MX2010010251A - Kit para extraer sangre, de preferencia sangre periferica, para la produccion de citoblastos. - Google Patents

Abstract

Kit (10) para extraer sangre, de preferencia, sangre periférica, para la producción de citoblastos pluripotentes, que comprende al menos un primer recipiente (12), con capacidad para contener la sangre extraída, que contiene un anticoagulante y la sustancia MCSF (factor estimulante de colonias de macrófagos).

Description

KIT PARA EXTRAER SANGRE, DE PREFERENCIA, SANGRE PERIFÉRICA, PARA LA PRODUCCIÓN DE CITOBLASTOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un Kit para extraer sangre, de preferencia, de tipo periférico, para la producción de citoblastos adultos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En años recientes el uso de citoblastos en terapia ha tenido amplia aprobación debido al éxito obtenido en el tratamiento de patologías que hasta ahora se consideraban incurables . Sin embargo, los métodos conocidos para obtener los citoblastos son largos, laboriosos y costosos. Los citoblastos pluripotentes (PSC por sus siglas en inglés) son una fuente disponible no sólo para la investigación sino también para la generación de medicamentos y para trasplantes (Wagers A.J. et al., 2002; Griffith L.G. et al., 2002). Hay citoblastos adultos y embrionarios, los primeros se derivan de blastocitos de 8 días, mientras que las células adultas se pueden obtener principalmente de la médula ósea, de tejido adiposo o muscular, de sangre periférica y del cordón umbilical.

La definición de citoblasto está en evolución constante y a la fecha no hay un consenso general ni un método estándar para aislarlos o identificarlos. Para todas estas células, las embrionarias (ES) y las adultas, tanto hemopoyéticas (HSC por sus siglas en inglés) como mesenquimatosas (MSC por sus siglas en inglés) (Kuwana M. et al., 2003), se han identificado varios marcadores genéticos, algunos de los cuales son comunes a muchos tipos de células (Condomines M. et al., 2006; Kang W.J. et al., 2006; Zaho Y. et al., 2003; Rabinovitch M. et al., 1976). Hasta el momento, la investigación está más orientada hacia el uso de citoblastos aislados de tejido embrionario, fetal y del cordón umbilical, pero esto genera problemas legales y éticos. Además de todo, en la actualidad el uso de estas células tiene varias contraindicaciones como riesgos de infección, de rechazo si se trasplantan y en algunos mamíferos como caballos, el desarrollo de teratomas . Para superar estos problemas, es sabido que la terapia " in vivo" usa citoblastos autólogos, de preferencia, aislados de médula ósea, tejido adiposo o sangre periférica. Partiendo de citoblastos adultos hay una etapa de diferenciación " in vi tro" (o "ex vivo") de los citoblastos en la línea deseada, por medio de factores específicos de inducción de la diferenciación y un una etapa posterior de trasplante " in vivo" de la línea celular diferenciada obtenidas. En estos métodos existe la desventaja del fenómeno de rechazo ya que las células diferenciadas reintroducidas al organismo afectado, no son reconocidas como células propias, en la medida que pierdan los factores de autoreconocimiento durante la etapa de diferenciación inducida in vitro. En el ser humano, extraer citoblastos de sangre periférica implica su purificación a través de un proceso denominado aféresis o leucoaféresis . Las células se extraen de la sangre, se recolectan y luego se inoculan en los pacientes inmediatamente después de la quimioterapia o la radioterapia . En la aféresis, que dura de 6 a 8 horas, la sangre se extrae de la vena de un brazo o de la vena del cuello o el pecho y se hace pasar a través de un aparato que separa los citoblastos. La sangre, purificada así, regresa al paciente, mientras que las células extraídas se conservan en refrigeración en nitrógeno líquido (Condomines M. et al., 2006; Kang W.J. et al., 2006). Esta técnica, aparte de ser dolorosa, también es sumamente estresante para el paciente. Sobre todo, la técnica no permite una real discriminación y/o purificación de los citoblastos circulantes. Las principales técnicas de purificación conocidas son: uso de factores de crecimiento o derivados plaquetarios (TGF-B, VEGF) , pero los costos de extraerlos son prohibitivos (Hou M. et al., 2006); aislamiento de citoblastos extraídos de médula ósea, que permite purificar y por lo tanto utilizar para terapia, aproximadamente 15% de las células contenidas en el material extraído; aislamiento de citoblastos de tejido adiposo, el cual requiere la eliminación quirúrgica de cantidades considerables de tejido del donante y no permite la administración intravenosa; IGF-l (factor de crecimiento insulinoide) conocido como tendotrofina (Fiedler J. et al., 2006); UBM (matriz de vejiga urinaria) : esta es un derivado del cerdo, que contiene citocinas (pero no células nucleadas) , que inducen la cicatrización de la herida pero no la regeneración de la zona lesionada (Zhang YS et al., 2005) . Zhao Y. et al . , describe otro método conocido, en el artículo "A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells" ("Subgrupo derivado de monocitos de sangre periférica humana actúa como citoblastos pluripotentes" ) y en el documento WO-A-2004/043990. Este es un método para preparar citoblastos que se derivan de monocitos, cuyas etapas consisten en aislar monocitos de sangre periférica, ponerlos en contacto con un componente mitogénico y posteriormente realizar el cultivo de los monocitos de sangre periférica en condiciones adecuadas para la propagación de las células. Este método, que inicialmente requiere de una etapa para aislar los monocitos y luego la etapa de expansión en un medio de cultivo, es muy largo, aproximadamente 15 a 20 días, para obtener un número significativo de citoblastos y no permite obtener citoblastos pluripotentes , es decir, no especializados, adecuados para inocularse directamente y después de un corto tiempo en el paciente. De nuevo, en la metodología de preparación de citoblastos a partir de monocitos, se conocen los documentos WO-A-2005/046570 , WO-A-2007/131200 y WO-A-03/083092. Sin embargo, puesto que se tiene que llevar a cabo un paso de purificación preliminar de la sangre con el fin de aislar sólo la fracción celular, es decir, los monocitos, y una expansión posterior para obtener los citoblastos buscados, los métodos descritos en estos documentos consumen mucho tiempo, una vez más del orden de 15 a 40 días para obtener una cantidad aceptable de citoblastos . Considerando lo anterior, existe la evidente necesidad de perfeccionar un método de expansión o de división y purificación de citoblastos adultos a partir de fuentes fácilmente disponibles, en particular, de sangre, de preferencia, sangre periférica, que permita también obtener citoblastos aptos para tratamiento farmacológico. También existe una evidente necesidad de comenzar la producción de citoblastos a partir de la sangre, de preferencia, sangre periférica, en un tiempo lo más corto posible, a fin de poder intervenir con rapidez en el paciente. Por lo tanto, el propósito de la presente invención es tener un Kit para la extracción de sangre, de preferencia, sangre periférica, para la producción de citoblastos pluripotentes , que permita comenzar con rapidez la producción de citoblastos pluripotentes. El solicitante ha concebido, evaluado y realizado la presente invención para superar las deficiencias del edo de la técnica y obtener estos y otros objetivos y ventajas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se plantea y caracteriza en la reivindicación independiente, mientras que las reivindicaciones dependientes describen otras características de la invención o variantes de la idea inventiva principal. Un método para la proliferación y purificación in vitro de citoblastos a partir de sangre, de preferencia, sangre periférica, desarrollado por los autores de la presente y descrita en la solicitud de patente internacional PCT/EP2007/059531 a nombre del presente solicitante, la cual se considera parte de la presente, como referencia, permite obtener citoblastos pluripotentes adultos y comprende una primera etapa que tiene dos subetapas : a) una primera subetapa de proliferación de citoblastos de sangre periférica, después de que se ha extraído la sangre, por medio de un tratamiento in vitro con MCSF (factor estimulante de colonias de macrófagos, por sus siglas en inglés) en una concentración entre 8 y 15 nM, de preferencia, 10 nM; b) una segunda subetapas de purificación, de preferencia, por medio de fraccionación en un gradiente de Ficoll . La primera subetapa de proliferación puede tener una duración variable según las condiciones en las cuales se lleva a cabo el tratamiento in vitro,- los autores han verificado experimentalmente que la duración del tratamiento in vitro con MCSF comprendida entre 24 y 96 horas, favorablemente entre 48 y 72 horas, da lugar a la estabilización de la proliferación, con identificación de los marcadores de citoblastos CD 90, CD 90/34, CD34 y CD117. Esta condición se considera la óptima. La purificación de la segunda subetapa básicamente tiene como fin destruir los corpúsculos rojos. La segunda etapa, que utiliza los semiproductos obtenidos en la etapa b) , permite la etapa c) proliferación de los citoblastos de sangre periférica, purificados en la etapa b) por medio de tratamiento in vitro con MCSF en una concentración comprendida entre 33 y 55 nM, de preferencia, 50 nM, con más preferencia 45 nM. Con estas concentraciones de MCSF, las células conservan el fenotipo de citoblastos pluripotentes adultos. Esta segunda etapa puede tener una duración que varía entre 24 y 96 horas, de preferencia, entre 48 y 72 horas . Se ha observado que, por el contrario, si se usa MCSF en una concentración mayor a 55 nM (por ejemplo, 70 nM) que después de 24 horas las células ya no conservan en fenotipo de citoblastos pluripotentes. En particular, la etapa a) de división y proliferación previa en suspensión con MCSF después de que la sangre se ha extraído permite aumentar el porcentaje de citoblastos. La siguiente etapa b) permite obtener citoblastos pluripotentes adultos, una vez administrados al paciente, se diferencian directamente in vivo sin provocar el fenómeno de rechazo o infección.

La eficacia de esta producción está soportada por la presencia de los marcadores de citoblastos CD90, CD90/34, CD34 y CD117 y por el hecho de que los citoblastos no pierden los factores de autoreconocimiento después de la división o expansión. Estos citoblastos no producen efectos colaterales como el fenómeno de rechazo, infección o desarrollo de teratomas, una vez administrados al paciente y son susceptibles de diferenciarse in vivo y comportarse como citoblastos pluripotentes . Los autores han observado que las células que han proliferado asi, por división o expansión, una vez inyectadas por vía local o intravenosa, adquieren in vivo (y no " in vitro" , como en los métodos conocidos en la técnica actual, por medio de factores de crecimiento adecuados y/o estímulos químicos (Gulati R. et al., 2003; Katz R.L. et al., 2002; Okazaki T. et al., 2005)) todas las características morfológicas y químicas de células macrofágicas , linfocíticas , epiteliales, endoteliales , neuronales y hepatocitos, según las necesidades y patologías del organismo vivo tratado. El método es menos invasivo que otros métodos empleados a la fecha para extraer citoblastos, sin dolor (a diferencia de la aféresis) y económico. Por último, la posibilidad de obtener estas células con facilidad y también poder conservarlas durante un tiempo prolongado, por ejemplo, refrigeradas en nitrógeno líquido, hace que las células obtenidas con el método según la invención sean aptas para trasplantes autólogos y para el tratamiento de muchas patologías (lesiones de varios tipos, enfermedades metabólicas y patologías neurológicas e inflamatorias crónicas) . Según una característica de la presente invención, un Kit para extraer sangre, de preferencia sangre periférica, para la producción de citoblastos pluripotentes según el método descrito en lo anterior, comprende un primer recipiente con capacidad para contener la sangre extraída, por ejemplo, un tubo de ensaye, que contiene un anticoagulante y la sustancia MCSF. Normalmente, el primer recipiente está hecho de vidrio. Con este Kit es posible extraer la sangre, de preferencia, sangre periférica, para comenzar de inmediato la proliferación y producción de citoblastos por medio del método descrito en lo anterior y por lo tanto, hacer que la producción de los mismos sea más rápida. Por lo tanto, la principal ventaja de la presente invención es que se obtiene una cantidad suficiente de citoblastos pluripotentes en un tiempo muy limitado, incluso en sólo 48 horas, en comparación con los métodos conocidos en la técnica actual, manipulando directamente la sangre entera. Por lo tanto, el Kit para extraer sangre según la presente invención, se propone como una solución rápida y eficaz para obtener citoblastos pluripotentes en forma directa a partir de la sangre, de preferencia, sangre periférica . Por lo general, la concentración de MCSF en el tubo de ensaye del Kit según la presente invención, varía de aproximadamente 2 a 20 nM, de preferencia, de aproximadamente 8 a 10 nM. Por lo general, se usa heparina o EDTA como anticoagulante. La presencia del anticoagulante es esencial para prevenir el inicio de la coagulación de la sangre, mientras que el MCSF es responsable del procedimiento de proliferación y expansión de los citoblastos. Según una modalidad variante de la presente invención, el Kit puede contener uno o más recipientes además del primero, por ejemplo, un tubo de ensaye. Este último, de preferencia, hecho con al menos una pared interna de un material, por ejemplo, material plástico como polipropileno (PP) , tratado con rayos infrarrojo o gamma, que impidan la adhesión de los citoblastos a la pared y en consecuencia su agregación, condición que debe evitarse. Normalmente, para esto último, hay un segundo recipiente para contener los citoblastos obtenidos para uso intravenoso y un tercer recipiente de diferente tamaño para uso local. Los citoblastos producidos en esos recipientes se pueden usar de inmediato o se pueden conservar, en nitrógeno líquido, de manera que se puedan usar posteriormente, cuando surja la necesidad. Según otra variante, los recipientes, tanto el utilizado para extraer la sangre, que contiene el anticoagulante y el MCSF, como los utilizados para la conservación, se pueden identificar por un número de serie, común, secuencial o generado conforme a un criterio predeterminado, a fin de facilitar la identificación en el laboratorio, en donde los citoblastos se preparan en el momento del transporte. Para una identificación unívoca es posible usar código de barras y/o etiquetas RFID, de lectura o lectura y escritura, que se apliquen a los recipientes, junto con los correspondientes lectores ópticos o electromagnéticos . La primera subetapa de proliferación del método descrito en lo anterior, de preferencia, inicia inmediatamente después de que la sangre se muestrea, para que mientras tanto la sangre no se coagule. La expresión "inmediatamente después"- significa el tiempo más corto posible entre el momento en el que se extrae la sangre y su coagulación, a fin de prevenir la coagulación de la sangre y comenzar la expansión de los citoblastos en el tiempo más corto posible después de que la sangre se ha extraído. En otras palabras, la expresión "inmediatamente después" se refiere al hecho de que la proliferación de los citoblastos inicia inmediatamente después de que la sangre se extrae del paciente, considerando que, para la presente invención, es esencial que el proceso de expansión comience antes de que la sangre se coagule . De hecho, la sangre recién extraída del paciente se coloca en el tubo de ensaye con el anticoagulante y el MCSF. El anticoagulante bloquea el inicio de la coagulación, mientras que la presencia simultánea de MCSF permite el rápido comienzo del proceso de expansión y garantiza la reducción del tiempo al mínimo, para comenzar el tratamiento en el paciente. Esta definición también incluye el caso en el que la muestra de sangre, de preferencia, sangre periférica, se extrae del paciente, se le adiciona anticoagulante a fin de bloquear la coagulación de la sangre que se somete a un proceso de conservación que no altera su capacidad para producir citoblastos. Si es necesario, la sangre se toma del lugar donde se almacena y se somete al proceso de expansión para citoblastos según se describió en lo anterior, es decir, adicionando MCSF y se obtiene con mucha rapidez la cantidad necesaria de citoblastos.

Por lo tanto, un procedimiento para muestrear y conservar sangre, de preferencia, sangre periférica, queda dentro del campo de la presente invención, el procedimiento tiene la capacidad de producir citoblastos en bancos sanguíneos adecuados y su uso posterior, cuando sea necesario, para la producción de citoblastos pluripotentes, al adicionar MCSF. Normalmente, después de extraer la sangre de donde se almacena, se coloca en un tubo de ensaye que ya contiene el MCSF en una concentración de 2 a 20 nM, de preferencia, 8 a 10 nM. Esto permite evitar el complejo y costoso procedimiento de conservar citoblastos, que dispone, por ejemplo, el uso de nitrógeno líquido tal como se mencionó antes y en su lugar utilizar sólo las técnicas convencionales de conservación de sangre.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE UNA MODALIDAD PREFERIDA Con relación a la Figura 1, un Kit (10) para extracción de sangre periférica según la presente invención, para la producción de citoblastos pluripotentes, comprende un primer tubo de ensaye (12) de vidrio, que contiene la sustancia MCSF (14) y en este caso heparina (16) . La concentración de MCSF en el tubo de ensaye (11) varía de aproximadamente 8 a 10 nM. El Kit comprende otros dos tubos de ensaye (18) y (20) de material plástico como polipropileno (PP) , tratados con rayos infrarrojos o gamma. Un segundo tubo (18) tiene como finalidad conservar las células obtenidas para uso intravenoso y un tercer tubo de ensaye (20) para uso local. Es importante que los tubos (12), (18) y (20) garanticen la esterilidad de su contenido. Los tubos de ensaye (12) , (18) y (20) están provistos de su respectivo tapón (22), (24) para taparlos. Los tapones (22) , (24) , pueden ser de presión, de rosca o de otro tipo. El tapón (22) del recipiente (12) puede ser, por ejemplo, de tipo presión. El tapón (24) de cada uno de los tubos (18) y (20) puede ser, por ejemplo, de tipo rosca. Las dimensiones del segundo tubo de ensaye (18) son: 115 mm de altura, 17 mm de diámetro, 0.3 mm de espesor y capacidad de 12 mL, mientras que las dimensiones del tercer tubo (20) son: 110 mm de altura, 30 mm de diámetro, 0.3 mm de espesor y capacidad de 40 mL. Después de la expansión por medio del MCSF según la presente invención, las células aisladas de sangre periférica actúan " in vivo" como citoblastos pluripotentes (PSC, por sus siglas en inglés) y son adecuadas para resolver en el transcurso de pocos meses lesiones o patologías incurables o curables sólo lentamente con los métodos y/o medicamentos clásicos.

MATERIALES Y MÉTODOS Muestreo ; Cada muestra de sangre periférica, aproximadamente 0.5 a 7 mL, se extrajo de caballos y perros a partir de las extremidades inferiores y de inmediato se introdujo en tubos de ensaye que contenían una cantidad adecuada de heparina y MCSF (10 nM) . En cualquier caso, se pueden utilizar otros anticoagulantes como EDTA. En este punto, se lleva a cabo la primera subetapa del tratamiento in vitro, en el que tenemos la división y proliferación previa de los citoblastos, gracias al MCSF.

Purificación: Las muestras de sangre se diluyeron 1:5 en PBS (solución salina con fosfato) que contenía NH4C1 (200 mM) , para provocar la lisis de los corpúsculos rojos, se centrifugaron a 10,000 g, se lavaron dos veces con PBS y se centrifugaron otra vez a 200 g. Las células nucleadas obtenidas se incubaron durante 7 a 12 horas a 37°C, de preferencia, durante 10 a 12 horas y se purificaron por fraccionación en gradiente de Ficoll, luego se aislaron y se lavaron tres veces con medio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) . Una vez purificadas, las células se incubaron otras 24 a 72 horas en presencia de 50 ng/mL de MCSF 45 nM, para obtener células, en las que aproximadamente 95% tienen fenotipo CD90 (según se determina por medio de análisis citofluorimétrico en un fotómetro de flujo FACScan de Becton Dickinson) , que luego se expanden a fin de obtener el número de células necesarias para tratamientos locales o centrifugados a 10,000g y se suspenden en PBS a una concentración aproximada de 90 x 103 células/mL para tratamientos intravenoso.

Inmunotinción: Para la fenotipificación citológica, las células se lavaron con PBS y se fijaron en un portaobjetos, en formaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a 20°C. A fin de identificar las proteínas intracelulares , las células se permeabilizaron con Tritón X-100 5% durante 5 minutos a 20°C y luego se incubaron durante 1 hora con los anticuerpos primarios diluidos en PBS que contenía BSA al 1% (para bloquear los sitios inespecíficos del antígeno) . Después de tres lavados sucesivos, los portaobjetos se incubaron durante 45 minutos con el conjugado de anticuerpo secundario con el fluorocromo más apropiado: FITC o tetrametil rodamina B isotiocianato (TRITC) o Cy5. Todos los anticuerpos secundarios fueron desarrollados utilizando un asno como hospedero, por Jackson ImmunoResearch. Las pruebas de inmunocitoquímica se llevaron a cabo a una temperatura de 4°C y en atmósfera saturada de humedad. Después de tres lavados, los portaobjetos se montaron utilizando "gelvatol_PBS" . Las imágenes de fluorescencia se adquirieron por medio de un microscopio de fluorescencia y como estándar interno la inmunofluorescencia directa contra gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa (anticuerpo policlonal de oveja producido por Cortex Biochem, San Leandro, CA) . Como controles negativos y para calibrar los niveles de fondo de fluorescencia, se utilizaron portaobjetos incubados con anticuerpos específicos, del mismo isotipo que las muestras correspondientes. El método así descrito se usó para identificar todos los marcadores (CD90, CD90/34, CD34 y CD117) y los marcadores reportados en la siguiente tabla.

Tabla: Caracterización de las células tratadas con MCSF (PCS) y macrófagos aislados de sangre periférica Intensidad de fluorescencia relativa Antígenos de superficie PSC Macrófagos MAC-1 76 ± 18 84 ± 15 CD14 126 ± 29 157 + 19 CD34 77 ± 16 15 ± 5 CD45 143 ± 26 165 ± 38 Producción de citocinas IL-1 82 ± 27 83 ± 12 IL-6 43 ± 22 67 + 14 IL-10 7 ± 8 58 + 7 TNF- 25 ± 16 67 ± 16 Indicadores funcionales Fagocitosis 187 ± 23 195 ± 26 Estimulación 0.72 ± 0.07 0.17 ± 0.02 Linfocitos, Abs540 Citotoxicidad % 9 ± 4 72 ± 6 Es evidente que se pueden hacer modificaciones y/o adiciones de partes, al Kit para la extracción de sangre, de preferencia, sangre periférica, para la producción de citoblastos según se describió en lo anterior, sin desviarse del campo y alcance de la invención. También es evidente que aunque la presente invención se ha descrito con referencia a los ejemplos, el experto en la técnica sin duda podrá lograr muchas otras formas equivalentes del Kit para extraer sangre, de preferencia, sangre periférica, para la producción de citoblastos, que tengan las características expuestas en las reivindicaciones y por lo tanto todas quedan dentro del campo de protección definido por las mismas.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Kit para recolectar sangre, de preferencia, sangre periférica, para la producción de citoblastos pluripotentes , caracterizado porque comprende al menos un primer recipiente (12) , con capacidad para contener la sangre extraída, que contiene un anticoagulante y la sustancia MCSF (factor estimulante de colonias de macrófagos) .
2. 2. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración de MCSF en el primer recipiente (12) está comprendida entre aproximadamente 2 nM y 20 nM.
3. 3. Kit según la reivindicación 2, caracterizado porque la concentración de MCSF en el primer recipiente (12) está comprendida entre aproximadamente 8 nM y 10 nM.
4. 4. Kit según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque el anticoagulante es heparina o EDTA.
5. 5. Kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende un elemento de cierre (22) para el primer recipiente (12) .
6. 6. Kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque también comprende al menos un segundo recipiente (18, 20) hecho con al menos la pared interna de un material que impide la adhesión de los citoblastos .
7. 7. Kit según la reivindicación 6, caracterizado porque el material es material plástico como polipropileno (PP) , tratado con rayos infrarrojos o gamma.
8. 8. Kit según las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque comprende un elemento de cierre (24) para cada recipiente (18, 20) .