WO2016043488A1 - 하이드로겔을 이용한 3차원적 줄기세포 골분화 유도 방법 - Google Patents

하이드로겔을 이용한 3차원적 줄기세포 골분화 유도 방법 Download PDF

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이순례
양지원
추설
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Definitions

  • the present invention relates to a method for bone differentiation in a short time on a synthetic biogel in inducing bone differentiation of mesenchymal stem cells.
  • Stem cell refers to a cell that can proliferate indefinitely while maintaining an undifferentiated state and that can be differentiated to have a specific function and shape given a certain environment and conditions.
  • Stem cells include adult stem cells, such as embryonic stem cells that can be made from human embryos, and bone marrow cells that constantly make blood cells.
  • Embryonic stem cells can differentiate into all the cells and tissues that make up the human body, but their use is limited for ethical reasons, while adult stem cells are derived from umbilical cord blood or bone marrow and blood of mature adults, and adult stem cells are transplanted in vivo.
  • the cells have differentiation flexibility that can later differentiate into specific tissues and organs and can metastasize to cells of other tissues different from the characteristics of the original cells, and are widely used in tissue engineering without ethical limitation.
  • various trials and early clinical trials are underway to regenerate and replace tissues or organs of patients by proliferating stem cells to differentiate into specific cells in the medical field.
  • Mesenchymal stem cells are one of the adult stem cells present in the various organs or blood of the body that have developed, and are easy to maintain and have no ethical problem. Compared with the in vitro passage culture and differentiation, there are limitations
  • bone marrow-derived stem cells from adult stem cells have been differentiated into osteogenic cells (Friedenstein AJ et al., Transplantation., 6: 230-247, 1968). Advances in the differentiation and proliferation of stem cells isolated from bone marrow into osteoblasts have increased the possibility of clinical application (Ohgushi H. et al., J. Biomed Mater Res., 48: 913-927, 1999). Recently, a method for differentiating bone cells from mesenchymal stem cells has been actively studied.
  • 10-0733914 discloses a three-dimensional micro-cell culture system characterized in that the cells are present in the three-dimensional gel, but the gel after the cell culture or differentiation of stem cells In order to separate cells existing inside, the gel must be melted, so that the cell damage is severely disadvantageous.
  • the cells can be easily separated, and in order to promote bone differentiation by increasing the medium contact surface area of the cells, they are present in a non-contact manner inside the cell culture vessel and promote contact with the medium in all directions of the cells to promote bone differentiation. It provides a method that can shorten the bone differentiation period.
  • stem cells and the medium can be contacted with a larger surface area, promoting the induction of bone differentiation of stem cells in the conventional bone differentiation method Compared to this, it is possible to significantly shorten the period of induction of bone differentiation, and the cells are attached to the inner and outer surface of the hydrogel, but the gel hydrogel is changed to the sol state at the culture temperature below 37 ° C, so that the cells can be easily separated after differentiation. There is one effect.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the stem cell differentiation method in the three-dimensional state of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing a stem cell differentiation method in a two-dimensional state using a conventional culture dish.
  • FIG. 3 is a diagram showing a three-dimensional stem cell differentiation method using a polymer membrane without a hydrogel.
  • FIG. 5 is a diagram confirming bone differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced by bone differentiation by the method of Comparative Example 1, the method of Comparative Example 2 (lane 2), and the Example.
  • Example 6 is a treatment of BMP2 100 ng / ml or Wnt3a 20 ng / ml in addition to the method of Comparative Example 2 (Control), Comparative Example 2, and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells induced bone differentiation by the method of Example Figure showing the degree of bone differentiation of (hydrogel (3D)).
  • Figure 7 is a diagram confirming the degree of bone differentiation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells induced bone differentiation for 1 day, 3 days, 5 days or 7 days by the method of the embodiment.
  • BMMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC fat-derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • EMSC embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells
  • the invention in one aspect, the invention
  • the present invention relates to a method for inducing bone differentiation of stem cells in a cell culture vessel in which a porous membrane coated with a hydrogel on one side is placed in a non-contact manner.
  • the present invention in one embodiment, the present invention
  • Stem cells can be cultured in bone differentiation induction medium to induce stem cell differentiation.
  • the method may further include culturing the stem cells in bone differentiation pretreatment medium for 10 to 24 hours after stem cell inoculation and before culturing in bone differentiation induction medium.
  • the pretreatment medium may have a glucose concentration of 1.5 g / l or less.
  • the porous membrane can be positioned in a non-contact manner to be parallel to the bottom of the cell culture vessel.
  • the order of coating the hydrogel on the porous membrane and the non-contact positioning within the cell culture vessel is not particularly limited. In this case, the hydrogel is coated after the porous membrane is placed in a non-contact manner on the bottom of the cell culture vessel. Alternatively, the hydrogel may be coated on the porous membrane in advance and then contactlessly disposed inside the cell container.
  • the cell culture vessel of the present invention generally refers to a dish or well plate used for cell culture, and is not particularly limited as long as it is a cell culture vessel used for cell culture and capable of introducing a porous membrane in a non-contact manner to the bottom of the vessel.
  • a hydrogel solution is applied to one surface of the porous membrane, the cells are attached onto the hydrogel, and then the cell culture vessel It may also be placed in a non-contact manner inside to induce bone differentiation.
  • the stem cells may be cultured for 3 to 7 days in the bone differentiation induction medium.
  • the medium is introduced between the porous membrane and the cell culture vessel to increase the contact surface area of the stem cells and the medium to shorten the bone differentiation induction period.
  • the porous membrane and the hydrogel of the present invention allow the permeation of air and the medium, the medium is introduced into the space between the porous membrane and the cell culture vessel resulting from the non-contact arrangement of the porous membrane and the cell culture vessel, the medium and air Because it also serves as the site of attachment of, the broader surface area of the stem cells in contact with the medium and air, thereby shortening the time for inducing bone differentiation.
  • the existing bone differentiation method takes 3 to 5 weeks, but using the method of the present invention, bone differentiation occurs in 3 to 7 days.
  • the cell culture vessel of the present invention generally refers to a dish or a well plate used for cell culture, and is not particularly limited as long as it is a cell culture vessel used for cell culture and capable of introducing a porous membrane into the container in a non-contact manner.
  • the sol-gel phase change of the hydrogel solution (hydrosol) to hydrogel may be performed at 37 °C for 1 to 2 hours.
  • the hydrogel may be 1 to 40% hydrogel, more preferably 1 to 15% hydrogel. Stem cells do not differentiate in 0% hydrogel, and bone differentiation efficiency does not increase more than 40%. It is not limited to this.
  • 1 to 40% of the hydrogel may be applied to the porous membrane 200 to 300 ⁇ l / cm 2 , the thickness of the hydrogel formed through the sol-gel phase shift may be 1 to 4 mm.
  • the hydrogel may have a viscosity of 1.E + 00 to 1.E + 06 (10 0 to 10 6 ) mPa ⁇ s at 37 ° C. according to% hydrogel, and pores outside the range
  • a hydrogel having a size it may be difficult to attach or differentiate stem cells. Since the hydrogel of the present invention is in a gel state at the cell culture temperature of 37 ° C., cells are cultured in and out of the gel, but are changed to a sol state below the culture temperature, so that the hydrogel is easily separated after cell differentiation.
  • the porous membrane may have a pore size of 0.1 to 8 ⁇ m, but is not limited as long as the pore size passes through the medium and air but cannot pass through the hydrogel.
  • the stem cells are umbilical cord mesenchymal stem cells, adipose derived mesenchymal stem cells, embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells ), Periodontal ligament cells or bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the stem cells are not particularly limited to the origin thereof, and examples thereof include cells derived from humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, and rabbits.
  • the stem cells are preferably stem cells derived from humans, but are not limited thereto.
  • porous membrane or “polymer membrane” refers to a material in the form of a porous membrane, a permeable membrane, or a film that passes through the medium and air but does not pass through the hydrogel.
  • the cell culture medium and the air permeable porous structure are not particularly limited.
  • hydrogel refers to a material that loses fluidity and forms a porous structure by solidifying a liquid using water as a dispersion medium through a sol-gel phase change.
  • the hydrogel is not particularly limited as long as it is suitable for cell attachment and culture, and in one embodiment of the present invention, a biodegradable synthetic biogel was used.
  • stem cell refers to an undifferentiated cell having self replication and differentiation capacity.
  • Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells, depending on their differentiation capacity.
  • the pluripotent stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into all tissues or cells constituting the living body, multipotent stem cells are not all kinds, but the ability to differentiate into a plurality of tissues or cells It means a cell having.
  • Unipotent stem cells refer to cells that have the ability to differentiate into specific tissues or cells. Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES Cells), undifferentiated germ cells (EG Cells), and iPS cells.
  • Multipotent stem cells include mesenchymal stem cells (fat-derived, Adult stem cells such as bone marrow-derived, umbilical cord blood or umbilical cord derived), hematopoietic stem cells (derived from bone marrow or peripheral blood, etc.), neural stem cells, reproductive stem cells, and the like. Committed stem cells, which exist in a low state and make only hepatocytes after vigorous division after activation.
  • the invention in one aspect, the invention
  • a porous membrane having a hydrogel to which cells are attached to one side thereof;
  • It relates to a stem cell differentiation apparatus comprising the non-contact arrangement of the porous membrane is attached to the inside of the cell culture vessel.
  • the porous membrane and the hydrogel may be capable of permeation of the medium and air.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells are CEFOgro ADMSC medium (CB-ADMSC-GM, CEFO, Korea), bone marrow-derived mesenchymal stem cells are CEFOgro BMMSC medium (CB-BMMSC-GM, CEFO, Korea), embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells CEFOgro ESMSC medium (CB-ESMSC-GM, CEFO, Korea), umbilical cord-derived mesenchymal stem cells are CEFOgro UCMSC medium (CB-UCMSC-GM, CEFO, Korea), periodontal ligament cells (PDL) are CEFOgro PDL medium (CB-PDL) -GM, CEFO, Korea) incubated for 3 to 4 days at 37 °C, CO 2 incubator, each stem cells were inoculated on the biogel, and then bone differentiation pretreatment medium (CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Korea) was added and incubated for 18 hours at 37 °C, CO 2 incubator. Thereafter, the medium
  • Stem cells were differentiated by a two-dimensional differentiation method which is a conventional stem cell differentiation method. Specifically, inoculate the cells in a 12 well cell culture vessel (plate) and incubated in a pretreatment medium (CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Korea) for induction of bone differentiation until the cell density is 85 to 90% Bone differentiation induction medium (CB-DM-Osteo, CEFO, Korea) was exchanged for induction of bone differentiation for 14 to 21 days (Fig. 2).
  • a pretreatment medium CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Korea
  • Example 1 in order to confirm the differentiation of stem cells in the case where 0% of the biodegradable synthetic biogel on the polymer membrane (only the polymer membrane is present), inoculation of the stem cells on the polymer membrane and the same as in Example 1 5 Incubated for days (FIG. 3).
  • Fat-derived mesenchymal stem cells induced bone differentiation for 14 days by the method of Comparative Example 1 bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced bone differentiation for 5 days by the method of Comparative Example 2 (0% biodegradable synthetic biogel) and the Bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced by bone differentiation by the method of Example (5%, 10% or 15% biodegradable synthetic biogel) were visually confirmed through bone microscopy through a phase contrast microscope.
  • the cells were washed twice with PBS, and then fixed at room temperature with 70% ethyl alcohol for 10 minutes and washed twice with distilled water in order to confirm the differentiated cells through alizarin red staining.
  • BMP bone morphogenic protein 2
  • peprotech, israel 100 ng / ml
  • Wnt3a peprotech, israel
  • the cells were washed twice with PBS, and then fixed at room temperature with 70% ethyl alcohol for 10 minutes and washed twice with distilled water in order to confirm the differentiated cells through alizarin red staining.
  • Alizarin Red (Alizarin Red) dye kit CB-SK-Osteo
  • Sol I Alizarin Red
  • Sol III treatment after image analysis was performed for 30 minutes at room temperature, and the stained reagents were completely dissolved. 100 ⁇ l of the dissolved solution was taken into a 96 well plate, and the absorbance was measured at 550 nm.
  • Image analysis was performed through alizarin red staining of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells induced with bone differentiation for 1, 3, 5 or 7 days by the method of the above example (10% biodegradable synthetic biogel). In addition, absorbance was measured at 550 nm to quantify this.
  • bone differentiation began to be induced from the first day of induction of bone differentiation, and the longer the bone differentiation period, the stronger the bone differentiation occurred.
  • bone differentiation is known to be less likely to occur in comparison with other mesenchymal stem cells in the conventional two-dimensional method. It was shown that bone differentiation is well done (Fig. 7).
  • the conventional two-dimensional bone differentiation method takes about 2 to 5 weeks of bone differentiation of mesenchymal stem cells, but by placing a polymer membrane in a non-contact manner on a cell culture vessel and applying a hydrogel thereon to the mesenchyme thereon Using the three-dimensional bone differentiation method of the present invention inoculated with stem cells and incubated with bone differentiation pretreatment medium, it was confirmed that bone differentiation occurs in 3 to 7 days.

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Abstract

본 발명은 간엽줄기세포의 골분화 유도에 있어서, 다공성막 및 생분해성 합성 바이오겔을 이용하여 세포를 세포 배양 용기와 비접촉적으로 배양함으로써 단시간 내에 골분화하는 방법에 관한 것으로, 종래의 골분화 방법에 비해 현저히 골분화 유도 기간을 단축시킬 수 있으며, 분화 후에도 세포의 분리가 용이한 효과가 있다.

Description

하이드로겔을 이용한 3차원적 줄기세포 골분화 유도 방법
본 발명은 간엽줄기세포의 골분화 유도에 있어서, 합성 바이오겔 위에서 단시간 내에 골분화하는 방법에 관한 것이다.
최근 조직공학과 재생의학의 발달에 의하여 손상된 조직과 장기를 치료할 수 있는 종래와는 다른 방법들이 개발되고 있는데, 그 중 제일 각광을 받고 있는 것은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에 의한 세포치료이다. 줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포에는 사람의 배아를 이용해 만들 수 있는 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 성체 줄기세포(Adult stem cell)가 있다. 배아줄기세포는 인체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있지만 윤리적인 이유로 사용이 제한되어 있는 반면, 성체 줄기세포는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수와 혈액 등에서 추출한 것으로, 성체 줄기세포는 생체 내 이식 후에 특정 조직 및 장기 특이적으로 분화할 수 있고, 본래 세포의 특성과는 다른 타 조직의 세포로 전이 분화할 수 있는 분화 유연성을 가지는 세포로서, 윤리적인 제한 없어 조직공학에 널리 사용되고 있다. 이에 최근에는 의료분야에서 줄기세포를 증식 후 특정 세포로 분화시켜 환자의 조직 또는 기관의 재생 및 치환을 위해 다양한 시도와 초기 임상 실험이 진행 중에 있다. 간엽줄기세포는 발생이 끝난 신체의 여러 장기 또는 혈액에 존재하는 성체 줄기세포 중에 하나로, 유지 방법이 용이하고 윤리적 문제가 없는 세포 원으로 현재 재생 의료 분야에서 가장 주목받는 줄기세포이나, 배아줄기세포에 비해 체외 계대 배양 및 분화능에 한계점이 존재하는 단점이 있다
이미 인간과 동물을 대상으로 한 연구에서 성체 줄기세포 중 골수 유래 줄기세포가 골형성 세포로 분화되는 것이 확인되었고(Friedenstein A.J. et al., Transplantation., 6:230-247, 1968), 최근 연구에서는 골수로부터 분리한 줄기세포를 배양하여 골아세포로 분화 증식시키는 방법에 진전이 있으며 이를 통한 임상적용의 가능성이 높아지고 있다(Ohgushi H. et al., J. Biomed Mater Res., 48:913-927, 1999). 최근에는 간엽 줄기세포로부터 골세포를 분화시키는 방법이 주도적으로 연구되고 있는 실정이다.
한편, 현재 줄기세포의 분화에 가장 널리 사용되고 있는 방법은 2차원적인 웰 플레이트(well plate)에서 세포를 배양하여 분화시키는 것이다. 그러나 최근 논문보고에 따르면 2차원(monolayer)적으로 세포 배양시, 3차원적 세포 배양을 했을 때보다 세포의 기능이 떨어지고 형태(morphology)도 현저히 달라진다는 보고들이 있었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 1943-1948, 2003; Cell, 111: 923-925, 2002; Cancer Cell 2: 205-216, 2002). 이와 같이 세포의 상태에 악영향을 미치는 방식으로 세포를 배양하면서 분화를 유도하면 분화가 어려우며, 기간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이러한 세포 배양의 단점을 극복하고자 대한민국 등록특허 제10-0733914호에서는 3차원 겔 속에 세포가 존재하는 것을 특징으로 하는 3차원 미세 세포 배양 시스템에 대하여 제시하고 있으나, 줄기세포의 세포 배양 또는 분화 후에 겔 내부에 존재하는 세포를 분리하기 위해서는 겔을 녹여내야 하므로 세포 손상이 심한 단점이 있다.
기존의 2차원적 세포 배양 용기에서 줄기세포를 골분화 유도하면 줄기세포의 일부분으로만 배지와 접하기 때문에 분화에 필요한 영양 성분, 유도 성분 및 공기의 유입이 용이하지 않아 분화가 어려우며, 분화 기간이 3 내지 5주로 긴 단점이 있다. 겔 내부에 배양되는 종래의 3차원 배양 방식은 세포를 분리할 수 없는 단점이 있어, 줄기세포의 골분화 후 분화된 세포의 분리 및 사용이 용이한 3차원 세포 배양 시스템의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명에서는 쉽게 세포를 분리할 수 있으면서, 세포의 배지 접촉 표면적을 증가시켜 골분화를 촉진시키기 위하여, 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 존재하면서 세포의 전방위로 배지와 접촉하여 골분화를 촉진시켜 골분화 기간을 단축시킬 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포를 골분화 유도하는 방법을 이용하여 줄기세포를 골분화하면, 줄기세포와 배지가 더 넓은 표면적으로 접촉할 수 있어, 줄기세포의 골분화 유도가 촉진되어 종래의 골분화 방법에 비해 현저히 골분화 유도 기간을 단축시킬 수 있으며, 세포가 하이드로겔의 내·외면에 부착되어 있으나 배양 온도인 37℃ 미만에서는 겔 상태의 하이드로겔이 졸 상태로 변하기 때문에, 분화 후에도 세포의 분리가 용이한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 3차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법을 나타낸 도식이다.
도 2는 종래의 배양 접시를 이용한 2차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법을 나타낸 도식이다.
도 3은 하이드로겔 없이 폴리머 막을 이용한 3차원적 줄기세포 분화 방법을 나타낸 도식이다.
도 4는 비교예 1의 방법 (14일: controlⅠ, 5일: controlⅡ), 비교예 2의 방법 (레인 3, 하이드로겔 농도 0%) 및 실시예의 방법으로 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포의 골분화를 확인한 도이다.
도 5는 비교예 1의 방법, 비교예 2의 방법 (레인 2) 및 실시예의 방법으로 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포의 골분화를 확인한 도이다.
도 6은 비교예 2의 방법 (control), 비교예 2의 방법에 추가로 BMP2 100 ng/ml 또는 Wnt3a 20 ng/ml을 처리를 처리, 및 실시예의 방법으로 골분화 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포 (hydrogel(3D))의 골분화 정도를 확인한 도이다.
도 7은 실시예의 방법으로 1일, 3일, 5일 또는 7일 동안 골분화 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포의 골분화 정도를 확인한 도이다.
도 8은 골수 유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방 유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄 유래 간엽줄기세포(UCMSC), 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포(ESMSC) 및 치주인대세포(PDL)를 비교예 1의 방법으로 14일 동안 (2D), 비교예 2의 방법 (without hygrogel) 및 실시예의 방법으로 골분화 유도한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은
한쪽 면에 하이드로겔이 도포된 다공성막이 비접촉적으로 내부에 위치한 세포 배양 용기에서 줄기세포를 골분화 유도하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은
다공성막을 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키고;
상기 다공성막의 한쪽 표면에 하이드로겔 용액을 도포하여 졸-겔 상변이를 통해 하이드로겔을 코팅하며;
상기 코팅된 하이드로겔 위에 줄기세포를 접종하고; 및
상기 줄기세포를 골분화 유도 배지에서 배양하여 줄기세포를 골분화 유도할 수 있다.
일 구현예에서, 줄기세포 접종 후, 골분화 유도 배지에서 배양하기 전에 상기 줄기세포를 골분화 전처리 배지에서 10 내지 24시간 동안 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 전처리 배지는 글루코오스 농도가 1.5g/l 이하일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다공성막을 세포 배양 용기의 바닥에 평행하도록 비접촉적으로 위치시킬 수 있다. 상기 다공성막에 하이드로겔을 코팅하는 것과 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키는 것의 순서가 특별히 한정되지 않으며, 상기의 경우, 다공성막을 세포 배양 용기의 바닥에 비접촉적으로 배치한 뒤에 하이드로겔을 코팅할 수도 있고, 미리 다공성막에 하이드로겔을 코팅한 뒤에 세포 용기 내부에 비접촉적으로 배치할 수도 있다.
본 발명의 세포 배양 용기는 일반적으로 세포 배양에 사용되는 접시(dish), 웰 플레이트를 말하며, 세포 배양에 사용되고, 다공성막을 용기 바닥에 비접촉적으로 도입할 수 있는 세포 배양용기라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 세포 배양 용기 내부에서 비수평적적으로 세포를 배양하여 줄기세포를 골분화 유도하는 경우에는 다공성막의 한쪽 표면에 하이드로겔 용액을 도포하고, 하이드로겔 위에 세포를 부착한 뒤 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시켜 골분화를 유도할 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 줄기세포는 골분화 유도 배지에서 3 내지 7일 동안 배양될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 다공성막과 세포 배양 용기의 사이에 배지가 유입되어 줄기세포와 배지의 접촉 표면적을 증가시켜 골분화 유도 기간을 단축시킬 수 있다. 본 발명의 다공성막 및 하이드로겔은 공기 및 배지의 투과를 허용하며, 다공성막과 세포 배양 용기가 비접촉적으로 배치됨으로써 생긴 다공성막과 세포 배양 용기 사이의 공간에 배지가 유입되어 배지 및 공기가 세포의 부착 부위로도 제공되기 때문에, 더 넓은 표면적으로 줄기세포가 배지 및 공기와 접하고 이로 인해 골분화 유도 시간이 단축된다. 일 예로, 기존 골분화 방식은 3주 내지 5주 걸리나, 본 발명의 방법을 이용하면 3일 내지 7일이면 골분화가 일어난다.
본 발명의 세포 배양 용기는 일반적으로 세포 배양에 사용되는 접시(dish), 웰 플레이트를 말하며, 세포 배양에 사용되고, 다공성막을 용기에 비접촉적으로 도입할 수 있는 세포 배양용기라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔 용액 (하이드로졸)의 하이드로겔로의 졸-겔 상변이는 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 1 내지 40% 하이드로겔일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 내지 15% 하이드로겔이다. 0% 하이드로겔에서는 줄기세포가 분화하지 못하고, 40% 이상에서는 골분화 효율이 더 증가하지 않아 의미가 없다. 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 1 내지 40 %의 하이드로겔을 다공성막에 200 내지 300 ㎕/cm2로 도포할 수 있으며, 졸-겔 상변이를 통해 형성된 하이드로겔의 두께는 1 내지 4 mm일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 하이드로겔 %에 따라 37℃에서의 점도가 1.E+00 내지 1.E+06 (100 내지 106)mPa·s일 수 있으며, 상기 범위 이외의 기공 사이즈를 가지는 하이드로겔에서는 줄기세포의 부착 또는 분화가 어려울 수 있다. 본 발명의 하이드로겔은 세포 배양 온도인 37℃에서는 겔 상태이기 때문에 겔의 내·외에서 세포가 배양되지만 배양 온도 미만에서는 졸 상태로 변하기 때문에 세포 분화 후에 분리가 용이하다.
일 구현예에서, 상기 다공성막은 공극이 0.1 내지 8 ㎛일 수 있으나, 배지 및 공기는 통과하나 하이드로겔은 통과하지 못할 공극 사이즈라면 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 줄기세포는 탯줄 유래 간엽줄기세포(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 지방 유래 간엽줄기세포(adipose derived mesenchymal stem cell), 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포(Embryonic stem cell derived mesenchymal stem cell), 치주인대세포(Periodontal ligament cell) 또는 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell)일 수 있다. 상기 줄기세포는 특별히 그 유래에 제한되지 않으며, 그 예로 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 유래의 세포가 있다. 상기 줄기세포는 바람직하게는 인간 유래의 줄기세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "다공성막" 또는 "폴리머막(polymer membrane)"은 배지 및 공기는 통과하나 하이드로겔은 통과하지 못하는 다공성막, 투과성막 또는 필름 형태의 물질을 말한다. 세포 배양 배지 및 공기 투과성인 다공성 구조물이라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "하이드로겔(hydrogel)"은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질을 말한다. 세포 부착 및 배양에 적합한 하이드로겔이라면 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의일 실시예에서는 생분해성 합성 바이오겔을 사용하였다.
본 발명에서 용어, "줄기세포"는 자기 복제능 및 분화증식능을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라서, 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell), 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)등의 아집단이 포함된다. 상기 전분화능 줄기세포는 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 다분화능 줄기세포는 모든 종류는 아니지만, 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단분화능 줄기세포는 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 전분화능 줄기세포로서는, 배아 줄기세포(ES Cell), 미분화생식선세포(EG Cell), 역분화줄기세포(iPS cell) 등을 들 수 있으며, 다분화능 줄기세포로서는,간엽계 줄기세포(지방유래, 골수유래, 제대혈 또는 탯줄 유래 등), 조혈계 줄기세포(골수 또는 말초 혈액 등에서 유래), 신경계 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 성체 줄기세포 등을 들 수 있으며 단분화능 줄기세포로는 평소에는 분열능이 낮은 상태로 존재하다가 활성화 이후 왕성한 분열로 오직 간세포들만을 만드는 간세포(Committed stem cell) 등을 들 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은
세포 배양 용기;
한쪽 면에 세포가 부착될 하이드로겔이 부착된 다공성막; 및
상기 세포 배양 용기의 내부에 상기 하이드로겔이 부착된 다공성막이 비접촉적으로 배치되는 것을 포함하는 줄기세포 분화 장치에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 다공성막 및 하이드로겔은 배지 및 공기의 투과가 가능한 것일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 3차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법
줄기세포의 분화를 촉진시키기 위하여, 3차원적으로 분화를 수행하고자 하였다. 이를 위하여, 세포 배양 접시 또는 웰의 바닥에 수평이 되도록 비접촉적으로 0.4 ㎛ 내지 1 ㎛인 폴리머 막 (Corning, USA)을 설치하고 생분해성 합성 바이오겔 (BASF, Germany)을 멸균된 3차 증류수에 다양한 %의 녹여 제조한 생분해성 합성 바이오겔 (BASF, Germany)을 폴리머 막 위에 250 ㎕/cm2로 도포한 뒤 1시간 30분 동안 37℃에서 겔로 굳혀 분화용 세포 배양기를 제작하였다. 졸-겔 상전이 후의 생분해성 합성 바이오겔의 두께는 최소 1 mm였으며, 평균 2.5 mm였다. 지방 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro ADMSC 배지 (CB-ADMSC-GM, CEFO, Korea), 골수 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro BMMSC 배지 (CB-BMMSC-GM, CEFO, Korea), 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro ESMSC 배지(CB-ESMSC-GM, CEFO, Korea), 탯줄 유래 간엽줄기세포는 CEFOgro UCMSC 배지 (CB-UCMSC-GM, CEFO, Korea), 치주인대세포(PDL)는 CEFOgro PDL 배지 (CB-PDL-GM, CEFO, Korea)로 37℃, CO2 배양기에서 3일 내지 4일간 배양한 뒤, 각각의 줄기세포를 상기 바이오겔 위에 접종한 뒤, 골분화 전처리 배지 (CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Korea)를 넣고 37℃, CO2 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 그 후, 골분화 유도배지 (CB-DM-Osteo, CEFO, Korea)로 배지를 교환하고 37℃, CO2 배양기에서 5일 동안 골분화를 유도하였다 (도 1).
비교예 1. 2차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법
종래의 줄기세포 분화 방법인 2차원적 분화 방법으로 줄기세포를 분화하였다. 구체적으로, 12well 세포배양 용기(접시)에 세포를 접종하고 골분화 유도를 위한 전처리 배지(CB-DM-Osteo-PT, CEFO, Korea)에서 세포 밀도가 85 내지 90%가 될 때까지 배양한 뒤 골분화 유도배지 (CB-DM-Osteo, CEFO, Korea)로 교환하여 14 내지 21일 동안 골분화를 유도하였다 (도 2).
비교예 2. 하이드로겔 없이 3차원 상태에서의 줄기세포 분화 방법
상기 실시예 1에서 폴리머 막 위에 생분해성 합성 바이오겔이 0%인 (폴리머 막만 존재) 경우에서의 줄기세포의 분화를 확인하기 위해, 폴리머 막 위에 줄기세포를 접종한 뒤 실시예 1과 동일하게 5일 동안 배양하였다 (도 3).
실험예 1. 골수 유래 간엽줄기세포의 골분화 확인
상기 비교예 1의 방법으로 14일 또는 5일 동안 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포, 상기 비교예 2의 방법 (0% 생분해성 합성 바이오겔)으로 5일 동안 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포 및 상기 실시예의 방법 (5%, 10% 또는 15% 생분해성 합성 바이오겔)으로 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포를 위상차 현미경을 통하여 육안으로 골분화를 확인하였다. 또한, 골분화한 세포를 알리자린 레드 염색을 통해 확인하기 위하여 세포들을 PBS로 2회 세척한 후 70% 에틸알콜로 10분간 상온에서 고정하고 3차 증류수로 2회 세척하였다. 이후 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색 키트 (CB-SK-Osteo)의 Sol I을 처리하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후 Sol II로 3회 깨끗이 세척한 후 도립현미경 (LEICA, Germany)으로 이미지 분석을 실시하였다. 아울러, 이를 수치화하기 위하여 이미지 분석 후 Sol III를 처리하여 30분간 상온에서 반응시키고 염색된 시약을 완전히 녹였다. 녹인 용액을 100 ㎕씩 취하여 96 웰 플레이트에 넣고 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 비교예 1의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 경우 및 비교예 2의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 경우 골분화가 이루어지지 않았으나, 실시예의 방법으로 5일 동안 골분화를 유도한 경우에는 5일 만에 충분한 골분화가 유도되었다. 특히, 실시예의 방법으로 골분화시 1 내지 30% 하이드로겔에서 골분화가 모두 잘 일어났으며, 특히 10% 농도에서 골분화가 가장 최적임을 알 수 있었다 (도 4).
실험예 2. 지방 유래 간엽줄기세포의 골분화 확인
상기 비교예 1의 방법으로 14일 동안 골분화 유도한 지방 유래 간엽줄기세포, 상기 비교예 2의 방법 (0% 생분해성 합성 바이오겔)으로 5일 동안 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포 및 상기 실시예의 방법 (5%, 10% 또는 15% 생분해성 합성 바이오겔)으로 골분화 유도한 골수 유래 간엽줄기세포를 위상차 현미경을 통하여 육안으로 골분화를 확인하였다. 또한, 골분화한 세포를 알리자린 레드 염색을 통해 확인하기 위하여 세포들을 PBS로 2회 세척한 후 70% 에틸알콜로 10분간 상온에서 고정하고 3차 증류수로 2회 세척하였다. 이후 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색 키트 (CB-SK-Osteo)의 Sol I을 처리하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후 Sol II로 3회 깨끗이 세척한 후 도립현미경 (LEICA, Germany)으로 이미지 분석을 실시하였다. 그 결과, 비교예 2의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 경우 골분화가 전혀 이루어지지 않았으나, 실시예의 방법으로 5일 동안 골분화시 1 내지 30% 생분해성 합성 바이오겔에서 골분화가 모두 잘 일어났으며, 특히 5 내지 10% 농도에서 골분화가 가장 최적임을 알 수 있었다 (도 5).
실험예 3. 탯줄 유래 간엽줄기세포의 골분화 확인
상기 비교예 2의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포, 상기 비교예 2의 방법으로 세포를 접종하고 BMP(bone morphogenic protein)2 (peprotech, israel) 100 ng/ml 또는 Wnt3a (peprotech, israel) 20 ng/ml을 처리하여 5일 동안 골분화를 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포 및 상기 실시예의 방법 (10% 생분해성 합성 바이오겔)으로 골분화 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포를 위상차 현미경을 통하여 육안으로 골분화를 확인하였다. 또한, 골분화한 세포를 알리자린 레드 염색을 통해 확인하기 위하여 세포들을 PBS로 2회 세척한 후 70% 에틸알콜로 10분간 상온에서 고정하고 3차 증류수로 2회 세척하였다. 이후 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색 키트 (CB-SK-Osteo)의 Sol I을 처리하고 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후 Sol II로 3회 깨끗이 세척한 후 도립현미경 (LEICA, Germany)으로 이미지 분석을 실시하였다. 아울러, 이를 수치화하기 위하여 이미지 분석 후 Sol III를 처리하여 30분간 상온에서 반응시키고 염색된 시약을 완전히 녹였다. 녹인 용액을 100 ㎕씩 취하여 96 웰 플레이트에 넣고 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 골분화를 촉진시키는 것으로 알려진 BMP와 Wnt3a를 처리하고 비교예 2의 방법으로 5일 동안 골분화 유도한 경우보다도 본 발명의 실시예 방법을 이용한 탯줄 유래 간엽줄기세포의 골분화 효율이 현저히 우수하였다 (도 6).
실험예 4. 탯줄 유래 간엽줄기세포의 골분화 기간에 따른 변화 확인
상기 실시예의 방법 (10% 생분해성 합성 바이오겔)으로 골분화를 1일, 3일, 5일 또는 7일 동안 유도한 탯줄 유래 간엽줄기세포를 알리자린 레드 염색을 통해 이미지 분석을 실시하였다. 아울러, 이를 수치화하기 위하여 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 골분화 유도 1 일차부터 골분화가 유도되기 시작하였고 골분화 기간이 길어질수록 골분화가 강하게 일어났다. 특히, 탯줄 유래 간엽줄기세포의 경우는 종래의 2차원 방식에서 다른 간엽줄기세포에 비해 골분화가 잘 일어나지 않는 것으로 알려져 있는데 본 발명의 실시예의 3차원 골분화 유도 방법을 이용한 경우에는 다른 간엽줄기세포와 같이 골분화가 잘 이루어지는 것으로 나타났다 (도 7).
실험예 5. 다양한 간엽줄기세포의 골분화 확인
골수 유래 간엽줄기세포, 지방 유래 간엽줄기세포, 탯줄 유래 간엽줄기세포, 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포 및 치주인대세포를 각각 상기 비교예 1의 방법으로 14일 동안, 상기 비교예 2의 방법 (0% 생분해성 합성 바이오겔)으로 5일 동안, 또는 상기 실시예의 방법 (10% 생분해성 합성 바이오겔)으로 5일 동안 골분화 유도한 뒤 알리자린 레드 염색을 통해 간엽줄기세포의 골분화 정도를 확인하였다.
그 결과, 비교예 1의 방법 및 비교예 2의 방법으로 5일간 골분화를 유도한 경우에는 간엽 줄기세포들의 골분화가 전혀 유도되지 않았으나, 실시예의 방법으로 생분해성 합성 바이오겔 위에서 3차원적으로 5일간 골분화를 유도한 경우에는 간엽줄기세포의 유래에 상관없이 골분화가 잘 이루어지는 것을 관찰할 수 있었다 (도 8).
상기에서와 같이, 종래의 2차원적 골분화 방법으로는 간엽줄기세포의 골분화가 약 2주 내지 5주 걸리나, 세포 배양 용기 위에 폴리머 막을 비접촉적으로 배치하고 그 위에 하이드로겔을 도포하여 그 위에 간엽줄기세포를 접종하여 골분화 전처리 배지로 배양한 뒤 골분화 유도 배지를 처리하는 본 발명의 3차원적 골분화 방법을 이용하면 3 내지 7일이면 골분화가 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

  1. 한쪽 면에 하이드로겔이 도포된 다공성막이 비접촉적으로 내부에 위치한 세포 배양 용기에서 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    다공성막을 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키고;
    상기 다공성막의 한쪽 표면에 하이드로겔 용액을 도포하여 졸-겔 상변이를 통해 하이드로겔을 코팅하며;
    상기 코팅된 하이드로겔 위에 줄기세포를 접종하고; 및
    상기 줄기세포를 골분화 유도 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 다공성막과 세포 배양 용기의 사이에 배지가 유입되어 줄기세포와 배지의 접촉 표면적을 증가시켜 골분화 유도 기간을 단축시키는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 1 내지 40% 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 37℃에서의 점도가 1.E+00 내지 1.E+06 (100 내지 106) mPa·s인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 다공성막은 공극이 0.1 내지 8㎛인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 다공성막 및 하이드로겔은 공기 및 배지의 투과를 허용하는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄 유래 간엽줄기세포(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 지방 유래 간엽줄기세포(adipose derived mesenchymal stem cell), 배아줄기세포 유래 간엽줄기세포(Embryonic stem cell derived mesenchymal stem cell), 치주인대세포(Periodontal ligament cell) 또는 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell)인 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  9. 제 2항에 있어서, 상기 졸-겔 상변이는 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  10. 제 2항에 있어서, 골분화 유도 배지에서 3 내지 7일 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 줄기세포를 골분화 유도하는 방법.
  11. 세포 배양 용기;
    한쪽 면에 세포가 부착될 하이드로겔이 부착된 다공성막; 및
    상기 세포 배양 용기의 내부에 상기 하이드로겔이 부착된 다공성막이 비접촉적으로 배치되는 것을 포함하는 줄기세포 분화 장치.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 다공성막 및 하이드로겔은 배지 및 공기의 투과가 가능한 것을 특징으로 하는 줄기세포 분화 장치.
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