CN110205288A - 一种治疗炎症性肠炎的细胞制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂，其中，所述细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞，所述细胞制剂为CD126阳性的细胞制剂。

Description

一种治疗炎症性肠炎的细胞制剂
技术领域
本发明涉及一种治疗炎症性肠炎的细胞制剂，其为一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂，特别其为一种CD126阳性的脐带沃顿区间充质干细胞制剂，本发明还涉及其制备方法、以及制备培养基及应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一种慢性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩病(Crohn Disease,CD)，该病与自身免疫功能紊乱密切相关，该病在西方国家很常见，近年我国IBD病例数激增，现已成为消化系统常见病及慢性腹泻的主要病因。到目前为止，其病因及具体的发病机理仍不清楚，临床上缺少对该病的根本性治疗方案。世界卫生组织把该病列为现代难治病之一。
现有的IBD治疗主要在于控制活动性炎症和调节免疫紊乱,常用的有3类药物：水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫抑制剂。长期使用上述药物会给患者带来很多不良反应,且对危重病例的疗效有限。对病情危重者须采用外科手术治疗，手术治疗后亦存在严重影响患者生活质量以及术后复发等问题。随着生物治疗技术迅猛发展，间充质干细胞移植治疗为IBD的治疗带来新的曙光。
常用的间充质细胞包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等，其中脐带沃顿区间充质干细胞最有研究潜力。与常用的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)相比，脐带沃顿区间充质干细胞具有来源丰富、对供体无影响、易于采集和运输、致癌性可能性小、病毒污染概率低、免疫源性弱、无社会、伦理和法律方面争议等诸多优点。更重要的是从脐带沃顿区分离的间充质干细胞含量高、增殖能力高于骨髓MSCs，免疫原性低于骨髓MSCs，现已成为科研及临床的研究热点。
发明内容
为了解决上述本领域中存在的问题，本发明的目的在于提供一种新型的能够用于治疗IBD的脐带沃顿区间充质干细胞制剂。
本发明提供一种用于治疗IBD的CD126阳性(下文中也称为CD126+)的脐带沃顿区间充质干细胞制剂。
本发明的目的还在于提供一种能够用于制备用于治疗IBD的脐带沃顿区间充质干细胞制剂的方法，以及制备其的培养基。
具体来说，本发明涉及以下方面：
1.一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂，其中，
所述细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞，
所述细胞制剂为CD126阳性的细胞制剂。
2.根据项1所述的细胞制剂，其中，所述细胞制剂为CD126阳性的细胞制剂是指通过细胞流式检测细胞制剂CD126的阳性率在95％以上，优选为99％以上。
3.根据项1或2所述的细胞制剂，其中，
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上，优选在95％以上。
4.根据项1～3中任一项所述的细胞制剂，其中，
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD31阳性率低于10％，优选低于9％，以及
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD45和CD34的阳性率低于5％，优选低于4％，进一步优选低于3％。
5.根据项1～4中任一项所述的细胞制剂，其是通过如下方法制备的细胞制剂，所述方法包括如下步骤：
利用低血清培养基培养来自胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞以获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂，以及
将所述脐带沃顿区间充质干细胞制剂与CD126抗体共孵育，然后通过流式细胞术分选获得的CD126阳性的细胞制剂。
6.根据项5所述的细胞制剂，其中，
所述低血清培养基中的血清浓度低于5vol％，优选为3vol％，
所述低血清培养基包括基础培养基以及生长因子和其他利于细胞生长的物质的组合物。
7.根据项6所述的细胞制剂，其中，所述生长因子及其他利于细胞生长的物质的组合物包括：
人上皮生长因子，即hEGF，
人碱性成纤维生长因子，即b-FGF，
重组人胰岛素样生长因子，
血小板衍生因子，即PDGF，
氢化可的松，
抗坏血酸，
肝素,以及
纤维连接蛋白。
8.根据项6或7所述的细胞制剂，其中，所述基础培养基是DMEM高糖培养基。
9.一种CD126阳性的人脐带沃顿区间充质干细胞制剂的制备，该细胞制剂用于治疗炎症性肠病，以及炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途。
10.根据项9所述的用途，其中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，所述炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎和其他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
11.根据项9或10所述的用途，其中，所述通过细胞流式检测细胞制剂CD126的阳性率在95％以上，优选为99％以上。
12.根据项11所述的用途，其中，所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上，优选在95％以上。
13.根据项12所述的用途，其中，所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD31阳性率低于10％，优选低于9％，以及
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD45和CD34的阳性率低于5％，优选低于4％，进一步优选低于3％。
14.一种制备CD126阳性的人脐带沃顿区间充质干细胞制剂的方法，其包括以下步骤：
利用低血清培养基培养来自胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞以获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂，以及
将所述脐带沃顿区间充质干细胞制剂与CD126抗体共孵育，然后通过流式细胞术分选获得的CD126阳性的细胞制剂。
15.根据项14所述的方法，其中，
所述低血清培养基包含的血清浓度低于5vol％，进一步优选为3vol％，
所述低血清培养基包括基础培养基以及生长因子的组合物。
附图说明
图1流式细胞仪检测人脐带沃顿区间充质干细胞相关标志物的检测结果图。
图2经流式细胞仪分选后的CD126阳性细胞制剂和CD126阴性细胞的表型鉴定。
图3CD126阳性细胞制剂和CD126阴性细胞给药DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠长度变化结果。
图4CD126阳性细胞制剂和CD126阴性细胞给药DSS诱导的结肠炎小鼠的血清炎症因子水平的变化结果。
图5CD126阳性细胞制剂和CD126阴性细胞给药DSS诱导的结肠炎小鼠结肠的病理变化结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细阐述和说明本发明的实施方式，但以下内容不应理解为对本发明作任何限制。
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
本发明涉及一种脐带沃顿区间充质干细胞制剂，其是CD126阳性的细胞制剂，这群细胞表达间充质干细胞的标志物如CD29、CD90、CD105等，且阳性率均在95％以上；而且这群细胞低表达白细胞、内皮细胞、造血干细胞祖细胞，更重要的是CD126阳性细胞几乎不表达移植排斥的标志物如HLA-DR，表明如果将来注射此类细胞制剂后出现过敏反应的可能性极低。
在本发明中，以CD126为标志物，从脐带沃顿区间充质干细胞中分离出CD126阳性和CD126阴性(以下也称为CD126-)两群细胞，流式细胞术分析这两群细胞表面的标志物，发现CD126+和CD126-两群细胞除CD126以外，间充质干细胞标志物、移植排斥标志物、白细胞、内皮细胞、造血干细胞祖细胞等的比例几乎完全一致。
间充质干细胞的标志物很多，鉴定间充质干细胞每次都需要与多种抗体共孵育，染很多个指标才能最终确定。本发明的发明人想寻找是否有一种新的标志物，可以代替其它标注物，成为鉴定间充质干细胞的新指标，幸运的是，本发明的发明人发现了CD126这个指标。CD126也叫IL-6的受体，只有表达CD126的细胞才能感受到炎症因子IL-6的刺激，不表达CD126的细胞不能感受到炎症因子IL-6的刺激。在本发明之前，通常认为CD126阴性的细胞对炎症性肠炎的治疗效果会高于CD126阳性的细胞，因为CD126阴性的细胞感受不到炎症因子IL-6的刺激，炎症性肠炎症状应该会减轻。然而，本发明的发明人意外地发现了相反的结论，意外的发现CD126阳性的细胞制剂治疗效果远远优于CD126阴性的细胞。本发明的发明人推测间充质干细胞在微量炎症因子的刺激下，能够分泌抑制炎症的因子，对抗炎症起到抑炎作用。CD126阳性的细胞表面表达IL-6的受体，能够感受到微量IL-6的刺激，立即发挥抗炎作用，起到减轻炎症的作用；而CD126阴性的细胞表面不表达IL-6的受体，因而感受不到微量IL-6的刺激，起不到对抗炎症的作用。因此，CD126阳性的细胞的治疗效果更好。
本发明涉及一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂，该细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞，该细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上，进一步优选在95％以上。
进一步，该细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD31阳性率低于10％，优选低于9％，该细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD45和CD34的阳性率低于5％，优选低于4％，进一步优选低于3％。
其中，脐带是由中胚层发育而来，是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构，外由羊膜包被，内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白糖和黏多糖的胶状组织构成。沃顿区呈胶状，由成纤维细胞、胶原纤维和蛋白多糖组成。胎儿脐带沃顿区间充质干细胞是从脐带的沃顿区分离得到的间充质干细胞。
在本发明中，CD29、CD44、CD90和CD105均为鉴定间充质干细胞常用的表面标志物，CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率证明该细胞制剂是间充质干细胞且其纯度很高。
在本发明中，CD31是内皮祖细胞的标志物、CD45是白细胞的标志物和CD34造血干细胞的标志物，CD31、CD45以及CD34的三个指标的阳性率低，说明本发明的细胞制剂纯度高。本发明制备的脐带沃顿区间充质干细胞制剂的纯度与用10vol％FBS培养的脐带间充质干细胞纯度相当，说明采用本发明的低血清培养基来培养人脐带沃顿区间充质干细胞切实可行。
在本发明中，采用流式细胞术来检测上述细胞制剂，具体来说将脐带沃顿区间充质干细胞用胰酶消化后计数，每份细胞为5x105个，一共分为13份。其中一份作为阴性对照，三份分别作为FITC、PE及APC三种荧光染料的单阳管(以上4个样品用于调试流式细胞仪，即调节电压和补偿)。另外9份细胞为样品管，分别加入FITC、PE或APC三种荧光染料其中之一标记的CD90、CD29、CD44、CD105、CD31、CD45、CD34、CD126和HLA-DR的抗体，冰上孵育20分钟，洗去多余抗体，每管加入200微升PBS缓冲液重悬细胞，将样品通过流式细胞仪分析即可以得到CD90、CD29、CD44、CD105、CD31、CD45、CD34、CD126和HLA-DR的抗体各指标的阳性率。
在本发明中，对于所使用的流式细胞仪没有特别的限定，可以使用任何本领域中常用的流式细胞仪。
本发明的细胞制剂是通过如下方法制备的，该方法包括以下步骤：利用低血清培养基培养来自胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞以获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂。
该方法还包括从脐带获取沃顿区间充质干细胞。对于从脐带获取沃顿区间充质干细胞的方法没有具体的限定，任何本领域常规的方法均可以使用。在一个具体的实施方式中，采用组织块培养法获取原代脐带间充质细胞。即将脐带沃顿区组织用眼科剪刀减成1cm3左右的小块，用镊子将小组织块铺于10cm的培养皿内，加入本申请中所述的低血清培养基，在37℃的培养箱内培养，2周左右细胞爬出。
在本发明中采用了低血清培养基来进行培养。通常在间充质干细胞培养方面，不同的研究人员或机构采用的血清浓度各不相同，大部分人使用10％(体积百分数)的胎牛血清，有的血清浓度高达20％(体积百分数)。一般来说，培养基中的血清浓度为3％(体积百分数)，可以称为低血清培养基。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、碳水化合物、生长因子、激素等。血清成分复杂，每批血清之间都有差别，不能保证其成分一致。另外，虽然血清内含有很多利于细胞生长的成分，但不可避免的含有一些对细胞有伤害的成分，如补体、抗体、内毒素等。因此，高浓度血清培养出的细胞不适合于临床应用，会增加了临床过敏的风险。而低血清培养基对于细胞生长、增殖、形态及功能无不良影响。本发明的低血清培养基包括基础培养基、生长因子及促进细胞生长各物质的组合物。
在上述体积百分比(以含3％FBS的培养基为例)是指每配制100毫升培养基，加3毫升胎牛血清(FBS)和97毫升的基础培养基，即FBS与总培养基体积的比例。
上述基础培养基是指包括碳水化合物、氨基酸、维生素和无机盐的培养基。
在本发明的一个优选的实施例中，使用DMEM高糖培养基，其能够提供间充质干细胞在体外生存所必需的营养物质，包括四大类物质，即碳水化合物、氨基酸、维生素和无机盐。DMEM培养基是在MEM培养基的基础上研制而成，其营养成分含量比MEM及α-MEM更高。
上述生长因子及利于细胞生长的多种物质的组合物包括：人上皮生长因子，即hEGF，人碱性成纤维生长因子，即b-FGF，重组人胰岛素样生长因子，血小板衍生因子，即PDGF，氢化可的松，抗坏血酸，以及肝素。
其中，人上皮生长因子(hEGF)，促进外胚层及中胚层细胞生长，如成纤维细胞。
人碱性成纤维生长因子(b-FGF)，促进成纤维细胞生长。
重组人胰岛素样生长因子，促进多种细胞生长。
血小板衍生因子(PDGF)，促进间充质细胞生长。
氢化可的松，促进表皮细胞生长。
本发明中使用的低血清培养基，其包括：
人上皮生长因子(hEGF)1～100ng/ml(优选1-30ng/ml)，人碱性成纤维生长因子(b-FGF)1～100ng/ml(优选1-30ng/ml)，重组人胰岛素样生长因子1～50ng/ml(优选1-20ng/ml)，血小板衍生因子(PDGF)1～100ng/ml(优选1-20ng/ml)，肝素1～100μg/ml(优选1-30μg/ml)，氢化可的松1～50μg/ml(优选1-20μg/ml)，抗坏血酸1～100μg/ml(优选5-30μg/ml)，纤维连接蛋白1～100ng/ml(优选1-30ng/ml)，FBS 1-20vol％(优选3-5vol％)，0.1-1vol％非必需氨基酸水溶液(优选1vol％)。另外，在本发明使用的DMEM高糖培养基补充2mmol/L的L-左旋谷氨酰胺，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素。
本发明的胎儿脐带沃顿区间充质干细胞制剂，在本发明中是指利用低血清培养基对胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞进行培养而得到的制剂。通过流式细胞仪检测，发现本发明的细胞制剂高表达CD29、CD90、CD44、CD105等干细胞高表达的标志物，且这些干细胞标志物的比例均在95％以上；另外，本发明的细胞制剂低表达造血及内皮细胞标志物，CD45和CD31的比例均低于5％；更重要的是，本发明的细胞制剂不表达移植排斥相关的标志物HLA-DR，本发明的细胞制剂纯度较高，且移植排斥的风险极低。
此外，本发明用于生产CD126阳性的细胞制剂的方法还包括：将上述得到的脐带沃顿区间充质干细胞制剂与CD126抗体共孵育，然后通过流式细胞术分选获得的CD126阳性的细胞制剂。在孵育之后，以CD126为分选标志物，通过流式细胞术无菌分选CD126阳性细胞和CD126阴性细胞，得到CD126阳性的脐带沃顿区间充质干细胞制剂，其CD126的比例在95％以上，优选在99％以上；得到CD126阴性的脐带沃顿区间充质干细胞制剂，其CD126的比例在5％以下，优选在1％以下，更优选为0.9％以下。
利用的本发明的CD126阳性的人沃顿区脐带间充质干细胞制剂能够有效抑制肠炎小鼠的体重降低，有效抑制肠炎小鼠的疾病活动指数，有效延长肠炎小鼠的结肠长度。可见本发明的细胞制剂可有效治疗小鼠的炎症性肠炎。
在DSS诱导的炎症性肠炎中，静脉注入CD126+细胞制剂后，可显著降低DSS诱导的小鼠的便血，稀便及体重降低程度，另外，细胞治疗组小鼠的结肠长度显著高于DSS处理组，可有效的治疗炎症性肠炎，而同样条件下筛选出来的CD126-细胞对炎症性肠炎没有显著的治疗作用。因此，在用细胞制剂治疗炎症性肠炎时，只要以这一标志物为检测标准即可，不需要在检测其它标志物，省时省力。
进一步本发明的细胞制剂是利用低血清培养基来制备的，利用低血清培养基进行培养对于细胞生长、增殖、形态及功能无不良影响。
本发明的细胞制剂可用于治疗炎症性肠病，例如可以用于治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病。
本发明涉及上述细胞制剂在用于制备治疗炎症性肠病，以及炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途，其中，炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎和其他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
实施例
下述实施例中使用的低血清培养基的组成如下：
人上皮生长因子(hEGF) 10ng/ml
人碱性成纤维生长因子(b-FGF) 10ng/ml
重组人胰岛素样生长因子(IGF) 5μg/ml
血小板衍生因子(PDGF) 10ng/ml
肝素 5μg/ml
氢化可的松 1μg/ml
抗坏血酸 10μg/ml
纤维连接蛋白 10ng/ml
非必需氨基酸水溶液 1％(体积百分比)
L-左旋谷氨酰胺 2mmol/L
DMEM培养基补充3-5％的FBS(体积百分比)，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素。
以上培养液、血清、细胞因子及活性材料可以选自一个公司或多个公司(如Sigma、hyclone、Gibco公司)的市售产品。
实施例1获得脐带沃顿区间充质干细胞
1.胎儿脐带的获取
取足月、无先天性疾病的新生儿的脐带；该产妇无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于试验研究均知情同意。
2.脐带沃顿区间充质细胞的获取
在无菌实验台内，将脐带用磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗，洗去残余血液。用无菌手术器械将脐带剪成2-3cm的小段，将脐带纵向剖开，去除脐动脉、脐静脉和羊膜后，将沃顿区剪成0.5-1mm3左右的小块。采用组织块培养法获取原代脐带间充质细胞：将上述脐带沃顿区组织块均匀的铺在10cm无菌培养皿内，覆盖60-70％皿底面积，倒置放入37℃培养箱15min；翻转培养皿，轻轻加入10ml间充质干细胞的上述低血清培养基，在37℃，5％CO2的培养箱内培养。3天后半量换液，7-10天左右，待组织块下均匀爬出细胞后，去除组织块，PBS清洗2次，每皿加入10ml新鲜的本申请中所述的间充质干细胞低血清培养基，此后3-4天换一次液。细胞铺满80％左右时进行传代。待细胞80％左右汇合时，0.25％的胰酶消化1-2min，按照1:3传代即得到我们所描述的脐带沃顿区间充质干细胞。
实施例2获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂
采用上述低血清培养基培养实施例1获得脐带沃顿区间充质干细胞。具体来说，组织块法分离得到的人脐带间充质干细胞，用上述低血清培养基培养，待细胞80％左右汇合时，0.25％的胰酶消化1-2分钟，大部分细胞用于扩大培养，小部分细胞用于鉴定干细胞的标志物。用流式细胞术检测CD29、CD44、CD90、CD105、CD31、CD45、CD34及HLA-DR的表达(细胞分别与以上相应的抗体共同孵育后，洗去多余的抗体，用PBS重悬细胞，利用BD公司的LSRFortessa仪器检测以上各指标的阳性率)，结果如图1所示。从图1的实验结果表明，实施例2得到的细胞制剂高表达间充质干细胞的标志物，CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在95％以上；低表达造血干细胞及内皮细胞标志物，CD31、CD45和CD34的比例低于10％；更重要的是，该细胞制剂不表达移植排斥前关的标志物HLA-DR。
实施例3获得CD126阳性的脐带沃顿区间充质干细胞制剂
采用实施例2获得的脐带沃顿区间充质干细胞制剂，在4℃的条件下，与CD126抗体共孵育20min，洗去多余的抗体，利用PBS重悬细胞。以CD126为分选标志物，通过流式细胞术无菌分选CD126阳性细胞和CD126阴性细胞，分选的结果如图2所示，得到CD126阳性的脐带沃顿区间充质干细胞制剂，其CD126的比例为99％；得到CD126阴性的脐带沃顿区间充质干细胞制剂，其CD126的比例为0.9％。
实施例4利用CD126阳性的脐带沃顿区间充质干细胞治疗小鼠DSS诱导的炎症性肠炎
C57BL/6小鼠适应环境3天，随机分为四组，即正常对照组，DSS模型组(DSS即硫酸葡聚糖钠，是肠炎模型的造模试剂，购于MP公司)，CD126阳性细胞制剂治疗组和CD126阴性细胞治疗组。小鼠给予3.5％的DSS水6天，细胞治疗组，在给DSS水的1，3，5天分别由尾静脉注射1x106个CD126阳性细胞制剂或CD126阴性细胞，注射体积为100微升/只。DSS模型组，在给DSS水的1，3，5天分别由尾静脉注射体积为100微升/只的PBS缓冲液。每天称小鼠的体重，检测便血程度。实验结束时，处死小鼠，取完整的结肠，检测其长度，并且对小鼠的体重指数以及结肠长度进行检测，结果见图3(具体的检测方法可以参见论文Sala E,Genua M,PettiL,et al.Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6,Independently of Their Localization to the Intestine.Gastroenterology 2015；149:163-176)。实验结果如图3所示，其中图3A是各组小鼠结肠长度的典型图片，可见利用CD126阳性的细胞制剂处理的小鼠的结肠长度明显高于模型组以及利用CD126阴性的细胞处理的小鼠的结肠长度，其与正常对照组的结果接近，显示本发明获得的CD126阳性的细胞制剂具有治疗肠炎的作用。图3B是对各组小鼠结肠长度的统计分析，其同样显示本发明获得的CD126阳性的细胞制剂具有治疗肠炎的作用。
实验结束后，麻醉小鼠，取血液分离血清，利用酶联免疫法(ELISA法)检测血清中炎症因子的水平，其中酶联免疫检测试剂盒购于eBioscience公司，结果见图4。DSS诱导后，小鼠血清炎症因子IL-6和TNF-α的水平显著上升，给予CD126阳性的细胞制剂，可显著降低炎症因子IL-6和TNF-α的水平，而CD126阴性的细胞对炎症因子没有显著的抑制作用，说明CD126阳性的细胞制剂有降低炎症因子，抑制肠炎的作用。
打开上述小鼠的腹腔，取完整的小鼠结肠，洗去粪便，结肠组织经福尔马林固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、莱卡切片机切片(厚度4μm)、脱蜡、复水、苏木素-依红染色、脱水、透明，中性树胶封片，具体方法参考2014年北京师范大学付艳霞的博士学位论文(结果见图5)。根据图5可以看出，正常小鼠的结肠组织，细胞排列有序，组织结构清晰，无炎症细胞浸润。DSS诱导的模型组小鼠结肠组织，细胞排列无序，组织结构还乱紊乱，大量炎症细胞浸润。注射CD126阳性细胞制剂后，结肠的组织结构基本正常，有少量炎症细胞浸润。注射CD126阴性细胞后，结肠的组织结构还是紊乱的，但比模型组稍轻，有大量炎症细胞浸润。可见，本发明获得的CD126阳性细胞制剂能够有效地抑制DSS引起结肠结构紊乱，抑制炎症细胞浸润，进而有效的治疗肠炎。

Claims (10)

1.一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂，其中，
所述细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞，
所述细胞制剂为CD126阳性的细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂，其中，所述细胞制剂为CD126阳性的细胞制剂是指通过细胞流式检测细胞制剂CD126的阳性率在95％以上，优选为99％以上。
3.根据权利要求1或2所述的细胞制剂，其中，
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上，优选在95％以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞制剂，其中，
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD31阳性率低于10％，优选低于9％，以及
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD45和CD34的阳性率低于5％，优选低于4％，进一步优选低于3％。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞制剂，其是通过如下方法制备的细胞制剂，所述方法包括如下步骤：
利用低血清培养基培养来自胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞以获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂，以及
将所述脐带沃顿区间充质干细胞制剂与CD126抗体共孵育，然后通过流式细胞术分选获得的CD126阳性的细胞制剂。
6.根据权利要求5所述的细胞制剂，其中，
所述低血清培养基中的血清浓度低于5vol％，优选为3vol％，
所述低血清培养基包括基础培养基以及生长因子和其他利于细胞生长的物质的组合物。
7.根据权利要求6所述的细胞制剂，其中，所述生长因子及其他利于细胞生长的物质的组合物包括：
人上皮生长因子，即hEGF，
人碱性成纤维生长因子，即b-FGF，
重组人胰岛素样生长因子，
血小板衍生因子，即PDGF，
氢化可的松，
抗坏血酸，
肝素,以及
纤维连接蛋白。
8.根据权利要求6或7所述的细胞制剂，其中，所述基础培养基是DMEM高糖培养基。
9.一种CD126阳性的人脐带沃顿区间充质干细胞制剂的制备，该细胞制剂用于治疗炎症性肠病，以及炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，所述炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎和其他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
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