EA018290B1

EA018290B1 - Набор для сбора крови, предпочтительно периферической крови, для получения стволовых клеток

Info

Publication number: EA018290B1
Application number: EA201071069A
Authority: EA
Inventors: Марко Полеттини; Алессандра Гамбакурта
Original assignee: Тэнкстем Срл
Priority date: 2008-03-18
Filing date: 2009-03-17
Publication date: 2013-06-28
Also published as: ZA201007259B; JP5517362B2; IL208145A; EA201071069A1; AU2009226963A1; BRPI0909754A2; MX2010010251A; PL2276569T3; RS52863B; SI2276569T1; HK1156562A1; EP2276569B1; US8500712B2; ES2421718T3; IL208145A0; EP2276569A1; DK2276569T3; CN102015108A; CA2718527C; WO2009115522A1

Abstract

Изобретение относится к набору (10) для сбора крови, предпочтительно периферической крови, для получения плюрипотентных стволовых клеток, включающему в себя, по меньшей мере, первый контейнер (12), который способен содержать взятую кровь и в котором находится антикоагулянт и вещество MCSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор).

Description

Данное изобретение касается набора для сбора крови, предпочтительно периферической крови, для получения стволовых клеток взрослого организма.

Уровень изобретения

В последние годы использование стволовых клеток в терапии вызывает широкое одобрение в связи с успехами, полученными при лечении патологий, которые до сих пор считались неизлечимыми.

Тем не менее, известные способы получения стволовых клеток являются длительными, трудоемкими и дорогостоящими.

Плюрипотентные стволовые клетки (Р8С, р1иг1ро1сп( к!ет се11к) являются источником, доступным не только для исследований, но также для создания лекарственных препаратов и для трансплантации (Шдегк АД. е! а1., 2002; СпййЬ Ь.О. е! а1., 2002).

Существуют стволовые клетки эмбриона и взрослого организма: эмбриональные получают из 8дневного бластоциста, в то время как взрослые могут быть получены главным образом из костного мозга, жировой или мышечной ткани, периферической крови и пуповины.

Определение стволовой клетки постоянно развивается, и на данный момент не существует общего консенсуса или стандартного способа их выделения или идентификации. Для всех этих клеток, эмбриональных (Е8, етЬгуошс к!ет се11к) и взрослых, гематопоэтических (Н8С, йаеторо1е!ю к!ет се11к) и мезенхимальных (М8С, текепс11ута1 к!ет сеНк) (Китапа М. е! а1., 2003), были определены различные генетические маркеры, некоторые из которых являются общими для многих типов клеток (Сопботтек М. е! а1., 2006; Капд V.! е! а1., 2006; 2йао Υ. е! а1., 2003; КаЬшоуйсйМ. е! а1., 1976).

На данный момент исследование в большей степени ориентировано на применение стволовых клеток, выделенных из эмбриональных тканей, плодов и пуповины, но это создает правовые и этические проблемы.

Прежде всего, на сегодняшний день применение этих клеток имеет различные противопоказания, такие как риск инфицирования, риск отторжения при трансплантации, а у некоторых млекопитающих, таких как лошади, развитие тератом.

Для преодоления этих проблем в терапии ίη νί\Ό известно применение аутологичных стволовых клеток, предпочтительно выделенных из костного мозга, жировой ткани или периферической крови. Начиная со стволовых клеток взрослого организма, проводят этап дифференциации ίη уйго (или ех у|уо) стволовых клеток в желаемую клеточную линию с помощью специфических факторов индукции дифференциации, а затем этап трансплантации ίη νί\Ό полученных дифференцированных клеточных линий. У этих способов есть недостаток - феномен отказа, когда дифференцированные клетки, повторно введенные в организм, не распознаются как собственные клетки, так как они теряют факторы самораспознавания на этапе индуцированной дифференциации ίη νίΙΐΌ.

У человека получение стволовых клеток из периферической крови влечет за собой их очистку посредством процесса, называемого аферезом или лейкаферезом. Клетки выделяют из крови, собирают и затем вводят пациентам сразу после химиотерапии или лучевой терапии.

В аферезе, который длится от 6 до 8 ч, кровь берут из вены руки или вены шеи или груди и пропускают через устройство, удаляющее стволовые клетки. Кровь, очищенную таким образом, возвращают в организм пациента, в то время как собранные клетки сохраняют путем замораживания в жидком азоте (Сопботтек М. е! а1., 2006; Капд V.! е! а1., 2006). Эта методика, помимо того что болезненна, также крайне стрессорна для пациента. Прежде всего, методика не обеспечивает реальное различение и/или очистку циркулирующих стволовых клеток. Основными известными методиками очистки являются следующие:

использование факторов роста или производных тромбоцитов (ТОР-В, УЕОР), но экономическая стоимость их выделения чрезмерно высока (Нои М. е! а1., 2006);

выделение стволовых клеток, взятых из костного мозга, которое позволяет очистить и, следовательно, использовать для терапии примерно 15% клеток, содержащихся во взятом материале;

выделение стволовых клеток из жировой ткани, которое требует предварительного хирургического удаления значительного количества тканей донора и делает невозможным внутривенное введение;

ЮР-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), известный как Тепбо!горЫп (Р1еб1ег 1. е! а1., 2006);

ИВМ (матрикс мочевого пузыря): получен от свиньи, содержит цитокины (но не нуклеарные клетки), которые индуцируют рубцевание ран, но не регенерацию зоны поражения (2йапд Υ.8. е! а1., 2005).

Другой известный способ описан 2йао Υ. е! а1. в статье А йитап рег1рНега1 Ь1ооб топосу1е-бепуеб киЬке! ас!к ак р1ипро!еп! к!ет се11к и в ν0-Α-2004/043990. Это способ изготовления стволовых клеток путем их получения из моноцитов, который включает этапы выделения моноцитов из периферической крови, введения их в контакт с митогенным компонентом, а затем культивирования моноцитов из периферической крови в условиях, подходящих для размножения клеток.

Этот способ, в котором вначале необходим этап выделения моноцитов, а затем этап размножения в культуральной среде, требует большого времени, примерно 15-20 дней, чтобы получить значительное количество стволовых клеток, и не позволяет получить плюрипотентные стволовые клетки, т.е. не специализированные, подходящие для введения в организм пациента сразу и через некоторое время.

- 1 018290

Опять же в рамках получения стволовых клеток из моноцитов также известны документы АО-А2005/046570, АО-А-2007/131200 и АО-А-03/083092. Тем не менее, поскольку необходимо выполнять предварительную очистку крови для выделения только клеточной фракции, т.е. моноцитов, а затем вызывать их размножение с целью получения желаемых стволовых клеток, способы, описанные в этих документах, требуют очень большого времени, снова примерно 15-40 дней, для получения приемлемого количества стволовых клеток.

В свете вышеизложенного существует очевидная необходимость усовершенствовать способ размножения или разделения и очистки взрослых стволовых клеток из легко доступных источников, в частности крови, предпочтительно периферической крови, что также позволит получить стволовые клетки, подходящие для фармакологического лечения.

Существует также очевидная необходимость начинать получение стволовых клеток из крови, предпочтительно периферической, в кратчайшие сроки, с тем чтобы иметь возможность своевременно ввести их пациенту.

Поэтому целью данного изобретения является получение набора для сбора крови, предпочтительно периферической крови, для получения плюрипотентных стволовых клеток, с тем чтобы обеспечить быстрый запуск получения плюрипотентных стволовых клеток.

Заявитель разработал, испытал и воплотил данное изобретение для преодоления недостатков уровня техники и для достижения этих и других целей и преимуществ.

Сущность изобретения

Данное изобретение изложено и охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, в то время как зависимые пункты формулы изобретения описывают другие характеристики изобретения или варианты основной идеи изобретателей.

Способ выращивания и очистки ίη νίίτο стволовых клеток из крови, предпочтительно периферической крови, разработанный авторами и под названием данной заявки описанный в международной патентной заявке РСТ/ЕР2007/059531, которая включена в нее полностью посредством ссылки, позволяет получить взрослые плюрипотентные клетки и содержит первый этап с двумя подэтапами:

а) первый подэтап выращивания стволовых клеток периферической крови после взятия крови путем обработки ίη νίίτο МС8Р (макрофагальным колониестимулирующим фактором) в концентрации 8-15 нМ, предпочтительно 10 нМ;

б) второй подэтап очистки, предпочтительно путем фракционирования в градиенте плотности фиколла.

Первый подэтап выращивания может иметь различную продолжительность в соответствии с условиями, в которых проводится обработка ίη νίίτο; авторы экспериментально, путем определения маркеров стволовых клеток ί.Ό90. СЭ90/34, СЭ34 и СЭ117. установили, что продолжительность обработки МС8Р ίη νίίτο от 24 до 96 ч, предпочтительно от 48 до 72 ч, приводит к стабилизации роста. Это условие считается оптимальным.

Очистка на втором подэтапе, по существу, направлена на разрушение эритроцитов.

Второй этап, на котором используются полупродукты, полученные на этапе б), обеспечивает в) рост стволовых клеток периферической крови, очищенных на этапе б) путем обработки МС8Р ίη νίίτο в концентрации от 35 до 55 нМ, предпочтительно 50 нМ, более предпочтительно 45 нМ.

С такими концентрациями МС8Р клетки сохраняют фенотип взрослых плюрипотентных стволовых клеток.

Этот второй этап может иметь продолжительность от 24 до 96 ч, предпочтительно от 48 до 72 ч.

Было отмечено, что, напротив, при использовании МС8Р в концентрации более 55 нМ (например, 70 нМ) уже после 24 ч клетки не сохраняют фенотип плюрипотентных стволовых клеток.

В частности, этап а) разделения и предварительного роста в суспензии с МС8Р после взятия крови позволяет увеличить процент стволовых клеток. Следующий этап б) позволяет получить взрослые плюрипотентные стволовые клетки, которые при введении их пациенту дифференцируются непосредственно ίη νίνο, не вызывая явлений отторжения или инфицирования.

Эффективность этого получения подтверждается наличием маркеров стволовых клеток СЭ90, СЭ90/34, СЭ34 и СЭ117, а также тем фактом, что стволовые клетки не теряют факторов самораспознавания при последующем разделении или размножении. Такие стволовые клетки при введении их пациенту не дают побочных эффектов, таких как феномен отторжения, инфицирование, развитие тератом, и могут дифференцироваться ίη νίνο и вести себя как плюрипотентные стволовые клетки.

Авторы увидели, что клетки, выращенные таким образом путем разделения или размножения, при введении их локально или внутривенно приобретают ίη νίνο (а не ίη νίίτο, как и в известных способах уровня техники с помощью соответствующих факторов роста и/или химических стимуляторов (Οιιίαΐί В. еί а1., 2003; ΚαΙζ В.Ь. еί а1., 2002; ΟΚαζαΚί Т. еί а1., 2005)) все морфологические и химические характеристики макрофагальных, лимфоцитарных, эпителиальных, эндотелиальных, нервных и гепатоцитарных клеток в соответствии с потребностями и патологиями живого организма, подвергающегося лечению. Способ является менее инвазивным, чем другие способы, используемые до сих пор для сбора стволовых клеток, безболезненным (в отличие от афереза) и экономичным.

- 2 018290

Наконец, возможность легкого получения этих клеток, а затем их сохранения в течение долгого времени, например замороженными в жидком азоте, делает клетки, полученные способом в соответствии с изобретением, пригодными для аутологичной трансплантации и для лечения многих патологий (повреждений различного типа, метаболических заболеваний, острых и хронических неврологических и воспалительных патологий).

В соответствии с одной характеристикой данного изобретения набор для сбора крови, предпочтительно периферической крови, для получения стволовых клеток с помощью описанного выше способа включает первый контейнер, который может содержать взятую кровь, например пробирку, содержащую антикоагулянт и вещество МС8Р. Как правило, первый контейнер изготовлен из стекла.

С помощью данного набора можно собрать кровь, предпочтительно периферическую кровь, чтобы быстро начать рост и продукцию стволовых клеток с помощью описанного выше способа и поэтому сделать их производство более быстрым.

В связи с этим основным преимуществом данного изобретения является то, что оно позволяет получить достаточное количество стволовых клеток за очень ограниченное время, даже всего за 48 ч, по сравнению со способами, известными в уровне техники в работе непосредственно с цельной кровью. Таким образом, набор для сбора крови в соответствии с данным изобретением предлагается в качестве быстрого и эффективного решения проблемы получения плюрипотентных стволовых клеток непосредственно из крови, предпочтительно периферической крови.

Как правило, концентрация МС8Р в пробирке набора в соответствии с данным изобретением варьирует от 2 до 20 нМ, предпочтительно примерно от 8 до 10 нМ.

Обычно в качестве антикоагулянта используется гепарин или ЭДТА.

Наличие антикоагулянта является необходимым для предотвращения свертывания крови, в то время как МС8Р является ответственным за порядок роста и размножения стволовых клеток.

В соответствии с вариантом воплощения изобретения набор может содержать один или более контейнер помимо первого контейнера, например пробирку. У последних предпочтительно, по меньшей мере, внутренняя стенка сделана из материала, например пластика, такого как полипропилен (РР), обработанного инфракрасными или гамма-лучами, что препятствует адгезии стволовых клеток к стенке и, следовательно, их агрегации, которая считается условием, которого следует избегать.

Как правило, данные контейнеры представляют собой второй контейнер, который содержит стволовые клетки, полученные для внутривенного введения, и третий контейнер различных размеров для местного применения.

Стволовые клетки, которые получены в указанных контейнерах, можно использовать сразу либо они могут быть сохранены в жидком азоте и использованы в дальнейшем, когда возникнет такая необходимость.

В соответствии с другим вариантом указанные контейнеры, и тот, который используется для взятия крови, в котором содержится антикоагулянт и МС8Р, и те, которые используются для сохранения, можно определить по серийному номеру, общему, последовательному или полученному в соответствии с заданным критерием, для облегчения идентификации в лаборатории, где получают стволовые клетки, и в момент отправки.

Для однозначной идентификации можно использовать штрих-коды и/или КРШ-метки формата гсабщд (однократной записи и многократного считывания) или гсабтдЛхпНпд (многократной записи и многократного считывания), прикрепленные к контейнерам, вместе с соответствующим оптическим или электромагнитным считывающим устройством.

Первый подэтап роста описанного выше способа предпочтительно начинают сразу после взятия крови, чтобы кровь тем временем не свернулась.

Под словами сразу после имеется в виду минимально возможное время между взятием крови и ее свертыванием, так чтобы предотвратить свертывание крови и начать размножение стволовых клеток в кратчайшее время после взятия крови.

Другими словами, сразу после относится к тому факту, что рост стволовых клеток начинается сразу после взятия у пациента крови, принимая во внимание, что для данного изобретения важно, что указанный процесс размножения начинается до того, как кровь сворачивается.

Фактически кровь, только что взятую у пациента, помещают в пробирку с антикоагулянтом и МС8Р. Антикоагулянт блокирует начало коагуляции, в то время как одновременное присутствие МС8Р обеспечивает быстрое начало процесса размножения и гарантирует минимизацию времени до начала лечения пациента.

Это определение также включает случай, когда образец крови, предпочтительно периферической, взят у пациента, к нему добавлен антикоагулянт для того, чтобы блокировать свертывание крови, которая подвергается хранению, в процессе которого не меняется возможность получения стволовых клеток.

При необходимости кровь берут из места ее хранения и подвергают процессу размножения стволовых клеток, описанному выше, т.е. добавляют МС8Р, очень быстро получая необходимое количество стволовых клеток.

Таким образом, в область данного изобретения вводится процедура взятия и сохранения крови,

- 3 018290 предпочтительно периферической, с помощью которой можно получить стволовые клетки в соответствующих банках крови и затем при необходимости использовать их для получения плюрипотентных стволовых клеток путем добавления МС8Г.

Как правило, после взятия крови из места ее хранения ее помещают в пробирку, которая уже содержит МС8Г в концентрации от 2 до 20 нМ, предпочтительно от 8 до 10 нМ.

Это позволяет избежать сложной и дорогостоящей процедуры сохранения стволовых клеток, которая требует, например, использования жидкого азота, как упоминалось выше, и вместо этого позволяет использовать только традиционные методики сохранения крови.

Подробное описание предпочтительной формы воплощения

Со ссылкой на прилагаемую фигуру набор 10 для сбора периферической крови в соответствии с данным изобретением для получения стволовых клеток включает в себя первую пробирку 12, изготовленную из стекла, содержащую вещество МС8Г 14 и в данном случае гепарин 16.

Концентрация МС8Г в пробирке 11 составляет от 8 до 10 нМ.

Набор включает еще две пробирки 18 и 20, изготовленные из пластика, такого как полипропилен (РР), обработанного инфракрасными или гамма-лучами.

Вторая пробирка 18 предназначена для сохранения клеток, полученных для внутривенного введения, а третья пробирка 20 - для местного применения.

Важно, что пробирки 12, 18 и 20 гарантируют стерильность их содержимого.

Все пробирки 12, 18 и 20 снабжены соответствующими пробками 22, 24 для их закрывания.

Пробки 22, 24 могут закрываться при надавливании, могут быть винтового или другого типа.

Пробка 22 контейнера 12 может, например, закрываться при надавливании.

Пробка 24 каждой из пробирок 18 и 20 может быть, например, винтового типа.

Размеры второй пробирки 18 составляют: высота 115 мм, диаметр 17 мм, толщина 0,3 мм, емкость 12 мл, в то время как размеры третьей пробирки 20 составляют: высота 110 мм, диаметр 30 мм, толщина 0,3 мм, емкость 40 мл.

После размножения с помощью МС8Р в соответствии с данным изобретением клетки, выделенные из периферической крови, действуют ίη νίνο как плюрипотентные стволовые клетки (Р8С) и подходят для разрешения в течение нескольких месяцев неизлечимых повреждений и патологий или излечимых классическими способами и/или лекарствами, но только медленно.

Материалы и методы.

Взятие образцов.

Каждый образец периферической крови, примерно 0,5-7 мл, берут у лошадей и собак из нижних конечностей и немедленно вносят в пробирки, содержащие соответствующее количество гепарина и МС8Р (10 нМ).

В любом случае могут быть использованы другие антикоагулянты, такие как ЭДТА.

В этот момент проводится первый подэтап обработки ίη νίΐτο, на котором происходит разделение и предварительный рост стволовых клеток с помощью МС8Р.

Очистка.

Образцы крови разводят в соотношении 1:5 в РВ8 (фосфатно-солевом буфере), содержащем ΝΗ·|ΓΊ (200 мМ), чтобы вызвать лизис эритроцитов, центрифугируют при 10000д, дважды промывают РВ8 и вновь центрифугируют при 200д. Полученные нуклеарные клетки инкубируют в течение 7-12 ч при 37°С, предпочтительно в течение 10-12 ч и очищают путем фракционирования в градиенте плотности фиколла, затем выделяют и три раза промывают средой ВРМ1 1640 (Ьйс Тсс11по1ощс5, Гранд-Айленд, Нью-Йорк).

После очищения клетки инкубируют еще 24-72 ч в присутствии 50 нг/мл МС8Г 45 нМ, чтобы получить примерно 95% клеток с фенотипом СЭ90 (который определяют посредством флуориметрического анализа с использованием проточного фотометра ГАС8сап от ВссЮп ΌΚΚιηδοη), а затем вызывают их размножение, получая количество клеток, необходимое для местного лечения, или центрифугируют при 10000д и суспендируют в РВ8 в концентрации примерно 90х10³ клеток/мл для внутривенного введения.

Иммуноокрашивание.

Для цитофенотипирования клетки промывают в РВ8, а затем фиксируют на слайде в 4% формальдегиде в РВ8 в течение 20 мин при 20°С.

Для выявления внутриклеточных белков клетки пермеабилизируют с помощью 0,5% Тгйоп Х-100 в течение 5 мин при 20°С, а затем инкубируют в течение 1 ч с первичными антителами, разведенными в РВ8, содержащем 1% В8А (для блокирования неспецифических антигенных сайтов). После трех последовательных промываний слайды инкубируют в течение 45 мин с вторичными антителами, конъюгированными с наиболее подходящим флуорохромом: МТС или изотиоцианатом тетраметилродамина В (ТШТС) или Су5.

Все вторичные антитела были изготовлены в 1аск§оп 1ттипоРс5сагс11 с использованием осла в качестве хозяина.

- 4 018290

Иммуноцитохимический анализ проводят при температуре 4°С и в насыщенной водяным паром атмосфере. После трехкратного промывания слайды устанавливают с помощью де1уа!о1_РВ8.

Затем с помощью флуоресцентного микроскопа получают флуоресцентные изображения, используя в качестве внутреннего стандарта прямую иммунофлуоресценцию против глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (поликлональные овечьи антитела производства Сойех Вюсйет, Сан-Леандро, Калифорния).

В качестве отрицательных контролей и для калибровки уровней фона флуоресценции используют слайды, инкубированные с неспецифическими антителами того же изотипа, что и исследуемые образцы.

Только что описанный способ используют для выявления всех маркеров (СЭ90, СЭ90/34, СО34 и СЭ117) и маркеров, приведенных в таблице.

Характеристика клеток, обработанных МС8Р (Р8С), и макрофагов, выделенных из периферической крови

	Интенсивность относительной флуоресценции
Поверхностные антигены	РЗС	Макрофаги
МАС-1	761 18	84 115
СО14	126129	157 + 19
СО34	771 16	1515
СО45	143126	165138
Продукция цитокинов
11_-1	82127	831 12
И-6	43122	671 14
Ιί-10	718	58 + 7
ΤΝΓ-β	25 116	671 16
Функциональные показатели
Фагоцитоз	187123	195 1 26
Стимуляция лимфоцитов, абсорбция при 540 нм	0,72 10,07	0,1710,02
Цитотоксичность %	914	72 16

Ясно, что в описанный выше набор для сбора крови, предпочтительно периферической крови, для получения стволовых клеток можно внести изменения и/или добавить части, не выходя из области и за рамки данного изобретения.

Также ясно, что, хотя данное изобретение описано со ссылкой на примеры, специалист в данной области определенно способен получить многие другие эквивалентные формы набора для сбора крови, предпочтительно периферической крови, для получения стволовых клеток, имеющие характеристики, изложенные в формуле изобретения и, следовательно, входящие в область защиты, определенную таким образом.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Набор для сбора крови, предпочтительно периферической крови, для получения плюрипотентных стволовых клеток, характеризующийся тем, что включает в себя контейнер (12) для взятой крови, в котором находится антикоагулянт и вещество макрофагальный колониестимулирующий фактор (МС8Р).
2. Набор по п.1, характеризующийся тем, что концентрация МС8Р в контейнере (12) составляет от примерно 2 до примерно 20 нМ.
3. Набор по п.2, характеризующийся тем, что концентрация МС8Р в контейнере (12) составляет от примерно 8 до примерно 10 нМ.
4. Набор по пп.1, 2 или 3, характеризующийся тем, что антикоагулянтом является гепарин или ЭДТА.
5. Набор по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что он включает в себя закрывающий контейнер элемент (22).
6. Набор по любому из предшествующих пунктов, характеризующийся тем, что он также включает контейнеры (18, 20), у которых, по меньшей мере, внутренняя стенка выполнена из материала, предотвращающего адгезию стволовых клеток.
7. Набор по п.6, характеризующийся тем, что указанный материал является пластиковым материалом, таким как полипропилен (РР), обработанным инфракрасными и/или гамма-лучами.
8. Набор по п.6 или 7, характеризующийся тем, что он включает в себя закрывающие для каждого из контейнеров (18, 20) элементы (24).