CN113502261B - 一种能高效分化成脂的规模化3d低氧间充质干细胞培养体系 - Google Patents

一种能高效分化成脂的规模化3d低氧间充质干细胞培养体系 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞3D低氧培养以及分化成脂的方法，属于细胞培养技术领域，3D低氧培养人脐带间充质干细胞的方法，包括以下步骤：1）将人脐带间充质干细胞在2D条件下培养至P2~P4代；2）将获得的P2~P4代脐带间充质干细胞接种3D环境中进行扩增培养至P5~P7代；步骤2）中所述3D环境以玻璃微球为载体；所述3D环境中的氧分压为3%~8%。本发明提供的方法培养获得的人脐带间充质干细胞生长状况良好，细胞形态呈梭形和多棱形；细胞增殖速度快，具有较高成脂分化能力，成脂分化效率高，成脂分化出现时间较早。

Description

一种能高效分化成脂的规模化3D低氧间充质干细胞培养体系
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞3D低氧培养方法以及分化成脂的方法。
背景技术
干细胞在组织工程和再生医学中的应用不可或缺，特别是对于成功修复长期自我更新的组织，如皮肤的应用，这使其成为再生医学治疗的一个潜在的强有力细胞来源。人类多能干细胞可以在体外培养并分化为人体的所有细胞类型，这些应用需要大量的高质量的细胞。因此，一个用于生产人类多能干细胞及其后代的良好3D低氧规模化培养显得尤为重要，3D低氧规模化培养可以提高人类胚胎干细胞衍生的多能干细胞和成人成体干细胞植入体内后的生存率和再生能力，这一点已被众多研究人员的实验结果所证实。
多种来源的MSCs在不同低氧浓度条件下培养时，发现其基因组完整性、衰老、死亡等细胞生存相关指标受到影响。大气氧浓度下体外培养过程中，MSCs出现非整倍体染色体和DNA断裂、损伤等现象（ ESTRADA J c, ALBO C, BENGURIA A, et al. Culture ofhuman mesenchymal stem cells at low oxygen tension improvesgrowth and geneticstability by activating glycolysis [J]. Cell .Death Differ, 2012, 19(5) :743-55. TARTE K, GAILLARD J, LATAILLADE J J, et al. Clinicalgrade pro-duction ofhuman mesenchy mal stromal cells: occur-rence of aneuploidy withouttransformation [J]. Blood, 2010,115(8) :1549 -53. ）。Estrada等发现在低氧下培养会减少这种情况（ ESTRADA J c, ALBO C, BENGURIA A, et al. Culture of humanmesenchymal stem cells at low oxygen tension improvesgrowth and geneticstability by activating glycolysis [J]. Cell .Death Differ, 2012, 19(5) :743-55.）。健康成人骨松质来源、人脐带来源、绵羊骨髓来源MSCs其低氧组与常氧组比衰老细胞量较少（FEHRER C, BRUNAUER R, LASCHOBER G, et al. Reduced oxygen tensionattenuates differentiation capacity of human mes-enchymal stem cells andprolongs their lifespan [J] . Aging Cell,2007, 6(6) :745-57 . NEKANTI U,DASTIDAR S, VENUGOPAL P, et al. Increasedproliferation and analysis ofdifferential gene expression in humanWharton,s jelly-derived mesench ymalstromal cells under hypox-ia[J]. Int J Biol Sci, 2010, 6(5) :499-512.ZSCHARNACK M, POESEL C, GALLE J, et al. Low oxygen expansion improvessubsequent chondrogenesis of ovine bone-marrow-d erived mesenchymal stemcells in collagen type I hydro-gel [J]. Cells Tissues Organs, 2009, 190(2) :81-93.）。VAL ORANI等（VALORANI MG, MONTELATICI E, GERMANI A, et al.Preculturinghuman adipose tissue mesenchymal st em cells under hypoxiaincreasestheir adip ogenic and osteogenic differentiation potentials. CellProlif.201 2;45(3):225-238.）研究发现低氧预处理能够促进脂肪间充质干细胞成脂分化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞3D低氧培养方法以及分化成脂的方法；所述方法培养的人脐带间充质干细胞的增殖速率、分化能力明显增强。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种人脐带间充质干细胞3D培养的方法，包括以下步骤：
1）将人脐带间充质干细胞在2D条件下培养至P2~P4代；
2）将获得的P2~P4代脐带间充质干细胞接种3D环境中进行扩增培养至P5~P7代；
步骤2）中所述3D环境以玻璃微球为载体；所述3D环境中的氧分压为3%~8%。
优选的，所述玻璃微球表面积为4~5mm2。
优选的，所述3D环境中的氧分压为4%~6%。
优选的，所述3D环境中的氧分压为5%。
优选的，所述3D环境由生物反应器提供。
优选的，步骤2）中所述接种的密度为103~105个细胞。
优选的，步骤2）中所述接种的密度为104个细胞。
本发明提供了一种人脐带间充质干细胞成脂分化的方法，包括以下步骤：
1）收集所述扩增获得的P5~P7代人脐带间充质干细胞，接种至MSC培养基中培养，当细胞汇合度达到80~90%时，将培养基更换为成脂分化培养基；
2）每1~3d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至15~20d。
优选的，步骤2）中每2d更换一次新鲜的成脂分化培养基。
优选的，步骤2）中培养至18d。
本发明的有益效果：本发明提供的人脐带间充质干细胞3D培养的方法，通过将细胞置于3D环境中在低氧的状态下进行规模化培养，能够更好地模拟体内条件，能更紧密地模仿复杂的细胞组织间相互作用以及在体内的微环境，为人脐带间充质干细胞的生长、分化提供了一个合适的微环境；根据实施例的记载可知，3D低氧规模化培养的人脐带间充质干细胞生长状况良好，细胞形态与常氧不同，；并且低氧条件下扩增的人脐带间充质干细胞具有较高成脂分化能力，成脂分化效率高，成脂分化出现时间较早。
根据实施例记载，成脂诱导分化后，2D、3D低氧规模化培养的人脐带间充质干细胞由纤维状逐渐缩短、变圆；3D组于第8天出现散在的点状小脂滴，而2D组在第10天才开始出现脂滴，继续培养，脂滴增多增大，3D组两周能够染色，2D组则需要3周才能够染色，油红O染色可见3D组的染色脂滴比2D组多。本发明提供的3D低氧培养方法培养的人脐带间充质干细胞的增殖速率、分化能力、分泌营养因子和抗炎因子的能力明显增强。
附图说明
图1为实施例1中第一组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态；
图2为实施例1中第二组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态；
图3为实施例1中第三组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态；
图4~图7为10倍镜下拍摄成脂分化油红O染色结果，为3D低氧培养的细胞成脂分化结果展示。
图8为第一组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态，左图为2D培养细胞，右图为3D培养细胞；
图9为第二组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态，左图为2D培养细胞，右图为3D培养细胞；
图10为第三组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态，左图为2D培养细胞，右图为3D培养细胞；
图11为20倍镜下拍摄成脂分化油红O染色结果，左图为第一组2D培养细胞成脂分化染色结果，右图为第一组3D培养细胞成脂分化染色结果；
图12为20倍镜下拍摄成脂分化油红O染色结果，左图为第二组2D培养细胞成脂分化染色结果，右图为第二组3D培养细胞成脂分化染色结果；
图13为20倍镜下拍摄成脂分化油红O染色结果，左图为第三组2D培养细胞成脂分化染色结果，右图为第三组3D培养细胞成脂分化染色结果。
具体实施方式
本发明提供了一种人脐带间充质干细胞3D培养的方法，包括以下步骤：1）将人脐带间充质干细胞在2D条件下培养至P2~P4代；2）将获得的P2~P4代脐带间充质干细胞接种3D环境中进行扩增培养至P5~P7代；步骤2）中所述3D环境以玻璃微球为载体；所述3D环境中的氧分压为3%~8%。
在本发明中，将人脐带间充质干细胞在2D条件下培养至P2~P4代。本发明对所述人脐带间充质干细胞的来源没有特殊限定，优选的分离自新生儿脐带组织。
本发明对所述人脐带间充质干细胞的分离方法没有特殊限定，采用本领域常规的分离方法即可。在本发明具体实施过程中，优选的包括以下步骤：A）酒精浸泡生理盐水清洗人脐带组织；B）将清洗后的人脐带组织剪断为3~4cm长的组织，洗去血液、剔除静脉，分离脐带间充质；C）将分离获得的脐带间充质剪断为1~2cm长的组织块置于无血清培养基中培养，当组织块周围新生细胞汇合80%后，收集细胞。
在本发明中，将收集到的细胞进行传代培养，本发明对所述传代培养的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的2D培养法培养即可。在本发明中，所述细胞培养至P2~P4代，更优选的培养至P3代。
在本发明中，将获得的P2~P4代脐带间充质干细胞接种3D环境中进行扩增培养至P5~P7代。在本发明中，3D环境由生物反应器提供，所述生物反应器内填充玻璃微球为载体，所述玻璃微球的表面积为4~5mm2，优选的为4.2~4.8mm2，更优选为4.5mm2。在本发明中，所述生物反应器是全自动、全封闭的系统，能够控制PH、OD、温度、压力、液位、搅拌速度、可检测葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、氨离子、谷氨酸等；所述生物反应器接种、培养、换液、消化、细胞收集等全部自动化操作。在本发明具体实施过程中，所述生物反应器为比瑞生物科技研发的多功能微型生物反应器B.R.Biocell DW 2.6L；在本发明具体实施过程中，使用的生物反应器的容积为2.6L。在本发明中，所述玻璃微球堆积在固定床生物反应器中形成固定床，由固定床构成微流道载体结构。
在本发明中，所述3D环境中的氧分压优选为4%~6%，更优选为5%。在本发明中，所述3D环境中的氧分压优选的通过向生物反应器中充入氧气、氮气、二氧化碳和空气实现，所述氧气、氮气、二氧化碳、空气通过气体控制器处理后，最终氧分压控制在5%，上述的氧含量能够为细胞提供更加接近人体组织内的微观环境。
本发明提供了一种人脐带间充质干细胞的成脂分化的方法，包括以下步骤：1）收集所述扩增获得的P5~P7代人脐带间充质干细胞，接种至MSC培养基中培养，当细胞汇合度达到80~90%时，将培养基更换为成脂分化培养基；2）每1~3d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至15~20d。
在本发明中，收集所述扩增获得的P5~P7代人脐带间充质干细胞，接种至MSC培养基中培养，当细胞汇合度达到80~90%时，将培养基更换为成脂分化培养基。在本发明中，所述MSC培养基为市售的人脐带间充质干细胞专用培养基。在本发明中，所述接种用的P5~P7代人脐带间充质干细胞的细胞密度优选为1~2×107cell/mL，更优选为1.6×107cell/mL；在本发明中，优选的每2mL MSC培养基中接种4~5×105个细胞，更优选为4.5×105个细胞。在本发明具体实施过程中，优选的将所述P5~P7代人脐带间充质干细胞接种至6孔板中，置于培养箱中培养；所述培养的温度优选为37℃，所述培养的O2体积浓度优选为5%。本发明优选的将细胞培养至汇合度达到80~90%后，将培养基更换为成脂分化培养基；所述更换具体为将原MSC培养基吸出，然后添加脂分化培养基；在本发明中，所述成脂分化培养基优选的为Stemcell （MesenCult™ Adipogenic Differentiation Medium）成脂分化培养基。
在本发明中，每1~3d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至15~20d。在本发明中，优选的每2d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至18d。在本发明中优选的通过油红O染液进行染色来检测成脂分化的情况，本发明对所述油红O染液的具体操作没有限定，采用本领域常规的油红O染液操作即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
原料种类：人源脐带间充质干细胞，国家干细胞转化资源库；原料的用量：P5代，4.5×105个细胞
方法步骤：
原代细胞提取
将人源脐带组织的两端结扎，浸泡于含有的生理盐水瓶子中，2~8℃运输到实验室。
在超净工作柜台中打开瓶子，收集瓶中保存液（若细胞污染，取此液体检测，查找污染源）。弃去多余保存液后，向瓶中加入20mL 75%酒精（浸没脐带即可），将收集瓶拧紧后，左右晃动7次后浸泡2min。
弃去酒精，加入用20mL生理盐水洗两次，清除酒精残留。
用无菌镊子取出脐带，放置于无菌100mm培养皿中，加入10mL生理盐水。用无菌剪刀将脐带分为3-4cm的小段，用镊子夹住脐带中央向两端推挤，洗去血液（一般3遍）。
找到脐静脉，从静脉旁边钝性剥开脐带，剔除静脉。注意：静脉较软，剔除静脉后组织应该是表面平滑的组织块。
分离脐带间充质（胶状），分离出的脐带间充质及时放入生理盐水中，注意剔除脐动脉（2条）。注意：动脉韧性大。
将分离出的组织块放入50mL离心管，用长剪子剪碎1-2cm的小段。取出无血清培养基（含血清替代物）以10mL/瓶的量分装入T75细胞培养瓶，将剪碎的组织块分装入其中。每根脐带可分10瓶左右。
将组织块摇晃分布均匀后，放入37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养5d后换液。
显微镜观察组织块周围，每5d更换培养基，约9d组织块周围爬出细胞，待细胞汇合80%后，收集细胞传代，进行2D培养至P4代。
2.6L生物反应器扩增
比瑞生物科技研发的多功能微型生物反应器B.R.Biocell DW 12L是全自动、全封闭系统，可控制PH、OD、温度、压力、液位、搅拌速度、葡萄糖、可检测乳酸、谷氨酰胺、氨离子、谷氨酸等，接种、培养、换液、消化、细胞收集等全部自动化操作。多个微球堆积在固定床生物反应器中形成固定床，由固定床构成微流道载体结构。低氧环境是往生物反应器中充入氧气、氮气、二氧化碳、空气每分钟0.5L，最终氧分压控制在5%，为细胞提供更加接近人体组织内的微观环境。
生物反应器中载体（玻璃微球）泉州精密玻璃珠工厂购买，为玻璃材质，透明球体，表面积为4.5mm2。
选取2D培养至P4代人间充质干细胞，以1×104个/cm2，取1×108个细胞接种至2.6L生物反应器中进行扩增。
7天扩增20倍，收获细胞2×109个。
收集细胞，进行质量检。
成脂分化检测方法
（1）细胞准备：制备1.6×107cell/mL MSC细胞悬液；
（2）细胞接种：取4.5×105细胞接种到装有2mL MSC培养基的6孔板中。接种完毕，即将细胞置于37℃，培养箱中培养；
（3）细胞诱导：待细胞长到基本融合的时候，吸去6孔板中的MSC培养基，并加入2mLMSC成脂分化培养基；
（4）细胞换液：每隔2天换一次MSC成脂分化培养基；
（5）细胞染色：培养18d，用油红O染液进行染色；
油红O染色：
（2.1）吸走6孔板中的MSC细胞成脂肪诱导分化培养基，用2mL 1×PBS冲洗2次。每孔加入1mL 4%多聚甲醛溶液，固定30min。
（2.2）吸走4%多聚甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1mL油红O工作液（工作液配制方法，体积比：油红O贮存液:蒸馏水为3:2，混匀后用中性滤纸过滤即可）染色30min。
（2.3）吸走油红O染液，用1×PBS冲洗3次。
（2.4）将培养板置于显微镜下观察成脂染色的效果。
对照组为2D常氧P5代，3组，观察细胞生长状况，记录细胞接种后的贴壁率，按照上述记载的方法进行成脂分化。
实验组为3D低氧规模化P5代，3组，观察细胞生长状况，记录细胞接种后的贴壁率，按照上述记载的方法进行成脂分化。
实验结果：
选取3组3D低氧规模化P5代细胞进行贴壁培养，如图1~3所示，其生长状况良好，细胞形态与常氧明显不同，均呈梭形和多棱形；细胞增殖速度快，细胞倍增时间比常氧组短(P均<0.05)，成脂分化效率高，出现时间较早。
成脂诱导分化后，如图4~7所示，3D低氧规模化培养的MSCs由纤维状逐渐缩短、变圆。第8天出现散在的点状小脂滴，继续培养至第16天，脂滴增多增大，油红O染色可见脂滴数量较多。
实验组和对照组的对比结果：
细胞形态：
2D培养、3D培养细胞形态如图8~图10所示，照片拍摄于细胞接种后24h在4倍镜拍摄。可见，3D低氧规模化培养的MSCs生长状况良好，细胞形态与常氧不同，均呈梭形和多棱形。
细胞贴壁率
（1）2D培养
第一例：接种细胞数量4.5×105个，接种24h后收集死细胞数量：1.2×105个，细胞贴壁率：73.3%；
第二例：接种细胞数量4.5×105个，接种24h后收集死细胞数量：1.08×105个，细胞贴壁率：76%；
第三例：接种细胞数量4.5×105个，接种24h后收集死细胞数量：9.71×104个，细胞贴壁率：78.4%。
（2）3D低氧培养
第一例：接种细胞数量4.5×105个，接种24h后收集死细胞数量：9.14×104个，细胞贴壁率：79.7%；
第二例：接种细胞数量4.5×105个，接种24h后收集死细胞数量：6.05×104个，细胞贴壁率：86.6%；
第三例：接种细胞数量4.5×105个，接种24h后收集死细胞数量：5.53×104个，细胞贴壁率：87.7%。
成脂分化
2D培养和3D低氧培养的细胞的成脂分化情况如图11~图13所示，照片拍摄于：油红染色后、由20倍镜拍摄。
成脂诱导分化后，2D、3D低氧规模化培养的MSCs由纤维状逐渐缩短、变圆。3D低氧培养组于第8天出现散在的点状小脂滴，而2D培养组在第10天开始出现脂滴，继续培养，脂滴增多增大，3D组15天左右染色，2D组则需要3周，油红O染色可见3D低氧培养组的染色脂滴比2D培养组多。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种人脐带间充质干细胞成脂分化的方法，由以下步骤组成：
1)将人脐带间充质干细胞在2D条件下培养至P4代；
2)将获得的P4代脐带间充质干细胞接种3D环境中进行扩增培养至P5代；所述接种的密度为104个细胞/cm2；所述3D环境由生物反应器提供；所述扩增是取1×108个P4代脐带间充质干细胞接种至2.6L生物反应器中进行扩增；
所述3D环境以玻璃微球为载体；所述3D环境中的氧分压为5％；所述3D环境中的氧分压为通过向生物反应器中充入氧气、氮气、二氧化碳和空气实现；
所述玻璃微球表面积为4.5mm2；
3)收集扩增获得的P5代人脐带间充质干细胞，接种至MSC培养基中培养，当细胞汇合度达到80～90％时，将培养基更换为成脂分化培养基；
4)每2d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至18d。
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