KR20140030703A

KR20140030703A - 간엽줄기세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR20140030703A
Application number: KR1020120097193A
Authority: KR
Inventors: 양윤선; 오원일; 권순재; 이미연; 전홍배
Original assignee: 메디포스트(주)
Priority date: 2012-09-03
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2014-03-12
Also published as: JP2015532596A; CN104781394B; EP2893001A1; CA2884000C; US20150284686A1; ES2755802T3; KR101532556B1; JP6478243B2; US11332715B2; DK2893001T3; EP2893001B1; CA2884000A1; PL2893001T3; IN2015DN01737A; US9580687B2; US10294456B2; WO2014035215A1; AU2013309642A1; CN104781394A; PT2893001T

Abstract

본 발명은 간엽줄기세포를 2.1 내지 3.8 mM의 칼슘 및 1.0 내지 3.0 mM의 마그네슘을 함유하는 배양용 배지에서 2 내지 5%의 저산소(hypoxia) 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 간엽줄기세포의 배양방법에 관한 것으로서, 본 발명의 배양방법은 일반적인 배양방법에 비해 간엽줄기세포의 증식력 및 생존도를 높일 수 있으며, 따라서 적은 횟수의 계대배양으로도 많은 수의 간엽줄기세포를 얻을 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 배양방법으로 얻은 간엽줄기세포는 면역원성을 나타내지 않으므로 세포치료제로서 보다 안전하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 사이토카인 분비능이 뛰어난 바, 연골 재생 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

간엽줄기세포의 배양 방법{METHOD FOR CULTURING MESENCHYMAL STEM CELLS}

본 발명은 간엽줄기세포의 효율적인 배양 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되고, 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있는 특성이 있으며, 분화 자극에 따라 상이한 세포로도 분화될 수 있는 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포 (embryonic stem cells, ES cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPS) 등이 이에 해당된다. 다분화능 및/또는 단분화능 줄기세포로는 성체줄기세포를 예로 들 수 있으며, 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등이 이에 해당한다.

지금까지, 모든 세포로 분화될 수 있는 전분화능을 가진 인간 배아줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만 아직 암발생의 위험 및 면역거부반응과 같은 문제점들을 완전히 해결하지 못하고 있는 실정이다.

또한, 분화가 끝난 성체세포를 여러 가지 방법으로 역분화시켜 분화 초기 단계인 배아줄기세포 상태로 회귀시킨 유도만능줄기세포(iPS)의 경우, 자가 세포를 이용하여 면역거부반응의 위험성은 배제할 수 있으나 암발생의 위험성은 여전히 해결해야 할 과제로 남아있다.

이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역조절기능과 함께 암발생의 위험성이 없는 간엽줄기세포가 제시되고 있다. 간엽줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 간세포, 췌도베타세포, 혈관세포 등으로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

간엽줄기세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등 다양한 조직에서 분리, 배양이 가능하나 각 기원에 따른 세포 표면 표지자가 조금씩 다르기 때문에 간엽줄기세포를 명확히 정의하는 것은 용이하지 않다. 다만 골세포, 연골세포, 근육세포로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태를 가지고, 기본적인 세포표면 표지자인 CD73(+), CD105(+), CD34(-) 및 CD45(-)를 발현하는 경우 일반적으로 간엽줄기세포로 규정하고 있다. 이와 관련하여, 상이한 유전적 기원 및/또는 배경을 가지는 간엽줄기세포들의 경우, 위에서 언급한 기존의 간엽줄기세포를 규정하는 기준들에 대하여는 서로 유의적 차이를 나타내지 아니하지만 통상적으로 각각의 생체내 활성에 있어서는 유의적 차이를 나타내게 된다. 또한 간엽줄기세포를 타가 유래 세포치료제로 사용하는 경우, 사용가능한 후보군(pool)이 한정적이므로 간엽줄기세포의 생체내 활성도가 낮아도 선택의 여지가 없어 대체가 불가능한 경우가 발생한다.

이에 더하여, 일반적으로 간엽줄기세포가 세포치료제로 이용되기 위해서는 재생의학 및/또는 세포치료 분야에서 요구되는 최소 세포수(약 1X10⁹ 정도)를 만족시켜야 하는데, 적정조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 고려한다면 필요한 세포수는 더욱 늘어나게 된다. 그 결과, 기존의 다양한 기원의 간엽줄기세포로부터 이 정도의 양을 공급하려면 생체외(in vitro) 실험에서 최소 10번 이상의 계대배양이 필요하게 되는데 이 경우 세포가 노화되고 변형되어 세포치료제로 더 이상 적합하지 않게 되는 문제가 발생한다.

따라서, 대량생산을 위해 보다 효과적으로 간엽줄기세포를 배양하는 방법이 요구된다.

간엽줄기세포의 배양방법으로서, 대한민국 공개특허 제2003-0069115호 및 문헌[Pittinger MF et al. Science, 284: 143-7, 1999; Lazarus HM et al. Bone Marrow Transplant, 16: 557-64, 1995; 및 Kern et al., Stem Cells, 24: 1294-1301, 2006] 등이 알려져 있으나, 상기 방법으로는 대량생산을 위해 요구되는 세포수를 얻기 힘들며, 매회 계대배양 이후 증식력이 감소하여 제대혈 유래 간엽줄기세포의 경우 9~10 계대배양시, 그리고 골수 및 지방 유래 간엽줄기세포의 경우 5~6 계대배양시 더 이상 증식이 이뤄지지 않고 세포의 노화가 급속히 진행되는 문제점이 있다. 따라서, 세포치료제로서 산업적으로 필요한 생산량을 달성하기 위해 종래 배양 방법에 비해 간단하면서도 비용도 저렴한 새로운 방법이 요구된다.

따라서 본 발명의 목적은 간엽줄기세포를 효율적으로 배양할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 수득된 증식력 및 면역학적 특성이 우수한 간엽줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 간엽줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 간엽줄기세포를 2.1 내지 3.8 mM의 칼슘 및 1.0 내지 3.0 mM의 마그네슘을 함유하는 배양용 배지에서 2 내지 5%의 저산소(hypoxia) 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 간엽줄기세포의 배양방법을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된, 증식력, 생존도, 회수율 및 면역학적 특성이 개선된 간엽줄기세포를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 간엽줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 배양방법은 일반적인 배양방법에 비해 간엽줄기세포의 증식력 및 생존도를 높일 수 있으며, 따라서 적은 횟수의 계대배양으로도 많은 수의 간엽줄기세포를 얻을 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 배양방법으로 얻은 간엽줄기세포는 면역원성을 나타내지 않으므로 세포치료제로서 보다 안전하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 사이토카인 분비능이 뛰어난 바, 연골 재생 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 각각 1.8 내지 9.3 mM 범위의 칼슘을 함유하는 배지에서 배양시, 배양 7일 후 초기 접종시 대비 세포 비율(상단 그래프) 및 배양 21일 동안의 세포수의 변화(하단 그래프)를 측정한 결과이다. 상단 그래프에서 P1 내지 P3은 계대 횟수를 의미한다.
도 2a 및 2b는 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 각각 1.8 내지 4.4 mM 범위의 칼슘을 함유하는 배지에서 7일(상단 그래프) 및 6일(하단 그래프)간 배양한 후 세포수를 측정한 결과이다.
도 3a 및 3b는 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 각각 정상산소(normoxia), 및 3% 및 5%의 산소 조건 하에서 배양한 후, 배가 시간(상단 그래프) 및 세포수(하단 그래프)를 측정한 결과이다. 상단 그래프에서 P1 내지 P3은 계대 횟수를 의미한다.
도 4는 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1)를 각각 일반 배양 조건(control), 칼슘 첨가 조건(Ca2+), 저산소 조건(hypoxia) 및 CMH 조건 하에서 배양한 후, 배가 시간(상단 그래프) 및 세포수(하단 그래프)를 측정한 결과이다. 각 그래프에서 P6 내지 P12는 계대 횟수를 의미하며, CMH 조건은 본원에 설명된 바와 같이, 칼슘 및 마그네슘 첨가 및 저산소 조건이 조합된 것을 의미한다.
도 5는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 각각 일반 배양 조건(control), 칼슘 첨가 조건(Ca2+), 저산소 조건(hypoxia) 및 CMH 조건 하에서 배양한 후, 1일 및 2일째의 생존도(상단 그래프) 및 회수율(하단 그래프)을 측정한 결과이다.
도 6a 및 6b는 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 내지 #4)를 일반 배양 조건(control) 및 CMH 조건 하에서 계대배양시, 배가 시간(상단 그래프) 및 세포수(하단 그래프)를 측정한 결과이다. 각 그래프에서 P1 내지 P9은 계대 횟수를 의미한다.
도 7은 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 각각 일반 배양 조건(control), 칼슘 첨가 조건(Ca2+), 저산소 조건(hypoxia) 및 CMH 조건 하에서 배양한 후, 줄기성 마커인 Oct4와 나노그(nanog)와 노화 마커인 P16의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 8은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 일반 배양 조건(control) 및 CMH 조건 하에서 계대배양한 후, SA-β-gal로 염색한 사진(상단) 및 제대혈 유래 간엽줄기세포를 일반 배양 조건(control), 칼슘 첨가 조건(Ca2+), 저산소 조건(hypoxia) 및 CMH 조건 하에서 배양한 후 β-gal 활성을 측정한 결과(하단 그래프)이다.
도 9는 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 각각 일반 배양 조건(control) 및 CMH 조건 하에서 배양한 다음, 연골 및 뼈로 분화를 유도한 후 촬영한 사진이다.
도 10은 일반 배양 조건(control) 및 CMH 조건 하에서 각각 배양한 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)가 반응세포(A)를 자극시키는지 여부를 확인한 그래프이다. 그래프에서 A는 반응세포를, B는 자극세포를, H는 PHA를 의미한다.
도 11은 도 10의 조건 하에서 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)로부터 분비된 PGE₂(프로스타글란딘 E₂)의 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 일반 배양 조건(control) 및 CMH 조건 하에서 각각 배양한 4종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 내지 #4)를 24시간 동안 펠렛 배양한 후 측정한 Tsp-2 분비량을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 간엽줄기세포를 2.1 내지 3.8 mM의 칼슘 및 1.0 내지 3.0 mM의 마그네슘을 함유하는 배양용 배지에서 2 내지 5%의 저산소(hypoxia) 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 간엽줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 간엽줄기세포의 배양방법은 다양한 기원 조직으로부터 유래된 간엽줄기세포에 적용될 수 있다. 상기 간엽줄기세포의 예로는 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양수, 탯줄, 치아 등에서 유래된 간엽줄기세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 간엽줄기세포의 배양방법은 제대혈 유래 간엽줄기세포에 적용된다.

또한, 본 발명의 간엽줄기세포의 배양방법은 다양한 대상으로부터 수득한 간엽줄기세포에 적용될 수 있다. 상기 간엽줄기세포의 예로는 인간을 포함한 포유동물로부터 수득한 간엽줄기세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 간엽줄기세포의 배양방법은 인간으로부터 수득한 간엽줄기세포에 적용된다.

본 발명의 배양방법은 2.1 내지 3.8 mM의 칼슘 및 1.0 내지 3.0 mM의 마그네슘을 함유하는 배양용 배지를 사용하는 것을 일차적인 특징으로 한다. 상기 배지는 당업계에 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지에 칼슘 및 마그네슘을 첨가하여 상기 농도로 조정함으로써 제조될 수 있다. 당업계에 통상적으로 사용되는 배지의 예로는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 최소 필수 배지(minimal essential medium, MEM), 알파-최소 필수 배지(α-MEM), 맥코이스(McCoys) 5A 배지, 이글스 기본 배지(eagle's basal medium), CMRL(Connaught Medical Research Laboratory) 배지, 글래스고우(Glasgow) 최소 필수 배지, 햄스(Ham's) F-12 배지, IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz') L-15 배지, RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지, 배지 199(Medium 199) 및 행크스 배지 199(Hank’s Medium 199)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배양용 배지는 필요에 따라 혈청을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 또한, 상기 배양용 배지는 혈청 대신에 혈청 대체물(serum replacement)을 포함할 수 있다.

하나의 구체예에서, 상기 배양용 배지는 5 내지 30%의 우태아혈청(FBS)을 함유하는 배지이다. 또 다른 구체예에서, 상기 배양용 배지는 혈청 대체물(serum replacement)을 포함하는 배지이다. 상기 혈청 대체물의 예로서, 혈청 대체물로 시판 중인 제품 이외에도 인간 혈청(human serum) 또는 인간 혈청 용해물(human platelet lysate) 중의 여러 성장인자, 및 PDGF, TGF, IGF 및 유사 패밀리의 사이토카인을 포함하는 여러 가지 성장인자가 사용될 수 있다.

본 발명의 배양방법에서 칼슘은 간엽줄기세포의 증식을 촉진하며, 간엽줄기세포의 면역원성을 억제하고, 사이토카인의 분비를 촉진한다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 칼슘은 배양용 배지를 기준으로 2.1 내지 3.8 mM의 농도로 사용될 수 있고, 바람직하게는 3.3 내지 3.8 mM, 더욱 바람직하게는 약 3.6 mM의 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 배양용 배지로서 알파-최소 필수 배지(α-MEM)가 사용되는 경우 상기 배지 중에 칼슘이 1.8 mM 농도로 포함되어 있으므로, 0.3 내지 2.0 mM의 칼슘, 바람직하게는 1.5 내지 2.0 mM, 더욱 바람직하게는 약 1.8 mM의 칼슘을 추가로 첨가하여 본 발명에 따른 칼슘 농도로 조정할 수 있다. 이와 유사하게, 다른 배양용 배지가 사용되는 경우 배지 자체 내에 포함된 칼슘 농도로부터 본 발명에 따른 칼슘 농도 조건을 맞추기 위해 추가되어야 할 칼슘 농도를 손쉽게 계산할 수 있다.

또한, 본 발명의 배양방법에서 마그네슘은 칼슘 첨가로 인한 칼슘 침전물의 형성을 방지하기 위한 목적으로 사용된다. 마그네슘은 배지 중에 1.0 내지 3.0 mM의 농도, 바람직하게는 약 1.8 mM의 농도로 사용될 수 있다. 마그네슘이 1.0 mM 미만으로 사용되는 경우 침전물의 형성을 방지하기 힘들며, 3.0 mM를 초과하는 경우 고농도의 마그네슘이 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM)의 형성을 저해하며, 세포의 배양용기 바닥에의 부착을 감소시켜 세포가 전단응력에 민감해지게 할 뿐만 아니라 세포내 무기질화(mineralization)을 증가시킬 우려가 있다. 예를 들어, 배양용 배지로서 알파-최소 필수 배지(α-MEM)가 사용되는 경우 상기 배지 중에 마그네슘이 0.8 mM 농도로 포함되어 있으므로, 0.2 내지 2.2 mM의 마그네슘, 바람직하게는 1.0 mM의 마그네슘을 추가로 첨가하여 본 발명에 따른 마그네슘 농도로 조정할 수 있다. 이와 유사하게, 다른 배양용 배지가 사용되는 경우 배지 자체 내에 포함된 마그네슘 농도로부터 본 발명에 따른 마그네슘 농도 조건을 맞추기 위해 추가되어야 할 마그네슘 농도를 손쉽게 계산할 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 배양용 배지는 5 내지 30%의 우태아혈청(FBS)를 함유하는 α-MEM 배지에, 0.3 내지 2.0 mM의 칼슘 및 0.2 내지 2.2 mM의 마그네슘이 추가됨으로써, 배지를 기준으로 칼슘 농도가 2.1 내지 3.8 mM의 농도이며 마그네슘이 1.0 내지 3.0 mM의 농도인 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명의 배양방법은 간엽 줄기세포를 저산소(hypoxia) 조건 하에서 배양하는 것을 이차적인 특징으로 한다. 상기 저산소 조건은, 대기 중의 산소 농도를 가리키는 정상 산소(normoxia) 조건과 비교하여, 간엽줄기세포의 증식을 더욱 촉진하며, 간엽줄기세포의 면역원성을 더욱 억제하고, 사이토카인의 분비를 더욱 촉진한다. 상기 목적을 달성하기 위하여 산소는 2 내지 5%의 농도로 사용될 수 있다. 상기 산소의 농도가 2% 미만이거나 5%를 초과하면 간엽줄기세포의 증식이 현저히 감소되는 문제가 발생한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 상기 산소는 약 3%의 농도로 사용된다. 상기 저산소 조건은 세포 배양기 내 산소 농도를 조절함으로써 이루어진다. 예를 들어, 정상 산소 조건을 갖는 배양기 내에 질소(100%) 가스 또는 질소/이산화탄소(95%/5%) 혼합 가스를 공급하여 배양기 내 공기를 대체함으로써 저산소 조건을 달성할 수 있다. 상기 산소 농도는 배양기에 장착된 산소 센서를 통해 확인할 수 있다.

전술한 조건 외에 간엽줄기세포의 배양은 통상적으로 알려진 방식대로 수행될 수 있다. 예를 들어, 간엽줄기세포는 3차원 생물반응장치(bioreactor 또는 spinner)를 이용하여 배양하거나, 일반 부착성 용기에서 배양할 수 있다.

본 발명의 배양방법은 배지 중의 칼슘 및 마그네슘 농도의 조정이라는 일차적인 특징과 저산소 조건하에서의 배양이라는 이차적인 특징을 조합함으로써, 개별 조건에 비해 간엽줄기세포의 증식을 촉진하고, 간엽줄기세포의 면역원성을 억제하며, 사이토카인의 분비를 촉진하는 상승효과를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 배양방법은 개별 조건에 비해 1.5 내지 5배로 간엽줄기세포의 증식을 촉진하고, 1 내지 3배로 면역원성을 억제하며, 1.5 내지 3배로 사이토카인의 분비를 촉진시킨다. 상기 조합된 본 발명의 배양방법은 본원에서 'CMH'(calcium + magnesium + hypoxia) 조건으로 지칭된다.

본 발명의 배양방법은 계대 배양시에 적용될 수 있다. 즉, 본 발명의 배양방법에 의해 배양한 간엽줄기세포를 상기와 동일한 배양방법으로 계대배양할 수 있다. 본 발명의 배양방법에 따라 배양시 간엽줄기세포의 증식이 촉진되므로, 적은 횟수의 계대배양으로 많은 수의 간엽줄기세포를 얻을 수 있는 장점이 있다. 예를 들어 매 계대마다 동일한 수의 세포를 접종하고 동일한 배양기간으로 5회 계대배양시 종래 배양방법에 비해 본 발명에 따른 배양방법은 100 내지 1000배 이상 더 많은 세포를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 배양방법을 통해 얻은 간엽줄기세포는 면역원성이 없고 면역반응을 유발하지 않으므로, 인간을 대상으로 한 세포치료제 또는 연골 재생 치료제로 효과적으로 사용될 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 상기 배양방법에 의해 수득된, 증식력, 생존도, 회수율 및 면역학적 특성이 개선된 간엽줄기세포를 제공한다. 상기 개선된 면역학적 특성으로는 면역원성을 나타내지 않고, 면역반응 억제물질(예를 들어, PGE₂)을 분비함으로써 면역억제 능력을 나타내며, 유용한 사이토카인(예를 들어, Tsp-2)의 분비량이 증가되는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 배양방법에 의해 수득된 간엽줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다. 본 발명의 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 간세포, 췌도베타세포, 혈관세포 또는 폐세포의 재생 또는 보호에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포치료제는 폐질환 치료; 폐질환에 의한 염증 억제 또는 치료; 폐조직 재생; 및 폐조직 섬유증 억제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 유용한 것을 특징으로 하며, 폐질환에 의한 염증반응 및 섬유증(fibrosis)을 억제하거나 호전시킬 수 있다. 나아가, 본 발명의 세포치료제는 심혈관 질환의 치료 또는 연골 재생용으로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 세포치료제는 면역조절 기능을 증가시키거나, 면역유발성, 면역세포침투 또는 면역원성 중 하나를 저하시킬 수 있으며, 염증반응을 억제시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 메디포스트(주)(한국)에서 제공받은 인간 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용하였다. 상기 세포는 제대혈 채취 단계 및 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리 및 배양하는 단계로부터 얻어질 수 있으며, 각 단계에 대한 자세한 내용은 다음과 같다.

제대혈 채취 단계에서는, 정상질식분만의 경우, 아기출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취하거나, 또는 제왕절개의 경우에는 아기 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취한다.

본 발명에서 출산 후 자궁 밖으로 만출된 제대 정맥으로부터 제대혈을 채취할 때는, 신생아가 태어난 후 태반과 태아를 연결하고 있던 제대정맥으로부터 무균적 조작법에 의해 채취한다.

제대정맥을 확보한 후, 채취침을 이용하여 항응고제가 함유된 제대혈 채취백(주머니)에 제대혈을 채취한다.

상기와 같이 채취된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리ㆍ배양하는 방법은 대한민국 등록특허 제10-0494265호의 방법을 비롯하여 기존에 사용되어 온 방법은 모두 사용할 수 있으며 (Pittinger MF, Mackay AM, et al., Science, 284: 143-7, 1999; Lazarus HM, Haynesworth SE, et al., Bone Marrow Transplant, 16: 557-64, 1995), 그 중 한 예를 들면 다음과 같다.

채취된 제대혈을 원심분리하여 단핵세포들을 분리한 후, 여러번 세척하여 이물질들을 제거한다. 세척 후 적절한 밀도로 단핵세포들을 배양용기에 심어 배양하면, 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는데 이 중 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성(homogeneous)이면서, 방추형 모양(spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 집락(colony) 형태로 증식하는 세포가 간엽줄기세포이다. 이후 세포가 컨플루언트(confluent)한 정도로 자라게 되면 계대배양을 실시하여, 필요한 만큼의 세포수가 될 때까지 증식시킨다.

실시예 1: 칼슘 농도에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식력

칼슘 농도에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식력을 평가하기 위하여, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 다양한 농도의 칼슘이 첨가된 배지에서 배양하였다.

구체적으로, 다른 산모로부터 얻은 동결보관된 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 해동한 후, 10% FBS가 함유된 α-MEM 배지(Invitrogen, USA)가 들어 있는 배양기(hypoxia/CO₂ incubator, Thermo Scientific #3131)에서, 37℃ 및 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 세포가 80~90%의 컨플루언시(confluency)에 도달하면 트립신을 처리하여 단일 세포들(single cells)을 얻었다. α-MEM 배지(10% FBS 함유; 1.8 mM의 칼슘 및 0.8 mM의 마그네슘이 함유되어 있음)에 다양한 농도(0 mM, 1.5 mM, 3 mM, 4.5 mM, 6 mM 및 7.5 mM)의 칼슘을 각각 첨가하여 배지 중의 칼슘 농도를 다음과 같이 다양하게 조정하였다: 1.8 mM, 3.3 mM, 4.8 mM, 6.3 mM, 7.8 mM 및 9.3 mM. 상기 배지에 간엽줄기세포를 5,000 세포/cm²의 농도로 접종하였다. 이때, 칼슘 첨가로 인한 침전물 형성을 방지하기 위해 1 mM의 마그네슘(배지 중 총 마그네슘 함량: 1.8 mM)을 첨가하였다. 상기 세포를 21%(v/v) 산소(normoxia) 조건 하에서 배양하였고, 세포가 80~90% 정도 자라면 같은 방법으로 계대 배양하였다. 각 계대 배양 후, 셀로미터 오토 T4 세포 계수기(Cellometer Auto T4 cell counter, Nexelcom, Lawrence, MA, USA)를 이용하여 세포수를 측정하였다. 상기 측정 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다. 도 1a 및 도 1b는 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 α-MEM 배지에 각각 0 내지 7.5 mM의 칼슘을 추가로 첨가한 배지에서 배양한 결과로서, 초기 접종시 세포수 대비 배양 7일째의 세포 비율(상단 그래프) 및 21일까지의 세포수(하단 그래프)를 나타낸 것이다.

상기 도 1a 및 도 1b에서 보는 바와 같이, 1.5 mM(전체 배지 중 칼슘 농도: 3.3 mM)의 추가 칼슘 농도에서 세포의 증식력이 제일 높았으며, 계대가 진행되어도 동일한 경향을 나타내었다. 다만, 3 mM(전체 배지 중 칼슘 농도: 4.8 mM) 이상의 추가 칼슘 농도에서는 증식력이 점차 감소하는 추세를 나타내었다.

한편, 최적의 칼슘 농도를 확인하기 위해, 추가된 칼슘 농도를 3 mM 이하에서 좀 더 세분화하여 전술한 방법대로 실험하였다. 상기 측정 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 도 2a 및 도 2b는 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 사용하여 실험한 결과로서, 각 도의 상단 그래프는 다양한 농도의 칼슘을 추가하여 배지 중 칼슘 농도를 1.8 mM, 2.1 mM, 2.4 mM, 2.7 mM, 3.0 mM, 3.3 mM 및 3.6 mM로 조정한 배지에서 7일간 배양 후 세포수를 나타낸 것이고, 하단 그래프는 다양한 농도의 칼슘을 추가하여 배지 중 칼슘 농도를 1.8 mM, 3.4 mM, 3.6 mM, 3.8 mM, 4.0 mM, 4.2 mM 및 4.4 mM)에서 6일간 배양 후 세포수를 나타낸 것이다.

상기 결과에서 보는 바와 같이, 0 내지 1.8 mM까지의 추가 칼슘 농도(배지 중 전체 칼슘 농도: 1.8 내지 3.6 mM)에서 세포의 증식력이 증가하다가 1.8 mM(배지 중 전체 칼슘 농도: 3.6 mM)를 초과하면서 세포의 증식력이 점차 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 볼 때, 세포의 최대 증식을 달성하기 위한 배지 중의 최적의 칼슘 농도가 3.6 mM인 것으로 확인되었고, 일반 배양 조건 대비 높은 증식력을 얻기 위해서는 배지를 기준으로 바람직하게는 2.1 내지 4.3 mM, 더욱 바람직하게는 3.3 내지 3.8 mM의 칼슘 농도에서 배양하는 것이 유리할 것으로 판단된다.

실시예 2: 산소 농도에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식력

산소 농도에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식력을 평가하기 위하여, 다양한 농도의 산소 조건 하에 제대혈 유래 간엽줄기세포를 배양하였다.

구체적으로, 실시예 1에서와 같이 10% FBS가 포함된 α-MEM 배지에 제대혈 유래 간엽줄기세포를 배양하되, 배지 중에 칼슘 및 마그네슘을 첨가하지 않고, 3%, 5% 및 정상 산소(대기 중 산소 농도, 21%) 조건 하에서 배양한 후, 세포의 증식력을 측정하였다. 상기 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다. 도 3a 및 도 3b는 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 사용하여 실험한 결과로서, 각 도의 상단 그래프는 다양한 산소 조건(정상, 3% 및 5%) 하에서 계대배양 횟수가 각각 1회, 2회, 3회인 세포가 세포수가 2배가 되는데 걸리는 시간(배가 시간; 일)을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 다양한 산소 조건(정상, 3% 및 5%) 하에서 21일간 배양시 세포수를 나타낸 것이다.

상기 결과에서 보는 바와 같이, 배치간 차이가 존재하긴 하였지만, 정상 산소(normoxia) 조건보다 저산소(hypoxia) 조건 하에서 세포의 증식력이 높은 것으로 나타났다. 특히, 3% 산소 농도에서 증식력이 제일 높았고 장기간 계대 배양하는 동안에도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 5% 이하의 산소 조건을 세분화하여 실험한 결과, 2 내지 5%의 산소 조건이 바람직한 것으로 결정되었다(데이터 미제시).

실시예 3: 칼슘(마그네슘 포함) 및 산소 농도 조합에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식력

칼슘(마그네슘 포함) 및 산소 농도 조합에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식력을 평가하기 위하여, 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 각각 일반 배양 조건(대조군), 칼슘(마그네슘 포함) 첨가 조건, 저산소 조건, 및 칼슘(마그네슘 포함)/저산소 조건(이하 "CMH"라 함) 하에서 배양하였다. 이때, 칼슘과 마그네슘은 각각 배지를 기준으로 3.6 mM(1.8 mM의 칼슘 추가) 및 1.8 mM(1 mM의 마그네슘 추가)의 농도로 사용하였고, 저산소 조건은 3% 농도의 산소 하에서 수행하였으며, 배양 과정은 실시예 1과 동일하게 수행하되, 각 간엽줄기세포를 일반배양 조건하에서 5회(P5) 계대배양한 후, 이후부터는 CMH 조건 하에서 7회 계대배양(P12)하였으며, 각 계대 후 7일간 배양하였다.

상기 실험결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 상단 그래프는 각 계대배양된 세포를 상기 조건 하에서 배양시 배가 시간(일)을 나타낸 것이고, 하단 그래프는 상기 조건 하에서 배양시 세포수를 나타낸 것이다.

상기 도 4에서 보는 바와 같이, 저산소 조건 및 칼슘 첨가 조건과 비교하여, 상기 두 조건을 조합한 CMH 조건 하에서 세포의 증식력이 현저히 향상되었고 이 효과는 계대 배양이 지속되어도 유지되었다. 다양한 세포 배치를 실험한 결과에서도 정도의 차이는 있지만 동일한 경향을 나타내었다. 상기 결과를 통해 본 발명의 CMH 배양방법이 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식 향상에 효율적임을 알 수 있었다.

실시예 4: 배양 조건에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 생존도 및 회수율 확인

본 발명의 CMH 조건이 제대혈 유래 간엽줄기세포의 생존도 및 회수율에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1)를 각각 일반 배양 조건(대조군), 저산소(3%) 조건, 칼슘(1.8 mM; 배지 중 전체 칼슘 농도 3.6 mM) 첨가 조건 및 CMH 조건(3% O₂ + 1.8 mM 추가 칼슘 + 1 mM 추가 마그네슘) 하에서 배양한 후, 배양용기에서 떼어내어 기본 배지(α-MEM 배지)로 3회 세척한 다음, 기본 배지에 현탁시켜 실온에서 보관하면서 시간에 따른 세포의 생존도 및 회수율을 비교하였다. 세포의 생존도는 세포를 회수하여 기본 배지에 현탁한 다음, 트립판 블루를 첨가하여 살아있는 세포를 염색하고, 현탁액(10~20 μL) 중의 세포수를 세포계수기(hemocytometer)를 이용하여 측정한 후, 살아있는 세포와 죽은 세포의 비율을 계산하여 구하였다. 한편, 세포의 회수율은 배양전 세포수 대비 살아있는 세포수의 비율을 계산함으로써 구하였다.

상기 실험 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 상단 그래프는 1일 및 2일째의 제대혈 유래 간엽줄기세포의 생존도를 나타내며, 하단 그래프는 1일 및 2일째의 제대혈 유래 간엽줄기세포의 회수율을 나타낸다.

상기 도 5에서 보는 바와 같이, 일반 배양된 세포에 비해 저산소 및 칼슘 첨가 조건 하에서 배양된 세포의 생존도 및 회수율이 우수하였고, 상기 각각의 조건들에 비해서 CMH 배양 조건 하에서 배양된 세포들의 생존도와 회수율이 훨씬 우수하였다. 서로 다른 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용하여 실험을 진행했을 때에도 정도의 차이는 있지만 동일한 결과를 나타내었으며, 이는 일반 배양 조건 또는 칼슘 첨가 및 저산소 개별 조건보다 CMH 배양 조건이 제대혈 유래 간엽줄기세포의 생존도를 향상시켜 더 많은 세포를 회수하는데 유리하다는 것을 보여준다.

한편, 간엽줄기세포(MSC #1 내지 #4)를 일반 배양 조건 및 CMH 조건 하에서 계대배양하여 세포 증식도를 살펴보았다. 상기 결과를 도 6a 및 6b에 나타내었다. 각 도의 상단 그래프는 배가 시간(doubling time)을 나타내고, 하단 그래프는 세포수를 나타낸다.

상기 도에서 보는 바와 같이, CMH 조건을 적용한 결과 세포 증식의 척도인 배가 시간이 대조군보다 짧으며 감소 정도도 완만하고 오래 유지되는 것으로 나타났다. 또한, 여러 계대 배양한 누적 세포수(cumulative growth curve)에서 확인할 수 있듯이 같은 간엽줄기세포라도 CMH 조건에서 훨씬 많은 수의 세포를 얻을 수 있었다. 서로 다른 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용하여 실험을 진행했을 때에도 정도의 차이는 있지만 동일한 결과를 나타내었고 이를 통하여 정상 배양 조건보다 CMH 배양 조건이 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식에 더 나은 결과를 유도함을 확인할 수 있다. 특히 제대혈 간엽줄기세포의 초기 계대부터 CMH 조건을 적용하는 경우 더 많은 세포를 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 배양 조건에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 줄기성 ( stemness ) 및 노화( senescence ) 분석

CMH 조건에서 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식이 향상된 원인을 살펴보기 위해, 줄기세포의 증식과 연관된 줄기성(stemness) 및 노화(senescence) 변화 유무를 조사하였다.

구체적으로, 실시예 3에서 같이 일반 배양 조건 및 CMH 조건 하에서 제대혈 유래 간엽줄기세포를 배양하였다. 세포가 80~90%의 컨플루언시에 도달하면 트립신을 처리하여 세포를 떼어내었다. 원심분리하여 배지를 제거하고, PBS로 세척한 다음, 다시 원심분리하여 세포를 얻었다. 이 과정을 2회 반복하여 세포 중에 남아있는 PBS를 완전히 제거하였다. 이후, RNA 분리 키트(Invitrogen사)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 분리하였다. 상기 RNA로부터 SuperScript^TMIII(invitrogen) 역전사효소를 사용하여 주형(template)로서 cDNA를 합성한 후, 줄기성 마커인 Oct4와 나노그(nanog) 및 노화 마커인 P16, 및 GADPH에 대한 특이적 프라이머(CosmogeneTech, 표 1 참조)를 이용하여 실시간(real-time) PCR을 수행하였다. 실시간 PCR은 LightCycler 480 Real-Time PCR System instrument (Roche)를 사용하여 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 95℃에서 10초, 62℃에서 30초 및 72℃에서 10초간 30사이클을 반복하여 수행하였다.

RT-PCR을 위한 프라이머

마커	서열 (F: 정방향, B: 역방향)
Oct4	F; CAATTTGCCAAGCTCCTGA (서열번호 1) R; CGTTTGGCTGAATACCTTCC (서열번호 2)
Nanog	F; AGATGCCTCACACGGAGACT (서열번호 3) R; TTTGCGACACTCTTCTCTGC (서열번호 4)
P16	F; GTGGACCTGGCTGAGGAG (서열번호 5) R; CTTTCAATCGGGGATGTCTG (서열번호 6)
GADPH	F; AGCCACCATCGCTCAGACAC (서열번호 7) R; GCCCAATACGACCAAATCC (서열번호 8)

상기 RT-PCR로 얻어진 PCR 산물의 RNA 수준을 대조군인 GAPDH의 발현량으로 정규화(normalization)하여 일반 배양 조건과 CMH 조건에서 배양한 세포 내 각 마커의 RNA 발현량을 비교하였다(상대적 비교, ddCT 방법).

상기 측정 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 상부 및 하부 그래프는 각각 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MSC #1 및 #2)를 대상으로 측정한 결과이다.

상기 도 7에서 보는 바와 같이, 일반 배양 조건(대조군)보다 CMH 조건에서 배양된 제대혈 유래 간엽줄기세포에서 Oct4와 나노그(nanog)의 발현이 증가하였고, 이는 개별 조건에서 배양한 세포에서의 발현보다 높았다. 또한, 노화 마커인 P16의 경우 Oct4와 반대의 양상을 나타내었다. 상기 결과는 CMH 배양 조건이 간엽줄기세포의 줄기성 및 노화 억제를 유도하여 증식력을 향상시킨다는 것을 보여준다.

한편, CMH 조건에서 배양시 노화 억제 여부를 확인하기 위해, 하기와 같이 실험하였다. 구체적으로, 실시예 3과 같이 일반 배양 조건 및 CMH 조건 하에서 제대혈 유래 간엽줄기세포를 7~8 계대배양하여 노화를 유도시킨 다음, 세포의 배양액을 제거하고 PBS로 1회 세척한 후, 1X 정착액(Fixation solution; Cell signaling Technology) 1 mL을 가하여 상온에서 3-5분간 배양하였다. 상기 정착액을 제거한 후, PBS 2 mL을 첨가하여 세포를 2회 세척하였다. 이후, 1 mL의 β-갈락토시다아제 염색 용액(Cell signaling Technology)을 첨가한 다음, 37℃ 배양기에서 2 내지 24시간 동안 배양하였다. 상기 염색 용액을 제거하고, PBS 1 mL을 첨가하여 세척한 다음, ECLIPSE TE2000-U 역상 현미경(Nikon Co., Kanagawa, Japan)으로 염색된 노화된 세포 수를 계수하였다.

상기 실험 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 상부는 SA-β-gal 염색 후 현미경으로 촬영한 사진이며, 하부 그래프는 SA-β-gal 활성을 나타낸 것이다. SA-β-gal 활성은 40~100배의 배율로 촬영한 사진에서의 총 세포수 대비 염색된 세포수를 측정한 후 통계처리하여 계산한 것이다.

도 8에서 보는 바와 같이, 일반 배양 조건보다 칼슘첨가 및 저산소 조건 하에서 배양된 세포에서 노화 진행이 억제되었고, CMH 조건 하에서 배양된 세포에서 상기 두 조건보다 훨씬 더 노화의 진행이 억제되었다.

상기 결과들은 본 발명의 CMH 배양 조건이 일반 배양 조건 또는 개별 조건보다 줄기성 향상과 노화 억제가 뛰어나며, 이로써 제대혈 유래 간엽줄기세포의 증식력을 향상시킨다는 것을 보여준다.

실시예 6: 배양 조건에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 분화능 및 표지 인자 변화 유무 확인

CMH 조건 하에서 배양시 제대혈 유래 간엽줄기세포의 기본 성상에 변화가 일어나는지 여부를 확인하기 위해, 연골분화(chondrogenic induction)와 골분화(osteogenic induction) 등 간엽줄기세포의 분화능 및 표지마커의 변화 여부를 분석하였다.

구체적으로, 실시예 3에서와 같이 2종의 제대혈 유래 간엽줄기세포(MS #1 및 #2)를 일반 배양 조건(대조군) 및 CMH 조건 하에서 배양한 후, 하기 기재된 방법에 의해 각각 연골 및 뼈로의 분화를 유도하였다. 그리고 나서, 연골 및 뼈를 염색하여 연골 및 뼈 분화 정도를 판별하였다.

연골분화 방법

연골분화 유도를 위해 15 mL 코니컬 튜브에 세포를 2~2.5×10⁵개씩 분주하였다. 이후 원심분리하여 세포를 얻은 다음, D-PBS로 세척하고, 분화 배지[high glucose DMEM(Gibco, cat#. 11995), 10ng/ml TGFβ-3(Sigma, cat#. T5425, 2ug), 500ng/ml BMP-6(R&D, cat#. 507-BP, 20ug ), 50ug/ml ascrobic acid(Sigma, cat#. A8960), 50mg/ml(1:100) ITS^TM+ Premix(BD, cat#. 354352), 40ug/ml L-proline(Sigma, cat#. P5607), 100ug/ml sodium pyruvic acid( Sigma, cat#. P8574 ), 100nM dexametasone(Sigma, cat#. D2915 )]가 200~250λ가 되도록 세포를 분화 배지에 현탁하여 튜브에 분주하였다. 상기 튜브를 1500 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 뚜껑을 약간 연 상태로 37℃ CO₂ 배양기에서 4주간 분화를 유도하였다. 이때 분화 배지는 일주일에 2회씩 절반을 교체하였다.

연골 염색 방법

연골분화 유도된 세포를 원심분리하여 PBS로 세척한 후 4% 파라포름알데하이드로 30분 내지 1시간 동안 상온에서 고정시켰다. 그리고 나서, 세포를 증류수로 2~3회 세척한 후, 동결절편법으로 절편(4~5 um 두께)을 제조하였다. 상기 절편을 95% 에탄올에 3~5분간 넣어둔 다음, 물로 2회 세척하였다. 그리고 나서, 0.1% 사프라닌 O(safranin O) 용액에 7분간 침지하여 염색하였다. 염색 후, 70% 에탄올로 2회, 70% 에탄올로 1회, 95% 에탄올로 2회, 95% 에탄올로 1회 및 100% 에탄올로 2회 세척하고, 자일렌 기질 용액에 3분간 침지한 다음, 건조시켰다. 건조 후, 지용성 마운팅 용액(mounting solution)으로 염색된 조직을 덮은 후 관찰하였다. 연골 분화 정도를 염색된 색깔 정도(보라색), 최종 분화된 펠렛의 크기 및 연골소강(lacuna) 구조의 형성 정도의 비교를 통하여 판별하였다.

골분화 방법

골분화의 유도를 위해, 세포를 500~1000개씩 6-웰 플레이트에 분주한 후, 2~4일 후 골분화 배지(1L α-MEM 배지에 β-glycerol phosphate 2.1604g, L-ascorbic acid-2-phosphate 0.012805g, dexamethasone/UVAB 0.6mg, gentamycin (10mg/ml) 5ml 및 FBS 100ml)로 교체하였다. 3일마다 배지를 새로운 분화 배지로 교체하면서 2~3주간 분화를 유도한 다음, ALP 염색법으로 분화 정도를 확인하였다.

골 염색 방법

분화된 세포를 PBS로 2회 세척한 후 고정화 용액(40% 아세톤)에서 30~45초간 배양하였다. 세포를 증류수로 2~3회 세척한 후 알칼리 염색 용액(Fast violoet B salt)을 첨가하고, 어두운 곳에서 상온에서 30분간 배양하였다. 세포를 증류수로 2회 세척한 다음, 메이어 헤마톡실린(Mayer’s Hematoxylin) 용액을 10~20초간 처리하였다. 상기 용액을 제거한 후 수돗물로 세척하여 건조하고, 지용성 마운틴 용액으로 염색된 조직을 덮어 관찰하였다. 골아세포로 분화된 세포가 세포내 알칼라인 포스파타아제의 활성화로 인해 진한 갈색으로 염색되므로, 상기 염색 정도로 골분화 정도를 판별하였다.

상기 결과를 도 9A 및 9B에 나타내었다. 도 9A 및 9B에서 보는 바와 같이, 일반 배양 조건과 CMH 조건에서 배양한 제대혈 유래 간엽줄기세포는 연골과 뼈로의 분화 유도시 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 세포 표면항원의 면역표현형을 분석하기 위하여, 하기와 같이 표지 마커 단백질(CD34, CD73, CD45, CD105)들의 발현을 FACS 분석으로 확인하였다.

구체적으로, 일반 배양 조건 및 CMH 조건에서 배양한 제대혈 유래 간엽줄기세포를 각각 트립신으로 처리한 후, 2% FBS가 포함된 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 상기 세척된 세포를 조혈 관련 항원인 CD34-FITC(fluorescein isothiocyanate) 및 CD45-FITC, 면역조절 관련 항원인 CD73-PE(phycoerythrin) 및 혈관 신생 관련 항원인 CD105-PE와 반응시켰다. 이후, 웨스턴 블롯법과 유사한 방식으로 이차 항체(IgG-FITC; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)를 추가로 붙인 다음, FACS 기기를 사용하여 이차항체의 신호를 탐색하여 전체 세포 중 해당 마커를 발현하는 세포 비율을 얻었다. 반응 후 분석은 FACSCalibur 유세포분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)와 CELLQUEST 소프트웨어를 이용하였다.

상기 결과를 표 2에 나타내었다.

		CD34	CD73	CD45	CD105
MSC #1	대조군	-	+	-	+
MSC #1	CMH	-	+	-	+
MSC #2	대조군	-	+	-	+
MSC #2	CMH	-	+	-	+
MSC #3	대조군	-	+	-	+
MSC #3	CMH	-	+	-	+

상기 표 2에서 보는 바와 같이, CMH 조건 하에서 배양시 일반 배양 조건과 비교하여 표지 마커 단백질의 발현에 있어 큰 차이가 없었다.

상기 결과들은, 본 발명의 CMH 배양 조건이 제대혈 유래 간엽줄기세포의 기본 특성에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.

실시예 7: 배양 조건에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 면역원성 및 면역억제 능력 비교

배양 조건에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 면역학적 특성을 혼합림프구 면역반응법(Mixed lymphocyte reaction, MLR)에 의해 다음과 같이 비교하였다.

구체적으로, 96-웰 플레이트에 음성대조군으로서 10 μg/ml의 미토마이신 C(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)가 처리된 2×10⁴의 일반 배양된 세포와 CMH 배양된 2×10⁴의 제대혈 유래 간엽줄기세포, 1×10⁵의 반응세포(말초혈액단핵세포('A'로 표시함); ALLCELLS, Emeryville, CA), 1×10⁵의 자극세포(비혈연 말초혈액단핵세포('B'로 표시함); ALLCELLS, Emeryville, CA)를 각각 단독 배양하였다. 양성대조군(1)의 경우 10 μg/ml의 PHA-L('H'로 표시함; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)이 처리된 말초혈액 단핵세포를 1×10⁵씩 웰에 넣고, 양성대조군(2)의 경우 반응세포와 자극세포 1×10⁵을 웰에 넣었다. 시험군의 경우, 말초혈액 단핵세포 그룹, PHA-L로 자극한 말초혈액 단핵세포 그룹, 반응세포와 자극세포를 반응시킨 그룹으로 나누어 각각 말초혈액 단핵세포를 1×10⁵씩 첨가하였다. 이후, 웰을 5일간 배양하여, 현미경으로 반응세포의 증식 및 군집형성을 확인하였고, 배양 5일째에 BrdU (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 처리하여 최종 24시간동안 새로 합성된 반응세포의 DNA를 VERSAmax^TM 흡광도 마이클로플레이트 리더(Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 370 nm에서 측정하였다.

상기 실험결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 보는 바와 같이, PHA-L(H)로 자극된 비혈연 말초혈액 단핵세포(A+H)에서 증식이 유도된 반면, 제대혈 유래 간엽줄기세포는 반응세포를 자극하지 않아 세포 증식을 유도하지 않았다(hUCB-MSC+A). 특히 일반 배양된 제대혈 유래 간엽줄기세포에 비해 CMH 조건으로 배양된 제대혈 유래 간엽줄기세포가 반응세포의 세포증식을 억제하는데 더 큰 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 상기 결과를 통해 일반 배양 조건보다 CMH 배양 조건에서 배양된 제대혈 유래 간엽줄기세포가 면역원성을 덜 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

반응세포(A)와 자극세포(B)가 반응하여 면역반응이 유도된 조건(A+B)과 반응세포에 PHA-L로 인위적인 자극을 주어 면역반응을 유도한 조건(A+H)에 일반 배양한 제대혈 유래 간엽줄기세포와 CMH 조건으로 배양한 제대혈 유래 간엽줄기세포를 첨가한 경우, 정상 배양한 제대혈 유래 간엽줄기세포에 비해 CMH 조건으로 배양한 제대혈 유래 간엽줄기세포를 첨가했을 때 반응세포인 말초혈액 단핵세포의 증식이 훨씬 더 많이 억제됨을 확인할 수 있다. 서로 다른 제대혈 유래 간엽줄기세포를 이용하여 실험을 진행했을 때에도 정도의 차이는 있지만 동일한 결과를 나타내었다. 상기 결과는 면역반응을 억제하는데 있어서, 일반 배양 조건보다 CMH 배양 조건 하에서 배양하는 것이 유리함을 보여준다.

한편, 상기와 동일한 방식으로 반응시켜 면역반응 억제물질인 PGE₂(프로스타글란딘 E₂)의 분비량을 PGE2 ELISA 키트(Cayman, Ann arbor, MI, USA)를 사용하여 하기와 같이 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였다. 시험 시료는 상기 MLR 반응에서 얻은 배양액을 사용하였다.

구체적으로, ELISA 측정에 필요한 표준품(standard)을 최대용량을 1000 pg/ml로 맞추고, 1/2로 연속희석하여 최저용량을 7.8 pg/ml로 맞춰 제조하였다. PGE2 캡처 항체가 결합되어 있는 플레이트에 표준품과 시험군의 배양 상층액을 각 웰에 50 μl씩 넣었다. 이후 각 웰에 PGE2 AchE Tracer를 50 μl씩 처리하고 일차 항체를 50 μl씩 넣은 다음, 플레이트를 4℃에서 18시간 동안 배양하였다. 세척 완충액으로 5회 세척하고, 각 웰에 엘만 시약(Ellman's Reagent, 키트 내 포함)을 각 웰에 200 μl씩 넣은 다음, 5 μl의 Tracer를 첨가하였다. 어두운 곳에서 60~90분 동안 배양한 후, 450 nm 파장에서 발색된 플레이트를 판독하였다.

상기 실험결과를 도 11에 나타내었다. 상기 도 11에서 보는 바와 같이, CMH 조건으로 배양한 제대혈 유래 간엽줄기세포가 정상 배양한 제대혈 유래 간엽줄기세포에 비해 약 3.7배 많은 PGE₂를 분비함을 확인하는 것으로 나타났으며, 이는 다른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 경우에도 비슷한 양상을 나타내었다. 상기 결과는 CHM 조건 하에서 배양된 제대혈 유래 간엽줄기세포가 일반 배양 조건에 비해 면역 억제 능력이 뛰어남을 보여준다.

실시예 8: 배양 조건에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 시험관내 사이토카인 분비 능력 비교

배양 조건에 따른 제대혈 유래 간엽줄기세포의 사이토카인 분비 능력을 비교하고자, 제대혈 유래 간엽줄기세포가 연골세포로 분화하는 과정에서의 Tsp-2 분비능을 측정하였다.

실시예 3에서와 같이 일반 배양 조건(대조군) 및 CMH 배양 조건 하에서 제대혈 유래 간엽줄기세포를 배양하여 세포가 80~90%의 컨플루언시에 도달하면 트립신을 처리하여 떼어내었다. 세포를 원심분리 후, 세포를 L-프롤린 40 μg/ml, 덱사메타손(dexamethasone) 0.6 μg/ml, 아스코브산 50 μg/ml 및 피루브산 나트륨 100 μg/ml이 포함되어 있는 고 글루코스 DMEM(high glucose DMEM) 배지로 세척하여 세포 중의 FBS를 완전히 제거하였다. 원심분리 후, 펠렛 상태의 제대혈 유래 간엽줄기세포를 2.0x10⁵세포/400㎕의 농도로 현탁하여 15 mL 코니컬 튜브에 400㎕씩 분주하였다. 550xg에서 5분간 원심분리 후, 거의 열릴 정도로 뚜껑을 닫아 랙(rack)에 세워서 배양하였다. 24시간 지난 후 펠렛 형성 정도 확인하고 펠렛을 제외한 상층액을 수거한 후 Tsp-2 분석 키트(R&D systems, USA)를 이용하여 Tsp-2의 수치를 측정하였다.

상기 결과를 도 12에 나타내었다. Tsp-2는 연골 재생 치료제로 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용하는데 있어서 역가가 되는 인자로서 Tsp-2가 많이 분비될수록 세포의 연골 재생 기능이 좋은 것을 의미한다. 도 12의 결과를 보면, 4종의 제대혈 유래 간엽줄기세포에서 정상 배양 조건보다 CMH 배양 조건이 더 높은 Tsp-2 분비량을 나타냄을 알 수 있다.

상기 결과는 본 발명의 CMH 조건 하에서 배양된 제대혈 유래 간엽줄기세포가 연골세포로의 분화능이 우수하며 연골 재생 치료제로서 유용함을 보여준다.

<110> MEDIPOST CO., LTD. <120> METHOD FOR CULTURING MESENCHYMAL STEM CELLS <130> FPD/201205-0116 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Oct4 <400> 1 caatttgcca agctcctga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Oct4 <400> 2 cgtttggctg aataccttcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nanog <400> 3 agatgcctca cacggagact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nanog <400> 4 tttgcgacac tcttctctgc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for P16 <400> 5 gtggacctgg ctgaggag 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for P16 <400> 6 ctttcaatcg gggatgtctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GADPH <400> 7 agccaccatc gctcagacac 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GADPH <400> 8 gcccaatacg accaaatcc 19

Claims

간엽줄기세포를 2.1 내지 3.8 mM의 칼슘 및 1.0 내지 3.0 mM의 마그네슘을 함유하는 배양용 배지에서 2 내지 5%의 저산소(hypoxia) 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 간엽줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 간엽줄기세포가 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 탯줄, 양수 또는 치아에서 유래된 것을 특징으로 하는, 간엽줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 배양용 배지가 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 최소 필수 배지(minimal essential medium, MEM), 알파-최소 필수 배지(α-MEM), 맥코이스(McCoys) 5A 배지, 이글스 기본 배지(eagle's basal medium), CMRL(Connaught Medical Research Laboratory) 배지, 글래스고우(Glasgow) 최소 필수 배지, 햄스(Ham's) F-12 배지, IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz') L-15 배지, RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지, 배지 199(Medium 199) 및 행크스 배지 199(Hank’s Medium 199)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 간엽줄기세포의 배양방법.
제3항에 있어서, 상기 배양용 배지가 5 내지 30%의 우태아혈청(FBS)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 간엽줄기세포의 배양방법.
제3항에 있어서, 상기 배양용 배지가 우태아혈청을 포함하지 않고 혈청 대체물(serum replacement)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 간엽줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 배양용 배지가 5 내지 30%의 우태아혈청(FBS)를 함유하는 α-MEM 배지에 0.3 내지 2.0 mM의 칼슘 및 0.2 내지 2.2 mM의 마그네슘이 추가된 것을 특징으로 하는, 간엽줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 배양된 간엽줄기세포를 동일한 배양 조건 하에서 계대배양하는 것을 특징으로 하는, 간엽줄기세포의 배양방법.
제1항의 방법에 의해 수득된, 증식력, 생존도, 회수율 및 면역학적 특성이 개선된 간엽줄기세포.
제8항의 간엽줄기세포를 포함하는 세포치료제.
제9항에 있어서, 상기 세포치료제가 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 간세포, 췌장베타세포, 혈관세포 또는 폐세포를 재생시키거나 보호하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 세포치료제.
제9항에 있어서, 상기 세포치료제가 폐질환 치료; 폐질환에 의한 염증의 억제 또는 치료; 폐조직 재생; 및 폐조직 섬유증 억제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 세포치료제.
제9항에 있어서, 상기 세포치료제가 연골 재생용인 것을 특징으로 하는 세포치료제.
제9항에 있어서, 상기 세포치료제가 자가면역질환 또는 이식편대숙주질환의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 세포치료제.