ii.将制冷剂装入所述冷却设备的所述第一隔室中，其中所述制冷剂的温度适合将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃，
iii.将包含该批细胞悬液的瓶装入所述冷却设备的所述第二隔室中，以及
iv.将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述方法符合GMP。
43.根据实施方案41和42中任一项所述的方法，其中所述制冷剂是冷却包。
44.根据实施方案41至43中任一项所述的方法，其中当装入所述第一隔室中时，所述制冷剂的温度为-20℃至-80℃。
45.根据实施方案41至44中任一项所述的方法，其中将所述批细胞悬液在所述温度下维持至少一小时。
46.根据实施方案41至45中任一项所述的方法，其中将所述批细胞悬液的温度维持在0-15℃，优选0-12℃，优选0-10℃，优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。
实施例
以下是用于实施本发明的非限制性实施例。
实施例1：用于建立大型细胞库的方案
在准备过程中，将小瓶在2-8℃预冷却。在冷冻保存前，用于冷却设备的凝胶包和金属支撑件在-20℃下冷冻过夜至少4小时。
首先，将hPSC在STEM-CELLBANKER(SCB)冷冻保存介质中配制。然后对适当汇合度的细胞进行拍照，并且收获细胞并计数。根据获得的活细胞总计数，确定可以例如以每瓶1x106个活细胞总数填充的小瓶的数目。然后将计算体积的细胞悬液转移到合适的无菌锥形管中并保持低温。对于小和大的细胞悬液体积(取决于培养形式)，以300g离心3min和5min以沉淀细胞。在生物安全柜(BSC)中，吸出上清液，然后敲打锥形管以使细胞沉淀物变松散。将细胞沉淀物用1-5mL的SCB轻轻重悬。添加更多的SCB以使细胞悬液达到一定体积，产生例如1x106个细胞/ml的浓度。
将细胞悬液转移到1L转瓶中并置于根据本发明的冷却设备中。将预冷冻的冷却包和金属支撑件插入冷却设备中。将冷却设备与细胞悬液一起放置在磁力搅拌器上，确保冷却设备位于搅拌板的中央。视情况设置混合速度。填充时，随着体积的减小，混合速度可以相应地改变。
使用fill-it系统(Sartorius Stedim Biotech)——一种台式自动化冷冻小瓶处理系统——自动地对冷冻小瓶进行开盖、填充和重新加盖，用于填充48管架的8路一次性使用的无菌管组连接至转瓶液体传输端口管。然后使用系统蠕动泵以1mL填充体积填充所需数目的冷冻小瓶。或者，还可以使用例如血清移液管手动填充冷冻小瓶。
然后将冷冻小瓶转移到控速冰箱中进行冷冻保存。一旦达到目标温度，就将冷冻小瓶置于干冰上或直接置于预冷却的架子上，并转移到液氮的汽相中进行长期储存。或者，使用Mr.Frosty或BioCision CoolCell冷冻容器。随后将装有填充的冷冻小瓶的冷冻容器放入-80℃冰箱中4-48小时。随后将冷冻小瓶转移到液氮的汽相中进行长期储存。
实施例2：不同温度下细胞活力的比较
本发明人研究了较长的冷冻保护剂暴露时间对解冻后hPSC(％存活率、平板接种和复苏)的影响，即，在特定时间点取样并立即冷冻保存，稍后解冻，然后评估细胞样品的活力。通过台盼蓝进行的活力评估详细描述于例如Strober W.Trypan Blue Exclusion Testof Cell Viability.Curr Protoc Immunol.2015；111:A3.B.1-.A3.B.3.发表于2015年11月2日.doi:10.1002/0471142735.ima03bs111。
在经历如实施例1所述方法和其中细胞悬液不维持在低于12℃的温度下的类似方法的hPSC之间进行比较。通过解冻冷冻保存的细胞样品并使用台盼蓝排除法来测试活力。
图4显示了在两个单独的实验中，相对于在室温(约20℃)下暴露于冷冻保存介质(特别是STEM-CELLBANKER)的不同暴露时间，通过台盼蓝排除法测定的hESC活力。显然，hPSC在维持在室温(RT)的细胞悬液中的时间越长，其活力越低。数据在表1中呈现。
表1：室温下的活力研究(％存活率)
5min 30min 120min 240min
98.8 98 91.3 82.5
98.8 93.4 92.5 86.5
图5显示了维持在约4℃的细胞悬液以及维持在室温(RT)的比较样品的结果。数据在表2中呈现，而分别在4℃和室温下240分钟时采集的样品的比较的统计概要在表3中呈现。
表2：采用维持在约2-8℃的细胞的活力研究(％存活率)
5min 30min 120min 240min 240min(RT)
98 97.2 95.8 95.7 77.4
97.8 95.3 95.7 93.6 74.7
97.4 94.7 97.2 96 74.9
表3：活力研究的ANOVA概要
实施例3：冷冻保存介质的温度的测量
在一项实验中，本发明人测量了当将瓶置于根据本发明的冷却设备中时，瓶中的冷冻保存介质的温度。分别在瓶的顶部和底部使用两个温度探头。在带有磁力搅拌的1L转瓶中使用STEM-CELLBANKER作为冷冻保存介质，介质体积为850ml。实验前将制冷剂和金属板于-20℃冷冻。
图6中显示了随时间推移的温度测量结果。临在0分钟之前，在约6℃的温度下添加STEM-CELLBANKER。实验过程中未更换制冷剂。
实施例4：分化细胞(hESC衍生的β样细胞)在不同温度下的细胞活力的比较
为了测试未成熟β细胞(StemCell Banker中100E6 VC/mL的单细胞)的保持时间，建立了以下实验：BC03后，使用标准SC2BC分化方案从1L DASgip生物反应器中收获。图8显示了比较表达NKX6.1和Islet-1标志物的细胞的百分比的流式细胞术点图。49.5％共表达这两种标志物，指示β细胞。Q0720882。将包含1mL 100E6 VC/mL的1.8mL小瓶储存在以下条件，之后转移至-80℃：
表4：室温储存
表5：4℃温度储存
次日将所有小瓶转移到液氮中。解冻时遵循以下方案：
/>
结果在图7中呈现，图7显示了在室温和大约4摄氏度下，对于冷冻保存介质(如StemcellBanker)的不同保持时间，通过NC-202测量的存活率％。室温下的平均存活率％从82％降至66％，而与之相比，4℃下(5min至240min)从89％降至85％。每个时间点由3名不同的操作者解冻6-8个小瓶。进行双向ANOVA Sidak多重比较检验以比较RT与4℃(表6)。
表6：用来比较RT与4℃的双向ANOVA Sidak多重比较检验
实施例5：hESC衍生的RPE细胞的冷冻保存
使在iMatrix-511(0.25mg/cm2，Nippi)上培养的E1C3(NN GMP0050E1C3)分化为RPE细胞，如Petrus-Reurer,Sandra等人,“Molecular profiling of stem cell-derivedretinal pigment epithelial cell differentiation established for clinicaltranslation.”Stem cell reports vol.17,6(2022):1458-1475.doi:10.1016/j.stemcr.2022.05.005所述。
使用RPE测试在不同温度下的冷冻保存介质保持时间及其如何影响RPE的活力。细胞最初保持在Stem Cell Banker中(在RT和4℃下保持如下所述的时间段)，然后转移到-80℃冰箱中。
RT：60min、120min和240min
4C：10min、30min、60min、120min和240min。
准备阳性对照。其(0min)代表直接转移到-80℃的细胞。
结果在图9中呈现，图9显示了在室温和大约4摄氏度下，对于冷冻保存介质(如StemcellBanker)的不同保持时间，通过NC-202测量的存活率％。室温下的存活率％从95％降至81％，而与之相比，4℃下(0min至240min)从95％降至89％。每个时间点由3名不同的操作者解冻8-10个小瓶。进行双向ANOVA Sidak多重比较检验以比较RT与4℃，如表7所示。
表7：hESC衍生的RPE细胞的活力研究中的双向ANOVA Sidak多重比较检验
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。

Claims (15)

1.建立细胞库的方法，其包括以下步骤：
a.提供一批包含干细胞或干细胞衍生细胞和冷冻保存介质的细胞悬液，
b.将该批细胞悬液维持在低于15℃的温度下，以及
c.将该批细胞悬液中的一定量的细胞悬液转移到一个或多个储存容器中以建立细胞库，
其中建立所述细胞库花费至少30分钟。
2.根据前述权利要求所述的方法，其中将一定量的所述批细胞悬液转移到至少10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个储存容器。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述温度维持在低于15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃或4℃，优选低于12℃，更优选低于8℃。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述温度维持在0-15℃，优选0-12℃，更优选0-10℃，更优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述温度维持在所述细胞悬液的冰点以上。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述温度维持在高于0℃、1℃、2℃或3℃。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中建立所述细胞库花费至少一小时、至少两小时或至少三小时。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括以下附加步骤：
d.从所述批细胞悬液中转移出所述量的细胞悬液后立即冷冻每个所述储存容器。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，转移到每个储存容器中的细胞悬液的量为0.25至1000ml。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述批细胞悬液的体积为至少25ml、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml或1L。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞是多能干细胞(PSC)并且/或者其中所述干细胞衍生细胞是β样细胞、心肌细胞或RPE细胞。
12.用于在制备细胞库期间冷却一批细胞悬液的冷却设备(100)，其包括：壳体(101)，该壳体(101)包括外壁(102)、适于接纳制冷剂的第一隔室(104，105)和适于容纳装有该批细胞悬液的容器的第二隔室(103)，其中所述第一隔室(104，105)和第二隔室(103)由导热元件(106，107)分隔开，由此当将所述制冷剂装入所述第一隔室(104，105)中并将装有该批细胞悬液的容器装入所述第二隔室(103)中时，所述制冷剂能够冷却该批细胞悬液。
13.冷却一批细胞悬液的方法，其包括以下步骤：
i.提供根据权利要求12所述的冷却设备，
ii.将制冷剂装入所述冷却设备的所述第一隔室中，其中所述制冷剂的温度适合将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃，
iii.将包含该批细胞悬液的瓶装入所述冷却设备的所述第二隔室中，以及
iv.将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述批细胞悬液的温度维持在0-15℃，优选0-12℃，优选0-10℃，优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。
15.根据权利要求12所述的冷却设备用于从一批细胞悬液制备细胞库的用途，其包括将该批细胞悬液的温度维持在低于15℃，优选0-12℃，优选0-10℃，更优选0-8℃，更优选2-8℃，更优选2-6℃，更优选3-5℃，甚至更优选约4℃。
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