TW202222159A - 用於細胞冷凍保存之無血清細胞冷凍保存液 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於冷凍保存免疫細胞之細胞冷凍保存液(Cryoprotective agent, CPA)，其中經細胞因子誘導的殺傷細胞尤佳。該細胞冷凍保存液之成分不含血清且由下列成分組成：(1)混合式基礎培養基、(2)二甲基亞碸(DMSO)、(3)血清取代物、(4)右旋糖酐(Dextran)。其特徵在於該保存液為混合式培養基及血清取代物以達成無血清冷凍保存功能。其用於免疫細胞尤其自然殺手細胞經解凍後可保持80%以上之細胞毒殺功能及功能性細胞標誌，並具備高濃度細胞乘載量。

Description

用於細胞冷凍保存之無血清細胞冷凍保存液
本發明係有關一種細胞冷凍保存液配方及其冷凍保存方法，尤其是用於包含細胞因子誘導的殺傷細胞等免疫細胞之冷凍保存。
相較於普遍施行之幹細胞療法，免疫細胞治療為較新穎之細胞治療技術。現行所使用之細胞冷凍保存液大多沿用幹細胞保存液，專利項目亦多以幹細胞或腫瘤細胞為主。然現今主流細胞冷凍保存液鮮有主張能夠保存經細胞因子誘導之殺傷性免疫細胞，對於免疫細胞解凍後之功能性亦無相關驗證資訊。
免疫細胞相較於幹細胞對於冷凍保存更為敏感，且冷凍過程對細胞會造成顯著功能性損傷及細胞凋亡 ( J Immunol Methods. 1989;125(1-2):185-9; J Immunol. 1997;45(6):618-22.; J Immunol Methods. 2007;326(1-2):93-115; Faseb J. 2002;16(12):1651-3.) 。目前市售之細胞冷凍保存液大多適用於幹細胞之保存，鮮有適用於免疫細胞，且宣稱之功效僅限於細胞存活率，對於細胞功能之保存付之闕如。
因應未來免疫細胞製劑工業化生產製造、擴大業務範圍、並確保產品有效性，冷凍保存技術不應只局限於細胞存活，亦須確保其細胞功能性得以保存。
此外，目前市售之細胞冷凍保存液，其細胞濃度的使用範圍大多僅0.5~10×10 6/mL，在細胞製劑的工業化生產上，仍有進一步改良的空間。
於是，本發明提供一種無血清細胞冷凍保存液，其凍存的細胞濃度可達1×10 8/mL，細胞經解凍後，相較於凍存前可保持90%細胞存活率，適用於一般性漸凍盒及程式降溫儀。
本發明之成分係由下列成分組成之混合物：(1)混合式基礎培養基、(2)二甲基亞碸、(3)血清取代物、(4)右旋糖酐。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該混合式基礎培養基係選自於RPMI、SCGM及AIM V Serum Free Medium或其組合。
於本發明之一些具體實施態樣，其中二甲基亞碸濃度係介於2.5~10 %。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該血清取代物係血小板裂解液。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該右旋糖酐(Dextran)濃度係介於2.5~10 % (V/V)。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該右旋糖酐(Dextran)分子量係介於40~78.5 kDa。
本發明於另一方面，係提供一種細胞冷凍保存方法，包含：將一細胞以請求項1之細胞冷凍保存液配製一細胞懸浮液；降溫至-80 ℃；及置於液態氮中保存。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該細胞為一免疫細胞。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該免疫細胞為自然殺手細胞。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該細胞為CD56 +細胞。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該細胞為CD56 +CD16 +細胞。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該細胞為CD56 +CD16 +CD314 +CD107a +細胞。
於本發明之一些具體實施態樣，其中該細胞懸浮液之細胞濃度係介於1×10 6~1×10 8/mL。
上述目的與概說僅提供本發明之簡要介紹。為了更詳細瞭解本發明此等目的與其他目的及本發明本身，習知技藝之人士咸瞭解應配合附圖解讀本發明之詳細說明與申請專利範圍。
用於本說明書，術語「冷凍保存液」(Cryoprotective agent, CPA)意指用於保護生物細胞免於因冷凍冰晶造成傷害之液態保存成分。
用於本說明書，術語「自然殺手細胞」(Nature killer cell; NK cell)意指一種隸屬於先天免疫系統(innate immune system)之毒殺性淋巴球(cytotoxic lymphocyte)，可被誘發以執行非專一性細胞毒殺效應。
用於本說明書，術語「不含血清」意指不需額外添加周邊血檢體來源之自體血漿或血清，或其他動物來源之血清。
熟諳相關技藝之人士當參考詳細說明與附圖時將更瞭解本發明許多其他優點與特色，其中涵括本發明原則之較佳結構具體實施例僅為實例說明。
實施例一　冷凍保存液製備
於無菌作業環境下，取用包含RPMI、SCGM或AIM V Serum Free Medium其中任兩種以30~70 %不等比例混合製備混合培養基。
於無菌作業環境下，以混合培養基為基底配置包含旋糖酐(Dextran)之高分子聚合物。其中右旋糖酐(Dextran) 分子量為40~78.5 kDa，配製置儲備溶液濃度為20%。將不同比例之儲備濃度加入冷凍保存液，最終濃度係介於5~10 %。
於無菌作業環境下，取用二甲基亞碸加入冷凍保存液，其最終濃度範圍係介於2.5~10 %。
於無菌作業環境下，取用血小板裂解液加入冷凍保存液，其最終濃度範圍係介於1~10 %。
將配置完成之冷凍保存液預冷至4 ℃。
於一些較佳的實施態樣中，冷凍保存液成分為7.5%的DMSO、5%的血小板裂解液、5%的Dextran 40及RPMI/SCGM混合式培養液 (冷凍保存液#1)；7.5%的DMSO、5%的血小板裂解液、10%的Dextran 40及RPMI/SCGM混合式培養液 (冷凍保存液#2)。
實施例二　細胞降溫冷凍
欲凍存之細胞經過細胞清洗後，以1×10 6~1×10 8/mL細胞濃度將其以冷凍保存液懸浮細胞，並分裝於冷凍小管中。
已盛裝細胞懸浮液之冷凍小管置入市售之細胞漸凍盒(CoolCell LX, Corning)，並將漸凍盒置入-80 ℃超低溫冷凍櫃降溫8~16小時。隔日將已降溫之冷凍小管移入液態氮桶保存。
除使用細胞漸凍盒，亦可改採微電腦程式降溫儀(IceCube 14S, SY-LAB) 進行全程溫控降溫。降溫完成後可直接移入液態氮桶保存。
實施例三　細胞解凍
將冷凍小管移出液態氮桶，移置過程中全程置於預冷之合金金屬導熱管架(CoolRack CF15, Corning)。在37 ℃水浴槽中將細胞完全解凍後，得進行後續實驗或培養步驟。
實施例四　細胞存活率測試
取樣培養細胞體積百分之一，將適量細胞混合Trypan Blue染劑染色，已染色之懸浮細胞液置入細胞計數盤。在倒立式顯微鏡下辨識存活（無染色）及死亡（被染色）細胞或以自動細胞計數儀。存活率計算公式為：存活細胞/(存活細胞+死亡細胞)。結果如第1圖所示。
實施例五　細胞族群分析
取1×10 6個細胞數，以Dulbecco's磷酸鹽緩衝液(DPBS)洗滌後懸浮於200 μL DPBS溶液，依照原廠建議使用量加CD56抗體在避光環境下置於冰上染色30分鐘。最後以流式細胞儀分析目標細胞所佔百分比。族群分析計算公式為：解凍後CD56陽性細胞百分比/解凍前CD56陽性細胞百分比。結果如第2圖所示。
實施例六　細胞活化標誌分析
取1×10 6個細胞數，以DPBS洗滌後懸浮於200 μL DPBS溶液，依照原廠建議使用量加入CD314 (自然殺手細胞活化標誌)、CD107a (毒殺能力標誌)及CD16 (抗體受體標誌) 抗體在避光環境下置於冰上染色30分鐘。最後以流式細胞儀分析目標細胞所佔百分比。族群分析計算公式為：解凍後CD314陽性、CD107a陽性或CD16陽性細胞百分比/解凍前CD314陽性、CD107a陽性或CD16陽性細胞百分比。結果如第3圖-第5圖所示。
實施例七　細胞毒殺能力分析
取1×10 6個細胞數之K562細胞作為自然殺手細胞毒殺標的，並使用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)螢光染記標記目標癌細胞，再加入5×10 6個細胞數之解凍細胞製劑，放入細胞培養箱後共培養4小時。細胞取出以DPBS洗滌後使用7-氨基放線菌素(7-Aminoactinomycin D, 7-AAD)細胞染劑偵測凋亡細胞，搭配流式細胞儀分析目標細胞(CFSE+)之凋亡細胞數(7-AAD+)作為細胞製劑毒殺率。細胞毒殺率計算為：目標細胞凋亡數（CFSE+, 7-AAD+）/目標細胞總數（CFSE+）。結果如第6圖所示。
本發明提供的一種無血清細胞冷凍保存液，其凍存的細胞濃度可達1×10 8/mL，高於市售之細胞凍存液，且相較於凍存前可保持90%細胞存活率。另一方面，本發明也提供一種用於細胞因子誘導的殺傷細胞之無血清免疫細胞的冷凍保存方法，細胞經解凍後，細胞族群百分比(CD56)解凍後不改變，細胞活化標誌(CD314、CD16、CD107a)解凍後可保持80%以上，毒殺效率可保持80%。
無
第1圖揭示了使用兩種不同冷凍保存液配方在解凍後相較於解凍前之細胞存活率。
第2圖揭示了使用兩種不同冷凍保存液配方在解凍後相較於解凍前之CD56細胞族群比例。
第3圖揭示了使用兩種冷凍保存液配方在解凍後相較於解凍前之具CD107a細胞毒殺標誌比例。
第4圖揭示了使用兩種不同冷凍保存液配方在解凍後相較於解凍前之具CD314細胞活化標誌比例。
第5圖揭示了使用兩種不同冷凍保存液配方在解凍後相較於解凍前之具CD16抗體受體標誌比例。
第6圖揭示了使用兩種不同冷凍保存液配方在解凍後相較於解凍前之細胞毒殺能力。
無

Claims (13)

  1. 一種細胞冷凍保存液(Cryoprotective agent, CPA)，其特徵在於不含血清，包含： 一混合式基礎培養基； 一血清取代物； 一右旋糖酐；及 二甲基亞碸。
  2. 如請求項1之細胞冷凍保存液，其中該混合式基礎培養基係選自於RPMI、SCGM及AIM V Serum Free Medium或其組合。
  3. 如請求項1之細胞冷凍保存液，其中該血清取代物係血小板裂解液。
  4. 如請求項1之細胞冷凍保存液，其中該右旋糖酐(Dextran)濃度係介於2.5~10 % (V/V)。
  5. 如請求項1之細胞冷凍保存液，其中該右旋糖酐(Dextran)分子量係介於40~78.5 kDa。
  6. 如請求項1之細胞冷凍保存液，其中二甲基亞碸濃度係介於2.5~10 %。
  7. 一種細胞冷凍保存方法，包含： 將一細胞以請求項1之細胞冷凍保存液配製一細胞懸浮液； 降溫至-80 ℃； 置於液態氮中保存。
  8. 如請求項7之方法，其中該細胞為一免疫細胞。
  9. 如請求項8之方法，其中該免疫細胞為自然殺手細胞。
  10. 如請求項7之方法，其中該細胞為CD56 +細胞。
  11. 如請求項10之方法，其中該細胞為CD56 +CD16 +細胞。
  12. 如請求項11之方法，其中該細胞為CD56 +CD16 +CD314 +CD107a +細胞。
  13. 如請求項7之方法，其中該細胞懸浮液之細胞濃度係介於1×10 6~5×10 8/mL。
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