CN117751914A - 间充质干细胞冻存液、注射液和冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种间充质干细胞冻存液，所述冻存液由甘油、人血白蛋白(HSA)和医用注射液组成。本发明的间充质干细胞冻存液组分简单明确，均采用临床级试剂，不含血清和动物源成分且不含有DMSO，冻存细胞复苏后可直接输注人体，显著减少洗涤过程所带来的细胞损失和损伤，更适于临床级间充质干细胞的长期储存。使用本发明的冻存液批次间稳定和室温稳定性均较好，能有效维持冻存后间充质干细胞良好的增殖能力和生物学功能且冻存过程简单，为临床级间充质干细胞的存储和广泛应用提供了条件。
Description
技术领域
本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种间充质干细胞冻存液、注射液和冻存方法。
背景技术
间充质干细胞(MSC，Mesenchyma1 Stroma1 Cell)作为一种成体干细胞，具有自我更新以及多向分化潜能，在体外或体内特定的诱导条件下，可分化为骨、软骨、脂肪、神经、肝、心肌、内皮等多种间质组织细胞，并具有较强的免疫调控功能。目前基于MSC的临床研究已经在许多国家广泛展开，主要应用于组织损伤修复(如硬骨、软骨损伤)、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、炎性肠炎)、器官移植后移植物抗宿主病(GvHD)、心血管疾病(如脑卒中、心肌梗死)、神经系统疾病(如阿尔茨海默症)等。现阶段用于临床研究或治疗的MSC主要来源于脐带、胎盘、骨髓以及脂肪组织等，此类自体或异体来源的MSC，普遍存在如保存期限较短的问题。
人诱导多能干细胞来源间充质样细胞(iMSC，human induced pluripotent stemcells-derived Mesenchymal Stem Cell)是由iPSC(human induced pluripotent stemcell)在特定条件下诱导分化获得，具有与MSC相同的分化和免疫调节功能。在药品GMP标准下工业化制备的iMSC细胞性质高度均一、特性稳定且质量可控，解决了MSC疗法的现存问题并实现细胞治疗产品的标准化和可控性，可用于不同疾病的临床治疗，并提高细胞治疗的有效率和稳定性。基于上述优势，天然组织来源的间充质干细胞治疗药物正逐步向iPSC来源的间充质干细胞药物升级转变，目前国内外也已经开展了诸多iMSC细胞治疗相关的临床研究。
然而与常规药品和其他生物制品不同，不同来源的MSC治疗产品的功能性成分为具有活力的细胞，细胞治疗产品的长期有效储存和使用时的细胞状态是影响治疗效果的关键因素，也是目前细胞治疗临床转化的主要难点。现阶段细胞的长期保存主要通过冻存实现，通常经冻存复苏后的细胞应能维持较高的活率、回收率和相应的生物学功能，有效的细胞冻存主要与细胞冻存液和冻存方式有关。
目前常用的细胞冻存液包含较高浓度的胎牛血清、细胞培养基、二甲基亚砜(DMSO，Dimethylsulfoxide)等其他非渗透性和渗透性冻存保护剂，由于其成分复杂不明确，在临床使用上存在一定风险。部分培养基中添加的功能型糖衍生物由糖类化合物与烯醇的氧化产物通过加成反应制备得到，存在批次间不稳定性且批次差异较大，无法标准化制备的问题。此外，DMSO对细胞和人体有一定的毒副作用。临床使用时为了去除血清、DMSO等成分，通常冻存的细胞制剂复苏后需反复多次洗涤以适用于临床应用，操作繁琐污染风险增加而且导致细胞损伤和损失大，不利于临床应用。目前还未探索出一种较为理想的间充质干细胞冻存液。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成分简单明确，冻存复苏后细胞能够直接注射，同时确保复苏后细胞的高活率和0小时回收率并维持细胞干性和生物学功能的间充质干细胞冻存液及冻存方法。为了解决上述问题，本发明提供了一种可直接输注人体的间充质干细胞冻存液，所述间充质干细胞冻存液由甘油、人血白蛋白和医用注射液组成。
优选的，所述间充质干细胞冻存液中：甘油的体积浓度为0.2％-30％；人血白蛋白的质量浓度为0.2％-18％；余量为医用注射液。
优选的，所述间充质干细胞冻存液中：甘油的体积浓度为1％-15％；人血白蛋白的质量浓度为1％-15％；余量为医用注射液。
优选的，所述间充质干细胞冻存液中：甘油的体积浓度为2％-15％；人血白蛋白的质量浓度为1％-15％；余量为医用注射液。
优选的，所述间充质干细胞冻存液中：甘油的体积浓度为5％-15％；人血白蛋白的质量浓度为1％-15％；余量为医用注射液。
更优选的，所述间充质干细胞冻存液中：甘油的体积浓度为5％-15％；人血白蛋白的质量浓度为5％-10％；余量为医用注射液。
优选的，所述医用注射液选自复方电解质注射液、氯化钠注射液和右旋糖酐氯化钠注射液中的一种。
更优选的，所述医用注射液为复方电解质注射液。
本发明提供了一种间充质干细胞注射液，所述间充质干细胞注射液包含本发明所述的间充质干细胞冻存液和间充质干细胞。
本发明提供了一种间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：使用本发明所述的间充质干细胞冻存液将间充质干细胞进行冻存。
优选的，所述冻存方式为直接将所述间充质干细胞置于-196℃以下的温度下冻存。
优选的，所述间充质干细胞在所述间充质干细胞冻存液中的冻存密度为8×106-12×106个细胞/mL。
有益效果
本发明的间充质干细胞冻存液成分简单明确，均采用临床级试剂，不含血清和动物源成分且不含有DMSO，冻存复苏后的细胞可直接输注人体从而显著减少洗涤过程所带来的细胞损伤和损失，更适于临床级间充质干细胞的长期储存。冻存液中各组分相互配合，能够大大减少冻存过程中对细胞的伤害，显著提高复苏后细胞的活率和0小时回收率并维持细胞的干性和生物学功能(包括淋巴细胞增殖抑制能力和三系分化能力)，同时细胞冻存液的批次稳定，冻存效果重复性良好，并且细胞复苏后可在室温放置，具有较好的室温稳定性，有效维持了间充质干细胞的高活率、高0小时回收率和生物学功能。此外，根据本发明某些实施方案的间充质干细胞冻存液还具有高的24小时活细胞回收率，细胞增殖能力良好。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。在附图中：
图1A为间充质干细胞冻存流程图；
图1B为冻存的间充质干细胞复苏流程图；
图2显示了冻存液中不同体积百分比甘油对iMSC冻存复苏后0小时活细胞回收率与细胞活率的影响；
图3显示了冻存液中不同体积百分比甘油对iMSC冻存复苏后培养24小时的活细胞回收率的影响；
图4显示了冻存液中不同质量百分比人血白蛋白对iMSC冻存复苏后0小时活细胞回收率与细胞活率的影响；
图5显示了冻存液中不同质量百分比人血白蛋白对iMSC冻存复苏后培养24小时的活细胞回收率的影响；
图6显示了不同医用注射液对iMSC冻存复苏后0小时活细胞回收率与细胞活率的影响；
图7显示了不同医用注射液对iMSC冻存复苏后培养24小时的活细胞回收率的影响；
图8显示了将维生素C添加到冻存液中对iMSC冻存复苏后细胞活率以及培养24小时活细胞回收率的影响；
图9显示了将海藻糖添加到冻存液中对iMSC冻存复苏后细胞活率以及培养24小时活细胞回收率的影响；
图10显示了iMSC冻存前(A)和复苏接种培养24小时后(B)40×与200×放大倍数下细胞形态图；
图11显示了将蔗糖和/或L-异亮氨酸添加到冻存液中对iMSC冻存复苏后培养24小时活细胞回收率的影响；
图12显示了不同冻存方式对iMSC冻存复苏后0小时活细胞回收率与细胞活率的影响；
图13显示了不同冻存方式对iMSC冻存复苏后培养24小时活细胞回收率的影响；
图14显示了不同细胞冻存密度对iMSC冻存复苏后0小时活细胞回收率与细胞活率的影响；
图15显示了不同细胞冻存密度对iMSC冻存复苏后培养24小时活细胞回收率的影响；
图16显示了不同批次的相同冻存液冻存的iMSC复苏后0小时活细胞回收率与细胞活率的重复性验证结果；
图17显示了不同批次的相同冻存液冻存的iMSC复苏后培养24小时活细胞回收率的重复性验证结果；
图18显示了冻存液冻存的iMSC复苏后在室温下放置不同时间对于0小时活细胞回收率与细胞活率的影响；
图19显示了冻存液冻存的iMSC复苏后在室温放置不同时间点后接种培养24小时的情况下的细胞形态图(40×与200×放大倍数)；
图20显示了冻存液冻存的iMSC复苏后在室温下放置不同时间对于培养24小时的活细胞回收率的影响；
图21显示了冻存液冻存的iMSC复苏后细胞表面特异性标志物表达检测结果；
图22显示了冻存液冻存的iMSC复苏后细胞的淋巴细胞增殖抑制检测结果；
图23显示了冻存液冻存的iMSC复苏后细胞的三系分化(成脂分化、成硬骨分化、成软骨分化)能力检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方案及实施例中的特征可以相互组合。
本发明提供的可直接输注人体的间充质干细胞冻存液，由甘油、人血白蛋白和医用注射液组成。
本发明中所有组分均为GMP级药用辅料或临床级药品，甘油为药用辅料级甘油(供注射用)，人血白蛋白为临床级人血白蛋白，以医用注射液作为细胞冻存液的基础液，成分明确，配方简单、安全，不含动物源成分且不含有DMSO，冻存复苏后可直接注射，因此可用于临床级间充质样干细胞的存储。冻存液中HSA能在细胞冻存和复苏过程中保护细胞膜，确保冻存复苏过程中细胞的活力，增加细胞的回收率。甘油能够降低冰点，防止细胞内形成冰晶，从而保护细胞不受损害，同时甘油还具有维持渗透压的作用，可以防止细胞因渗透压变化而受到损害，适用于细胞的快速冻存。
细胞冻存复苏后若细胞状态不佳将不利于临床应用，通过冻存复苏后0小时细胞活率和回收率检测可以判断冻存细胞复苏后的细胞状态，进一步的通过培养24小时的活细胞回收率则能够更加充分的了解冻存效果。本发明中间充质干细胞冻存液中的三种组分相互协同，能够大大减少冻存过程中对细胞的伤害并确保高细胞活率，显著提高细胞复苏后0小时回收率，并维持细胞的干性和生物学活性且细胞注射液批次稳定性和室温稳定性好，冻存效果稳定。
本发明的间充质干细胞冻存液中甘油的体积浓度可以为0.2％-30％；人血白蛋白的质量浓度可以为0.2％-18％；余量为医用注射液。
本发明的间充质干细胞冻存液中甘油的体积浓度可以为1％-25％；人血白蛋白的质量浓度为1％-15％；余量为医用注射液。
本发明的间充质干细胞冻存液中甘油的体积浓度可以为1％-20％；人血白蛋白的质量浓度为1％-15％；余量为医用注射液。
本发明的间充质干细胞冻存液中甘油体的体积浓度可以为1％-15％；人血白蛋白的质量浓度可以为1％-15％；余量为医用注射液。
鉴于显著更高的24小时活细胞回收率，优选本发明的间充质干细胞冻存液中甘油的体积浓度为2％-15％；人血白蛋白的质量浓度为1％-15％；余量为医用注射液；更优选本发明的间充质干细胞冻存液中甘油体积浓度为5％-15％；人血白蛋白的质量浓度为1％-15％；余量为医用注射液；进一步更优选本发明的间充质干细胞冻存液中甘油体积浓度可以为5％-15％；人血白蛋白的质量浓度可以为5％-10％；余量为医用注射液。最优选本发明的间充质干细胞冻存液中甘油体积浓度为5％；人血白蛋白的质量浓度为5％；余量为医用注射液。
本发明的间充质干细胞冻存液中，医用注射液可以选自复方电解质注射液、氯化钠注射液和右旋糖酐氯化钠注射液中的一种或其他常用的医用注射液。右旋糖酐氯化钠注射液的实例可以包括右旋糖酐40氯化钠注射液，右旋糖酐70氯化钠注射液等。
本发明的间充质干细胞冻存液中，医用注射液可以为复方电解质注射液。医用注射液选用复方电解质注射液选时，冻存复苏后细胞活率和0小时活细胞回收率均可达到高水平，并且细胞冻存复苏后的24小时活细胞回收率最高，细胞增殖能力最好。
本发明所述的间充质干细胞冻存液冻存间充质干细胞复苏后，可作为间充质干细胞注射液直接输注人体，无需洗涤，更适用于大规模临床应用。
下面具体描述本发明间充质干细胞细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据配制体积，计算冻存液中各组分的量，将对应量的甘油、人血白蛋白和临床级医用注射液混合均匀得到混合溶液；
(2)使用过滤器将步骤(1)得到的混合溶液进行过滤除菌后即可获得间充质干细胞冻存液。
本发明提供了一种间充质干细胞注射液，所述注射液包含本发明所述的间充质干细胞冻存液和间充质干细胞。
本发明中所述间充质干细胞包括天然组织来源的原代间充质干细胞比如PB-MSC，CB-MSC和人诱导多能干细胞来源的间充质样干细胞或者诱导间充质样干细胞，即iMSC。此外，本发明中所述间充质干细胞还包括基因修饰的间充质干细胞比如基因修饰的iMSC。原代间充质干细胞、诱导间充质样干细胞或者基因修饰的间充质干细胞均可以通过本领域常规技术获得或者商购得到或者其他适合的方法制备。
间充质干细胞注射液中的间充质干细胞的量为治疗具体的疾病或病症所需的有效量，可以取决于疾病或病症的性质并且可以通过标准临床技术确定。例如，间充质干细胞注射液中间充质干细胞的量可以为至少约1×106细胞/mL，至少约1×107细胞/mL，至少约1×108细胞/mL，至少约1×109细胞/mL，至少约1×1010细胞/mL，至少约1×1011细胞/mL，或者至少约1×1012细胞/mL。
本发明提供了一种间充质干细胞的冻存方法，可以包括以下步骤：使用本发明所述的间充质干细胞冻存液将间充质干细胞进行冻存。具体的，通过将间充质干细胞悬浮于间充质干细胞冻存液中进行冻存。
更具体地，所述间充质干细胞的冻存方式可以包括：直接将所述间充质干细胞置于-196℃以下的温度下冻存。例如，可以将间充质干细胞冻存液与间充质干细胞混合后灌装至冻存容器中，将冻存容器直接置于-196℃以下的液氮罐中冻存。
所述间充质干细胞的冻存方式还可以包括：首先将所述间充质干细胞置于第一温度比如-80℃的温度下冻存，之后转移至第二温度比如-196℃以下的温度下冻存。例如，可以将所述间充质干细胞冻存液与间充质干细胞混合后灌装至冻存容器中，将冻存容器放入-80℃超低温冰箱冻存，之后转移至-196℃以下液氮罐中储存。
间充质干细胞的冻存方式还可以包括：首先使用程序降温方式将所述间充质干细胞置于第一温度比如-80℃或-100℃冻存，之后转移至第二温度比如-196℃以下的温度下冻存。例如，可以将所述间充质干细胞冻存液与充质干细胞混合后灌装至冻存容器中，使用程序降温方式冻存间充质干细胞注射液，随后转移至-196℃以下液氮罐中储存。
所述的程序降温方式可以包括：以一定降温速率如-1℃/min，从室温降温至-100℃。
所述的程序降温方式还可以包括：
S1：设置降温起始温度为：20℃；
S2：-10℃/分钟降温至0℃；
S3：0℃维持15分钟；
S4：-1℃/分钟降温至-8℃；
S5：-50℃/分钟降温至-45℃；
S6：+15℃/分钟升温至-12℃；
S7：-3℃/分钟降温至-100℃；
S8：-100℃维持5分钟。
在上述冻存方式中，优选直接将所述间充质干细胞置于-196℃以下的温度下冻存。该冻存方式冻存过程简便，可以提供更高的24小时活细胞回收率，更适于iMSC细胞的快速冻存，冻存细胞复苏后细胞增殖能力有效维持。
本发明中间充质干细胞在所述充质干细胞冻存液中的冻存密度可以为1×106-3×107个/mL(例如2×106个/mL、10×106个/mL、25×106个/mL)。
优选地，本发明中间充质干细胞在所述充质干细胞冻存液中的冻存密度为8×106-12×106个/mL(例如9×106个/mL、10×106个/mL、11×106个/mL)。在该冻存密度下，本发明的冻存方法具有显著更高的24小时活细胞回收率。
使用本发明冻存液冻存间充质干细胞的冻存过程简单快速，为临床级间充质干细胞的存储和广泛应用提供了条件。
实施例
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但不能把实施例理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中试剂和原料来源的说明如下，应当说明的是本发明对所用试剂材料的来源不做限制。
间充质干细胞(iMSC)由安徽中盛溯源生物科技有限公司诱导iPSC分化获得(CN201910884482.4)；PBMC购自上海儒百生物科技有限公司(PBMNC050C)；蔗糖购自江苏汉斯通药业有限公司(F20200000093)；L-异亮氨酸购自无锡晶海氨基酸股份有限公司(国药准字H32022213)；维生素C注射液购自上海信谊药业有限公司(国药准字H20054283)；海藻糖购自江苏汉斯通药业有限公司(F20200000284)；甘油购自湖南尔康制药股份有限公司(湘食药辅准字F200050007)；人血白蛋白购自成都蓉生药业有限责任公司(国药准字S10940024)；复方电解质注射液购自山西振东制药股份有限公司(国药准字H20113035)；氯化钠注射液购自安徽双鹤药业有限责任公司(国药准字H34023608)；右旋糖酐40氯化钠注射液购自石家庄四药有限公司(国药准字H13022493)；人间充质干细胞无血清培养基为安徽首宁生物科技有限公司产品(RP02010)；T细胞无血清培养基为安徽首宁生物科技有限公司产品(RP03030)；DPBS购自Thermo Fisher公司(C14190500BT)；TrypLETM Select Enzyme(10×)购自Thermo Fisher公司(A1217702)；CD73-APC抗体购自BD Biosciences公司(560847)；CD90-APC抗体购自BD Biosciences公司(559869)；CD105-APC抗体购自Biolegend公司(323208)；CFSE购自BD Biosciences公司(565082)；PHA购自Sigma公司(11082132001)；IL2购自江苏金丝利药业股份有限公司(国药准字S10970055)；hMSC-成骨分化试剂盒为安徽首宁生物科技有限公司产品(RP02014-C)；人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒为赛业(广州)生物科技有限公司产品(HUXUC-90041)；hMSC-成脂分化试剂盒为安徽首宁生物科技有限公司产品(RP02014-A)。
实施例1：间充质干细胞冻存液中甘油浓度的影响
1、制备间充质干细胞冻存液
按照表1所示的间充质干细胞冻存液配方进行配制，冻存液的配制方法包括以下步骤：
(1)根据冻存液配制体积，计算冻存液中各组分的量，将对应量的甘油、人血白蛋白和医用注射液混合均匀，获得混合溶液；
(2)使用0.22μm过滤器对步骤(1)获得的混合溶液进行过滤除菌后即可获得间充质干细胞冻存液；
(3)将制备的间充质干细胞冻存液置于2-8℃条件下保存。
表1含有不同体积百分比甘油的冻存液组分配比
2、间充质干细胞(iMSC)的冻存
使用具有表1所示配方的冻存液按照图1A所示的步骤将间充质干细胞(iMSC)进行冻存。具体步骤如下：
(1)细胞传代和培养：
使用人间充质干细胞无血清培养基传代培养获得细胞汇合度为80％-95％的待冻存间充质干细胞。
(2)细胞收集：
向细胞培养容器中加入DPBS洗涤细胞1-2次；吸弃DPBS后加入适量0.5×TrypLETMSelect Enzyme至刚好覆盖培养容器底面，37℃条件下消化细胞至完全脱离培养基质；收集细胞悬液，250×g条件下离心5分钟，弃上清，收集细胞沉淀；向获得的细胞沉淀中加入适量复方电解质注射液洗涤细胞一次，随后将细胞均分成6份，250×g条件下离心5分钟，吸弃洗涤液，收集细胞沉淀。
(3)加入间充质干细胞冻存液：
分别向步骤(2)中最终获得的6份细胞沉淀中加入适量表1所示的细胞冻存液，获得相应细胞悬液。
(4)调节至所需细胞冻存密度：
使用Vi-CELL XR细胞计数仪计数后，向各组细胞悬液中补加适量对应细胞冻存液，调节细胞冻存密度为10×106个/mL。
(5)灌装细胞至冻存容器：
将步骤(4)所得各组细胞悬液灌装至2mL细胞冻存管中，灌装体积为1mL。
(6)细胞冻存：
将各组细胞悬液置于-80℃超低温冰箱冻存过夜后，转移至-196℃液氮罐中长期储存。
3、间充质干细胞复苏
冻存的间充质干细胞复苏流程如图1B所示，具体包括以下步骤：
(1)细胞37℃水浴复苏：
从液氮罐中取出冻存的间充质干细胞，并将各组冻存细胞依次置于37℃水浴锅中，轻柔摇晃至完全解冻；
(2)复苏后细胞计数：
分别从各组解冻后的iMSC细胞悬液中取适量细胞悬液，使用Vi-CELL XR细胞计数仪计数，记录复苏0小时细胞活率、活细胞密度，并计算复苏后0小时活细胞回收率，结果见图2；0小时活细胞回收率＝[(活细胞密度×1mL)/(1×107个活细胞)]×100％。
如图2所示，各组冻存的iMSC细胞复苏后细胞活率高达约93％-97％，0小时活细胞回收率高达约96％-107％，可见含有不同浓度甘油的冻存液冻存iMSC复苏后细胞活率和0小时活细胞回收率均可达到高水平。
(3)细胞接种培养：
分别从各组解冻后的iMSC细胞悬液中，移取1×106个细胞接种至预加2mL人间充质干细胞无血清培养基的6孔板一孔中，并置于37℃、5％CO2浓度以及饱和湿度的二氧化碳培养箱中静置培养24±2小时。
(4)细胞拍照与消化收集：
各组iMSC细胞悬液复苏后接种培养24小时，吸弃培养上清，使用DPBS洗涤细胞1-2次，吸弃DPBS后向6孔板每孔中加入1mL 0.5×TrypLETM Select Enzyme，37℃条件下消化细胞至完全脱离培养基质，获得各组消化后细胞悬液。
(5)细胞计数：
取各组消化后细胞悬液，使用Vi-CELLXR细胞计数仪分别计数，获得各组活细胞密度，并计算iMSC复苏后接种培养24小时活细胞回收率，结果见图3。所述24小时活细胞回收率＝[(活细胞密度×1mL)/(1×106个细胞)]×100％。
如图3所示，甘油体积浓度为2％-15％的第2组至第6组细胞冻存液冻存iMSC复苏后接种培养24小时的情况下，仍有50％以上的24小时活细胞回收率，尤其是第4组至第6组细胞冻存液中甘油体积浓度为5％-15％，其24小时活细胞回收率可达到100％以上，表明细胞冻存复苏后的增殖能力能有效维持。
实施例2：间充质干细胞冻存液中人血白蛋白浓度的影响
1、制备间充质干细胞冻存液
按照表2所示的间充质干细胞冻存液配方进行配制，冻存液的配制方法参照实施例1。
表2含有不同质量百分比人血白蛋白的冻存液组分配比
2、间充质干细胞(iMSC)的冻存
使用具有表2所示配方的冻存液按照图1A所示的步骤将间充质干细胞(iMSC)进行冻存。具体步骤参照实施例1。
3、间充质干细胞复苏
将冻存的间充质干细胞按照附图1B所示的复苏流程复苏，并进行相关检测。具体步骤参照实施例1。
iMSC复苏后细胞活率和0小时活细胞回收率的结果显示于图4中，且iMSC复苏后接种培养24小时的活细胞回收率显示于图5中。如图4所示，各组冻存的iMSC复苏后细胞活率高达约95％-99％，0小时活细胞回收率高达约96％-103％，可见含有不同浓度的人血白蛋白的冻存液冻存iMSC复苏后细胞活率和0小时活细胞回收率均可达到高水平。如图5所示，所有细胞冻存液冻存iMSC复苏后接种培养24小时的活细胞回收率基本上均可达到约80％以上，尤其是第3组和第4组细胞冻存液细胞冻存复苏后24小时活细胞回收率更高，细胞增殖能力良好，其中第3组人血白蛋白质量浓度为5％时效果最佳。
实施例3：间充质干细胞冻存液中医用注射液的影响
1、制备间充质干细胞冻存液
选用不同医用药典级注射液测试冻存效果。细胞冻存液的具体配制比例如表3，具体配制方法参照实施例1。
表3含有不同医用注射液的细胞冻存液组分配比
2、间充质干细胞的冻存
使用具有表3所示配方的冻存液按照图1A所示的步骤将间充质干细胞(iMSC)进行冻存。具体步骤参照实施例1。
3、间充质干细胞复苏
将冻存的间充质干细胞按照附图1B所示的复苏流程复苏，并进行相关检测。具体步骤参照实施例1。
iMSC复苏后细胞活率和0小时活细胞回收率的结果显示于图6中，且iMSC复苏后接种培养24小时的活细胞回收率显示于图7中。如图6所示，细胞冻存液中分别使用复方电解质注射液、氯化钠注射液和右旋糖酐40氯化钠注射液作为医用注射液时，各组冻存的iMSC复苏后细胞活率高达约96％-97％，0小时活细胞回收率高达约96％-110％，可见使用不同医用注射液的冻存液冻存iMSC复苏后细胞活率和0小时活细胞回收率均可达到高水平。如图7所示，分别使用三种医用注射液的细胞冻存液冻存iMSC复苏后接种培养24小时的活细胞回收率均大于80％；其中，当使用复方电解质注射液作为医用注射液时，细胞冻存复苏后24小时活细胞回收率最高，细胞增殖能力最好。
实施例4：冻存液中维生素C的添加对间充质干细胞冻存效果的影响
1、制备间充质干细胞冻存液
按照表4所示的间充质干细胞冻存液配方进行配制，冻存液的配制方法包括以下步骤：
(1)根据冻存液配制体积，计算上述冻存液中各组分的量，将对应量的维生素C注射液、甘油、人血白蛋白和医用注射液混合均匀，获得混合溶液；
(2)使用0.22μm过滤器步骤(1)获得的混合溶液进行过滤除菌后即可获得间充质干细胞冻存液；
(3)将制备的间充质干细胞冻存液置于2-8℃条件下保存。
表4含有维生素C的冻存液与不含维生素C的冻存液的组分配比
2、间充质干细胞(iMSC)的冻存
使用具有表4所示配方的冻存液按照图1A所示的步骤将间充质干细胞(iMSC)进行冻存。具体步骤参照实施例1。
3、间充质干细胞复苏
将冻存的间充质干细胞按照附图1B所示的复苏流程复苏，并进行相关检测。具体步骤参照实施例1。
iMSC复苏后细胞活率和24小时活细胞回收率的结果显示于图8中。如图8所示，添加维生素C的第2组细胞冻存液与不添加维生素C的第1组冻存液冻存iMSC复苏后细胞活率分别为97.3％和96.8％，可见，冻存液中添加维生素C对于细胞活率没有影响。类似地，冻存液中添加维生素C对于0小时活细胞回收率也几乎没有影响(未图示)，相反地，冻存液中添加维生素C会使24小时活细胞回收率从约104％下降至约87％。因此，细胞冻存液中添加维生素C不仅导致冻存液成本增加，而且不利于iMSC的冻存，因此冻存液中不需要添加维生素C。
实施例5：冻存液中海藻糖的添加对间充质干细胞冻存效果的影响
1、制备间充质干细胞冻存液
按照表5所示的间充质干细胞冻存液配方进行配制，冻存液的配制方法包括以下步骤：
(1)根据冻存液配制体积，计算上述冻存保护液中各组分的量，将对应量的海藻糖、甘油、人血白蛋白和医用注射液混合均匀，获得混合溶液；
(2)使用0.22μm过滤器对步骤(1)获得的混合溶液进行过滤除菌后即可获得间充质干细胞冻存液；
(3)将制备的间充质干细胞冻存液置于2-8℃条件下保存。
表5含有海藻糖的冻存液与不含海藻糖的冻存液的组分配比
2、间充质干细胞的冻存
使用具有表5所示配方的冻存液按照图1A所示的步骤将间充质干细胞(iMSC)进行冻存。具体步骤参照实施例1。
3、间充质干细胞复苏
将冻存的间充质干细胞按照附图1B所示的复苏流程复苏，并进行相关检测。具体步骤参照实施例1。
iMSC复苏后细胞活率和24小时活细胞回收率的结果显示于图9中。如图9所示，添加海藻糖的第2组细胞冻存液与不添加海藻糖的第1组冻存液冻存iMSC复苏后细胞活率分别为97.3％和96.1％，可见，冻存液中添加海藻糖对于细胞活率没有影响，类似地，冻存液中添加海藻糖对于0小时活细胞回收率也几乎没有影响(未图示)，相反地，冻存液中添加海藻糖会使24小时活细胞回收率从约104％下降至约74％。因此，细胞冻存液中添加海藻糖不仅导致冻存液成本增加，而且不利于iMSC的冻存，因此冻存液中不需要添加添加海藻糖。
实施例6：冻存液中蔗糖和/或L-异亮氨酸的添加对间充质干细胞(iMSC)冻存效果的影响
1、制备间充质干细胞冻存液
按照表1所示的间充质干细胞冻存液配方进行配制，冻存液的配制方法包括以下步骤：
(1)根据冻存液配制体积，将对应量的甘油、人血白蛋白与医用注射液混合均匀，获得混合溶液；
(2)当需要添加蔗糖和/或L-异亮氨酸时，使用步骤(1)获得的混合溶液溶解相应量的蔗糖和/或L-异亮氨酸，充分溶解并混合均匀后加入医用注射液定容至配制体积；
(3)使用0.22μm过滤器对所得混合溶液进行过滤除菌后即可获得间充质干细胞冻存液；
(4)将制备的间充质干细胞冻存液置于2-8℃条件下保存。
表6含有蔗糖和/或L-异亮氨酸的间充质干细胞冻存液与不含蔗糖和/或L-异亮氨酸的间充质干细胞冻存液组分配比
2、间充质干细胞(iMSC)的冻存
使用具有表6所示配方的冻存液按照图1A所示的步骤将间充质干细胞(iMSC)进行冻存。具体步骤如下：
(1)细胞传代和培养：
使用人间充质干细胞无血清培养基传代培养获得细胞汇合度为80％-95％的待冻存间充质干细胞，拍照记录冻存前细胞生长状态，结果见图10(A)(图示为配方2冻存液，其余配方结果相似未展示)。
(2)细胞收集：
向细胞培养容器中加入DPBS洗涤细胞1-2次；吸弃DPBS后加入适量0.5×TrypLETMSelect Enzyme至刚好覆盖培养容器底面，37℃条件下消化细胞至完全脱离培养基质；收集细胞悬液，250×g条件下离心5分钟，弃上清，收集细胞沉淀；向获得的细胞沉淀中加入适量复方电解质注射液洗涤细胞一次，随后将细胞均分成6份，250×g条件下离心5分钟，吸弃洗涤液，收集细胞沉淀。
(3)加入间充质干细胞冻存液：
分别向步骤(2)中最终获得的细胞沉淀中加入适量表1所示的细胞冻存液，获得相应细胞悬液；
(4)调节至所需细胞冻存密度：
使用Vi-CELL XR细胞计数仪计数后，向各组细胞悬液中补加适量对应细胞冻存液，调节细胞冻存密度为10×106个/mL。
(5)灌装细胞至冻存容器：
将步骤(4)所得各组细胞悬液灌装至2mL细胞冻存管中，灌装体积为1mL。
(6)细胞冻存：
将各组细胞悬液置于-80℃超低温冰箱冻存过夜后，转移至-196℃液氮罐中长期储存。
3、间充质干细胞复苏
冻存的间充质干细胞复苏流程如图1B所示，具体包括以下步骤：
(1)细胞37℃水浴复苏：
从液氮罐中取出冻存的间充质干细胞，并将冻存细胞依次置于37℃水浴锅中，轻柔摇晃至完全解冻。
(2)细胞接种培养：
分别从各组解冻后的iMSC细胞悬液中，移取1×106个细胞接种至预加2mL人间充质干细胞无血清培养基的6孔板一孔中，并置于37℃、5％CO2浓度以及饱和湿度的二氧化碳培养箱中静置培养24±2小时。
(3)细胞拍照与消化收集：
拍照记录iMSC复苏后接种培养24小时，细胞形态结果见图10(B)，随后吸弃培养上清，使用DPBS洗涤细胞1-2次，吸弃DPBS后向6孔板每孔中加入1mL 0.5×TrypLETM SelectEnzyme，37℃条件下消化细胞至完全脱离培养基质，获得各组消化后细胞悬液。
(4)细胞计数：
取各组消化后细胞悬液，使用Vi-CELLXR细胞计数仪分别计数，获得活细胞密度，并计算iMSC复苏后接种培养24小时活细胞回收率，结果见图11；所述24小时活细胞回收率＝[(活细胞密度×1mL)/(1×106个细胞)]×100％。
如图10所示，各组细胞冻存液冻存iMSC，冻存前和复苏接种培养24小时后细胞形态一致。使用添加蔗糖和/或L-异亮氨酸的细胞冻存液获得的细胞活率和0小时细胞回收率与使用未添加蔗糖和/或L-异亮氨酸的细胞冻存液获得的细胞活率和0小时细胞回收率基本类似(未图示)，因此，蔗糖和/或L-异亮氨酸的添加对于细胞活率和0小时细胞回收率基本没有影响。如图11所示，冻存液中添加蔗糖和/或L-异亮氨酸反而会使24小时活细胞回收率从约113％和约123％下降至小于40％，因此，细胞冻存液中添加蔗糖和/或L-异亮氨酸不仅导致冻存液成本增加，而且不利于iMSC的冻存，因此冻存液中不需要添加添加蔗糖和/或L-异亮氨酸。
实施例7：不同冻存方法对间充质干细胞冻存效果的影响
使用实施例6中具有表6所示的配方2的冻存液将间充质干细胞(iMSC)进行冻存，步骤(1)-(5)同实施例1，步骤(6)按照如下方式进行：
A)先将装有间充质干细胞悬液的冻存管放入-80℃超低温冰箱冻存，随后转移至液氮罐(-196℃)中冻存；或，
B)直接将装有间充质干细胞悬液的冻存管置于液氮罐(-196℃)中冻存；或，
C)使用程序降温仪降温(降温速率-1℃/min，降温至-100℃)，随后将装有间充质干细胞悬液的冻存管转移至液氮罐(-196℃)中冻存；或，
D)使用程序降温仪降温，随后将装有间充质干细胞悬液的冻存管转移至液氮罐(-196℃)中冻存，所述的降温程序包括以下步骤：
S1：设置降温起始温度为：20℃；
S2：-10℃/分钟降温至0℃；
S3：0℃维持15分钟；
S4：-1℃/分钟降温至-8℃；
S5：-50℃/分钟降温至-45℃；
S6：+15℃/分钟升温至-12℃；
S7：-3℃/分钟降温至-100℃；
S8：-100℃维持5分钟。
3、间充质干细胞复苏
将冻存的间充质干细胞按照附图1B所示的复苏流程复苏，并进行相关检测。具体步骤参照实施例1。结果显示于图12和图13中。
如图12所示，不同冻存方式下(A、B、C、D)冻存iMSC复苏后细胞活率为约90％以上，基本相近，0小时活细胞回收率均大于90％，尤其是在冻存方式B和D下的0小时活细胞回收率均大于110％；如图13所示，不同冻存方式对于24小时活细胞回收率的影响与对于0小时活细胞回收率的影响类似，其中B和D组冻存方式下的24小时活细胞回收率均大于110％，尤其是B组直接将iMSC细胞悬液置于-196℃液氮罐中冻存，24小时活细胞回收率最高，该冻存方式冻存过程简便，更适于iMSC细胞的快速冻存，冻存细胞复苏后细胞增殖能力有效维持。
实施例8：细胞冻存密度对冻存效果的影响
1、制备间充质干细胞冻存液
按照实施例6表6中配方2的冻存液配方进行配制，冻存液的配制方法参照实施例1。
2、间充质干细胞(iMSC)的冻存
使用按照配方2配制的冻存液冻存间充质干细胞(iMSC)，冻存步骤如图1A所示，具体冻存步骤参照实施例1，不同之处在于，将实施例1中步骤(3)和步骤(4)中对应的冻存液替换为按照表6中配方2配制的冻存液，步骤(4)中使用Vi-CELL XR细胞计数仪计数后，向各组沉淀中补加适量配方2的冻存液分别调节细胞冻存密度为：细胞冻存密度1(VCD 1)为2×106个细胞/mL±20％、细胞冻存密度2(VCD 2)为10×106个细胞/mL+20％、细胞冻存密度3(VCD 3)为25×106个细胞/mL±20％。
3、间充质干细胞复苏
冻存的间充质干细胞复苏流程如图1B所示。具体步骤参照实施例1。结果显示于图14和图15中。
如图14所示，使用按照表6中配方2配制的冻存液冻存不同密度的iMSC复苏后细胞活率相似，为约90％以上，0小时活细胞回收率均在78％以上，尤其是在细胞冻存密度2(VCD2)条件下的0小时活细胞回收率大于100％。如图15所示，不同冻存密度对于24小时活细胞回收率具有显著的影响，其中VCD 2冻存密度下的24小时活细胞回收率高达125％，而VCD 3冻存密度下的24小时活细胞回收率仅为66.8％，尤其是VCD 1冻存密度下的24小时活细胞回收率低至19.8％，表明在VCD 2冻存密度下冻存效果最佳，冻存细胞复苏后细胞增殖能力有效维持。
实施例9：冻存液冻存效果重复性验证
1、制备间充质干细胞冻存液
按照实施例6中表6所示的组别2配方重复3次进行间充质干细胞冻存液的配制，具体配制步骤参照实施例6。
2、间充质干细胞的冻存
使用以上重复配制的3批间充质干细胞冻存液按照图1B所示步骤将间充质干细胞(iMSC)进行冻存，具体实验步骤参照实施例1。
3、间充质干细胞复苏
将冻存的间充质干细胞按照附图1B所示的复苏流程复苏，并进行相关检测。具体步骤参照实施例1。结果显示于图16和图17中。
如图16所示，使用不同批次的相同冻存液冻存iMSC并复苏后细胞活率基本上相似，为约90.8％-91.5％，且0小时活细胞回收率基本上相似，为约105％-114％。如图17所示，不同批次的相同冻存液冻存的细胞复苏后接种培养24小时活细胞回收率基本上相似，为约112％-130％。因此，本发明的三组分冻存液批次稳定、冻存效果重复性好。
实施例10：冻存液稳定性验证
1、制备间充质干细胞冻存液
按照实施例6中表6所示的组别2配方进行间充质干细胞冻存液的配制，具体配制步骤参照实施例1。
2、间充质干细胞的冻存
使用以上间充质干细胞冻存液按照图1A所示步骤将间充质干细胞(iMSC)进行冻存，具体步骤参照实施例1。
3、间充质干细胞复苏
将冻存的间充质干细胞按照图1B所示的复苏流程复苏，并进行相关检测，具体包括以下步骤：
(1)细胞37℃水浴复苏：
从-196℃液氮罐中取出冻存的iMSC细胞，并将冻存细胞置于37℃水浴锅中，轻柔摇晃至完全解冻；
(2)解冻细胞放置：
将解冻后的iMSC细胞悬液分为5组，分别在室温条件下放置0小时、1小时、2小时、3小时、4小时；
(3)复苏后细胞计数：
分别从解冻后室温放置对应时间点的iMSC细胞悬液中取适量细胞悬液，使用Vi-CELLXR细胞计数仪计数，记录复苏后室温放置对应时间点细胞活率、活细胞密度，并计算室温放置对应时间点活细胞回收率，结果见图18；所述室温放置对应时间点活细胞回收率＝[(活细胞密度×1mL)/(1×107个活细胞)]×100％。
如图18所示，复苏后的细胞在室温条件下放置4小时内，细胞活率和0小时细胞回收率分别从90.8％和114.0％呈现缓慢下降趋势，但在4小时的时间点仍然维持76.2％的较高活率并且细胞回收率仍然大于80％；
(4)细胞接种培养：
分别从解冻后室温放置对应时间点的iMSC细胞悬液中，移取1×106个细胞接种至预加2mL人间充质干细胞无血清培养基的6孔板一孔中，并置于37℃、5％CO2浓度以及饱和湿度的二氧化碳培养箱中静置培养24±2小时；
(5)细胞拍照与消化收集：
拍照记录复苏后室温放置对应时间点细胞接种培养24小时后的细胞形态(结果见图19)，复苏的各组iMSC细胞接种培养24小时后，吸弃培养上清，使用DPBS洗涤细胞1-2次，吸弃DPBS后向6孔板每孔中加入1mL0.5×TrypLETM Select Enzyme，37℃条件下消化细胞至完全脱离培养基质，获得各组消化后细胞悬液；
如图19所示，在冻存细胞复苏后室温放置数小时(0-4h)然后接种培养24小时的情况下，仍有大量贴壁细胞且细胞形态与冻存前贴壁细胞形态保持一致。
(6)细胞计数：
取各组消化后细胞悬液，使用Vi-CELL XR细胞计数仪分别计数，获得活细胞密度，并计算复苏后室温放置对应时间点细胞在接种培养24小时后的活细胞回收率，结果见图20；所述24小时活细胞回收率＝[(活细胞密度×1mL)/(1×106个细胞)]×100％。
如图20所示，在细胞于室温条件下放置4小时内(尤其是3小时内)然后接种培养24小时的情况下，仍然保持较高的活细胞回收率，尤其是在细胞放置3小时内的情况下其活细胞回收率大于80％。可见，使用本发明的细胞冻存液冻存后的iMSC室温稳定性较好，符合临床转化要求，适合于作为细胞注射液直接用于细胞输注等各种临床应用场合。
实施例11：间充质干细胞冻存复苏后生物学功能检测
1、间充质干细胞冻存后复苏
从-196℃液氮罐中取出储存1个月的实施例6中组别2的细胞冻存液冻存的iMSC细胞，按照图1B所示的间充质干细胞复苏流程进行细胞复苏，并检测其相关生物学功能，包括：1)细胞表面特异性标志物表达检测；2)淋巴细胞增殖抑制检测；3)细胞三系分化(成脂分化、成硬骨分化、成软骨分化)能力检测。
( 1)细胞表面特异性标志物表达检测
取实施例6中组别2的细胞冻存液冻存复苏后的iMSC细胞，进行细胞计数，之后分装4支，每支1×105-2×105个活细胞，一支为对照组不加抗体，剩余3支分别加入APC标记的CD73、CD90以及CD105抗体，2-8℃条件下避光孵育30分钟后，使用流式细胞仪检测分析，结果见图21。如图21所示，细胞冻存前与冻存复苏后iMSC细胞表面特异性标志物表达相似，细胞冻存不改变细胞原有表型即能有效维持细胞干性和功能，iMSC细胞表面特异性标志物CD73、CD90以及CD105表达量均大于99.8％。
(2)淋巴细胞增殖抑制检测
S1：取实施例6中组别2的细胞冻存液冻存复苏后的iMSC细胞，接种至预加2mL人间充质干细胞无血清培养基的6孔板一孔中，置于37℃、5％CO2浓度以及饱和湿度的二氧化碳培养箱中静置培养至细胞汇合度为80％-95％；
S2：取出培养至细胞汇合度为80％-95％的iMSC细胞，消化后计数，按1.5×105个活细胞/mL接种至6孔板一孔，每孔接种2mL细胞悬液，并置于37℃、5％CO2浓度以及饱和湿度的二氧化碳培养箱中静置培养1天；
S3：冻存的PBMC复苏后，使用T细胞无血清培养基重悬，并置于37℃、5％CO2浓度以及饱和湿度的二氧化碳培养箱中静置培养1天；
S4：取出培养1天的PBMC加入CFSE，轻柔混匀后，37℃条件下避光孵育10分钟，进行细胞标记，随后使用T细胞无血清培养基稀释洗涤标记的PBMC，离心后再次使用T细胞无血清培养基重悬PBMC，并进行细胞计数；
S5：设置A)单独培养组：根据计数结果按2.5×105个活细胞/mL的PBMC接种至6孔板一孔，每孔接种2mL细胞悬液，并向单独培养组培养基(T细胞无血清培养基)中加入PHA(终浓度为5μg/mL)和IL2(终浓度为100IU/mL)进行刺激；B)iMSC与PBMC共培养组：取培养1天的iMSC，吸弃原培养基，使用DPBS洗涤2次，并按2.5×105个活细胞/mL加入标记的PBMC，iMSC与PBMC共培养比例为3：5，其中向共培养组培养基(T细胞无血清培养基)中加入PHA(终浓度为5μg/mL)和IL2(终浓度为100IU/mL)进行刺激；
S6：将单独培养组和iMSC与PBMC共培养组细胞置于37℃、5％CO2浓度以及饱和湿度的二氧化碳培养箱中静置培养5天；
S7：细胞培养5天后，拍照记录各组细胞生长状态，结果见图22；同时移取各组培养上清，并轻柔吹散，随后使用细胞计数仪计数，计算iMSC对淋巴细胞增殖抑制率，计算公式为淋巴细胞增殖抑制率＝[1-(共培养组总活细胞数/单独培养组总活细胞数)]×100％。
如图22所示，单独培养组培养至第5天可见明显的PBMC细胞团块生长(图A)，其中活细胞总数为0.9×105个活细胞；共培养组培养至第5天无明显的PBMC细胞团块生长(图B)，其中活细胞总数为9.16×105个活细胞，淋巴细胞增殖抑制率为90.17％，说明冻存的iMSC细胞复苏后具有淋巴细胞增殖抑制能力。
(3)细胞三系分化(成脂分化、成硬骨分化、成软骨分化)能力检测
取实施例6中组别2的细胞冻存保护液冻存复苏后的iMSC细胞，分别使用hMSC-成脂分化试剂盒、hMSC-成骨分化试剂盒以及人脐带间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒进行iMSC三系分化，并使用油红O对成脂细胞进行染色，茜素红对成硬骨细胞进行染色，阿利新蓝对成软骨细胞进行染色，结果见图23。
如图23所示，根据染色结果可以看出，冻存的iMSC细胞复苏后具有成脂分化能力(图A)、成硬骨分化能力(图B)和成软骨分化能力(图C)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种可直接输注人体的间充质干细胞冻存液，所述间充质干细胞冻存液由甘油、人血白蛋白和医用注射液组成。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液中，甘油的体积浓度为0.2％-30％，人血白蛋白的质量浓度为0.2％-18％，余量为医用注射液。
3.根据权利要求2所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液中，甘油的体积浓度为1％-15％，人血白蛋白的质量浓度为1％-15％，余量为医用注射液。
4.根据权利要求3所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液中，甘油的体积浓度为2％-15％，人血白蛋白的质量浓度为1％-15％，余量为医用注射液。
5.根据权利要求4所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液中，甘油的体积浓度为5％-15％，人血白蛋白的质量浓度为1％-15％，余量为医用注射液。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液中，甘油的体积浓度为5％-15％，人血白蛋白的质量浓度为5％-10％，余量为医用注射液。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述医用注射液为选自复方电解质注射液、氯化钠注射液和右旋糖酐氯化钠注射液中的一种。
8.根据权利要求7所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述医用注射液为复方电解质注射液。
9.一种间充质干细胞注射液，所述间充质干细胞注射液包含权利要求1-8任意一项所述的间充质干细胞冻存液和间充质干细胞。
10.一种间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
使用权利要求1-8任意一项所述的间充质干细胞冻存液将间充质干细胞进行冻存。
11.根据权利要求10所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存的方式为：直接将所述间充质干细胞置于-196℃以下的温度下冻存。
12.根据权利要求11所述的冻存方法，其特征在于，所述间充质干细胞在所述间充质干细胞冻存液中的冻存密度为8×106-12×106个细胞/mL。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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