JP2015532596A - 間葉系幹細胞を培養するための方法 - Google Patents

Abstract

間葉系幹細胞を培養するための方法であって、２〜５％酸素の低酸素状態下、２．１〜３．８ｍＭの濃度のカルシウム及び１．０〜３．０ｍＭの濃度のマグネシウムを含有する培地で間葉系幹細胞を培養するステップを含む方法が開示される。該培養方法は、増殖能及び生存率に関して間葉系幹細胞を改善することによって、少ない継代数でも間葉系幹細胞の数を増加させることができる。さらに、該培養方法により調製された間葉系幹細胞は、免疫原性の欠如による安全な細胞治療剤としてだけでなく、サイトカインの良好な分泌による軟骨再生剤としても有効に使用される。【選択図】図４

Description

発明の分野

本発明は、効率的に間葉系幹細胞を培養するための方法に関する。

発明の背景

用語「幹細胞」は、胚、胎児及び成人の組織に見出される未分化型の体細胞であって、多様な特化した細胞型に分化する可能性を有する細胞の一般名である。幹細胞は、（未分化状態を維持しながら）多数の細胞分裂周期を経る能力（自己再生）、及び特定の刺激（環境）に応じて特殊化された細胞型に分化する能力（分化能）、さらには系列のバリアーを越え、他の組織に固有である細胞の発現プロファイル及び機能表現型を採り入れる能力（可塑性）を特徴とする。

幹細胞は、種々の基準に従って分類され得る。分化能は、幹細胞の分類（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、及び単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞）を可能にする。多能性幹細胞は、いずれの細胞型にも分化する多能性を有する。科学者から近時高い注目を集めている胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）は多能性幹細胞の代表である。成体幹細胞は複能性又は単能性を示す。成体幹細胞には造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞等がある。

細胞治療薬においてヒト胚性幹細胞の多能性を利用する種々の試みにもかかわらず、発癌及び免疫拒絶反応の可能性の高さは依然として残り、克服しがたい障害である。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、これらの問題に対する解決策として近年提案されている。ｉＰＳ細胞は、分化した成体体細胞から初期化により人工的に得られる多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳ細胞は、完全に患者に由来することから免疫拒絶反応の問題を回避するかもしれないが、ｉＰＳ細胞による発癌のリスクは依然として解決されるべき問題である。

あるいは、免疫調節効果を示し、発癌のリスクを示さないことから、間葉系幹細胞が推進されている。間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、神経芽細胞、心筋芽細胞、肝細胞、膵島ベータ細胞、血管細胞等を含む種々の細胞型に分化することができる複能性幹細胞であり、免疫応答を調節する機能を有することが知られている。

間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、脂肪組織等の種々の組織から単離され得るが、間葉系幹細胞が由来する起源によって細胞表面マーカーが互いに若干異なるため、十分に定義されていない。概して、間葉系幹細胞が骨芽細胞、軟骨細胞及び筋芽細胞に分化し得、紡錘形の形態を有し得、表面マーカーＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ３４（−）、及びＣＤ４５（−）を発現し得るならば、該幹細胞は間葉系幹細胞として定義される。これに関連して、遺伝的起源及び／又は背景の異なる間葉系幹細胞は、それらの定義、すなわち間葉系幹細胞の定義の点では互いに大きく異ならないが、通常、インビボ活性の点では互いに異なる。さらに、間葉系幹細胞が外因性細胞治療薬として使用される場合、間葉系幹細胞のプールが限られているために、インビボ活性が低いとしても選択肢又は利用可能な選択肢は多くない。

さらに、再生医療及び／又は細胞療法における細胞治療薬として使用するのに必要な間葉系幹細胞の最小数は約１×１０^９細胞である。実際には、適切な条件を設定して基準を決定するための実験を考慮すると、該最小数はさらに増加する。種々の起源からそのような量で間葉系幹細胞が供給されるには、少なくとも１０回のインビトロ継代が必要とされる。しかし、この場合、細胞は老化・変形するため、細胞治療薬としての使用に適さなくなる可能性がある。

したがって、間葉系幹細胞の大量生産に有効な培養方法が必要とされる。

間葉系幹細胞を培養するための方法は、韓国特許出願公開第２００３−００６９１１５号明細書、及び文献［Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ ＭＦ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８４： １４３−７， １９９９； Ｌａｚａｒｕｓ ＨＭ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， １６： ５５７−６４， １９９５；及びＫｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２４： １２９４−１３０１， ２００６］に記載されているが、大量生産に利用可能な細胞数の保証に関して問題が見出された。さらに、これらの方法には、増殖能を有する間葉系幹細胞の数が継代ごとに減少するという欠点がある。例えば、臍帯血由来間葉系幹細胞は増殖することができないが、９〜１０継代後に急速に老化し、この現象は、骨髄由来又は脂質由来間葉系幹細胞では５〜６継代後に見出される。したがって、従来の方法に比べてより高い簡便性及び経済的利益を伴う産業上の利用に十分な程度まで間葉系幹細胞数を増加させることができる新規の方法が求められている。

すなわち、本発明は、効率的に間葉系幹細胞を培養するための方法を提供することを目的とする。

本発明はまた、上記方法により調製された間葉系幹細胞であって、優れた増殖能及び免疫学的特性を示す間葉系幹細胞を提供することを目的とする。

本発明はさらに、間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を提供することを目的とする。

本発明の一態様において、間葉系幹細胞を培養するための方法であって、２〜５％酸素濃度の低酸素状態下、２．１〜３．８ｍＭの濃度のカルシウム及び１．０〜３．０ｍＭの濃度のマグネシウムを含有する培地で間葉系幹細胞を培養するステップを含む方法が提供される。

本発明の他の態様において、上記方法により調製された間葉系幹細胞であって、増殖能、生存率、回収率、及び免疫学的特性において改善されている間葉系幹細胞が提供される。

本発明のさらなる態様において、本発明の間葉系幹細胞を含む細胞治療剤が提供される。

本発明の培養方法は、増殖能及び生存率に関して間葉系幹細胞を改善することによって、少ない継代数でも間葉系幹細胞の数を増加させることができる。さらに、本発明の培養方法により調製された間葉系幹細胞は、免疫原性の欠如による安全な細胞治療剤としてだけでなく、サイトカインの良好な分泌による軟骨再生医療としても有効に使用される。

図１Ａ及び１Ｂ（ＦＩＧ．１Ａ及び１Ｂ）は、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）が、カルシウム濃度１．８〜９．３ｍＭのα−ＭＥＭで培養された後、７日目の播種細胞数に対する細胞数の倍率（上段）及び２１日目までの累積細胞数（下段）を示すグラフである。上段のグラフ中、Ｐ１〜Ｐ３は継代数を表す。 図１Ａ及び１Ｂ（ＦＩＧ．１Ａ及び１Ｂ）は、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）が、カルシウム濃度１．８〜９．３ｍＭのα−ＭＥＭで培養された後、７日目の播種細胞数に対する細胞数の倍率（上段）及び２１日目までの累積細胞数（下段）を示すグラフである。上段のグラフ中、Ｐ１〜Ｐ３は継代数を表す。 図２Ａ及び２Ｂ（ＦＩＧ．２Ａ及び２Ｂ）は、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）が１．８〜３．６ｍＭの総カルシウム濃度下で７日間（上段）及び１．８ｍＭ〜４．４ｍＭの総カルシウム濃度下で６日間（下段）培養された後の細胞数を示すグラフである。 図２Ａ及び２Ｂ（ＦＩＧ．２Ａ及び２Ｂ）は、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）が１．８〜３．６ｍＭの総カルシウム濃度下で７日間（上段）及び１．８ｍＭ〜４．４ｍＭの総カルシウム濃度下で６日間（下段）培養された後の細胞数を示すグラフである。 図３Ａ及び３Ｂ（ＦＩＧ．３Ａ及び３Ｂ）は、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）が種々の酸素状態（正常、３％、及び５％）下で培養された場合の倍加時間（上段）、及び臍帯血由来間葉系幹細胞が該酸素状態下で培養された後２１日目までの累積細胞数（下段）を示すグラフである。上段のグラフ中、Ｐ１〜Ｐ３は継代数を表す。 図３Ａ及び３Ｂ（ＦＩＧ．３Ａ及び３Ｂ）は、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）が種々の酸素状態（正常、３％、及び５％）下で培養された場合の倍加時間（上段）、及び臍帯血由来間葉系幹細胞が該酸素状態下で培養された後２１日目までの累積細胞数（下段）を示すグラフである。上段のグラフ中、Ｐ１〜Ｐ３は継代数を表す。 図４（ＦＩＧ．４）は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１）が典型的状態（対照）、増加カルシウム状態（Ｃａ^２＋）、低酸素状態、及びＣＭＨ状態で培養された後の倍加時間（上段）及び累積細胞数（下段）を示す。各グラフ中、Ｐ５〜Ｐ１２は継代数を表し、ＣＭＨ状態は、カルシウム及びマグネシウム添加状態と低酸素状態との組み合わせを意味する。 図５（ＦＩＧ．５）は、臍帯血由来間葉系幹細胞が典型的状態（対照）、カルシウム添加状態（Ｃａ^２＋）、低酸素状態、及びＣＭＨ状態で培養された後１日及び２日の時点の細胞生存率（上段グラフ）及び回収率（下段グラフ）を示す。 図６Ａ及び６Ｂ（ＦＩＧ．６Ａ及び６Ｂ）は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１〜＃４）が典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態で培養された後の倍加時間（上段）及び累積細胞数（下段）を示す。各グラフ中、Ｐ１〜Ｐ９は継代数を表す。 図６Ａ及び６Ｂ（ＦＩＧ．６Ａ及び６Ｂ）は、臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１〜＃４）が典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態で培養された後の倍加時間（上段）及び累積細胞数（下段）を示す。各グラフ中、Ｐ１〜Ｐ９は継代数を表す。 図７（ＦＩＧ．７）は、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）が典型的状態（対照）、カルシウム添加状態（Ｃａ^２＋）、低酸素状態、及びＣＭＨ状態で培養された後の、幹細胞性（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）マーカーＯｃｔ４及びｎａｎｏｇ並びに老化マーカーＰ１６のｍＲＮＡ発現レベルを示す。 図８（ＦＩＧ．８）は、典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態での継代後ＳＡ−β−ｇａｌで染色された臍帯血由来間葉系幹細胞の写真（上段）、並びに臍帯血由来間葉系幹細胞が典型的状態（対照）、カルシウム添加状態（Ｃａ^２＋）、低酸素状態、及びＣＭＨ状態で培養された後、β−ｇａｌ活性が培養状態に応じてプロットされたグラフ（下段）である。 図９Ａ及び９Ｂ（ＦＩＧ．９Ａ及び９Ｂ）は、典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態で培養された臍帯血由来間葉系幹細胞が軟骨及び骨に分化するように誘導された後の、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）の写真である。 図９Ａ及び９Ｂ（ＦＩＧ．９Ａ及び９Ｂ）は、典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態で培養された臍帯血由来間葉系幹細胞が軟骨及び骨に分化するように誘導された後の、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）の写真である。 図１０（ＦＩＧ．１０）は、典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態で培養された異なる２種の臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）が応答細胞（Ａ）を刺激するかどうかを示すグラフ（Ａ、Ｂ、及びＨは、それぞれ応答細胞、刺激細胞、及びＰＨＡを表す。）である。 図１１（ＦＩＧ．１１）は、図１０の状態で培養された臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）から放出されたＰＧＥ_２（プロスタグランジンＥ_２）のレベルを示すグラフである。 図１２（ＦＩＧ．１２）は、典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態で２４時間培養された異なる４種の臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１〜＃４）から放出されたＴｓｐ−２のレベルを示すグラフである。

発明の詳細な説明

好ましい実施形態において、本発明は、間葉系幹細胞を培養するための方法であって、２〜５％酸素の低酸素状態下、２．１〜３．８ｍＭの濃度のカルシウム及び１．０〜３．０ｍＭの濃度のマグネシウムを含有する培地で間葉系幹細胞を培養するステップを含む方法を提供する。

本発明の培養方法は種々の起源の間葉系幹細胞に適用され得る。本発明において有用な間葉系幹細胞の例には、臍帯血、骨髄、脂質、筋肉、皮膚、羊水、臍帯、又は歯に由来する間葉系幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい一実施形態において、本発明の培養方法は臍帯血由来間葉系幹細胞に適用される。

さらに、本発明の培養方法が適用され得る間葉系幹細胞は種々の対象に由来し得る。例えば、本発明において有用な間葉系幹細胞はヒトを含む哺乳動物から得られるが、これに限定されない。本発明の好ましい一実施形態ではヒト起源の間葉系幹細胞が使用される。

本発明の培養方法は、２．１〜３．８ｍＭの濃度のカルシウム及び１．０〜３．０ｍＭの濃度のマグネシウムを含有する培地の使用により主に特徴付けられる。培地は、カルシウム及びマグネシウムの濃度を調整することによって幹細胞用の典型的な培地から調製され得る。典型的な培地の例には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、マッコイ５Ａ培地、イーグル基礎培地、ＣＭＲＬ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）培地、グラスゴー最小必須培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培地、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地、１９９培地、及びハンクス１９９培地が含まれるが、これらに限定されない。

任意選択で、培地は血清を含有してもしなくてもよい。さらに、血清代替物が血清の代わりに培地において使用されてもよい。

本発明の一実施形態において、培地は５〜３０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する。他の実施形態において培地は血清代替物を含有する。市販製品に加えて、ヒト血清又はヒト血小板溶解物中の種々の増殖因子（ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＩＧＦ、及びそのようなタンパク質ファミリーのサイトカインが含まれる）が血清代替物として使用され得る。

本発明の培養方法において、カルシウムは、間葉系幹細胞の増殖を促し、免疫原性を抑制し、サイトカイン分泌を刺激する働きをする。これに関して、カルシウムは、培地中２．１〜３．８ｍＭの濃度、好ましくは３．３〜３．８ｍＭの濃度、より好ましくは約３．６ｍＭの濃度で使用され得る。例えば、α−ＭＥＭが培地として採用される場合、培地が既に１．８ｍＭのカルシウムを含有していることから、カルシウムは、０．３〜２．０ｍＭの濃度、好ましくは１．５〜２．０ｍＭの濃度、より好ましくは約１．８ｍＭの濃度で添加され得る。同様に、本発明の培養方法の実施に必要な所望の濃度を得るために添加されるカルシウム濃度は、典型的な培地の中から採用された培地自体のカルシウム濃度を考慮して容易に計算することができる。

本発明の培地において、マグネシウムはカルシウムの沈殿を防ぐのに使用される。マグネシウムは、培地中１．０〜３．０ｍＭの濃度、及び好ましくは約１．８ｍＭの濃度で使用され得る。例えば、マグネシウムが培地中１．０ｍＭ未満の濃度で存在する場合、カルシウムは沈殿する傾向にある。他方、培地中３．０ｍＭより高いマグネシウム濃度は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成をブロックし、培養皿の底への細胞の付着を妨げ、その結果、細胞をずり応力に影響されやすくさせ、細胞内石灰化を増加させる可能性がある。例えば、α−ＭＥＭが培地として採用される場合、培地が既に０．８ｍＭマグネシウムを含有していることから、マグネシウムは、０．２〜２．２ｍＭの濃度、及び好ましくは１．０ｍＭの濃度で添加され得る。同様に、本発明の培養方法の実施に必要な所望の濃度を得るために添加されるマグネシウム濃度は、典型的な培地の中から採用された培地自体のマグネシウム濃度を考慮して容易に計算することができる。

したがって、本発明の好ましい実施形態による培地は、５〜３０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．３〜２．０ｍＭのカルシウム、及び０．２〜２．２ｍＭのマグネシウムが添加され、その結果、カルシウム及びマグネシウムがそれぞれ合計２．１〜３．８ｍＭ及び１．０〜３．０ｍＭに達するα−ＭＥＭをベースとするものであり得る。

さらに、本発明の培養方法の他の特徴は、間葉系幹細胞のための低酸素培養状態である。酸素正常状態に比べて低酸素状態は、間葉系幹細胞の増殖を促し、免疫原性を抑制し、サイトカイン分泌を刺激する。これに関連して、低酸素状態は２〜５％の酸素含量を有する空気である。２％より低い又は５％を超える酸素濃度に関する問題は、間葉系幹細胞の増殖の著しい減少である。本発明の好ましい一実施形態において、間葉系幹細胞は約３％酸素の雰囲気で培養される。低酸素状態は、細胞インキュベーターの酸素濃度を調整することによって実現され得る。例えば、インキュベーターを窒素（１００％）又は窒素／二酸化炭素（９５％／５％）でパージして酸素正常状態の雰囲気を低酸素雰囲気に調整し得る。インキュベーター中の酸素濃度は、インキュベーターに取り付けられた酸素センサーによりモニターされ得る。

本発明の上述の状態を除き、間葉系幹細胞は従来の方法で培養され得る。例えば、間葉系幹細胞は、３次元バイオリアクター若しくはスピナー又は典型的な付着性培養容器で培養され得る。

カルシウム及びマグネシウムの濃度に関する第１の特徴が低酸素状態に関する第２の特徴と組み合わされると、相乗効果を得ることができる。すなわち、カルシウム及びマグネシウムの濃度と低酸素状態との組み合わせは、個別の状態に比べて、間葉系幹細胞をより効率的に増殖させ、免疫原性の抑制及びサイトカイン分泌の刺激におけるより高い改善を可能にする。例えば、組み合わされた状態下、間葉系幹細胞は、個別の状態に比べてさらに１．５〜５倍増殖し、免疫原性は１〜３倍減少し、サイトカイン分泌は１．５〜３倍増加する。本発明の培養方法に関する組み合わされた状態は「ＣＭＨ状態」（カルシウム＋マグネシウム＋低酸素状態）と呼ばれる。

本発明の培養方法は間葉系幹細胞の継代に適用され得る。すなわち、本発明の培養方法を用いて培養された間葉系幹細胞は同じ方法で継代培養することができる。間葉系幹細胞をより効率的に増殖させることによって、本発明の培養方法は、より少ない継代が行われてもより多数の間葉系幹細胞を生産するという利点を有する。例えば、各継代で同じ数の細胞が播種され、均一な期間培養された５継代後、本発明の培養方法は、従来の方法より数に関して１００〜１０００倍多い間葉系幹細胞を生産することが見出された。

さらに、本発明の培養方法により増殖された間葉系幹細胞は、非免疫原性で免疫応答を引き起こさないだけでなく、ヒトに対する細胞治療剤又は軟骨再生剤として有効に使用することもできる。

したがって、本発明の他の態様において企図されるのは、上記培養方法を用いて調製された間葉系幹細胞であって、増殖能、生存率、回収率、及び免疫学的特性において改善されている間葉系幹細胞である。免疫学的特性における改善には、非免疫原性、免疫を抑制する免疫抑制因子（例えばＰＧＥ２）の放出、及び有用なサイトカイン（例えばＴｓｐ−２）の放出の増加が含まれる。

さらなる好ましい実施形態において、本発明は、間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を提供する。本発明の細胞治療剤は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島ベータ細胞、血管細胞、又は肺細胞の再生又は保護に適用される。さらに、本発明の細胞治療剤は、肺疾患の治療、肺疾患誘発性炎症の抑制若しくは治療、肺組織の再生、及び肺線維症の抑制からなる群から選択されるものに有用である。特に、該治療剤は、肺疾患誘発性炎症及び線維症を抑制又は改善するのに使用することができる。さらに、本発明の細胞治療剤は心血管疾患の治療又は軟骨の再生に適用することができる。さらに、本発明の細胞治療剤は、免疫応答、免疫細胞透過、又は免疫原性を減少させ、免疫調節機能を改善し、また、炎症反応を抑制することができる。また、本発明の細胞治療剤は自己免疫疾患又は移植片対宿主病の治療にも適用される。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。

本発明における使用のために、ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞がＭｅｄｉｐｏｓｔ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｋｏｒｅａから入手された。細胞は、以下に例示されるように、臍帯血を採取し、臍帯血から間葉系幹細胞を単離し、間葉系幹細胞を培養することによって調製され得る。

臍帯血は、通常の自然経膣分娩後、胎盤が子宮内に残っている間に、又は帝王切開後、胎盤が子宮から排出された時点で、子宮から排出される臍静脈から採取され得る。

新生児の出生後、子宮から排出され及び新生児を胎盤につなげている臍静脈は、臍帯血が臍静脈から採取される前に無菌的に処理されなければならない。

臍帯血は、抗凝固剤を含有するバッグに臍静脈からシリンジを通じて回収される。

臍帯血から間葉系幹細胞を単離し、該細胞を培養する方法は、韓国特許第１０−０４９４２６５号、及び多くの報告（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ ＭＦ， Ｍａｃｋａｙ ＡＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８４： １４３−７， １９９９； Ｌａｚａｒｕｓ ＨＭ， Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ ＳＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， １６： ５５７−６４， １９９５）に開示されている。これらの１つが以下で簡単に説明される。

単球は、採取した臍帯血を遠心分離して分離し、数回洗浄して不純物を除去する。次いで、単球を適切な密度で培養容器に播種し、増殖させ、単一の層を形成させる。間葉系幹細胞は形態学的に均一であり、位相差顕微鏡下で観察される紡錘形の細胞を含むコロニーを形成しながら増殖する。次いで、必要な細胞数が得られるまで、細胞をコンフルエンスでの継代により培養する。

実施例１（カルシウム濃度による臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能）：
カルシウム濃度による増殖能を調べるために、臍帯血由来間葉系幹細胞を種々の濃度のカルシウムの存在下で培養した。

異なる母親のインフォームドコンセントを得て分娩後に回収し、凍結状態で保存した臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）を解凍し、インキュベーター（低酸素／ＣＯ_２インキュベーター，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃３１３１）中５％ＣＯ_２条件下、１０％ＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＳＡ）において３７℃で培養した。細胞を８０〜９０％コンフルエンシーに増殖させた時、細胞をトリプシンによる処理により単一の細胞に分離した。α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳを添加した；１．８ｍＭカルシウム及び０．８ｍＭマグネシウムを含有）に、種々の濃度（０ｍＭ、１．５ｍＭ、３ｍＭ、４．５ｍＭ、６ｍＭ、及び７．５ｍＭ）のカルシウムを、培地のカルシウム濃度が１．８ｍＭ、３．３ｍＭ、４．８ｍＭ、６．３ｍＭ、７．８ｍＭ、及び９．３ｍＭに調整されるように添加した。間葉系幹細胞を５０００細胞／ｃｍ^２の密度で培地に播種した。カルシウム誘発沈殿を防ぐために、マグネシウムを１ｍＭの濃度で各培地（総マグネシウム濃度１．８ｍＭを含有）に添加した。細胞を、８０〜９０％コンフルエンシーでの継代により２１％（ｖ／ｖ）酸素状態（酸素正常状態）で培養した。細胞を、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ Ｔ４細胞カウンター（Ｎｅｘｅｌｃｏｍ， Ｌａｗｒｅｎｃｅ， ＭＡ， ＵＳＡ）を用いて継代ごとにカウントした。結果を図１Ａ及び１Ｂに示す。図１Ａ及び１Ｂは、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）を、０〜７．５ｍＭの種々の濃度でカルシウムをさらに添加したα−ＭＥＭで培養した後、７日目の播種細胞数に対する細胞数の倍率（上段）及び２１日目までの累積細胞数（下段）を示すグラフである。

図１Ａ及び１Ｂに見られるように、細胞の増殖能は、カルシウムを１．５ｍＭの濃度（総カルシウム濃度３．３ｍＭ）でさらに添加した時にピークに達し、継代にわたって同じパターンで同様に観察された。３ｍＭ以上のカルシウム（培地中４．８ｍＭ以上の総カルシウム濃度）を添加すると、増殖能は徐々に低下した。

最適カルシウム濃度を決定するために、カルシウムをさらに細分化した濃度で最大値３ｍＭまで添加した。結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。図２Ａ及び２Ｂは、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）を１．８ｍＭ、２．１ｍＭ、２．４ｍＭ、２．７ｍＭ、３．０ｍＭ、３．３ｍＭ、及び３．６ｍＭの総カルシウム濃度下で７日間（上段）並びに１．８ｍＭ、３．４ｍＭ、３．６ｍＭ、３．８ｍＭ、４．０ｍＭ、４．２ｍＭ、及び４．４ｍＭの総カルシウム濃度下で６日間（下段）培養した後の細胞数を示すグラフである。

グラフに見られるように、増殖能は０〜１．８ｍＭの範囲の添加カルシウム濃度（培地中１．８〜３．６ｍＭの総濃度）にわたって増加し、次いで添加カルシウム濃度が１．８ｍＭ（培地中３．６ｍＭの総カルシウム濃度）を超えた時、減少し始めた。これらの結果から、間葉系幹細胞の最大増殖を可能にする最適カルシウム濃度は培地中３．６ｍＭであることが理解される。したがって、間葉系幹細胞が、好ましくは２．１〜４．３ｍＭの濃度、より好ましくは３．３〜３．８ｍＭの濃度のカルシウムを含有する典型的な培地で培養されることが増殖能に関して有利である。

実施例２（酸素濃度による臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能）：
酸素濃度による増殖能を調べるために、臍帯血由来間葉系幹細胞を種々の濃度の酸素の存在下で培養した。

具体的には、カルシウム又はマグネシウムのいずれも１０％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭにさらに添加しないことを除いて、臍帯血由来間葉系幹細胞を３％若しくは５％酸素下又は酸素正常状態（空気中酸素レベル２１％）状態下、実施例１と同様にして培養した。結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。図３Ａ及び３Ｂは、異なる２種の供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）を、１、２及び３回の継代後、種々の酸素状態（正常、３％、及び５％）下で培養した場合に、細胞の数が二倍になるのに要した時間（上段）、並びに臍帯血由来間葉系幹細胞を該酸素状態下で培養した後２１日目までの累積細胞数（下段）を示すグラフである。

これらのグラフに見られるように、増殖能はバッチ間で差があったが、酸素正常状態より低酸素状態下で高いことが測定された。特に、増殖能は酸素レベル３％でピークに達した。これは、多数回の継代で培養した細胞について同じパターンで観察された。さらに、最大値５％までさらに画分した酸素状態下で細胞を増殖能について調べた。酸素レベル２〜５％が好ましかった（データは示さず）。

実施例３（カルシウム（マグネシウムを含む。）と酸素状態との組み合わせによる臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能）：
カルシウム（マグネシウムを含む。）と酸素濃度状態との組み合わせによる、臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖能の試験を行った。細胞を典型的状態（対照）、外添したカルシウム（マグネシウムを含む。）の存在下、低酸素状態、及び外添したカルシウム（マグネシウムを含む）／低酸素状態（以下「ＣＭＨ」と呼ぶ。）で培養した。これに関して、培地は、カルシウム及びマグネシウムをそれぞれ３．６及び１．８Ｍの総濃度で含有した（１．８ｍＭカルシウム及び１ｍＭマグネシウムを追加的に添加）。低酸素状態は酸素レベル３％に設定した。細胞を実施例１に類似の方法で培養した。典型的状態での５継代（Ｐ５）後、間葉系幹細胞を、継代間７日の一定の間隔でＣＭＨ状態下７回の継代（Ｐ１２）により培養した。

結果を図４に示す。図４は、上記状態下での継代後の細胞の倍加時間（日）（上段）及び累積細胞数（下段）を示している。

図４のデータから理解されるように、細胞をＣＭＨ状態で培養した場合、低酸素状態又はカルシウム添加状態に比べて細胞の増殖能は有意に増加した。この効果は、多数回の継代にわたって同じパターンで観察された。種々の細胞バッチでの実験は、いくらか差があったものの類似の結果を示した。したがって、これらの結果は、本発明のＣＭＨ状態が臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖に極めて有効であることを示すものである。

実施例４（培養状態に応じた臍帯血由来間葉系幹細胞の生存率及び回収率）：
臍帯血由来間葉系幹細胞の生存率及び回収率に対する本発明のＣＭＨ状態の影響の試験を行った。このために、臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１）を典型的状態（対照）、低酸素状態（３％）、増加カルシウム状態（１．８ｍＭ；培地中３．６ｍＭの総カルシウムレベル）、及びＣＭＨ状態（３％Ｏ_２＋１．８ｍＭ添加カルシウム＋１ｍＭ添加マグネシウム）で培養し、培養容器から剥離し、基礎培地（α−ＭＥＭ）で３回洗浄し、基礎培地（α−ＭＥＭ）に懸濁した。室温で維持しながら、細胞懸濁液を生存率及び回収率について経時的に調べた。細胞生存率は、回収して基礎培地に懸濁した細胞をトリパンブルーで染色し、所定容量（１０〜２０μＬ）の懸濁液中の青く染色された生細胞を含む全細胞を、血球計算盤を用いてカウントした後、死細胞に対する生細胞の割合（％）として表した。回収率は、培養前に対する培養後の生細胞数の割合（％）として表した。

結果を図５に示す。図５は、臍帯血由来間葉系幹細胞を上記状態で培養した後１日及び２日の時点の細胞生存率（上段グラフ）及び回収率（下段グラフ）を示す。

図５に見られるように、細胞は、典型的状態より低酸素状態又は増加カルシウム状態で培養した場合に高い生存率及び回収率を示し、ＣＭＨ状態で培養した場合にさらに高い生存率及び回収率を示すことが観察された。いくらか差はあったものの、同様の結果が、異なる供給源に由来する臍帯血由来間葉系幹細胞で得られた。これらのデータは、臍帯血由来間葉系幹細胞の生存率を上昇させてより多数の細胞を回収する上で、ＣＭＨ状態が典型的状態又は個別の状態より有利であることを示している。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１〜＃４）を典型的状態及びＣＭＨ状態で継代により培養し、増殖能について調べた。結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。図６Ａ及び６Ｂは倍加時間（上段）及び累積細胞数（下段）を示す。

グラフに見られるように、ＣＭＨ状態は、対照に比べて、多数回の継代にわたって倍加時間（細胞増殖の指標）を有意に減少させた。さらに、累積増殖曲線のデータから明らかなように、同じ供給源に由来していてもはるかに多数の間葉系幹細胞がＣＭＨ状態で得られた。いくらか差はあったものの、同様の結果が、異なる臍帯血由来間葉系幹細胞を用いた実験から得られた。これらのデータは、ＣＭＨ状態がより効率よく増殖するように間葉系幹細胞を誘導することを示している。特に、ＣＭＨ状態を臍帯血由来間葉系幹細胞の最初の継代に適用した場合、さらに多数の間葉系幹細胞が生産された。

実施例５（培養状態に応じた臍帯血由来間葉系幹細胞の幹細胞性及び老化に関するアッセイ）：
なぜＣＭＨ状態が臍帯血由来間葉系幹細胞の増殖を改善するのかを調べるために、幹細胞の増殖に関連する該細胞の幹細胞性及び老化をアッセイした。

このために、臍帯血由来間葉系幹細胞を典型的状態及びＣＭＨ状態で実施例３のように培養した。細胞が８０〜９０％コンフルエンシーに達した時点で、細胞をトリプシンで剥離した。遠心分離による培地の除去後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離により回収した。この手順を２回繰り返して、細胞から培地を完全に除去した。その後、製造者のプロトコールに従ってＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離した。ＲＮＡは、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下でｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、幹細胞性マーカーＯｃｔ４及びｎａｎｏｇ、老化マーカーＰ１６、並びにＧＡＤＰＨに特異的なプライマーを用いてｃＤＮＡに対して実施した。ＰＣＲは９５℃，１０分間の変性で開始し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ機器（Ｒｏｃｈｅ）において、９５℃，１０秒間；６２℃，３０秒間；及び７２℃，１０秒間の３０サイクルで行った。

表１：
ＲＴ−ＰＣＲのプライマー：

典型的状態及びＣＭＨ状態で培養した細胞における各マーカーのＲＮＡの発現レベルを比較する前に、ＲＴ−ＰＣＲにより得られたＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨのＲＮＡのレベルに対して標準化した（相対分析，ｄｄＣＴ法）。

結果を図７に示す。図７は、異なる２種の臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）のｍＲＮＡ発現レベルを示す。

図７に見られるように、幹細胞性マーカーＯｃｔ４及びｎａｎｏｇの発現レベルは、典型的状態（対照）及び個別の状態よりＣＭＨ状態で培養した臍帯血由来間葉系幹細胞で高かった。老化マーカーＰ１６は、Ｏｃｔ４の発現パターンと逆の発現パターンを示した。これらの結果は、ＣＭＨ状態が老化を抑制しながら間葉系幹細胞の幹細胞性を維持し、その結果、増殖能を改善することを示している。

間葉系幹細胞の老化を抑制するＣＭＨ状態の能力を確認するために以下の実験を実施した。臍帯血由来間葉系幹細胞を、７〜８継代で、実施例３のように典型的状態及びＣＭＨ状態で培養した。培地の除去後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、室温で３〜５分間、１ｍＬの１×固定液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とインキュベートした。固定液を細胞から除去し、次いで細胞を２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を３７℃インキュベーターでβ−ガラクトシダーゼに対する１ｍＬの色素溶液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と２〜２４時間インキュベートした。色素溶液の除去後、細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、得られた染色老化細胞を倒立顕微鏡ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｕ（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏ．， Ｋａｎａｇａｗａ， Ｊａｐａｎ）下でカウントした。

結果を図８に示す。図８は、ＳＡ−β−ｇａｌで染色後の細胞の顕微鏡写真（上段）、及びＳＡ−β−ｇａｌ活性のグラフを示す（下段）。ＳＡ−β−ｇａｌ活性は、４０〜１００倍の倍率で撮影された写真上でカウントした全細胞に対する染色細胞の比を計算して決定した。

図８から明らかなように、間葉系幹細胞における老化の進行は、カルシウム添加状態又は低酸素状態よりＣＭＨ状態でさらに遅延し、典型的状態よりはるかに遅延した。

上記データは、本発明のＣＭＨ状態が、典型的状態又は個別の状態より効率的に幹細胞性を維持し、老化を抑制し、これにより間葉系幹細胞が高効率で増殖できることを実証するものである。

実施例６（培養状態に応じた臍帯血由来間葉系幹細胞の分化能及びマーカー発現）：
臍帯血由来間葉系幹細胞の特性に対するＣＭＨ状態の影響の試験を行った。この目的のために、間葉系幹細胞を、軟骨形成誘導及び骨形成誘導による分化能及びマーカー発現についてアッセイした。

異なる２種の供給源から得られた臍帯血由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ ＃１及び＃２）を実施例３のように典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態で培養した後、軟骨及び骨に分化するように該細胞を下記のように誘導した。次いで、染色法を用いて軟骨及び骨への分化を評価した。

軟骨形成誘導：
軟骨形成誘導における使用のために、細胞を２〜２．５×１０^５細胞の集団で１５ｍＬコニカルチューブに入れ、遠心分離して細胞ペレットを得た。細胞ペレットをＤ−ＰＢＳで洗浄し、２００〜２５０μｌの分化培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ， ｃａｔ＃．１１９９５）、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ−３（Ｓｉｇｍａ， ｃａｔ＃．Ｔ５４２５， ２μｇ）、５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−６（Ｒ＆Ｄ， ｃａｔ＃．５０７−ＢＰ， ２０μｇ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ， ｃａｔ＃．Ａ８９６０）、５０ｍｇ／ｍｌ（１：１００）ＩＴＳ（商標）＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＢＤ， ｃａｔ＃．３５４３５２）、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン（Ｓｉｇｍａ， ｃａｔ＃．Ｐ５６０７）、１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ， ｃａｔ＃．Ｐ８５７４）、１００ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ， ｃａｔ＃．Ｄ２９１５）］に懸濁し、細胞懸濁液をチューブに等分した。これらのチューブを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その後、細胞を３７℃のＣＯ_２インキュベーターにおいて、チューブを僅かに開いた状態で４週間培養して軟骨への分化を誘導した。分化培地は週に２回、新鮮なものと半分のみ取り替えた。

軟骨染色プロトコール：
軟骨形成誘導後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中、室温で０．５〜１時間固定した。その後、細胞を蒸留水で２回又は３回洗浄し、凍結切片法を用いて切片（４〜５μｍ厚）に調製した。切片を９５％エタノールに３〜５分間浸漬させ、水で２回洗浄した。０．１％サフラニンＯで７分間染色した後、細胞を７０％エタノールで２回、７０％エタノールで１回、９５％エタノールで２回、９５％エタノールで１回、及び１００％エタノールで２回洗浄し、キシレン基質溶液に３分間浸漬し、乾燥させた。その後、染色細胞を脂溶性封入溶液で覆い、観察した。軟骨形成誘導を、色（紫）、分化したペレットのサイズ、及び形成された小腔構造を比較して評価した。

骨形成誘導：
骨形成誘導における使用のために、細胞を密度５００〜１０００細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種し、２〜４日後、培地を骨形成誘導培地（１Ｌのα−ＭＥＭ中、β−グリセロールリン酸 ２．１６０４ｇ、Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスフェート ０．０１２８０５ｇ、デキサメタゾン／ＵＶＡＢ ０．６ｍｇ、ゲンタマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ） ５ｍｌ、及びＦＢＳ １００ｍｌ）と取り替えた。細胞を、３日ごとに新鮮なものと取り替えた分化培地を用いて２〜３週間培養した。軟骨形成誘導をＡＬＰ染色法により評価した。

骨染色プロトコール：
分化細胞をＰＢＳで２回洗浄し、固定液（４０％アセトン）で３０〜４５秒間インキュベートした。分化細胞を蒸留水で２回又は３回再び洗浄し、暗所でアルカリ染色溶液（ファストバイオレットＢ塩）と３０分間インキュベートした。次いで、細胞を蒸留水で２回洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液により１０〜２０秒間処理した。染色溶液の除去後、細胞を水道水で洗浄し、乾燥させ、脂溶性封入溶液で覆い、観察した。骨芽細胞は細胞内アルカリホスファターゼの活性化により暗褐色に染色されるため、軟骨形成誘導を染色の程度により評価した。

結果を図９Ａ及び９Ｂに示す。図９Ａ及び９Ｂに見られるように、軟骨形成誘導及び骨形成誘導に関して、典型的状態及びＣＭＨ状態で培養した間葉系幹細胞の間に有意な差はなかった。

他方、本発明の方法により培養された臍帯血由来間葉系幹細胞の細胞表面抗原の免疫表現型を調べた。これに関連して、ＦＡＣＳを用いて表面マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ７３、ＣＤ４５、及びＣＤ１０５）の発現を分析した。

典型的状態及びＣＭＨ状態で培養した臍帯血由来間葉系幹細胞をトリプシン処理し、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、造血細胞関連抗原ＣＤ３４及びＣＤ４５（両方ともＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）とコンジュゲート）、免疫調節関連抗原ＣＤ７３（ＰＥ（フィコエリトリン）とコンジュゲート）、並びに血管新生関連抗原ＣＤ１０５（ＰＥとコンジュゲート）と反応させた。その後、細胞を、ウエスタンブロッティングに類似の方法で二次抗体（ＩｇＧ−ＦＩＴＣ； Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ， ＵＳＡ）によりさらにマークし、その後、マーカーを発現する細胞対全細胞の比に対するＦＡＣＳを用いて二次抗体のシグナルを検出した。反応後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）、及びソフトウェアＣＥＬＬＱＵＥＳＴを用いてシグナルを分析した。

結果を下記表２にまとめる。
表２：

表２のデータから理解されるように、ＣＭＨ状態で培養した細胞と典型的状態で培養した細胞との間にマーカータンパク質の発現における有意な差はなかった。

上記データは、本発明のＣＭＨ状態が臍帯血由来間葉系幹細胞の基本的な特性に対し、有意な影響を与えないことを実証するものである。

実施例７（培養状態に応じた臍帯血由来間葉系幹細胞の免疫原性及び免疫抑制の比較）：
培養状態に応じた臍帯血由来間葉系幹細胞の免疫学的特性を、次のように混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いて評価した。

陰性対照として、典型的状態及びＣＭＨ状態で１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）の存在下培養した臍帯血由来間葉系幹細胞を２×１０^４細胞／ウェルの密度で、応答細胞（末梢血単球（「Ａ」と表す）；ＡＬＬＣＥＬＬＳ， Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）を１×１０^５細胞／ウェルの密度で、並びに刺激細胞（非関連末梢血単球（「Ｂ」と表す）；ＡＬＬＣＥＬＬＳ， Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）を１×１０^５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに別々に播種した。陽性対照（１）として、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡ−Ｌ（「Ｈ」と表す；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理した末梢血単球を１×１０^５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに添加した。陽性対照（２）として、応答細胞及び刺激細胞の各々を１×１０^５細胞／ウェルの密度で添加した。試験群では、間葉系幹細胞、末梢血単球、ＰＨＡ−Ｌ刺激末梢血単球、又は応答細胞と刺激細胞との組み合わせ（各単球は１×１０^５細胞の密度で使用）と５日間インキュベートし、応答細胞の増殖及びコロニー形成を顕微鏡下で観察した。インキュベーション後５日目に、細胞をＢｒｄＵ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）で処理し、直前２４時間に応答細胞において新たに合成されたＤＮＡのレベルを、ＶＥＲＳＡｍａｘ（商標）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）で３７０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。

結果を図１０に示す。図１０に見られるように、増殖はＰＨＡ−Ｌ（Ｈ）刺激非関連末梢血単球（Ａ＋Ｈ）において誘導されたのに対し、臍帯血由来間葉系幹細胞は応答細胞を刺激せず、その結果、細胞増殖の誘導をもたらさなかった（ｈＵＣＢ−ＭＳＣ＋Ａ）。特に、臍帯血由来間葉系幹細胞は、典型的状態よりＣＭＨ状態で培養した場合、応答細胞の増殖に対する大きな阻害効果を与えることが観察された。これらのデータは、ＣＭＨで培養した臍帯血由来間葉系幹細胞が、典型的状態で培養した臍帯血由来間葉系幹細胞より免疫原性を有しにくいことを示している。

応答細胞（Ａ）と刺激細胞（Ｂ）との反応、すなわち（Ａ＋Ｂ）、又はＰＨＡ−Ｌによる応答細胞（Ａ）の人工的刺激、すなわち（Ａ＋Ｈ）によって免疫応答が誘導される状況に適用した場合、ＣＭＨ状態で培養した臍帯血由来間葉系幹細胞は、典型的状態で培養した臍帯血由来間葉系幹細胞より応答末梢血単球の増殖を大幅に抑制することが観察された。類似の結果は、異なる供給源から得られた臍帯血由来間葉系幹細胞で得られたが、いくらか（但し僅かな）差があった。これらのデータは、ＣＭＨ培養状態が、免疫原性の抑制に関して典型的状態より有利であることを実証するものである。

間葉系幹細胞を上記と同様にして反応させた後、該細胞から放出される免疫抑制因子のＰＧＥ_２（プロスタグランジンＥ_２）を、製造者のプロトコールに従ってＰＧＥ２ ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｙｍａｎ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ， ＵＳＡ）を用いて分析した。ＭＬＲ由来の培養物を検体として使用した。

ＥＬＩＳＡアッセイに必要な標準物質は、最大密度１０００ｐｇ／ｍＬを有し、該最大値から連続的に半希釈されて最小密度７．８ｐｇ／ｍＬを有するように調製した。標準物質及び試験群の培養上清の各々を、５０μｌの量でＰＧＥ_２捕捉抗体コートプレートの各ウェルに添加した。次いで、５０μｌのＰＧＥ_２ ＡｃｈＥトレーサー及び５０μｌの一次抗体を各ウェルに添加し、その後、４℃で１８時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、２００μｌのエルマン試薬（キットに含まれる。）を各ウェルに添加し、その後、１ウェル当たり５μｌのトレーサーを添加した。プレートを暗条件下で６０〜９０分間インキュベートし、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。

結果を図１１に示す。図１１に見られるように、臍帯血由来間葉系幹細胞はＣＭＨ状態で培養した場合、典型的状態より約３．７倍多い量でＰＧＥ_２を放出することが観察された。類似の結果は、異なる臍帯血由来間葉系幹細胞で得られた。これらのデータは、ＣＨＭ状態で培養した臍帯血由来間葉系幹細胞が、典型的状態で培養した臍帯血由来間葉系幹細胞より免疫抑制性であったことを実証するものである。

実施例８（培養状態に応じた臍帯血由来間葉系幹細胞のサイトカイン放出能力に関するインビトロアッセイ）：
臍帯血由来間葉系幹細胞のサイトカイン放出能力に対する培養状態の影響を、臍帯血由来間葉系幹細胞が軟骨細胞に分化する間に放出されるＴｓｐ−２を測定することによってアッセイした。

臍帯血由来間葉系幹細胞を、実施例３と同様にして典型的状態（対照）及びＣＭＨ状態で培養した。８０〜９０％コンフルエンシーに達した時点で、細胞をトリプシン処理により剥離した。遠心分離後、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン、０．６μｇ／ｍｌデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、及び１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウムを含有する高グルコースＤＭＥＭで細胞ペレットを洗浄して、細胞からＦＢＳを完全に除去した。遠心分離により再び得た臍帯血由来間葉系幹細胞ペレットを２．０×１０^５細胞／４００μｌの密度で懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに４００μｌのアリコートで入れた。５５０×ｇで５分間遠心分離した後、チューブに極めてゆるく栓をした。チューブを、ラックに立てて置きながら２４時間インキュベートした。ペレットが形成されたら、上清を回収し、Ｔｓｐ−２アッセイキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ）を用いてＴｓｐ−２のレベルについて分析した。

結果を図１２に示す。Ｔｓｐ−２は、軟骨再生剤としての使用のための臍帯血由来間葉系幹細胞の力価を説明する因子である。より高いレベルのＴｓｐ−２を放出する細胞は、軟骨をより効率的に再生するものと評価された。図１２のデータから明らかなように、異なる４種の臍帯血由来間葉系幹細胞のすべてがＣＭＨ状態において典型的状態より高いレベルのＴｓｐ−２を放出した。

上記データは、ＣＭＨ状態で培養した臍帯血由来間葉系幹細胞が軟骨細胞に分化する優れた可能性を有し、それ故、軟骨再生剤として有用であることを示すものである。

Claims (13)

1. 間葉系幹細胞を培養するための方法であって、２〜５％酸素の低酸素状態下、２．１〜３．８ｍＭの濃度のカルシウム及び１．０〜３．０ｍＭの濃度のマグネシウムを含有する培地で間葉系幹細胞を培養するステップを含む方法。
2. 間葉系幹細胞は臍帯血、骨髄、脂質、筋肉、皮膚、羊水、臍帯、又は歯に由来する、請求項１に記載の方法。
3. 培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、α−ＭＥＭ、マッコイ５Ａ培地、イーグル基礎培地、ＣＭＲＬ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）培地、グラスゴーＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５ 培地、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地、１９９培地、及びハンクス１９９培地からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 培地は５〜３０％のウシ胎児血清を含む、請求項３に記載の方法。
5. 培地はウシ胎児血清を含まず、血清代替物を含む、請求項３に記載の方法。
6. 培地は、５〜３０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．３〜２．０ｍＭのカルシウム、及び０．２〜２．２ｍＭのマグネシウムが添加されたα−ＭＥＭをベースとするものである、請求項１に記載の方法。
7. 間葉系幹細胞は請求項１と同じ状態で継代培養される、請求項１に記載の方法。
8. 請求項１に記載の方法を用いて調製された間葉系幹細胞であって、増殖能、生存率、回収率、及び免疫学的特性において改善されている間葉系幹細胞。
9. 請求項８に記載の間葉系幹細胞を含む細胞治療剤。
10. 脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島ベータ細胞、血管細胞、又は肺細胞の再生又は保護に適用される、請求項９に記載の細胞治療剤。
11. 肺疾患の治療、肺疾患誘発性炎症の抑制若しくは治療、肺組織の再生、及び肺線維症の抑制からなる群から選択されるものに有用である、請求項９に記載の細胞治療剤。
12. 軟骨の再生に適用される、請求項９に記載の細胞治療剤。
13. 自己免疫疾患又は移植片対宿主病の治療に適用される、請求項９に記載の細胞治療剤。

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