CN117796388A - 间充质干细胞冻存液及其冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种间充质干细胞冻存液及其冻存方法。按体积百分比计，该冻存液的制备原料包括10%~15%血清白蛋白溶液、5%~10%二甲基亚砜及75%~85%右旋糖酐40葡萄糖注射液；所述血清白蛋白溶液中血清白蛋白的浓度为0.1g/mL~0.3g/mL，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液中右旋糖酐40的浓度为25 g/mL~35 g/mL，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液中葡萄糖的浓度为20 g/mL~30 g/mL；所述二甲基亚砜和所述右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积比为1：（7.5~15）。
Description
技术领域
本申请涉及干细胞技术领域，具体而言，涉及一种间充质干细胞冻存液及其冻存方法。
背景技术
干细胞（stem cell）是形成各组织、器官的原始细胞，能够自我更新并在一定条件下分化成其他细胞的未分化细胞。干细胞是疾病机制和药理研究的热点，在细胞治疗和再生医学上具有广阔的应用前景。干细胞移植治疗通过利用干细胞的自我更新、免疫调节、抗炎、信号传导和分化特性，达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治疗目的，为各个系统的疑难杂症的治疗带来了希望。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，MSC能够分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一，MSC作为重要的再生医学资源，在临床的疾病治疗领域将有非常重要的应用价值。细胞疗法和再生医学产品拥有非常独特的产业链，在整个产业链上，细胞必须保持活力和功能。然而由于传统的间充质干细胞注射液导致细胞解冻后功能不佳，其临床应用也受到了限制。
因此，亟需一种能够防止冻存过程中的细胞损伤、保持细胞复苏后的高活率及其功能的冻存液。
发明内容
为了克服传统技术中的上述问题，本申请提供了一种间充质干细胞冻存液，其在冷冻保存时获得间充质干细胞的高存活率、且能够防止冻存过程中的细胞损伤和保持细胞复苏后的高活率。为了最大限度地提高存活率，在冷冻保存前将间充质干细胞冻存液添加到间充质干细胞中。具体地，本申请还涉及间充质干细胞冻存液用途，其用于增加经冷冻保存后的间充质干细胞的存活力，以及改善冷冻保存间充质干细胞在低温下的长期稳定性。
本申请的一方面涉及一种间充质干细胞冻存液，按体积百分比计，所述冻存液的制备原料包括10%~15%血清白蛋白溶液、5%~10%二甲基亚砜及75%~85%右旋糖酐40葡萄糖注射液；所述血清白蛋白溶液中血清白蛋白的浓度为0.1g/mL~0.3g/mL，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液中右旋糖酐40的浓度为25g/mL~35g/mL，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液中葡萄糖的浓度为20g/mL~30g/mL；所述二甲基亚砜和所述右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积比为1：（7.5~15）。
在其中一个实施例中，按体积百分比计，所述冻存液的制备原料包括10%~12%血清白蛋白溶液、8%~10%二甲基亚砜及75%~80%右旋糖酐40葡萄糖注射液。
在其中一个实施例中，所述二甲基亚砜和所述右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积比为1：（7.5~10）。
本申请另一方面提供了一种间充质干细胞的冻存方法，其特在于，包括以下步骤：
将待冻存的间充质干细胞与如上述的间充质干细胞冻存液进行混合后再冷冻。
在其中一个实施例中，所述间充质干细胞的密度为6×106个/mL~7×106个/mL。
在其中一个实施例中，所述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞。
在其中一个实施例中，所述混合的步骤包括：
向所述间充质干细胞中加入预冷的血清白蛋白溶液和部分右旋糖酐40葡萄糖注射液进行重悬，得到中间混合物；
向所述中间混合物中加入预冷的二甲基亚砜和剩余的右旋糖酐40葡萄糖注射液，进行混合。
在其中一个实施例中，所述预冷满足（1）~（2）中至少一个条件：
（1）所述预冷处理的温度为2℃~8℃；
（2）所述预冷处理的时间为30min以上。
在其中一个实施例中，所述冷冻的方法包括：
先于0℃~4℃下，进行预冷处理；
进行第一次降温处理，以0.5℃/min~2℃/min的速度降温至-40℃；
进行第二次降温处理，以4℃/min~6℃/min的速度降温至-90℃。
在其中一个实施例中，所述冷冻的方法包括：
先于4℃下，进行预冷处理；
进行第一次降温处理，以1℃/min的速度降温至-40℃；
进行第二次降温处理，以5℃/min的速度降温至-90℃。
与传统技术相比，本申请的有益效果为：
二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂，能够快速穿透细胞膜进入细胞中，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。二甲基亚砜与右旋糖酐40葡萄糖注射液联合应用，能够发挥渗透性和非渗透性两种冻存保护剂的协同作用，并配以对细胞膜具有稳定作用的血清白蛋白，形成了一个比较稳定的冷冻保护体系。上述成分互相配合，使得间充质干细胞冻存液在冷冻保存时获得间充质干细胞的高存活率、且能够防止冻存过程中的细胞损伤和保持细胞复苏后的高活率，利于间充质干细胞体外大规模培养和临床应用。
附图说明
图1为实施例1中解冻复苏后脐带来源间充质干细胞的显微图；
图2为实施例1中流式分析解冻复苏后脐带来源脐带间充质干细胞表达结果图，横坐标为细胞数量，纵坐标为荧光强度；
图3为实施例1中解冻复苏后脐带来源间充质干细胞生长曲线图；
图4为实施例1中解冻复苏后脐带来源间充质干细胞成骨诱导分化后茜素红染色；
图5为实施例1中解冻复苏后脐带来源间充质干细胞成脂诱导分化后油红O染色结果图；
图6为实施例1中解冻复苏后脐带来源间充质干细胞成软骨诱导分化后阿辛蓝染色结果图。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照实施例对本申请进行更全面的描述，以下给出了本申请的较佳实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本申请的一实施方式提供了一种间充质干细胞冻存液，该冻存液的制备原料包括10%~15%血清白蛋白溶液、5%~10%二甲基亚砜及75%~85%右旋糖酐40葡萄糖注射液；血清白蛋白溶液中血清白蛋白的浓度为0.1g/mL~0.3g/mL，右旋糖酐40葡萄糖注射液中右旋糖酐40的浓度为25 g/mL ~35 g/mL，右旋糖酐40葡萄糖注射液中葡萄糖的浓度为20 g/mL ~30g/mL；二甲基亚砜和右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积比为1：（7.5~15）。
二甲基亚砜(DMSO)是一种重要的渗透型细胞保护剂，能够快速穿透细胞膜进入细胞中，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤；而右旋糖苷40葡萄糖注射液作为非渗透性试剂在细胞外形成高渗，使细胞脱水，从而保护细胞不受冰晶形成的损伤，由此，二甲基亚砜与右旋糖酐40葡萄糖注射液联合应用，能够发挥渗透性和非渗透性两种冻存保护剂的协同作用；此外，本体系中还添加适量的血清白蛋白溶液，对细胞具有较强的保护作用，能够促进细胞的增长，延长细胞存活的时间，还能够增加血容量和维持渗透压，调节组织与血管之间水分的动态平衡，维持细胞渗透压相对稳定，保证了间充质干细胞在冻存过程中的安全性；上述成分互相配合，使得间充质干细胞冻存液在冷冻保存时获得间充质干细胞的高存活率、且能够防止冻存过程中的细胞损伤和保持细胞复苏后的高活率，利于间充质干细胞体外大规模培养和临床应用。
就保护体系而言，保护剂的浓度会影响冻干后细胞存活率。若保护剂太少，会有大量细胞膜裸露在介质中，在冻存时就可能改变细胞通透性，不能起到保护菌体的作用；反之保护剂太多，细胞的渗透压和通透性也会受影响。
可理解，当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
需要说明的是，血清白蛋白溶液的取值范围为“10%~15%”，即可取10%~15%的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：10%、10.1%、10.15%、10.2%、10.25%、10.3%、10.35%、10.4%、10.45%、10.5%、10.55%、10.6%、10.65%、10.7%、10.75%、10.8%、10.85%、10.9%、10.95%、11%、11.1%、11.15%、11.2%、11.25%、11.3%、11.35%、11.4%、11.45%、11.5%、11.55%、11.6%、11.65%、11.7%、11.8%、11.9%、12%、12.1%、12.2%、12.3%、12.4%、12.5%、12.6%、12.7%、12.8%、12.9%、13%、13.1%、13.2%、13.3%、13.4%、13.5%、13.6%、13.7%、13.8%、13.9%、14%、14.1%、14.2%、14.3%、14.5%、14.6%、14.7%、14.8%、14.9%或者15%；或这些数值中任意两个组成的范围，作为示例，包括：10%~13%。
二甲基亚砜的取值范围为“5%~10%”，即可取5%~10%的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：5%、5.1%、5.15%、5.2%、5.25%、5.3%、5.35%、5.4%、5.45%、5.5%、5.55%、5.6%、5.65%、5.7%、5.75%、5.8%、5.85%、5.9%、6%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6、9.7%、9.8%、9.9%、或者10%；或这些数值中任意两个组成的范围，作为示例，包括：7%~10%。
右旋糖酐40葡萄糖注射液的取值范围为“75%~85%”，即可取75%~85%的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：75%、75.1%、75.15%、75.2%、75.25%、75.3%、75.35%、75.4%、75.45%、75.5%、75.55%、75.6%、75.65%、75.7%、75.75%、75.8%、75.85%、75.9%、76%、76.1%、76.2%、76.3%、76.4%、76.5%、76.7%、76.8%、76.9%、77%、77.1%、77.2%、77.3%、77.4%、77.5%、77.6%、77.7%、77.8%、77.9%、78%、78.1%、78.2%、78.3%、78.4%、78.5%、78.6%、78.7%、78.8%、78.9%、79%、79.1%、79.2%、79.3%、79.4%、79.5%、79.6%、79.7%、79.8%、79.9%、80%、80.1%、80.2%、80.3%、80.4%、80.5%、80.6%、80.7%、80.8%、80.9%、81%、81.1%、81.2%、81.3%、81.4%、81.5%、81.6%、81.7%、81.8%、81.9%、82%、82.1%、82.3%、82.4%、82.5%、82.6%、82.7%、82.8%、82.9%、83%、83.1%、83.2%、83.3%、83.4%、83.5%、83.6%、83.7%、83.8%、83.9%、84%、84.1%、84.2%、84.3%、84.4%、84.5%、84.6%、84.7%、84.8%、84.9%或者85%；或这些数值中任意两个组成的范围，作为示例，包括：75%~81%。
血清白蛋白溶液中血清白蛋白的浓度的取值范围为“0.1g/mL~0.3g/mL”，即可取0.1g/mL~0.3g/mL的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：0.1 g/mL、0.11 g/mL、0.12 g/mL、0.13g/mL、0.14 g/mL、0.15 g/mL、0.16 g/mL、0.17 g/mL、0.18 g/mL、0.19 g/mL、0.2 g/mL、0.21 g/mL、0.22 g/mL、0.23 g/mL、0.24 g/mL、0.25 g/mL、0.26 g/mL、0.27 g/mL、0.28 g/mL、0.29 g/mL或者0.3 g/mL；或这些数值中任意两个组成的范围，作为示例，包括：0.1 g/mL~0.2 g/mL。
右旋糖酐40葡萄糖注射液中右旋糖酐40的浓度的取值范围为“25 g/mL ~35 g/mL”，即可取0.1g/mL~0.3g/mL的范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。具体示例包括但不限于实施例中的点值及以下点值：25 g/mL、26 g/mL、27 g/mL、28 g/mL、29 g/mL、30 g/mL、31 g/mL、32 g/mL、33 g/mL、34 g/mL或者35 g/mL；或这些数值中任意两个组成的范围。
右旋糖酐40葡萄糖注射液中葡萄糖的浓度的取值范围为“20 g/mL ~30 g/mL”，即可取20 g/mL、21 g/mL、22 g/mL、23 g/mL、24 g/mL、25 g/mL、26 g/mL、27 g/mL、28 g/mL、29 g/mL或者30 g/mL；或这些数值中任意两个组成的范围。
甲基亚砜和右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积比为1：（7.5~15），具体示例可为1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9、1:10、1:10.5、1:11、1:11.5、1:12、1:12.5、1:13、1:13.5、1:14、1:14.5或者1:15；或这些数值中任意两个组成的范围1：（7.5~12）。
在其中一些实施例中，按体积百分比计，冻存液的制备原料包括10%~12%血清白蛋白溶液、8%~10%二甲基亚砜及75%~80%右旋糖酐40葡萄糖注射液。
在其中一些实施例中，甲基亚砜和右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积比为1：（7.5~10）。
本申请的另一实施方式还提供一种间充质干细胞的冻存方法，包括：将待冻存的间充质干细胞与上述间充质干细胞冻存液进行混合后再冷冻。
在其中一些实施例中，上述间充质干细胞的密度为6×106个/mL~7×106个/mL。
在其中一个实施例中，上述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞。可以理解的是，在其他一些实施例中，间充质干细胞不限于脐带来源的间充质干细胞，还可以是其他来源的间充质干细胞。
在其中一些实施例中，上述混合的步骤包括步骤S10~步骤S20。
步骤S10：向间充质干细胞中加入预冷的血清白蛋白溶液和部分右旋糖酐40葡萄糖注射液进行重悬，得到中间混合物。
步骤S20：向步骤S10中得到的中间混合物中加入预冷的二甲基亚砜和剩余的右旋糖酐40葡萄糖注射液，进行混合。
在其中一些实施例中，预冷处理的温度为2℃~8℃。
在其中一些实施例中，预冷处理的时间为30min以上。
在其中一些实施例中，上述冷冻的步骤包括：先于0℃~4℃下，进行预冷处理；进行第一次降温处理，以0.5℃/min~2℃/min的速度降温至-40℃；进行第二次降温处理，以4℃/min~6℃/min的速度降温至-90℃。
在一具体示例中，冷冻的步骤包括：先于4℃下，进行预冷处理；进行第一次降温处理，以1℃/min的速度降温至-40℃；进行第二次降温处理，以5℃/min的速度降温至-90℃。
且在-135℃超低温液氮条件下长期保存，经复苏后细胞活率不低于85％，细胞形态正常，后续增殖能力、分化潜能和免疫调节能力不受影响。上述间充质干细胞的冻存方法无需进行离心洗涤，对细胞的损伤小，且无再次清洗操作时引入的污染风险，提高了间充质干细胞生物制品批次间的质量稳定性和间充质干细胞生物制品的活性。
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
血清白蛋白溶液中血清白蛋白含量为0.2g/mL，来源于美国杰特贝林生物制品有限公司，商品型号（进口药品注册证号）为S20190035；二甲基亚砜来源于Sigma公司，商品型号为D2650；右旋糖酐40葡萄糖注射液中右旋糖酐40的含量为30 g/mL（每500mL含30g），葡萄糖的含量为25 g/mL（每500mL含25g），来源于四川科伦药业股份有限公司，商品型号为国药准字H51020230；间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞；胎牛血清购自GIBCO，商品型号为A5669701；培养液（DMEM/F12）购自GIBCO，商品型号为11330057。
实施例1
实施例1提供的间充质干细胞液氮冻存保护液，其制备步骤为：
1.提前配制好冷冻保护剂：
冻存液1（二甲基亚砜：右旋糖酐40葡萄糖注射液=1：1.6）。
2.冻存液放置于2-8℃冷藏预冷30min以上。
3.消化收集第4代的脐带间充质干细胞于离心瓶中，根据计数结果用含白蛋白的右旋糖酐40葡萄糖注射液重悬，再加入冻存液1（细胞悬液：冻存液1=3：1），最终细胞浓度为6.25×106个/mL。
4.将细胞悬液分装至5mL冻存管中，4mL/管，细胞数为2.5×107个/管。
5.程序降温仪中进行程序降温：开机待温度降温至4℃时等待，此时放入冻存管，以1℃/min的速度降温至-40℃，再以5℃/min的速度降温至-90℃。程序冷冻结束后转移至气相液氮罐中。每批次可冻存400管以上，细胞总数达到1010。
实施例2
实施例2中间充质干细胞的冻存方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于冻存条件不同，具体步骤如下：
将冻存管放入程序降温盒后，放入超低温冰箱过夜，再移入气相液氮罐中。
实施例3
实施例3~4与实施例1不同之处仅在于：冻存保护液各制备原料的体积不同，具体见表1。
对比例1
对比例1提供的间充质干细胞液氮冻存保护液，其制备步骤为：
1.提前配制好冷冻保护剂：
冻存液1（二甲基亚砜：右旋糖酐葡萄糖注射液=1：1.6）。
2.冻存液放置于2-8℃冷藏预冷30min以上。
3.消化收集第4代的脐带间充质干细胞于离心瓶中，根据计数结果用含白蛋白的培养液重悬，其中培养液为含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，再加入冻存液1（细胞悬液：冻存液1=3：1），最终细胞浓度为6.25×106个/mL。
4.将细胞悬液分装至5mL冻存管中，4mL/管，细胞数为2.5×107个/管。
5.程序降温仪中进行程序降温：开机待温度降温至4℃时等待，此时放入冻存管，以1℃/min的速度降温至-40℃，再以5℃/min的速度降温至-90℃。程序冷冻结束后转移至气相液氮罐中。每批次可冻存400管以上，细胞总数达到1010。
对比例2
对比例2中间充质干细胞的冻存方法与对比例1基本相同，不同之处仅在于冻存条件不同，具体步骤如下：
将冻存管放入程序降温盒后，放入超低温冰箱过夜，再移入气相液氮罐中。
对比例3
对比例3提供的间充质干细胞液氮冻存保护液，其制备步骤为：
1.提前配制好冷冻保护剂：
冻存液2（二甲基亚砜：胎牛血清=1：4）。
2.冻存液放置于2-8℃冷藏预冷30min以上。
3.消化收集第4代的脐带间充质干细胞于离心瓶中，根据计数结果用含白蛋白的培养液重悬，其中培养液为含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，再加入冻存液2（细胞悬液：冻存液2=1：1），最终细胞浓度为6.25×106个/mL。
4.将细胞悬液分装至5mL冻存管中，4mL/管，细胞数为2.5×107个/管。
5.程序降温仪中进行程序降温：开机待温度降温至4℃时等待，此时放入冻存管，以1℃/min的速度降温至-40℃，再以5℃/min的速度降温至-90℃。程序冷冻结束后转移至气相液氮罐中。每批次可冻存400管以上，细胞总数达到1010。
对比例4
对比例4中间充质干细胞的冻存方法与对比例3基本相同，不同之处仅在于冻存条件不同，具体步骤如下：
将冻存管放入程序降温盒后，放入超低温冰箱过夜，再移入气相液氮罐中。
对比例5
对比例5与实施例1不同之处仅在于：冻存保护液各制备原料的体积不同，具体见表1。
表1
一、性能测试
1.检测细胞活率
气相液氮罐冻存一定时间后，37℃解冻复苏，检测细胞活率。
用DPBS将样品稀释至细胞数5-10×106/mL；使用0.2%台盼蓝染色（1：1）将细胞悬液充分混匀；用移液枪取20μL细胞悬液加入计数板样品槽；计数板推入计数仪；点击Countstar细胞计数仪软件进行样品测量。
2.对实施例和对比例复苏后的间充质干细胞的细胞表型进行检测，具体采用流式检测的方法检测干细胞表面标志物。
3.对实施例和对比例复苏后的间充质干细胞的增殖能力进行检测，具体采用生长曲线法计算干细胞倍增时间。
4.对实施例和对比例复苏后的间充质干细胞的分化潜能进行检测，具体采用茜素红（ARS） 染色法分析干细胞的成骨能力、油红O（Oil red O） 染色法分析干细胞的成脂能力、阿辛蓝（Alcian Blue） 染色法分析干细胞的成软骨能力。
5.对实施例和对比例复苏后的间充质干细胞的免疫调节能力进行检测，具体采用对人淋巴细胞增殖抑制来检测间充质干细胞的免疫抑制能力。
二、测试结果
其中，细胞活率检测结果如下表2所示。
表2 间充质干细胞冻存液活菌计数结果
根据上述表2结果可知，实施例1及实施例2解冻复苏后细胞活率均大于90%，优于对比例3~4，说明不含血清的间充质干细胞冻存液可以达到常规含血清的间充质干细胞冻存液的冻存效果，而且二甲基亚砜的含量由10%降低到9.6%。虽然实施例1~2及对比例1~2解冻复苏后细胞活率均大于90%，但是实施例1和实施例2中用可用于临床的右旋糖酐葡萄糖注射液替代了对比例1~4中的培养液，可进一步降低将来临床应用的风险。此外，结合程序冷冻仪程序降温冻存，可每批次冻存细胞总数达1010以上，批次间差异小。
人脐带间充质干细胞解冻复苏后的细胞显微图如图1所示，解冻复苏后人脐带间充质干细胞形态正常，流式分析人脐带间充质干细胞表达结果如图2所示，其中，横坐标表示细胞数量，纵坐标表示荧光强度，结果显示人脐带间充质干细胞表达CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD45、CD19、HLADR、CD11b，人脐带间充质干细胞解冻复苏后的生长曲线如图3所示，人脐带间充质干细胞成骨诱导分化后茜素红染色结果如图4所示，人脐带间充质干细胞成脂诱导分化后油红O染色结果如图5所示，人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化后阿辛蓝染色结果如图6所示，后续分化潜能不受影响；人脐带间充质干细胞免疫抑制检测结果如表3所示，人脐带间充质干细胞解冻复苏后细胞的免疫调节能力正常。
表3
综上所述，通过本申请间充质干细胞冻存方法，使用不含外源性动物血清、不含培养基的冻存液配方联合程序冷冻仪程序降温冻存，可实现规模化无血清间充质干细胞冻存，每批次可以冻存1010以上干细胞。本申请解实施例中冻复苏后脐带来源间充质干细胞与对比例中解冻复苏后脐带来源间充质干细胞相比，细胞活率更高、细胞形态正常，后续增殖能力、分化潜能和免疫调节能力不受影响。因此，本申请间充质干细胞冻存液对干细胞的长期深低温保存具有重要意义。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，按体积百分比计，所述冻存液的制备原料包括10%~15%血清白蛋白溶液、5%~10%二甲基亚砜及75%~85%右旋糖酐40葡萄糖注射液；所述血清白蛋白溶液中血清白蛋白的浓度为0.1g/mL~0.3g/mL，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液中右旋糖酐40的浓度为25 g/mL ~35 g/mL，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液中葡萄糖的浓度为20 g/mL ~30 g/mL；所述二甲基亚砜和所述右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积比为1：（7.5~15）。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，按体积百分比计，所述冻存液的制备原料包括10%~12%血清白蛋白溶液、8%~10%二甲基亚砜及75%~80%右旋糖酐40葡萄糖注射液。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述二甲基亚砜和所述右旋糖酐40葡萄糖注射液的体积比为1：（7.5~10）。
4.一种间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待冻存的间充质干细胞与如权利要求1~3任一项所述的间充质干细胞冻存液进行混合后再冷冻。
5.根据权利要求4所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述间充质干细胞的密度为6×106个/mL~7×106个/mL。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞。
7.根据权利要求4~6任一项所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述混合的步骤包括：
向所述间充质干细胞中加入预冷的血清白蛋白溶液和部分右旋糖酐40葡萄糖注射液进行重悬，得到中间混合物；
向所述中间混合物中加入预冷的二甲基亚砜和剩余的右旋糖酐40葡萄糖注射液，进行混合。
8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于，所述预冷满足（1）~（2）中至少一个条件：
（1）所述预冷处理的温度为2℃~8℃；
（2）所述预冷处理的时间为30min以上。
9.根据权利要求4~6任一项所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述冷冻的方法包括：
先于0℃~4℃下，进行预冷处理；
进行第一次降温处理，以0.5℃/min~2℃/min的速度降温至-40℃；
进行第二次降温处理，以4℃/min~6℃/min的速度降温至-90℃。
10.根据权利要求9所述的间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述冷冻的方法包括：
先于4℃下，进行预冷处理；
进行第一次降温处理，以1℃/min的速度降温至-40℃；
进行第二次降温处理，以5℃/min的速度降温至-90℃。
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