KR100888830B1 - 패턴화된 폴리디메틸실록산을 이용한 줄기세포의 분화 또는증식방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 패턴화된 폴리디메틸실록산(polydimethlsiloxane, PDMS)을 지지체로 이용하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 증식방법 및 분화방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 마이크로 단위로 패턴화된 폴리디메틸실록산을 지지체로 이용한, 줄기세포의 증식방법 및, 성체 줄기세포를 신경세포, 골세포, 지방세포, 근육세포 및 섬유세포로 구성된 군에서 선택되는 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 성체 줄기세포가 마이크로 단위패턴의 PDMS위에서 목적하는 세포로의 효율적인 분화, 예를 들어 신경세포로의 분화뿐만 아니라, 이러한 신경세포 등의 길이 증가가 일정한 방향성을 가지고 있기 때문에 치료에 효과적이다.

줄기세포, 폴리디메틸실록산, 증식, 분화

Description

패턴화된 폴리디메틸실록산을 이용한 줄기세포의 분화 또는 증식방법{Method for Differentiating and Proliferating of Stem Cell Using Patterened Polydimetylysiloxan}

도 1은 본 발명의 PDMS를 제조하기 위해 사용한 실리콘 틀의 형상이다.

도 2는 본 발명의 PDMS위에 마이크로 단위로 제작한 패턴의 SEM(Scanning electron microcopy) 이미지이다[(A):1㎛, (B):2㎛, (C);4㎛ (Scale bar=10㎛]

도 3은 마이크로 단위로 패턴한 PDMS위에 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 사진이다. DIC(differential interference contrast)는 미분 간섭효과를 통해 세포의 현미경상 보이는 이미지 그대로를 보인 것이며, PI(Pyridine Iodine)는 피리딘 요오드를, Hoechst는 Hoechst 33238, merged는 PI와 Hoechst 33238 그림을 합친 것을 나타낸다[A,B,C,D:대조군(패턴이 들어가지 않은 PDMS); E,F,G,H: 1㎛ 패턴이 들어간 PDMS; I,J,K,L: 2㎛ 패턴이 들어간 PDMS; M,N,O,P: 4㎛ 패턴이 들어간 PDMS].

도 4의 A는 PDMS와 일반 배양 접시(dish)에서 배양한 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포의 증식 그래프이며, B는 패턴에 크기와 유무에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포의 증식 그래프이며, C는 그 증식 정도는 비율로 환산한 그래프이다.

도 5의 A는 마이크로 패턴된 PDMS 위에 씨딩된 후 24시간 후의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 사진이며, B는 전-신경 유도 배지(pre neuronal induction medium:DMEM + 5%FBS 1mM BME)에 넣은 후 24시간 후의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 사진이다.

도 6은 마이크로 패턴된 PDMS에서 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 나타내는 사진이다.

도 7의 A는 마이크로 단위로 패턴된 PDMS위에서 배양된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 수에 대한 그래프이고, B는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경세포로 분화/핵 염색 발현(액 혐색당 뉴런으로 분화한 세포의 %)에 대한 그래프이다.

도 8은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 분화된 신경세포의 길이에 대한 그래프이다.

도 9의 A 내지 F는 각 마이크로 단위의 패턴에 따른, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 분화된 신경세포의 각도에 따른 정렬 분포를 나타낸 그래프이다.[A: 1㎛ PDMS; B:2㎛ PDMS; C:4㎛ PDMS; D: Flat PDMS; E: 10°이내에 정렬된 세포의 %; F: 20°이내에서 정렬된 세포의 %].

도 10은 도9의 A 내지 D의 샘플을 주사 현미경(SEM, Scanning electron microcopy)으로 촬영한 사진이다 [A: CTL(패턴화되지 않은 PDMS); B: 1㎛ PDMS (scale=5㎛); C:2㎛ PDMS(scale=20㎛); D:4㎛ PDMS(scale=20㎛)].

본 발명은 패턴화된 폴리디메틸실록산(polydimethlsiloxane, PDMS)을 지지체로 이용하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 증식방법 및 분화방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 마이크로 단위로 패턴화된 폴리디메틸실록산을 지지체로 이용한, 줄기세포의 증식방법 및, 성체 줄기세포를 신경세포, 골세포, 지방세포, 근육세포 및 섬유세포로 구성된 군에서 선택되는 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다. 만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.

끊임없이 자가 재생능력과 신체 내의 모든 조직으로 분화 할수 있는 능력을 가진, 이러한 줄기세포를 이용한 치료법은 현재 많은 난치병 치료를 위한 획기적인 치료법으로 대두 되고 있다. 종래에는 신경계, 허헐성 질환, 근골격계, 심혈관계, 내분비, 유전 및 간질환 등을 포함한 수많은 난치병을 더 이상 진전되지 않도록 하는 보존적 치료에 국한되었던 반면, 최근 생명공학의 눈부신 발전에 힘입어 줄기세포를 이용한 치료법이 개발 중이며, 또한 많은 과학자들이 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포를 응용하기 시작하였다.(Miyahara Y. et al., Nature Medicine, 12(4):459-65, 2006; Kang, K.S. et al., Stem Cells, 24(6):1620-6, 2006; Silva, G.V. et al., Circulation, 18;111, 2005)

성체 줄기세포는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포로서,그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 이러한 성체 줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 담당한다. 대표적인 성체 줄기세포에는 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSCs)와 중간엽(간엽) 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)가 있다. 조혈모세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 주로 혈액내의 혈구세포로 분화하는 반면, 중간엽(간엽) 줄기세포는 골모세포(osteoblast), 연골모세포(chondroblast), 지방세포(adipocyte) 및 근육모세포(myoblast) 등의 중배엽성 조직의 세포로 분화하는 것으로 알려져 있다.

성체 줄기세포를 얻을 수 있는 대표적인 조직으로 골수가 알려져 있으며, 이러한 골수에는 조혈줄기세포, 중간엽(간엽) 줄기세포, 다분화능 성체전구세포(multipotent adult progenitor cells; MAPCs) 등의 존재가 보고되어 있다. 특히, 골수 유래 다분화능 성체 전구세포가 중간엽(간엽) 줄기세포와 같이 골모세포, 연골모세포, 지방세포 등으로 분화할 뿐만 아니라 신경세포, 내피세포, 간세포 등 다른 조직의 세포로도 분화가 가능하다는 연구가 발표되면서 많은 관심을 끌고 있다(Reyes M. et al., Blood 98: 2615-2625, 2001; Reyes M. et al., J. Clin. Invest. 109: 337-346, 2002). 또한 이외에 신경줄기세포, 피부줄기세포, 모낭줄기세포, 유방줄기세포, 태반 줄기세포등 모든 성인의 장기에 성체줄기세포가 존재하는 것이 확인되었다. 최근에는 성체 줄기세포를 이용, 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다. 제대혈 유래 간엽 줄기세포는 골수 유래 간엽 줄기세포와 함께, 다양한 세포로 분화 유도되어 혈액 관계 질환의 치료 등에 필요한 세포치료제로써 활용 가능성이 높아, 성체 줄기세포를 확보할 수 있는 공급원으로써 중요성이 높아지고 있다.

이와 같이 줄기세포를 이용한 치료법이 개발되고 있으나, 세포증식과 분화의 한계로 치료의 효과를 극대화시키는 것이 당면 과제이다. 그래서 현재 치료의 효과를 보기 위해 필요한 분화능력 및 세포의 증식에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있으며, 적은 수의 세포를 가지고 그 효과를 극대화시키기 위해 다양한 물질, 폴리머, 하이드로젤 등의 생체재료를 이용해 줄기세포가 원하는 조직의 세포로 분화로 촉진하거나 증식 시키는 방법이 연구되고 있다. (Lechner S et al: Artif Organs. 2006 (10):770-4) (Fan H, et al Biomaterials. 2006 Sep;27(26):4573-80) (Benoit DS et al Acta Biomater. 2005 Jul;1(4):461-70) (Recknor JB et al Biomaterials. 2006 Aug;27(22):4098-108).

생체재료는 어떤 형태이던지 인체와 접촉하므로 반드시 생물학적으로 적합해야만 한다. 일반적으로 의료용으로 사용되는 재료는 인체와 접촉하는 정도에 따라 3개의 군으로 나누며, 제1급은 인체와 직접 접촉하지 않거나 접촉하더라도 체액조성에 변화를 주지 않는 것, 제2급은 간헐적 또는 24시간 이내의 단기간 접촉하는 것 및 제3급의 인체 내에 삽입되어 지속적으로 조직과 접촉하는 것으로 구분하고 있으며, 특히 이식체인 제3급 재료는 인체에 대하여 완전한 안전성이 보장되어야 한다. 이들 제3급 재료는 주변 조직과의 생물학적 반응형태에 따라 이식 후 면역반응을 일으키지 않으면서 형태와 구조를 유지하는 생체불활성(bioinert), 주위조직과 직접 결합하여 생물학적 기능을 제공하는 생체활성(bioactive), 및 이식후 서서히 체내에서 분해되어 재생하는 자가조직으로 치환되는 생분해성(biodegradable) 재료로 나누어 볼 수 있다.

재료와 인체조직과의 반응은 숙주의 면역반응에 관련된 생체안정 성(biostability)과 재료의 성질에 관련된 생체적합성(biocompatibility)을 고려하여야 한다. 생체안정성으로서는 생체재료의 이식 후 발열, 염증, 항원성, 발암성 반응이 일어나지 않아야 하며, 생체적합성으로는 이식체가 기계적, 용적(volumetric), 생화학적으로 주위 조직과 융화를 이루어야 한다. 즉, 체내에 이식된 생체재료는 해부학적 크기와 형태가 수복되어야할 부위와 정확하게 일치하여야 하며, 재료의 영 모듈러스(Young's modulus)와 같은 기계적 성질도 본래 조직과 가능한 한 본래 조직과 같아야 지속적인 인체운동에 의해 유발되는 물리적 부하(physical stress)에 의해 유발되는 기계적 열화(deterioration)와 피로(fatigue)를 피하여 유지할 수 있다.

특히 본 발명에서 사용된 디메틸실록산중합체 (PDMS, polydimethylsiloxane)는 생체 친화성이 있는 물질로, 현재 인공 와우 등 생체 조직 이식 시 사용되고 있으며, 세포의 증식을(Legallais C.etl al :Biomaterials. 2006 Aug;27(22):4109-19) 증식시키고, 일정한 패턴을 통해 기관형적(organotypic) 배양을 하거나 (Yaghoub B.M. Biotechnol Bioeng, 5;92(3):336-45, 2005) 원하는 곳에 신경세포를 자리잡게(positioning)하여 신경 세포 간의 커뮤니케이션을 증폭시킬 수 있는 물질로, 최근 이 PDMS를 이용한 여러 연구들이 진행 중이다.

현재 성체 줄기세포의 다분화능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 골수뿐 아니라 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 다분화능이 입증되어, 난치병 치료를 위한 세포 치료에 안정적인 공급원으로 각광 받고 있다. 현재 줄기세포를 이용한 치료에 있어 가장 중요한 요인은 줄기세포를 이용한 치료시 줄기세포의 안정 적인 세포수 확보와 원하는 조직의 세포로 안정적으로 분화시키는 것이 가장 주요한 핵심 사안이다.

그러나 종래의 줄기세포를 이용한 치료에 있어서, 그 세포의 증식과 분화가 주입한 세포수에 비해 그 효율이 낮아 치료효과를 크게 못하고 있다는 한계점이 있어왔다. 특히 척추 손상에서는 무엇보다 끊어진 척추 신경을 이어 주는 것이 가장 중요하며, 그러기 위해서는 신경세포의 길이와 일정한 방향성을 가져 끊어진 신경을 이을수 있는 가교역할이 필요하다.

줄기세포는 세포 대 세포(cell to cell), 그리고 성장인자(Growth factors)들을 포함한 세포 대 세포외 기질(cell to extracellular matrix(ECM))에 의해 그 분화의 운명(fate)이 많이 좌우되는것으로 알려져 있고, 또한 유익한(instructive) 환경에 의해서도 영향을 많이 받는것으로 알려져 있다.(Nakayama et al, Neurosci Res:2003:(46);241-9).

이에 본 발명자들은 신경 세포의 방향성과 길이를 증가시키고 또한 증식을 원활하게 하여 끊어진 부분의 가교역할을 할 수 있는 지지체를 사용하여 그 줄기세포 치료 효과를 배가 시킬수 있는 방법을 찾고자 하였다.

이에 본 발명자들은 제대혈에서 유래된 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화 유도 시 마이크로 단위로 패턴화된 PDMS에서 배양한 결과, 신경세포로의 분화를 촉진 할 뿐만 아니라 세포의 증식도 증가한다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 성체 줄기세포를 마이크로 단위로 패턴된 PDMS에서 배양하여, 목적하는 세포로의 분화능을 향상시키고, 줄기 세포의 증식을 향상시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 수득되고, 패턴화된 PDMS 지지체에 고정되어 있는 줄기세포를 함유하는 줄기세포 치료제 또는 세포 치료제를 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로 단위로 패턴화된 폴리디메틸실록산(polydimethlsiloxane, PDMS)을 지지체로 이용하는 것을 특징으로 하는을 이용하여 성체 줄기세포를 증식 또는 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 성체 줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 또는 자궁 등에서 유래된 성체 줄기세포를 선택할 수 있고, 바람직하게는, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 성체 줄기세포를 증식 또는 분화시키는 방법을 이용하여 수득되고, 패턴화된 PDMS 지지체에 고정되어 있는 줄기세포를 함유하는 줄기세포 치료제 또는 세포 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 일정한 패턴이 형성되어 있는 PDMS 물질 위에, 제대혈에서 분리한 성체 줄기세포를 배양했을 때 세포의 증식이 증가 되었을 뿐만 아니라 신경세포로의 분화가 더 활발히 진행되었다는 발견에 기초한, 새로운 성체 줄기세포의 증식 또는 분화방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하는 "분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명에서 사용하는 "증식(proliferation)"이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물 의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식으로 보는 것이 정당하다.

본 발명에서 사용하는 "성체 줄기세포"란 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미하며, 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다

본 발명의 성체 줄기세포는 이미 공지되어 있는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래된 성체 줄기세포로부터 분리, 사용할 수 있다.

성체 줄기세포는 성성세포로 분화할 수 있는 신경줄기세포, 골수세포로 분화할 수 있는 조혈모 세포, 뼈, 연골, 지방, 근육 등으로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포, 간세포로 분화할 수 있는 간줄기세포 등이 있다. 그 중에서도 중간엽 줄기세포는 골세포뿐만 아니라 연골세포, 지방세포, 근육세포, 섬유세포 등 여러 가지 근골격계 세포들로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는 세포이다.

중간엽 줄기세포는 제대혈(탯줄)과 골수 등에 존재하므로 세포 분리도 다른 성체조직보다 용이하며 중간엽 줄기세포를 이러한 근골격계 질환뿐 아니라 다른 질환의 치료에 이용하고자 하는 노력들이 행하여지고 있다. 그 이유는 다른 줄기세포와는 달리 골수에서 쉽게 배양 증폭되며, 기존에 알려져 왔던 바와는 달리 중간엽 유래 세포뿐만 아니라, 내배엽 혹은 외배엽 유래의 세포로 분화가 가능하며, 자가의 세포를 이용하므로 면역에 의한 거부 반응이 없으며, 배아줄기세포와 달리 원하는 방향으로 분화되지 않은 세포가 암을 유발할 가능성이 매우 희박하여 임상적으로 매우 중요한 장점을 갖고 있기 때문이다.

특히, 본 발명의 일 구체예로서, 윤리학적 문제가 없고 줄기세포를 얻기 용이하며 다분화능을 가진 제대혈에서 유래한 줄기세포를 사용하여 신격세포로 분화하는 방법을 들 수있다.

제대혈은 최근에 많은 양의 줄기세포를 가지고 있는 것으로 알려지면서 연구가 활발히 이루어지고 있다. 제대혈이 조혈모세포의 풍부한 원천으로 알려진 이후, 임상적으로 제대혈 이식을 통해 혈액관련 질환을 치료하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있으며, 자가이식 치료를 위하여 제대혈을 냉동시켜 수년 후 사용가능한 상태로 보존하는 제대혈 은행이 국내에서도 활성화되고 있다. 제대혈은 골수와는 달리 분만과정에서 버려지는 제대(umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다. 또한, 제대혈 이식시 나타날 수 있는 이식편대숙주반응이 골수 이식에 비해 상당히 적어 제대혈에 포함되어 있는 줄기세포의 성상 확인 및 그의 임상에의 응용 확대를 위한 연구가 전 세계적으로 이루어지고 있다. 또한, 제대혈에 중간엽(간엽) 줄기세포의 존재(Erices A, et al., Br. J. Haematol. 109: 235-242, 2000; Lee OK, et al., Blood 103: 1669-1675, 2004)가 보고되고 있다.

한편, 본 발명에서 사용하는 "디메틸실록산중합체(PDMS, polydimethylsiloxane)"는 산화규소 고분자로서 흔히 실리콘(silicone)이라고 부르며, 분자량에 따라 그 성질을 다양하게 변화시킬 수 있다. 즉 분자량 1만이하의 겔(gel)상태로부터 30만이상의 고무(rubber)상 까지 변하며, 흔히 카테터, 배뇨/ 배농관은 물론 다양한 이식용 재료로서 현재까지 가장 널리 사용되고 있다

PDMS 는 인공 와우 등과 같이 인체에 이식시 거부감이 없어 많이 쓰이고 있으며, 최근 발표된 논문에 의하면 망막 색소 상피세포(retinal pigment epithelial) 세포의 증식을 위해 기질(substrate) (Krishna Y et al, J Biomed Mater Res A. 2006 Oct 20)로 하이드로겔(hydorgel)과 함께 많이 쓰이고 있다. 하지만 하이드로겔은 매트릭스(matrix) 타입으로 많이 쓰이는 반면에 PDMS는 원하는 모양이나 패턴을 쉽게 제작할수 있고, 생체적합성도 뛰어나 향후 줄기세포를 이용한 세포이식시 조직 공학적으로 응용이 가능한 장점이 있다.

본 발명의 하나의 태양에서는, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화 유도시 마이크로 패턴된 PDMS가 신경세포로의 교차 분화(transdifferentiation)를 유도하고, 또한 분화 유도뿐만 아니라 세포의 증식에도 효과가 있음을 보여준다.

특히, PDMS가 비록 세포 증식에 도움을 주지만, 패턴이 없는 경우에는 유의적으로 증가하지 못하는 반면, PDMS에 일정한 간격으로 패턴을 주는 것이 더 효과적이다. 즉, 줄기세포에서 세포의 자가 증식(self renwealty)과 함께 중요한 분화에서, 본 발명에 따른 패턴화된 PDMS를 적용하는 경우, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 신경세포로 교차 분화가 효과적으로 유도되며, 분화된 신경 세포가 패턴이 없는 곳에서 분화 유도 시킨 신경 세포에 비해, 신경세포의 길이나 분화 정도가 더 많이 분화된다.

본 발명세서 상기 폴리디메틸실록산은 마이크로 단위 크기의 패턴을 지니고 있는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1 내지 4 ㎛ 크기의 패턴을 지니고 있는 것을 특징으로 한다.

본원 발명에 있어서 "패턴의 크기"라 함은 도 1에서 나타내는 바와 같은 실리콘 몰드에 의해 제조한 PDMS 지지체에 있어서, 오목한 홈의 간격 크기를 의미하는 것으로 도2에서 어둡게 나타난 부분의 가로 길이에 해당한다.

신경세포로 분화시 패턴의 크기가 좁을수록 신경세포로 분화가 현저히 증가한다. 특히, 일정한 방향성을 가지고 자라는 신경 세포의 길이의 증가는, 임상 적용시 끊어진 신경 세포끼리 연결할 때 일정한 방향성 없이 짧은 신경세포보다는 길게 늘어진 신경세포가 끊어진 부위에서 많은 신경을 잘 전달할 수 있다는 점에서, 신경을 전달하는 중요한 요소가 되기 때문에 그 의의가 크다 할 수 있다.

본 발명은 줄기세포를 이용한 다양한 치료에 유용하게 적용될 수 있을 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 설명한 성체 줄기 세포의 증식방법을 통해 수득되고, 패턴화된 PDMS 지지체에 고정되어 있는 줄기세포를 함유하는 줄기세포 치료제 또는, 성체 줄기 세포를 신경세포, 골세포, 지방세포, 근육세포 또는 섬유세포 등으로 분화시키는 방법을 통해 수득되고, 패턴화된 PDMS 지지체에 고정되어 있는 줄기세포를 함유하는 세포 치료제를 제조할 수 있을 것이다.

일례로, 신경계 손상에서 끊어진 신경을 연결하기 위해 줄기세포를 주입시 본 발명에 따른 마이크로 패턴된 PDMS 지지체에 고정되어 있는 줄기세포를 함유하는 줄기세포 치료제를 이용한다면, 적은 수의 세포로도 충분한 세포의 증식을 가져 와 줄기세포의 효과를 극대화시킬 수 있게 된다. 또한, 많은 수의 신경세포의 분화및 길게 자란(늘어진) 신경 세포로 인해, 신경이 끊어진 부분에 확실한 가교 역활을 함으로서 신경계 손상 치료에 있어 줄기세포를 기본으로 한 조직학적 공학방법이 융합되어 그 치료 효과를 배가시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포을 사용하고 있으나, 이 밖에도 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등의 인간조직 유래 성체 줄기세포를 사용할 수 있는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

제조예 : 줄기세포 배양 및 패턴화된 PDMS 제작

(1) 제대혈 중간엽 줄기세포 배양

인간제대혈은 보라매 병원 임상시험심사위원회(IRB)에 의해 승인된 산모 동의하에 정상 분만후 즉시 제대정맥으로부터 얻었고, 이 실험은 서울대학교 생명윤 리심의위원회가 의해 승인하였다. 사람의 제대혈로부터 얻은 혈액을 PBS와 1:1 비율로 희석하여 교반한 다음, Ficoll-pague:제대혈 = 15:25의 비율로 피콜 상 분리를 실시하였다. 15㎖의 피콜용액에 PBS와 1:1의 비율로 희석된 혈액 샘플을 천천히 흘려 층이 분리되도록 한 다음, 원심분리 한 후 튜브의 중간층에 얇은 버피 코트층(buffy coat layer)이 형성된 것을 확인하고, 분리해 새로운 튜브로 이동시켰다. 상기 튜브에 HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)를 첨가하여 총 30mL의 용액이 되게한 다음, 1200rpm에서 15분간 원심분리한 후, 상층액은 버리고, 침전액을 즉시 얼음에 보관하였다. 침전액에 1mL의 HBSS를 첨가하여 부드럽게 파이펫팅(pipetting)해주고, 29 mL의 HBSS을 추가로 첨가하여, 같은 방법으로 튜브를 흔들어 균일하게 섞어준 다음, 1200rpm에서 5분간 원심분리를 실시하여 상층액은 제거하고, 다시 1200rpm에서 5분간 원심분리를 실시한(상기 과정을 2회 반복하였다) 후, 세포를 수득하였다. 배지[DMEM(low glucose) + 1%PSN + 20% FBS]에 세포를 부유시킨 후, 75 플라스크에 각각 1~2 x 108의 세포가 들어가도록 배지에 희석 시켰다(플라스크에 들어가는 배지의 양은 20 mL로 하였다).

CO₂ 배양기에서 3일간 세포배양 후, 상층액을 새로운 75 플라스크에 이동시키고, 플라스크 바닥에 부착되어 있는 세포 위에는 최초 배양 시와 동일한 성분의 배양액을 채워놓았다. 4~10일 이후에, 트립신을 사용하여 세포를 이탈시켜 새로운 플라스크에 1x104/mL로 시딩(seeding)하여 유지시키는 방법으로, 성체 줄기세포를 배양 및 유지하였다.

(2) PDMS에 마이크로 단위로 패턴 제작

도 1과 같은 실리콘 틀을 사용하여, PDMS에 각각 다른 사이즈의 패턴을 주조하였다. 실리콘 몰드는 포토리소그래피(photolithogrpahy)와 에칭 작업을 통해 주조하였으며, 주조된 실리콘 몰드는 황산과 과산화수소 (4:1) 비율로 조제한 용액에 소독한 후 hexaethyldislazane(HMDS)를 실리콘 와퍼 위에 코팅한 후 1 ㎛ 깊이로 만든후 포토레지스트를 통해 나머지 부분을 제거하였다, 그렇게 만든 실리콘 몰드 위에 Sylgard184 PDMS 엘라스토머(Dow corning, Midland, MI)를 몰드 위에 부운 후 진공 챔버로 옮겨 가스를 제거하였다. PDMS가 실리콘 몰드 위에 어느정도 굳혀지면, 70℃에서 좀더 단단하게 만들기 위해 한 시간 정도 가열(heating)하였다. PDMS 레이어를 실리콘 몰드로부터 조심스럽게 떼어낸 뒤 초음파 클리너에 넣어 15분간 넣어 잔여물 없이 깨끗한 패턴을 얻기 위해 시행하였다. PDMS 패턴은 70% 알콜올과 UV 에 넣어 소독한 후 세포실험에 사용하였다.

이렇게 얻어진 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 5000/ml개씩 PDMS가 들어 있는 24 웰(well)에 넣어 키운 후 위에서 세포가 약 60-70%정도 이르렀을 때 배지1 (DMEM +5%FBS+100mM BME)를 넣어 24시간 배양 후 다시 배지 2 (DMEM 에 1% DMSO, 100㎛ BHA)를 넣은 후 4시간 반 후에 면역학적 염색으로 신경세포의 분화 정도와 세포수를 측정하였다.

(3) 면역 염색

4% 파라포름 알데하이드를 PB(Phosphate buffer)에 만든 후 실린지 필터( 0.45㎛)를 사용하여 필터 하여 준비하였다. 배지는 버리고 세포가 들어 있는 웰에 4% 파라포름 알데히드 용액을 넣어 30분간 방치하여 세포를 고정하였다. 고정후 PBS로 3번 조심스럽게, 수세한 후 0.4% 트리톤(triton)x-100를 넣어 10분간 방치하여 세포를 퍼미에이블리제이션(permiablization)하여 세포 투과성을 높였다. 방치 후 다시 PBS로 수세하였다. 수세 후 10% NGS (Normal goat serum)을 넣어 한 시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 블로킹 후 Tuj-1(신경세포의 마커) 일차 항체를 10% NGS 와 PBS (1:1) 용액에 1:1000으로 희석하여 4℃ 에서 밤새 반응시켰다. 반응후 PBS로 3번 수세 후 형광 이차 항체 Alexa 488을 1:1000으로 10% NGS 와 PBS (1:1) 용액에 희석 후 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 PBS로 3번 수세한 후 PBS에 Hoechst 33233(100ug/ml)(핵염색) 을 1:100으로 희석하여 20분간 반응시킨 후 PBS로 3번 수세 후 마운팅 메디움(mounting medium)에 올린 후 공초점 현미경으로 이미지를 분석하였다.

(4) 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy,SEM)

샘플을 4% 파라포름 알데하이드에 15분간 고정후 PBS로 10분씩 세번 수세하였다. 수세후 1% 오드뮴 테록사이드 (Odmium terroxide)로 두시간 동안 후고정(post-fixation)한다. 고정후 빠르게 두번 PBS 수세 후, 탈수법으로 디하이드레이션(Dehydration)하기 위해 EtOH:DI 50%의 비율을 60%, 70% 80% 90% 100% 증가시켜 10분씩 시행하였다. 이소아밀락테이트(Isoamylacetate)을 15분 넣어 샘플을 건 조(dry) 하는데 두 번 반복 시행하였다. 임계점 건조기(critical point dryer)를 사용하여 완전히 건조 후 금막 코팅을 15분간 시행하였다. 그 후 주사전자현미경(Scanning electron microscopy, SEM)로 관찰하였다.

실시예 1 : 마이크로 단위로 패턴한 PDMS 위에서의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식

제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 씨딩(seeding) 후 24시간 후에 4% 파라포름 알데하이드로 고정 후 헥스트 (100ug/ml) 와 PI(1mg/ml) 각각 1:100 과 1:3000으로 PBS에 희석하여 20분간 방치 후, PBS수세 후 형광 현미경으로 관찰하였다.

헥스트 와 PI 모두, 핵에 염색되는 것으로 PI경우 세포의 괴저사(necrotic death)의 지표이며, 헥스트의 경우 핵의 난할(cleavedge)나 응축(condensation)으로 세포사(apoptosis)를 확인할 수 있다. 실험에서는 세포의 괴저사나 세포사는 확인되지 않았고, 정상적인 세포의 핵만이 관찰되었다. 그림 1(A)에서 보는 것과 같이, 패턴이 들어가지 않은 것에 비해, 패턴이 들어간 경우 세포의 증식이 증가 되었으며, 특히 1㎛ 패턴에서 가장 세포의 증식이 활발히 이루어졌다(도 3).

또한, 세포의 증식은 1㎛에서 가장 많이 증가 되었음을 확인하였다. 패턴이 없는 대조군에 비해 2㎛와 4㎛에서도 세포의 증식이 증가 되었으나, 패턴의 간격이 크면 클수록 세포의 증식 정도는 감소 되었음을 확인하였다(도 4).

실시예 2 : 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화유도

제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 5000개/ml로 씨딩하여, 24시간 후에 확인하였다(도 5의 A). 그리고 전-신경 유도 배지(pre neuronal induction medium)(DMEM +5%FBS+1mM BME)를 넣어준 후 24시간 후에 확인하였다(도 5의 B).

처음 씨딩했을 때와 달리 세포의 모양이 신경세포처럼 길게 분화된 모습을 확인 할 수 있었다. 특히 패턴이 없을 때는 세포의 길이도 짧고 방향성이 없지만, 패턴이 있는 PDMS위에서 자란 세포들은 세포의 길이가 길며, 패턴에 따라 자라는 방향성을 가지고 있었다.

면역염색을 통한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 관찰한 결과, 패턴이 없는 PDMS 와 마이크로 단위로 패턴이 들어간 PDMS에서 세포의 증식뿐 아니라 뉴런으로 분화 정도가 확연히 다름을 알수가 있었다(도 6). CTL에서는 신경세포로 분화의 정도가 적었을 뿐 아니라 세포의 수도 적었으며, 반면에 1㎛ 패턴에서는 대부분의 세포가 신경 세포로 분화하였으며(green: Tuj-1 신경세포의 마커), 패턴의 간격이 클수록 신경 세포로 분화하는 정도가 적어짐을 알 수가 있었다.

실시예 3 : 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화와 세포의 증식

도 7의 A사진에서 알 수 있듯이, CTL에 비해 마이크로 패턴된 PDMS위에서 키운 제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 더 많이 증식하였으며, 또한 도 7의 B사진에서 알 수 있듯이, 핵 염색당 뉴런으로 분화한 세포의 %를 살펴본 결과, CTL에 비해 특 히 1㎛와 2㎛패턴 PDMS에 분화 유도 시켰을 때 신경 세포로 분화가 유의적으로 증가되었다. 면역염색 결과와 부합하여, 패턴이 없는 경우보다 있는 경우, 신경세포로 분화 및 증식이 촉진되었으며, 특히 1㎛에서 신경세포로의 분화가 유의적으로 증가되었을뿐 아니라 그 세포수 역시 증가하여, 1㎛패턴의 PDMS가 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화를 촉진함을 알수 있었다.

또한 도 8에서 알수 있듯이, 분화된 신경 세포의 길이 또한 1㎛패턴의 PDMS에서 가장 유의적임이 확인되었다. 1㎛ 패턴의 PDMS에 의해 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 신경세포로의 분화시, CTL에 비해 약 2배 이상 세포의 길이가 길어졌으며 2㎛ PDMS 에선, 1.5배 이상 길이가 증가되었다. 반면에 4㎛ PDMS에서는 패턴이 없는 CTL과 큰 차이를 보이지 않아, 신경세포로 분화시 패턴의 간격이 좁을수록 신경세포로 분화가 현저히 증가 됨을 확인하였다.

실시예 4: 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 분화된 신경세포의 길이와 정렬(alignment) 정도

제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 분화된 신경세포가 각 패턴마다 정렬되는 분포를 각도별로 확인하였다(도 9). 본 발명에서 분화된 신경세포가 패턴과 평행하면 0°이며 패턴과 수직을 이루면 90°로 정의하였다. 도 9는 분화된 신경세포가 패턴을 따라서 어느 정도로 정렬하는지 본 그래프로서, 각도가 작을수록 패턴을 따라 자라는 것으로, 그리고 각도가 90°에 가까울수록 패턴을 따라서 자라지 않는 것으로 판단할 수 있다.

A(1㎛), B(2㎛), C(4㎛), D(CTL) 1㎛ 넓이의 패턴을 보면, 대다수의 신경으로 분화된 줄기세포의 약 80%가 10° 안에서 패턴을 따라 정렬(alignment)되어 있으며, 2㎛ 패턴은 1㎛ 패턴보다는 %가 작지만 10° 내지 20°에서 내에서 대부분 정렬됨을 볼 수 있었다. 반면에 패턴이 없는 대조군의 경우는 특정 각도 내에서 정렬되지 않고, 골고루 모든 각도 내에서 유의성 없는 분포를 나타내었다.

또한, 각 샘플을 SEM, 주사 현미경으로 촬영하였다(도 10). 주사 현미경은 전자 발생원으로 부터 전자를 조사해 미소한 점으로 초점을 맞추고, 검출기로 미소점에서의 변화된 신호량의 대소를 브라운관 점의 명암으로써 영상시키는 방식이다.주사전자현미경(SEM)은 고체상태에서 미세조직과 형상을 관찰하는 데에 가장 다양하게 쓰이는 분석기기로서 마이크로 이하의 단위의 시료를 관찰하는데 뛰어난 실험 기법이다.

이 기법을 통하여 분석한 결과, 패턴이 없는 PDMS의 경우 세포들이 거미줄 처럼 연결되고, 분화된 신경세포들의 길이 역시 짧았다. 반면에 1㎛ 패턴이 들어간PDMS 위의 제대혈 줄기세포로 부터 분화된 신경세포는 세포의 모양뿐만 아니라 길이 역시 현저하게 패턴을 따라 길어 졌음을 확인할 수 있었다(그림 7B) 4㎛패턴 PDMS 위의 세포는 1㎛ 이나 2㎛ 비해 세포의 길이가 짧았으나, 패턴이 없는 대조군에 비해서는 분화된 신경세포의 길이가 증가됨이 관찰되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에서는 성체 줄기세포가 마이크로 단위패턴의 PDMS위에서 목적하는 세포(예를 들어, 신경세포)로의 효율적인 분화뿐만 아니라, 분화된 세포(예를 들어, 신경세포)의 길이의 증가가 일정한 방향성을 가지고 있기 때문에 임상 치료, 예를 들어 신경세포의 경우에는 척수손상 및 신경손상의 치료에 효과적이다. 즉, 줄기세포가 신경세포 등으로 분화시 방향성을 가지고 있어 치료에 유리하며, 또한 분화된 신경세포의 길이도 충분히 증가되어, 끊어진 신경을 재생 회복시키는데 단순히 줄기세포만 주입하여 치료하는 것보다 본원발명의 마이크로 단위패턴의 PDMS를 사용하는 것이 보다 효과적이다.

Claims (7)

1 내지 2 ㎛로 패턴화된 폴리디메틸실록산을 지지체로 이용하는 것을 특징으로 하는, 성체 줄기세포의 증식방법.

1 내지 2 ㎛로 패턴화된 폴리디메틸실록산을 지지체로 이용하는 것을 특징으로 하는, 성체 줄기세포를 신경세포, 골세포, 지방세포, 근육세포 및 섬유세포로 구성된 군에서 선택되는 세포로의 분화방법.

제1항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁으로 구성된 군에서 유래된 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는 증식방법.

제3항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 증식방법.

제2항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁으로 구성된 군에서 유래된 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는 분화방법.

제5항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 분화방법.

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