KR101920277B1 - 뇌졸중 증상을 치료하는 방법 - Google Patents

뇌졸중 증상을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 뇌졸중을 앓았던 대상에서 뇌 기능 개선 또는 뇌 기능 상실의 방지 및/또는 운동 장애의 치료 또는 예방 및/또는 뇌 뉴런 재생을 위한 방법들을 제공하며, 이 방법은 이 대상에게 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 투여하는 것을 포함한다.

Description

뇌졸중 증상을 치료하는 방법{Method of treating the effects of stroke}
관련된 출원 데이터
본 출원은 2012년 6월 3일자로 제출된 "뇌졸중 증상을 치료하는 방법"제목의 미국 가출원 번호 61/493,057를 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
서열 목록
본 출원은 전자 양식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록의 전체 내용이 참고자료에 편입된다.
분야
본 개시내용은 대상에게서 뇌졸중의 증상을 치료하는 방법들에 관계한다.
뇌졸중은 호주에서 심장병 다음으로 두 번째 사망 원인이다. 미국에서는 세 번째 사망 원인이며, 매년 뇌졸중으로 140,000명 이상이 사망한다. 또한, 미국에서 심각한 장기적 신체장애(disability)의 주요 원인이기도 하다. 2005년부터 2050년까지 미국에서 계획된 비용은 US$2.2조 달러이다.
신체장애는 뇌졸중 생존자들의 75%에 영향을 주는데, 뇌졸중 생존자들의 고용가능성을 감소시킬 수 있다. 뇌졸중은 대상에게 신체적, 정신적, 감정적 또는 이들 셋이 조합적으로 영향을 줄 수 있다.
뇌졸중으로 인한 신체적 무력은 근육 허약, 무감각, 욕창(pressure sores), 폐렴, 실금, 행동불능 (학습된 움직임을 실행할 수 없는 능력), 일상생활을 하는데 곤란함, 식욕 상실, 언어 상실(speech loss), 시력 상실(vision loss), 및 통증을 포함한다. 뇌졸중이 심각한 경우, 또는 뇌간의 일부와 같은 특정 위치에 있는 경우, 혼수 또는 사망을 결과할 수 있다.
뇌졸중으로 인한 감정적 문제는 뇌에 감정 중추에 직접적인 손상으로 야기될 수 있거나, 또는 욕구불만 및 새로운 제약에 적응 곤란으로 야기될 수 있다. 뇌졸중-이후 감정적 곤란은 우울, 불안, 패닉 발작, 둔마된 정동 (감정 표면의 실패), 조병, 무감정, 및 정신이상을 포함한다.
뇌졸중으로 인한 인지 결함은 인지능력 장애, 말하기 문제, 치매, 그리고 주의력 및 기억관련 문제를 포함한다. 뇌졸중 피해지는 자신의 불능, 소위 질병불각증(anosognosia)이라고 불리는 상태를 모를 수 있다. 편측공간 무시(hemispatial neglect)라고 불리는 상태에서, 환자는 손상된 반구의 반대쪽 공간 측면에 있는 어느 것에도 주의를 기울일 수 없다.
모든 뇌졸중 환자들의 최대 10%는 이 사안의 후속으로 1주일이내 가장 흔하게 발작이 일어난다. 뇌졸중의 심각성은 발작의 가능성을 증가시킨다.
뇌졸중은 뇌로의 혈액 공급의 방해로 인하여 뇌 기능의 상실이 신속하게 일어나는 것이다. 이는 차단(혈전증, 동맥 색전증), 또는 출혈 (혈액의 누출)로 인한 허혈(혈행의 부족)으로 인한 것일 수 있다. 그 결과, 뇌에서 영향을 받은 지역은 기능을 할 수 없고, 신체의 한쪽에 하나 이상의 손발을 움직일 수 없고, 말을 이해하거나 말을 나타내는데 장애, 또는 시계의 한 쪽을 볼 수 없는 결과를 야기할 수 있다. 뇌졸중은 대개 뉴런 세포 사망을 초래하고, 사망으로 이어질 수 있다.
뇌졸중의 두 가지 공통적 유형이 있다: (i) 허혈성 뇌졸중, 이것은 뇌로 가는 혈류의 일시적 또는 영구적 폐쇄로 야기되며, 뇌졸중 경우의 85%를 차지하고, 그리고 (ii) 출혈성 뇌졸중, 이것은 파열된 혈관으로 야기되며, 나머지 경우의 대부분을 차지한다. 허혈성 뇌졸중의 가장 흔한 원인은 중앙 뇌 동맥(내부 경동맥으로부터 하류의 내부-두개 동맥)의 폐쇄이며, 이로써 대뇌 (가령, 뇌 피질), 가령, 뇌의 운동 및 감각 피질이 손상된다. 이러한 손상은 편마비, 반-무감각증을 초래하고, 그리고 손상된 뇌 반구에 따라 언어 또는 시강-공각적 결함을 초래한다.
허혈성 뇌졸중에 대한 현재 치료는 허혈성 반암부(penumbra)의 구조에 초점을 두고 있는데, 이를 테면, 구조적 일체성은 유지하지만 전기적 기능은 상실된 뇌의 중간정도로 과소관류된 영역에 초점을 두고 있다. 현재, 다음의 결과를 개선시키기 위한 임상적으로 증명된 치료는 오직 4가지 뿐이다:
● 추가적 뇌졸중을 방지하기 위한 아스피린,
● 폐색을 역전시키기 위하여 조직 플라스미노겐 활성물질과 함께 급성 혈전 용해
● 뇌졸중 유닛에서 관리, 그리고
● 두 개내 압력을 감소시키기 위하여 반구두개골절개술(hemicraniectomy)
그러나, 이러한 치료는 단순하게 진행되는 신경 손상을 완화시키는 시도일 뿐이며, 상실된 뉴런 또는 뇌 기능을 회복시키지 않는다.
N-메틸-D-아스파르트산염 수용체 길항제들, 날메펜(nalmefene), 루벨루졸(lubeluzole), 클로메티아졸(clomethiazole), 칼슘 패널 차단제 (a-아미노-3-히드록시-5-메틸이소옥사졸-4-프로피온산 길항제들, 세로토닌 항진제들 (가령, 레피노탄), 그리고 경막 칼륨 채널 조절물질을 포함), 티리라자드(tirilazad), 항-ICAM-I 항체, 인간 항백혈구 항체 (Hu23F2G), 항혈소판 항체 (가령, 아비씨마브(abciximab)), 시티콜린(citicoline)(시티딘-5'-디포스포콜린의 외생적 형태), 그리고 기초 섬유아세포 성장인자를 포함하는 일부 신경보호 물질들이 뇌졸중의 치료에서 효과에 대해 테스트되었고, 그리고 실패하였다.
전술한 내용으로부터 뇌졸중의 치료법이 당분야에 필요하다는 것이 자명할 것이다. 바람직한 치료법은 뇌졸중으로 인한 최소한 일부 신경 손상을 복구하거나 및/또는 뇌졸중의 증상으로 인하여 상실된 최소한 일부 뇌 기능을 회복시키는 것이다.
요약
본 개시내용은 발명자들이 뇌졸중 결과의 치료에 유용한 세포 집단의 확인에 기초된다. 본 명세서에서 구체화된 것과 같이, 발명자들은 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 분비된 인자들이 뇌졸중후 상실된 뇌 기능을 복원시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 예시적인 STRO-1+ 세포들은 골수 및/또는 치수로부터 유도되며, 치료에 사용하기에 앞서 배양되거나 및/또는 보관된다. 발명자들은 뇌졸중의 증상들을 치료하기 위하여 세포들 및/또는 분비된 인자들의 효과를 설명하기 위하여, 허혈성 뇌졸중, 가령, 대뇌에 영향을 준 인증된 동물 모델을 이용하였다.
예를 들면, 발명자들은 뇌 기능을 복원할 수 있거나 및/또는 뇌졸중 후 움직임 장애를 치료할 수 있다는 것을 보여주었다. 발명자들은 STRO-1+ 세포들이 뉴런으로부터 축색의 성장을 야기하는 인자들 (가령, SDF-1)을 분비한다는 것 또한 보여주었다. 임의의 이론 또는 작용 방식에 결부되지 않고, 발명자들은 이들 인자가 신경보호, 혈관신생, 면역-조절 및/또는 신경가소성(neuroplasticity)에 기여할 수 있다고 제안한다.
발명자들은 STRO-1+ 세포들이 뉴런-유사 세포들로 분화될 수 있다는 것 또한 보여주었다. 그러나, 뇌졸중을 앓고 있는 대상의 뇌로 주사 후, 이들 세포들중 소수만이 몇 주간 생존한다. 이 결과들은 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 분비된 인자들은 뇌졸중 이후 대상의 고유 뉴클레오티드의 생존 및/또는 재생에 기여한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 제시된 발견들은 뇌졸중의 하나 또는 그 이상의 증상을 치료하는 방법에 대한 근간을 제시한다. 예를 들면, 이러한 방법들은 뇌졸중을 앓았던 대상에게 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 뇌졸중을 앓았던 대상에게서 뇌 기능을 개선 또는 뇌 기능 상실을 방지하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 대상에게 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 대상에게서 뇌 기능은 대상의 운동 장애를 개선시킨다. 한 실시예에서, 뇌 기능은 뇌 피질 기능, 이를 테면, 운동 피질 기능 및/또는 감각 피질 기능이다.
본 개시내용은 추가적으로 또는 대안으로 뇌졸중을 앓았던 대상에게서 운동 장애를 치료 또는 방지하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 대상에게 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 기술된 방법의 한 실시예에서, 운동 장애는 마비, 부분적 마비, 불명료한 언어(slurred speech), 서투른 동작(uncoordinated movement), 근육 허약, 긴장저하(hypotonicity), 긴장고조(hypertonicity) 또는 비정상적 불수의 운동(involuntary abnormal movement)움직임이다.
본 개시내용은 추가적으로 뇌졸중을 앓았던 대상에서 뇌 뉴런을 재생시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 대상에게 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 추가적으로 뇌졸중을 앓았던 대상에게서 뇌 위축을 치료, 감소 또는 방지하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이 대상에게 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 위축은 뇌량(corpus callosum)에 있다.
한 실시예에서, 개시내용의 방법을 실행함으로써 재생된 뇌 뉴런은 뇌 피질, 예를 들면, 운동 피질 및/또는 감각 피질에 있다.
한 실시예에서, 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중이다.
본 개시내용에 의해 고려되는 예시적인 뇌졸중은 대상의 중앙 뇌 동맥의 폐색으로 인한 허혈성 뇌졸중이다.
한 실시예에서, 본 개시내용의 방법은 이 대상에게 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 뇌졸중 후 1 시간 내지 1 개월 사이, 예를 들면, 1 시간 내지 2 주, 이를 테면 1 시간 내지 1 주 사이에 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단은 뇌졸중 후 약 72 시간 이내에 투여된다. 예를 들면, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단은 뇌졸중 후 약 48시간 이내에 투여된다.
또다른 실시예에서, 이 방법은 뇌졸중 후 약 24시간 이내에 이 대상에게 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단은 뇌졸중 후 약 24시간에 투여된다.
한 실시예에서, 이 방법은 STRO-1밝음(bright) 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포 집단을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 후손은 STRO-1밝음 세포들에 대해 추가적으로 농축된다.
예시적인 세포들 및/또는 후손은 추가적으로 조직 비-특이적 알칼리 포스파타제 (TNAP) 및/또는 열 쇼크 단백질 90β (HSP90P) 및/또는 CD146을 발현시킨다.
한 실시예에서, 세포들의 집단은 골수 또는 치수로부터 유래된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 집단은 전신으로 투여된다.
대안 실시예에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 집단은 대상의 뇌에 국소적으로 투여된다. 예를 들면, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 집단은 대상의 뇌에 국소적으로 투여된다. 한 실시예에서, 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들은 추가적으로 (또는 대안으로) 대상의 선조체로 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손이 농축된 집단은 뇌졸중 부위로부터 멀리 있는 부위로 투여되며, 그리고 뇌졸중의 부위, 가령, 허혈성 경색 또는 허혈성 경색을 에워싸는 경계 영역으로 이동된다.
임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 예시적인 방법은 뇌 기능을 개선시키고 및/또는 뇌 뉴런을 재생시키는데 충분한 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들의 용량을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 이 방법은 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들의 유효 용량 또는 치료요법적으로 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 이 방법은 kg당 0.1 x 106 내지 5 x 106의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 이 방법은 kg당 0.3 x 106 내지 2 x 106의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 이 방법은 kg당 0.5 x 106 내지 2 x 106의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 이 방법은 kg당 0.5 x 106 내지 1.5 x 106의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 이 방법은 kg당 약 5 x 105의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 또는 약 1.5 x 106의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 이 방법은 kg당 약 1.8 x 106의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법은 낮은 용량의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 낮은 용량의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손은 kg당 0.1 x 105 내지 0.5 x 106의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들은 다수의 횟수로 투여된다. 예를 들면, 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들은 4주 또는 그 이상마다 한 번씩 투여된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손의 25% 미만은 투여 이후 28일 동안 대상의 뇌 (가령, 대뇌)에 남아있다. 예를 들면, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손의 10% 미만은 투여 이후 28일 동안 대상의 뇌 (가령, 대뇌)에 남아있다. 예를 들면, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손의 5% 또는 3% 미만은 투여 이후 28일 동안 대상의 뇌 (가령, 대뇌)에 남아있다.
한 실시예에서, 한 실시예에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 후손 세포들이 농축된 이 집단은 자가(autogeneic) 또는 동종이계(allogeneic)며 및/또는 이 가용성 인자들은 자가 또는 동종이계 세포들로부터 유도될 수 있다. 한 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법은 이 집단 및/또는 후손을 단리 또는 농축 및/또는 가용성 인자들을 단리하는 것을 포함한다.
임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법의 실시예에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 후손 세포들이 농축된 집단은 투여에 앞서 및/또는 가용성 인자들을 획득하기에 앞서 배양 확장되었다. 한 실시예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 추가적으로 이 집단 및/또는 후손을 배양하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 이 방법은 추가적으로 이 집단 및/또는 후손을 보관하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 이 집단 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 유도된 가용성 인자들은 전술한 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 유도된 가용성 인자들 및 운반체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물 형태로 투여된다. 한 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법은 추가적으로 운반체 및/또는 부형제와 함께 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들을 제형화하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법은 추가적으로 치료 이후 대상의 뇌 기능을 테스트하는 것을 포함한다. 예를 들면, 이 방법은 추가적으로 대상의 움직임 및/또는 힘 및/또는 말하기 및/또는 힘을 테스트하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 대상의 뇌 기능이 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들의 투여전과 비교하여 유의적으로 증가되지 않았다면, 이 방법은 추가 용량의 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시예에서, 치료될 대상은 포유동물, 이를 테면 영장류, 예를 들면, 인간이다.
본 개시내용은 뇌졸중 이후 대상의 뇌 기능 개선 또는 뇌졸중 이후 대상의 운동 장애의 치료 또는 뇌졸중 이후 대상의 뇌 뉴런의 재생에 사용하기 위한 용도로 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 또한 제공한다.
본 개시내용은 뇌졸중 이후 대상의 뇌 기능 개선 또는 뇌졸중 이후 대상의 운동 장애의 치료 또는 뇌졸중 이후 대상의 뇌 뉴런의 재생을 위한 약물의 재조에 있어서 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단의 용도를 추가적으로 제공한다.
본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법에 사용하기 위한 지침과 함께 포장된 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 포함하는 키트를 또한 제공한다.
예를 들면, 본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법에서 조성물의 용도를 나타낸 제품 정보와 함께 포장된 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법에 사용하기 위한 지침과 함께 포장된 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 단리 또는 배양하는 키트를 또한 제공한다.
본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법에 사용하기 위한 지침과 함께 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 제공하는 방법을 또한 제공한다.
본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 명세서에서 설명된 방법에 추후 사용을 위하여 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 및/또는 그로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 세포들의 집단을 단리 또는 단리 또는 보관을 제공하거나 또는 보관을 포함하는 방법을 또한 제공한다.
본 명세서에서 기술된 방법들은 추가 뇌졸중 위험을 감소시키는 방법들에 준용될 것이다.
도 1. 성숙 인간 골수 다형핵 세포(BMMNC)에 의한 TNAP(STRO-3) 및 간엽성 전구 세포 마커, STRO-1밝음의 공동-발현. 이중-칼라 면역형광과 유세포분석법은 FITC에 커플링된 염소 항-뮤린 IgM 항체로 간접적으로 표지된 STRO-1 MACS-선별된 BMMNC(x 축), 그리고 PE에 커플링된 염소 항-뮤린 IgG로 간접적으로 표지된 STRO-3 mAb(뮤린 IgG1)(y 축)의 배양에 의해 수행되었다. 점도표 히스토그램은 리스트모드 데이터(listmode 데이터)로서 수집된 5 x 104 이벤트를 나타낸다. 수직선과 수평선은 동일한 조건 하에 처리된 아이소타입-정합된 대조 항체, 1B5(IgG)와 1A6.12(IgM)로 획득된 <1.0% 평균 형광의 반응성 수준으로 설정되었다. 이들 결과는 STRO-1밝음 세포의 소수 집단이 TNAP(위쪽 오른쪽 사분면)을 공동-발현하지만, 나머지 STRO-1+ 세포가 STRO-3 mAb와 반응하지 않는다는 것을 증명한다.
도 2. 배양된 그리고 확장된 STRO-1밝음 MPC의 STRO-1밝음 또는 STRO-1흐림(dim) 후손의 발현 프로파일. 탈체(ex vivo) 확장된 골수 MPC의 단일 세포 현탁액은 트립신/EDTA 처리에 의해 준비되었다. 세포들은 STRO-1 항체로 착색되며, 후속적으로 염소-항 뮤린 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트와 항온처리에 의해 나타난다. 형광 활성화된 세포 분류(A)이후, 전체 세포성 RNA는 STRO-1흐림 또는 STRO-1밝음을 발현시키는 세포들의 정제된 집단으로부터 준비된다. RNAzolB 추출 방법, 및 표준 절차들을 이용하여, 각 준집단으로부터 총 RNA를 단리시켰고, cDNA 합성을 위한 주형으로 이용되었다. 다양한 전사체들의 발현은 이미 언급된 것과 같이 표준 프로토콜을 이용한 PCR 증폭에 의해 평가되었다(Gronthos et al . J Cell Sci . 77(5:1827-1835, 2003). 본 연구에 이용된 프라이머 세트는 표 2에 나타낸다. 증폭 이후, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되고, 에티디움 브롬화물 착색에 의해 시각화되었다(B). 각 세포 표식에 대한 상대적인 유전자 발현은 ImageQant 소프트웨어를 이용하여 하우스-키핑(house-keeping) 유전자, GAPDH의 발현에 대한 기준으로 평가되었다(C).
도 3. 배양된 그리고 확장된 STRO-1+ MPC의 STRO-1밝음 후손은 높은 수준의 SDF-1를 발현시키지만, STRO-1흐림 후손은 발현되지 않는다. (A) STRO-1+ BMMNC의 MACS-단리된 조제물은 FACS를 이용하여, 영역, STRO-1밝음 및 STRO-1흐림/둔감에 따라 상이한 STRO-1 하위세트로 분할된다. 총 RNA는 각 STRO-1 하위집단으로부터 준비되었고, STRO-1밝음 공제 혼성화 라이브러리를 구축하는데 이용되었다(B-C). 대표적인 PCR 산물로 블랏된 복제 니트로셀룰로오즈 필터들은 STRO-1밝음 공제된 cDNA로 형질변환된 세균 클론으로부터 증폭되었다. 그 다음 필터들은 [32P] 데옥시시티딘 삼인산염 (dCTP)-라벨된 STRO-1밝음(B) 또는 STRO-1흐림/둔감 (C) 공제된 cDNA로 프로브시켰다. 화살표는 인간 SDF-1에 대응하는 cDNA 단편을 내포하는 1 클론의 차등 발현을 나타낸다. (D) 역 전사효소 (RT)-PCR 분석은 배양에 앞서, 새로 MACS/FACS-단리된 BMMNC STRO-1 집단으로부터 준비된 총 RNA에서 SDF-1 및 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소 (GAPDH) 전사체들의 상대적 발현을 설명한다. bp는 염기쌍을 나타낸다.
도 4. 인간 DPSC들은 뉴런-유사 세포들로 분화된다. (A) 현미경사진의 사본은 인간 포피 섬유아세포 (HFF)가 시험관내에서 뉴런-유도성 배지에 반응하지 않음을 보여준다. (B) 현미경사진의 사본은 hDPSC가 시험관에서 뉴런-유도성 배지에서 뉴런 표현형으로 분화된다는 것을 보여준다 (C) 그래픽 설명은 -44 내지 36 mV 범위에서 10 mV 증가되는 단계의 30ms에 반응하여 분화된 DPSC에 기록된 Na+ 전류의 흔적의 대표적인 예를 나타낸다. (D) 전압 단계에 반응하여 분화된(D) 그리고 분화안된 (N.D) DPSC에서 획득된 피크 Na+ 전류의 평균 I-V 플롯을 나타낸다.
도 5. 뇌졸중 모델을 치료하는데 이용된 과정을 나타내는 일련의 설명이다. 패널 A는 중앙 뇌 동맥 폐색 (MCAo)-후 1일 시점에 경색된(백색) 조직을 보기 위하여 염화 2,3,5-트리페닐테스라졸리움으로 착색된 대표적인 쥐의 관상 뇌 부분을 보여준다. 패널 B는 항-인간 미토콘드리아 항원 항체와 헤마토실린으로 착색된 대표적인 쥐의 관상 뇌 부분을 보여준다. 패널 A와 B에서 검은 점들은 전정(bregma)에 대해 전-후-0.40 mm, 중앙-측면-0.40 mm, 경뇌막(dura)으로부터 등-배-5.50mm에서 제 1 선조체(striatal) 주사 부위와, 그리고 경뇌막으로부터 등-배-1.75mm에서 제 2 피질 주사부위를 나타낸다. 패널 C는 처리 과정을 도표로 나타내는데, 이때 동물은 MCAo (0일 시점으로 나타냄)전 3일 동안 훈련되고, 그리고 세 번째 세션은 수술전 기선(-1 일 시점)으로 이용된다. 동물은 MCAo 이후 24시간에 인간 DPSCs 또는 배지 단독을 수용하도록 무작위로 할당되었다. 처리 할당에 대해 모르는 연구자들에 의한 거동 평가는 MCAo 이후 1, 7, 14, 21, 및 28 일에 시행되었다. 모든 동물은 실험 과정 동안에 매일 10 mg/kg 사이클로스포린 A의 피하 주사를 맞았다. 동물들을 희생시키고, 이들의 뇌는 뇌거동 연구의 결론에서 면역조직화학을 위하여 처리되었다. 눈금 막대=2mm(A, B). 약어: Cx, 뇌 피질; DPSC, 치수 줄기 세포; MCAo, 중앙 뇌 동맥 폐색; Str, 선조체.
도 6. MCAo 이후 신경거동 결과에서 인간 DPSC 처리의 효과를 나타내는 일련의 그래프다. MCAo 이후, 모든 동물은 모든 거동 테스트(1일 또는 7일 vs. -1일)에서 기능적 결함을 나타내었다. 패널 A는 이식후 4주에, DPSC-처리된 동물들은 비이클-처리된 동물과 비교하여 전체적 신경 득점에서 유의적인 개선을 나타내었다(p < 0.018 집단 x 일수 상호작용, 분산분석의 반복된-측정[ANOVA]; 21일 및 28일 시점에서 처리 집단 사이에 각각 p<0.05 및 p<0.01; 사후(post hoc) Fisher의 보호된 최소 유의차 검증). 패널 B에 나타낸 것과 같이 DPSC-이식된 집단은 유의적으로 개선된 앞다리 감각운동 능력을 또한 보여주었고, 이는 걸음걸이 테스트에서 반대측 앞다리에서 얻은 유의적으로 더 많은 걸음걸이로 설명된다 (p=0.045 전반적인 처리 효과). 패널 C는 DPSC-이식된 집단은 접착 테이트 제거 테스트에서 비이클-처리된 집단과 비교하여 반대측 앞발로부터 라벨을 제거하는 시도하는 시간의 비율이 유의적으로 더 적다는 것을 또한 보여주었다(p=0.049 전반적인 처리 효과). 처리 집단간에 거동 차이는 로타로드(rotarod)에서 (패널 D) 그리고 가늘어진/턱모양의(tapered/ledged) 들보 걷기(패널 E) 테스트에서 통계학적 유의성에 도달하는데 실패했다(p > 0.05, 반복된-측정 ANOVA). 뇌졸중 동물은 빙글도는 거동으로 인하여 MCAo 이후 1일 시점에서 들보 걷기 임무를 완료할 수 없다. 값들의 분포를 보기 위하여 박스 플롯으로 데이터를 플롯하였다. 상자내 중심 별표는 중간을 나타내고, 이 상자는 값의 평균 50%(이를 테면, 25번째부터 75번째 백분위 범위)를 나타낸다. 위스커(whiskers)는 데이터의 크기를 나타내는데, 맨 마지막 관찰은 외부 원으로 나타낸다. 약어: DPSC, 치수 줄기 세포; MCAo, 중앙 뇌 동맥 폐색.
도 7. 허혈 이후 뇌에서 생존 DPSC의 분포를 나타내는 사진 사본이다. 대표적인 쥐의 관상 뇌 부분들은 관상 이식 후 4주차에서 이식된 DPSCs의 생존 및 이동 패턴을 보여준다(개별 세포들은 검은 점으로 나타내었다. 절단면들은 쥐 뇌 조직으로부터 인간 세포들을 탐지하기 위하여 인간 미토콘드리아 항원에 대해 착색되었다. 뇌졸중 병소쪽으로의 DPSCs의 표적화된 이동과 경색 주변에 궁극적인 축적이 주목된다. 눈금 막대 = 2 mm. 약어: B, 전정; CC, 뇌량; Cx, 뇌 피질; DG, 배면 해마의 톱니모양의 뇌회; LV, 측면 심실; Str, 선조체.
도 8. 뇌졸중-후 28일 시점에서 합체된(engrafted) 인간 DPSC들의 형태를 보여주는 사진 사본이다. 중앙 뇌 동맥 폐색 4주후 설치류 뇌에서 인간 DPSC들의 고배율 확대(인간 미토콘드리아 항원-양성 세포들은 진회색으로 착색되었다; 도면의 우측면)에서 경색 중심의 바로 부근에 축적(패널 A)과 CC를 따라 분명한 이동(패널 B)이 설명되었다. 주사 및 뇌졸중 부위의 반대측 뇌 반구내에 DPSC들의 빈약한 분포를 주목한다. 점들은 개별 인간 DPSC들을 나타낸다. 패널 C는 일부 DPSC-유도된 세포들은 내피 세포들 (화살표), 혈관주위세포, 또는 평활근 세포들 (화살표머리)와 일치되는 형태학적 외양으로, 뇌 혈관의 벽 안으로 합체된 것을 보여준다. 패널 D는 DPSC-유도된 세포들의 형태가 성상세포 (화살표) 및 뉴런 (화살표머리)을 연상시켰다는 것을 보여준다. 눈금 막대=2mm (패널 A, B) 및 25 μm (패널 C, D 그리고 = 패널 A, B에서 40 고-확대 삽입물). 약어: B, 전정; CC, 뇌량.
도 9. 몸의 같은 쪽 병소(ipsilesional) CC 위축에서 DPSC 치료 효과를 보여주는 일련의 그림이다. 패널 A는 전정 수준에서 쥐 뇌 절단면을 나타내는데, 이때 몸의 같은 쪽과 반대 쪽 반구 모두에서 뇌의 중심선(LI)에서 그리고 측면 뇌실의 측면 모서리(L2)에서 CC 두께 측정에 이용된 두 부위가 표시된다. 패널 B는 이식후 4 주 시점에서 비이클 처리된 동물과 비교하여 DPSC-처리된 동물의 같은 쪽 반구내 뇌량 위축이 감소되는 경향이 있었다는 것을 보여준다. LI (중심선) CC 측정 쪽으로 L2 (몸에서 같은 쪽)의 표준화는 통계학적 의의에 이르지 못하였다(p > 0.05). 처리 집단들 간에 반대쪽 CC 두께 측정에서 차이가 없었다. 데이터는 평균±SEM으로 나타낸다. 눈금 막대=100 μm. 약어: CC, 뇌량; Contra, 반대측; Cx, 뇌 피질; DPSC, 치수 줄기 세포; Ipsi, 몸에서 같은 쪽; LV, 측면 뇌실.
도 10. 그래프는 염소 항-뮤린 IgM 또는 IgG 접합된-FITC 2차 항체를 이용하여 탐지된 아이소타입 (IgM, IgG2a 및 IgG1) 음성 대조군(점선)과 비교하여 간엽성 줄기 세포 표식들, STRO-1, STRO-4 및 CD146 (직선)의 양성 세포 표면 발현과 함께 배양 확장된 골수 유도된 게잡이원숭이 MPC의 단일 세포 현탁액을 이용하여 생성된 유동 세포분석 분포도를 나타낸다. 분포도는 단핵세포/대식세포의 표식들(CD14), 조혈성 줄기/선조 세포들의 표식들 (CD34) 그리고 성숙한 백혈구의 표식들(CD45)에 대한 세포 표면 발현이 부족하다는 것을 또한 보여준다. 아이소타입 대조군과 비교하여 1% 이상 형광 수준이 양성을 나타낸다.
서열 목록에 대한 핵심
SEQ ID NO: 1 GAPDH를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 2 GAPDH를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 3 SDF-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 4 SDF-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 5 IL-1β를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 6 IL-1β를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 7 FLT-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 8 FLT-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 9 TNF-α를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 10 TNF-α를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 11 KDR을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 12 KDR을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 13 RANKL을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 14 RANKL을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 15 렙틴(Leptin)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 16 렙틴(Leptin)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 17 CBFA-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 18 CBFA-1을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 19 PPARy2를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 20 PPARy2를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 21 OCN을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 22 OCN을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 23 MyoD를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 24 MyoD를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 25 SMMHC를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 26 SMMHC를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 27 GFAP를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 28 GFAP를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 29 네스틴(Nestin)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 30 네스틴(Nestin)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 31 SOX9를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 32 SOX9를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 33 콜라겐 유형 X를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 34 콜라겐 유형 X를 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 35 어그리칸(Aggrecan)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
SEQ ID NO: 36 어그리칸(Aggrecan)을 인코드하는 핵산 증폭용 올리고뉴클레오티드
일반적 기술 및 선택된 정의들
명세서를 통하여, 다른 언급이 없는 한 또는 내용이 다른 것들을 요구하지 않는, 이들 단계중 하나 및 다수(가령, 하나 또는 그 이상), 문제의 조성물의 단계들의 집단 또는 집단을 포괄하도록 단일 단계, 문제의 조성물, 문제의 조성물의 단계들의 집단 또는 집단에 대한 언급이 있을 것이다.
본 개시내용의 각 실시예는 다른 명시적 언급이 없는 한, 각 실시예 및 모든 다른 실시예에 대해 필요한 변경을 하여 적용될 수 있다.
본 개시내용은 명시적으로 언급된 것 이외의 다양한 변화 및 수정을 사용할 수 있다는 것을 당업계 숙련자들은 인지할 것이다. 본 개시내용은 이러한 모든 변화 및 수정을 포함하는 것으로 이해된다. 본 개시내용은 이 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급된 또는 표시된 모든 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물들, 그리고 전술한 단계들 또는 특징들의 임의의 그리고 모든 조합들 또는 임의의 두 개 또는 그 이상의 전술한 단계들 또는 특징들을 또한 포함한다.
본 명세서에 포함된 특정 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 이들 실시예는 설명을 목적으로만 의도된 것이다. 기능적으로 등가의 산물들, 조성물들 그리고 방법들은 개시내용의 범위내에서 명백히 있다.
본 개시내용은 다른 언급이 없는 한, 분자 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액에서 펩티드 합성, 고형상 펩티드 합성, 그리고 면역학의 통상적인 기술을 이용하여 과도한 실험없이 실시된다. 이러한 과정들은 예를 들면, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vols I, II, 및 III 전체; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, 전체 내용; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, 전체 내용, 그리고 Gait, ppl-22의 논문; Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; 및 Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, 전체 내용; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, 전체 내용; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), 시리즈 전체; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides(Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wnsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Mler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide 합성, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int . J. Peptide Protein Res . 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); and Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, 전체 내용에 기술된다.
명세서를 통하여, 다른 언급이 없는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 단계 또는 요소 또는 정수(integer) 또는 단계들 또는 요소들 또는 정수들의 집단을 포함하나 그러나 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 집단을 배제하지 않는다는 의미로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "~로부터 유래된"은 특정 원천으로부터 반드시 직접적으로 유도될 필요는 없지만, 해당 원천으로부터 명시된 완전체(integer)를 획득할 수 있다. STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들로부터 유래된 가용성 인자들의 내용에서, STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들을 시험관에서 배양하는 동안 생성된 하나 또는 그 이상의 인자들, 가령, 단백질들, 펩티드들, 탄수화물들, 등을 의미할 것이다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "뇌졸중"은 뇌로 가는 혈류 또는 뇌간에서 타격으로 인하여 보통 신속하게 발생되는 뇌 기능(들)의 상실을 의미한다. 이 타격은 가령, 혈전증 또는 색전증에 의한 허혈(혈액의 부족)일 수 있거나, 또는 출혈로 인한 것일 수 있다. 한 실시예에서, 뇌 기능의 상실은 뉴런 세포 사멸이 수반된다. 한 실시예에서, 뇌졸중은 대뇌 또는 이의 영역으로부터 또는 대뇌 또는 이의 영역으로 혈액의 상실 또는 타격이 원인이 된다. 한 실시예에서, 뇌졸중은 뇌혈관 원인의 신경 결손으로 24 시간이상 지속되거나 또는 24 시간 이내에 사망에 의해 중단된다(세계 보건 기구의 정의에 따르면). 24 시간이상 증상의 지속은 뇌졸중을 일과성 허혈성 발작 (TIA)과 분리시키는데, 이때 증상은 24시간 미만으로 지속된다. 뇌졸중의 증상은 편마비 (신체의 한 측면의 마비); 편측부전마비 (신체의 한 측면에서 허약); 안면 근육 허약; 무감각; 감정의 축소; 후각, 미각, 청각 또는 시각의 변경; 후각, 미각, 청각 또는 시각의 상실; 눈꺼풀의 늘어짐(안검하수); 눈 근육의 눈에 띄는 허약; 감소된 구토 반사; 삼키는 능력의 감소; 빛에 대한 눈동자 반응성 감소; 안면 감각의 감소; 균형 감소; 안진증; 쇠약해진 호흡율 ; 쇠약해진 심박수; 흉부유양돌기성 근육의 허약과 머리를 한 쪽으로 돌리는 능력의 감소 또는 무능력; 혀의 허약; 실어 (말을 못하거나 또는 언어를 이해하지 못함); 행동불능 (쇠약해진 자발적 움직임); 시야 결점; 기억 결손; 반경시 또는 편측공간 무시 (병소의 반대쪽 시야 측면에서 공간에 대한 주의력 결손); 정리안된 사고; 혼돈; 성욕 과잉의 몸짓 발생; 질병불각증 (결손의 존재에 대한 끊임없는 부정); 걸음 곤란; 쇠약해진 협조 운동; 어지러움; 불균형; 의식의 상실; 두통; 및/또는 구토를 포함한다.
당업자는 "대뇌"는 뇌 피질 (또는 뇌 반구의 피질), 기저핵 (또는 기저 핵) 및 변연계를 포함한다는 것을 인지할 것이다.
용어 "뇌 기능"은 다음을 포함한다:
● 추리, 계획, 말하기, 움직임, 감정 부분, 그리고 문제 해결(전두엽과 연합된);
● 자극의 이동, 지향, 인식 및 감지(두정엽과 연합된);
● 시각적 처리(후두엽과 연합된); 그리고
● 청력 자극의 감지 및 인식, 기억 및 말하기 (측두엽과 연합된).
여기에서 이용된 것과같이, 용어 "운동 장애"는 뇌졸중 이전과 비교하여 대상의 움직이는 능력에서 임의의 변화를 말한다. 예시적인 운동 장애들은 마비, 부분적 마비, 어눌한 말하기, 서투른 동작, 근육 허약, 긴장저하, 긴장고조 또는 무의식적 비정상적 움직임을 포함한다.
여기에서 이용된 것과같이, 뉴런 "재생"은 대상의 내생성 뉴런이 성장(가령, 축색을 성장시키기 위하여) 및/또는 분열되도록 유도되거나 및/또는 내생성 뉴런 줄기 세포가 새로운 뉴런을 만들기 위하여 성장 및/또는 분열 및/또는 분화되도록 유도되는 것을 의미한다. 이는 뉴런을 만들기 위하여 분화되는 투여된 세포와는 다르다. 이 용어는 뉴런을 재생시키는 방법이 투여된 세포들이 뉴런 또는 다른 세포 유형으로 분화되는 것을 추가적으로 포함할 수 없다는 것을 의미하지는 않는다.
여기에서 이용된 것과같이, 용어 "유효량"은 뇌졸중을 앓고 있는 대상에서 뇌 뉴런의 재생을 유도하기 위하여 및/또는 이 대상에서 뉴런으로 분화시키는데 충분한 양의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 집단을 의미한다. 유효량은 그 자체로 치료 장점을 제공하는데 충분한 양이어야 하는 것은 아니며, 예를 들면, 이 집단 및/또는 세포들 및/또는 가용성 인자들의 유효량의 다중 투여로 치료 장점을 제공할 수 있다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "치료요법적 유효량"은 뇌졸중을 앓았던 대상에서 뇌 기능을 개선시키고 및/또는 운동 장애를 치료하거나 및/또는 뇌 뉴런을 재생시키는데 충분한 양의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 유래된 가용성 인자들이 농축된 집단을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "낮은 용량(low dose)"은 1x106 미만의 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손의 양을 의미하지만, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 "유효량" 및/또는 "치료요법적으로 유효량"이 되기에는 충분한 것으로 이해된다. 예를 들면, 낮은 투여량은 0.5 x 106 또는 이보다 적은 세포들, 또는 0.4 x 106 이보다 적은 세포들 또는 0.3 x106 이보다 적은 세포들 또는 0.1 x 106 이보다 적은 세포들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "치료하다(treat)" 또는 "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은 치료요법적으로 유효량의 가용성 인자들 및/또는 세포들을 투여하고, 그리고 운동 장애의 심각성을 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "방지하다(prevent)"또는 "방지하는(preventing)" 또는 "방지(prevention)"는 예방적으로 유효량의 가용성 인자들 및/또는 세포들을 투여하고, 그리고 뇌졸중 이후 운동 장애 또는 뇌 기능 상실을 중단 또는 방해 또는 운동 장애의 발달 또는 진행을 지연시키는 것을 의미한다. 따라서, 본 개시내용의 방법들은 뇌졸중을 앓았던 대상에서 운동 장애 또는 뇌 기능 상질을 예방하는 방법에 준용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "가용성 인자"는 물 용해성인 STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손에 의해 생산된, 임의의 분자, 예를 들면, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 지질단백질, 지질펩티드, 탄수화물 등을 의미할 때 사용된다. 이런 가용성 인자는 세포내의 것이고 및/또는 세포에 의해 분비될 수 있다. 이런 가용성 인자는 복잡한 혼합물(가령, 상층액) 및/또는 이의 분획이고 및/또는 정제된 인자일 수 있다. 본 개시내용의 한 실시예에서, 가용성 인자는 상층액 내에 포함된다. 따라서 하나 또는 그 이상의 가용성 인자의 투여에 관한 본 명세서에서 임의의 실시예는 상층액의 투여에 준용될 수 있는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, 용어 "상층액"은 적합한 배지, 예를 들면, 액상 배지에서 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손을 시험관내에서 배양한 후 생성된 비-세포성 물질을 지칭한다. 전형적으로, 상층액은 적합한 조건 및 시간하에 배지에서 세포를 배양하고, 이어서 원심분리와 같은 과정에 의해 세포성 물질을 제거함으로써 생산된다. 상층액은 투여 전 추가 정제 단계를 거치거나 또는 거치지 않을 수 있다. 한 실시예에서, 상층액은 105 미만의 세포들, 104 미만, 예를 들면, 103 미만의 세포를 포함하는데, 가령, 살아있는 세포가 없다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "정상 또는 건강한 개인"은 뇌졸중을 앓지 않은 대상을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "뇌졸중의 효과"는 하나 또는 그 이상의 뇌 기능을 개선, 운동 장애를 치료 또는 예방 및/또는 뇌 뉴런을 재생을 포함하는 것으로 이해되며, 이에 대한 문헌 뒷받침을 제공한다.
STRO-r 세포들 또는 후손 세포들, 그리고 상층액 또는 하나 또는 그 이상이로부터 유래된 가용성 인자들
STRO-1+ 세포는 골수, 혈액, 치수 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 흉선, 골, 인대, 힘줄, 골격근, 피부, 그리고 골막에서 발견되는 세포들이며, 생식세포주(germ line) 예를 들면, 중배엽(mesoderm) 및/또는 내배엽(endoderm) 및/또는 외배엽(ectoderm)으로 분화될 수 있다. STRO-1+ 세포들의 예시적인 원천은 골수 및/또는 치수로부터 유래된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포는 지방성, 골질, 연골성, 탄성, 근육성, 그리고 섬유성 연결 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 세포이다. 이들 세포가 들어가는 특정한 계통 결정(lineage-commitment)와 분화 경로는 기계적 영향 및/또는 내인성 생물활성 인자, 예를 들면, 성장 인자, 사이토킨, 및/또는 호스트 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 조건(local microenvironmental condition)으로부터 다양한 영향에 좌우된다. 따라서 STRO-1+ 다능성 세포는 분열하여 딸 세포를 산출하는 비-조혈성 기원 세포이고, 이들은 줄기 세포이거나, 또는 때가 되면, 비가역적으로 분화하여 표현형 세포를 산출하는 전구 세포이다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포는 뉴런 또는 뉴런-유사 세포로 분화될 수 있다.
한 실시예에서 STRO-1+ 세포는 뉴런으로부터 축색 성장을 유도 또는 촉진시키는 하나 또는 그 이상 인자들을 분비한다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포는 개체, 예를 들면, 치료되는 개체 또는 관련된 개체 또는 관련 없는 개체(동일한 종 또는 상이한 종인지에 상관없이)로부터 획득된 샘플로부터 농축된다. 본 명세서에서, 용어 "농축되는(enriched)", "농축(enrichment)" 또는 이의 변형은 세포의 처리되지 않은 집단(가령, 고유 환경에서 세포)과 비교할 때, 한 가지 특정 세포 유형의 비율 또는 다수의 특정 세포 유형의 비율이 증가되는 세포의 집단을 기술하는데 이용된다. 한 실시예에서, STRO-1+ 세포들에 대해 농축된 집단은 적어도 약 0.1% 또는 0.5% 또는 1% 또는 2% 또는 5% 또는 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25% 또는 30% 또는 50% 또는 75% STRO-1+_ 세포들을 포함한다. 이에 대해, 용어 "STRO-1+ 세포들에 대해 농축된 세포들의 집단"은 "X% STRO-1+ 세포들을 포함하는 세포 집단"에 대한 명백한 뒷받침을 제공하기 위해 사용되며, 이때 X%는 본 명세서에서 언급된 백분율이다. STRO-1+ 세포들은 일부 실시예들에서, 클론생성 콜로니, 가령 CFU-F (섬유아세포)를 형성하고 또는 이의 하위 집단(가령, 50% 또는 60% 또는 70% 또는 70% 또는 90% 또는 95%)은 이 활성을 보유할 수 있다.
한 실시예에서, 세포들의 집단은 선택가능한 형태의 STRO-r 세포들을 포함하는 세포 조제물로부터 농축된다. 이 점에 있어서, 용어 "선택가능한 형태"는 이 세포들이 STRO-1+ 세포들의 선별을 허용하는 마커(가령, 세포 표면 마커)을 발현시킨다는 것으로 이해될 것이다. 이 마커는 STRO-1일 수 있지만, 반드시 그렇지는 않다. 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 및/또는 구체화된 것과 같이, STRO-2 및/또는 STRO-3 (TNAP) 및/또는 STRO-4 및/또는 VCAM-1 및/또는 CD146 및/또는 3G5를 발현시키는 세포들(가령, MPCs)은 또한 STRO-1를 발현시킨다(그리고 STRO-1밝음일 수 있다). 따라서, 세포들이 STRO-1+ 이라는 표시는 이 세포들이 STRO-1 발현에 의해 선택될 수 있다는 것을 의미하지 않는다. 한 실시예에서, 이 세포들은 적어도 STRO-3 발현에 의해 선택되는데, 가령, 이들은 STRO-3+ (TNAP+)이다.
세포 또는 이의 집단의 선택에 대한 언급은 특정 조직 원천으로부터 선택을 요구하지 않는다. 본 명세서에서 기술된 것과 같이, STRO-1+ 세포들은 방대한 원천으로부터 선택되거나 또는 단리되거나 농축될 수 있다. 즉, 일부 실시예들에서, 이들 용어는 STRO-1+ 세포들 (가령, MPCs) 또는 맥관화된 조직을 포함하는 임의의 조직으로부터 또는 혈관주위세포 (가령, STRO-1+ 혈관주위세포) 또는 본 명세서에서 언급된 임의의 하나 또는 그 이상의 조직을 포함하는 것으로부터 선택을 위한 뒷받침을 제공한다.
한 실시예에서, 세포는 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, STRO-4+(HSP-90β), CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 개별적으로 또는 집단적으로 선택되는 하나 또는 그 이상의 마커를 발현한다.
한 실시예에서, 세포들 또는 세포들의 집단은 STRO-1+ (또는 STRO-1밝음) 및 CD146+를 발현시키는 간엽성 전구 세포들에 대해 농축된다.
"개별적으로"는 본 발명이 언급된 마커 또는 마커의 그룹을 하나하나씩 포함하고, 그리고 개별 마커 또는 마커의 그룹이 본 명세서에 하나하나씩 열거되지 않았음에도 불구하고, 첨부된 청구항이 이런 마커 또는 마커의 그룹을 하나하나씩 및 서로로부터 나누어 정의한다는 것을 의미한다.
"집단적으로"는 본 발명이 임의의 숫자 또는 조합의 언급된 마커 또는 마커의 그룹을 포함하고, 그리고 이런 숫자 또는 조합의 마커 또는 마커의 그룹이 본 명세서에 구체적으로 열거되지 않았음에도 불구하고, 첨부된 청구항이 이런 조합 또는 하위-조합을 하나하나씩, 그리고 임의의 다른 조합의 마커 또는 마커의 그룹으로부터 나누어 정의한다는 것을 의미한다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포는 STRO-1밝음(bright)(동의어, STRO-1밝음(bri))이다. 한 실시예에서, Stro-1밝음 세포는 STRO-1흐림 또는 STRO-1중간 세포에 비하여 우선적으로 농축된다.
예를 들면, STRO-1밝음 세포는 추가적으로, TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ , STRO-4+ (HSP-90P) 및/또는 CD146+ 중에서 하나 또는 그 이상이다. 예를 들면, 이 세포들은 전술한 마커들중 하나 또는 그 이상에 대해 선택되고 및/또는 전술한 마커들중 하나 또는 그 이상을 발현하는 것으로 보인다. 이점에 있어서, 기존에 농축된 또는 단리된 세포들이라기 보다는 명시적으로 테스트할 필요가 없는 마커를 발현하는 것으로 나타난 세포들이 테스트되고, 그리고 후속적으로 이용되며, 단리된 또는 농축된 세포들은 동일한 마커를 또한 발현하는 것으로 합당하게 추정될 수 있다.
한 실시예에서, 간엽성 전구 세포는 WO 2004/85630에서 정의된 바와 같은 혈관주위 간엽성 전구 세포이다. 예를 들면, 간엽성 전구 세포들은 혈관주의세포 세포의 표식을 발현시키는데, 가령, 이 세포들은 STRO-1+ 또는 STRO-1밝음 및/또는 3G5+이다. 한 실시예에서, 이 세포들은 맥관화된 조직 또는 장기들 또는 이의 일부분으로부터 단리된 세포들이거나 또는 세포들이었거나 또는 이 세포들의 후손이다.
소정의 마커에 대해 "양성"인 것으로 지칭되는 세포는 마커가 세포 표면 상에 존재하는 정도에 따라, 상기 마커를 낮은(lo 또는 흐림) 또는 높은(밝음(bright), 밝음(bri)) 수준으로 발현할 수 있고, 여기서 이들 용어는 세포의 분류 과정에 이용된 형광 또는 다른 마커의 강도에 관계한다. lo(또는 흐림 또는 둔감) 및 밝음의 구별은 분류되는 특정 세포 집단에서 이용된 마커의 문맥에서 이해될 것이다. 소정의 마커에 대해 "음성"인 것으로 지칭되는 세포는 상기 세포로부터 반드시 완전하게 존재하지 않는 것은 아니다. 이 용어는 마커가 상기 세포에 의해 상대적으로 매우 낮은 수준에서 발현되고, 그리고 검출가능하게 표지될 때 매우 낮은 신호를 발생시키거나, 또는 배경 수준, 예를 들면, 아이소타입 대조 항체를 이용하여 검출된 수준 이상으로 검출되지 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 이용된, 용어 "밝음"은 검출가능하게 표지될 때 상대적으로 높은 신호를 발생시키는 세포 표면 상에 마커를 지칭한다. 이론에 한정됨 없이, "밝음" 세포는 샘플 내에 다른 세포보다 표적 마커 단백질(가령, STRO-1에 의해 인식되는 항원)을 더욱 많이 발현하는 것으로 제안된다. 가령, STRO-1밝음 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석에 의한 측정에서 FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지될 때, 비-밝음 세포 (STRO-1둔감/흐림)보다 더욱 큰 형광 신호를 발생시킨다. 예를 들면, "밝음" 세포는 출발 샘플 내에 포함된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포 중에서 적어도 약 0.1%를 구성한다. 다른 실시예들에서, "밝음" 세포는 출발 샘플 내에 포함된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포 중에서 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 또는 적어도 약 2%를 구성한다. 한 실시예에서, STRO-1밝음 세포는 "배경", 다시 말하면, STRO-1- 세포에 비하여, STRO-1 표면 발현의 2 로그 크기(log magnitude) 높은 발현을 갖는다. 그에 비해, STRO-1흐림 및/또는 STRO-1중간 세포는 "배경"보다 STRO-1 표면 발현의 2 로그 크기 이하, 전형적으로 약 1 로그 또는 그 이하 높은 발현을 갖는다.
본 명세서에서, 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타아제의 모든 동족체(isoform)를 포함하는 것으로 의도된다. 가령, 용어는 간 동족체(LAP), 골 동족체(BAP) 및 신장 동족체(KAP)를 포함한다. 한 실시예에서, TNAP는 BAP이다. 한 실시예에서, 본 명세서에서 TNAP는 Budapest Treaty의 규정 하에 수탁 번호 PTA-7282로 2005년 12월 19일자에 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다.
더 나아가, 개시내용의 실시예에서, STRO-1+ 세포는 클론원성 CFU-F를 발생시킬 수 있다.
STRO-1+ 다능성 세포 중에서 유의미한 부분이 적어도 2가지 상이한 생식세포주로 분화할 수 있는 것이 바람직하다. 다능성 세포가 결정(commitment)될 수 있는 계통의 무제한적 실시예에는 골 전구 세포; 담관 상피 세포와 간세포에 대해 다능성인 간세포 기원; 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)와 별아교세포(astrocyte)로 진행하는 아교 세포 전구체를 발생시킬 수 있는 신경 국한된 세포; 뉴런으로 진행하는 뉴런 전구체; 심근과 심근세포, 포도당-반응성 인슐린 분비 췌장 베타 세포주에 대한 전구체가 포함된다. 다른 계통에는 치아모세포(odontoblast), 상아질-생산 세포(dentin-producing cell)와 연골세포, 그리고 망막 색소 상피 세포, 섬유아세포, 피부 세포, 예를 들면, 케라티노사이트, 수상돌기 세포, 모낭 세포, 신관 상피 세포, 평활근과 골격근 세포, 고환 기원(testicular progenitor), 혈관 내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 간질, 심근, 평활근, 골격근, 혈관주위, 혈관, 상피, 아교, 뉴런, 별아교 및 희소돌기아교 세포의 전구 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
또다른 실시예에서, STRO-1+ 세포는 배양 시에, 조혈 세포를 발생시킬 수 없다.
한 가지 실시예에서, 이들 세포는 치료되는 개체로부터 채취되고, 표준 기술을 이용하여 시험관내에서 배양되고, 그리고 자기조직 또는 동종이계 조성물로서 개체에 투여를 위한 상층액 또는 가용성 인자 또는 확대된 세포를 획득하는데 이용된다. 대안적 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 확립된 인간 세포주의 세포가 이용된다. 또다른 유용한 가지 실시예에서, 비-인간 동물의 세포(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터)가 이용된다.
본 개시내용에서는 또한, 시험관내 배양액으로부터 생산되는 STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손 세포(후자는 또한, 확대된 세포로서 지칭됨)로부터 획득되거나 유래되는 상층액 또는 가용성 인자의 이용을 고려한다. 본 발명의 확대된 세포는 배양액 조건(배양 배지에서 자극 인자의 숫자 및/또는 유형 포함), 계대배양(passage)의 횟수 및 이와 유사한 것에 따라, 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 후손 세포는 모(母) 집단으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10회 계대배양(passage)후 획득된다. 하지만, 후손 세포는 모(母) 집단으로부터 임의의 횟수의 계대배양후 획득될 수도 있다.
후손 세포는 적절한 배지에서 배양함으로써 획득될 수 있다. 세포 배양액과 관련하여 이용될 때, 용어 "배지"는 세포를 둘러싸는 환경의 성분을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상(phase)과 물질(material)의 혼합물일 수 있다. 배지에는 액체 성장 배지뿐만 아니라 세포 성장을 유지하지 않는 액체 배지가 포함된다. 배지에는 또한, 아교질 배지, 예를 들면, 아가, 아가로오스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스가 포함된다. 예시적인 기체 배지에는 페트리 접시 또는 다른 고형 또는 반고형 서포트 상에서 성장하는 세포가 노출되는 기체 상(gaseous phase)이 포함된다. 용어 "배지"는 또한, 비록 세포와 아직 접촉되지 않은 경우에도 세포 배양에서 이용이 의도되는 물질을 지칭한다. 다시 말하면, 박테리아 배양액에 대해 제조된 영양소 농축된 액체가 배지이다. 물 또는 다른 액체와 혼합될 때 세포 배양에 적합해지는 분말 혼합물은 "분말 배지"로 명명될 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명의 방법에 유용한 후손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자성 구슬을 이용하여 골수로부터 TNAP+ STRO-1+ 세포를 단리 또는 농축하고, 그리고 이후, 단리된 세포를 배양 확대함으로써 획득된다(적절한 배양 조건의 실시예를 위해 Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995를 참고한다).
한 가지 실시예에서, 이런 확대된 세포(후손)(가령, 적어도 5회 계대배양후)는 TNAP-, CC9+, HLA 클래스 I+, HLA 클래스 II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86-, CD34- 및/또는 CD80-일 수 있다. 하지만, 본 명세서에서 기술된 것들과 상이한 배양 조건 하에, 상이한 마커의 발현이 변할 수도 있다. 또한, 이들 표현형의 세포가 확대된 세포 집단에서 우세할 수 있긴 하지만, 이것은 이러한 표현형(들)을 갖지 않는 적은 부분의 세포가 존재한다는 것을 의미하지 않는다(가령, 확대된 세포 중에서 적은 비율은 CC9-일 수 있다). 한 가지 실시예에서, 확대된 세포는 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력을 여전히 갖는다.
한 가지 실시예에서, 상층액 또는 가용성 인자, 또는 세포 그 자체를 획득하는데 이용되는 확대된 세포 집단은 세포 중에서 적어도 25%, 이를 테면, 적어도 50%가 CC9+인 세포를 포함한다.
다른 실시예에서, 상층액 또는 가용성 인자, 또는 세포 그 자체를 획득하는데 이용되는 확대된 세포 집단은 세포 중에서 적어도 40%, 이를 테면, 적어도 45%가 STRO-1+인 세포를 포함한다.
추가의 실시예에서, 확대된 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD 90, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R (STRO-2 = 렙틴-R), RANKL, STRO-4(HSP-90P), STRO-1밝음 및 CD146 또는 이들 마커의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 마커를 집단적으로 또는 개별적으로 발현할 수 있다.
한 가지 실시예에서, 후손 세포는 WO 2006/032092에서 정의되고 및/또는 기술된 바와 같은 다능성 확대된 STRO-1+ 다능성 세포 자손(MEMP)이다. 후손이 유래될 수 있는 STRO-1+ 다능성 세포의 농축된 집단을 제조하는 방법은 WO 01/04268 및 WO 2004/085630에서 기술된다. 시험관내 배경에서, STRO-1+ 다능성 세포는 드물게는, 절대 순수한 조제물로서 존재하고, 그리고 일반적으로 조직 특이적 결정된 세포(TSCC)인 다른 세포와 함께 존재할 것이다. WO 01/04268에서는 약 0.1% 내지 90%의 순도 수준에서 골수로부터 이런 세포를 수확하는 것을 언급한다. 후손이 유래되는 MPC를 포함하는 집단은 조직 공급원으로부터 직접적으로 수확되거나, 또는 대안으로, 탈체(ex vivo)에서 이미 확대된 집단일 수 있다.
예를 들면, 후손은 그들이 존재하는 집단의 전체 세포 중에서 적어도 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95%를 포함하는, 실질적으로 정제된 STRO-1+ 다능성 세포의 수확된, 확대되지 않은 집단으로부터 획득될 수 있다. 이러한 수준은 예로써, TNAP, STRO-4(HSP-90P), STRO-1밝음, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 구성된 군에서 개별적으로 또는 집단적으로 선택되는 적어도 하나의 마커에 대해 양성인 세포를 선별함으로써 달성될 수 있다.
MEMPS는 그들이 마커 STRO-1밝음에 대해 양성이고 마커 알칼리성 포스파타아제(ALP)에 대해 음성인 점에서, 새로 수확된 STRO-1+ 다능성 세포로부터 구별될 수 있다. 대조적으로, 새로 단리된 STRO-1+ 다능성 세포는 STRO-1밝음과 ALP 둘 모두에 대해 양성이다. 본 개시내용의 한 가지 실시예에서, 투여된 세포 중에서 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 표현형 STRO-1밝음, ALP-를 갖는다. 추가 한 가지 실시예에서, MEMPS는 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1 중에서 하나 또는 그 이상에 대해 양성이다. 또 다른 실시예에서, MEMPS는 TERT 활성을 나타내지 않고 및/또는 마커 CD18에 대해 음성이다.
STRO-1+ 세포 출발 집단은 WO 01/04268 또는 WO 2004/085630에서 기술된 임의의 하나 또는 그 이상의 조직 유형, 다시 말하면, 골수, 치수 세포, 지방 조직 및 피부, 또는 아마도 더욱 넓게는, 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 골, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.
본 개시내용에 설명된 방법들을 실시함에 있어서, 임의의 소정의 세포 표면 마커를 보유하는 세포의 분리가 다수의 상이한 방법에 의해 달성될 수 있지만, 예시적인 방법은 관련된 마커에 결합제(가령, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 결합, 그 이후에 높은 수준 결합, 또는 낮은 수준 결합 또는 결합 없음을 나타내는 것들의 분리에 의존하는 것으로 이해될 것이다. 가장 편리한 결합 작용제는 항체 또는 항체-기초된 분자, 예를 들면, 단클론 항체이거나, 또는 이들 후자 작용제의 특이성으로 인하여 단클론 항체에 기초된 분자(가령, 이의 항원 결합 단편들을 포함하는 단백질들)이다. 항체가 양쪽 단계에 이용될 수 있지만, 다른 작용제가 이용될 수도 있고, 따라서 이들 마커에 대한 리간드는 또한, 그들을 보유하거나, 또는 그들이 없는 세포를 농축하는데 이용될 수 있다.
항체 또는 리간드는 조제(粗製) 분리를 가능하게 하는 고형 서포트에 부착될 수 있다. 한 실시예에서, 분리 기술은 수집되는 분획의 생존능의 유지를 극대화시킨다. 상이한 효능의 다양한 기술이 상대적 조제(粗製) 분리를 달성하는데 이용될 수 있다. 이용되는 특정 기술은 분리의 효능, 연관된 세포독성, 수행의 용이함과 속도, 그리고 정교한 장비 및/또는 기술에 대한 필요성에 좌우될 것이다. 분리를 위한 절차에는 항체-코팅된 자성 구슬을 이용한 자성 분리, 친화성 크로마토그래피 및 고형 매트릭스에 부착된 항체로 "팬닝(panning)"이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 정확한 분리를 제공하는 기술에는 FACS가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. FACS를 수행하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 기술된 각 마커에 대한 항체는 상업적으로 구입가능하고(가령, STRO-1에 대한 단클론 항체는 R&D Systems(USA)로부터 상업적으로 구입가능하다), ATCC 또는 다른 기탁 기관으로부터 입수가능하고 및/또는 당분야의 인정된 기술을 이용하여 생산될 수 있다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포를 단리하는 방법은 예로써, STRO-1의 높은 수준 발현을 인식하는 자성 활성화된 세포 분리(MACS)를 이용하는 고형 상 분류 단계인 첫 번째 단계를 포함한다. 특허 명세서 WO 01/14268에서 기술된 바와 같이, 더욱 높은 수준의 전구 세포 발현을 유발하기 위해, 두 번째 분류 단계가 뒤따를 수 있다. 이러한 두 번째 분류 단계는 2개 또는 그 이상 마커의 이용을 필요로 할지도 모른다.
STRO-1+ 세포를 획득하는 방법은 또한, 공지된 기술을 이용한 첫 번째 농축 단계전 이들 세포의 공급원을 수확을 포함할 지도 모른다. 따라서 상기 조직은 외과적으로 제거될 것이다. 공급원 조직을 포함하는 세포는 이후, 소위 단일 세포 현탁액 내로 분리될 것이다. 이러한 분리는 물리적 및/또는 효소적 수단에 의해 달성될 수 있다.
일단 적절한 STRO-1+ 세포 집단이 획득되면, 이것은 임의의 적절한 수단에 의해 배양되거나 확대되어 MEMP가 획득될 수 있다.
한 가지 실시예에서, 이들 세포는 치료되는 개체로부터 채취되고, 표준 기술을 이용하여 시험관내에서 배양되고, 그리고 자기조직 또는 동종이계 조성물로서 개체에 투여를 위해 상층액 또는 가용성 인자 또는 확대된 세포를 획득하는데 이용된다. 대안적 실시예에서, 확립된 인간 세포주 중에서 하나 또는 그 이상의 세포는 상층액 또는 가용성 인자를 획득하는데 이용된다. 본 발명의 다른 유용한 가지 실시예에서, 비-인간 동물의 세포(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터)가 상층액 또는 가용성 인자를 획득하는데 이용된다.
본 개시내용의 방법 및 용도는 비-인간 영장류 세포, 유제류, 개, 고양이, 토끼목, 설치류, 조류, 그리고 어류 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 비-인간 동물 종으로부터 세포를 이용하여 실시될 수 있다. 본 개시내용의 방법이 실시될 수 있는 영장류 세포에는 침팬지, 비비, 게잡이 원숭이, 그리고 임의의 다른 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 개시내용이 실시될 수 있는 유제류 세포에는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 물소 및 들소의 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 개시내용의 방법이 실시될 수 있는 설치류 세포에는 생쥐, 쥐, 기니 피그, 햄스터 및 게르빌루스 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 개시내용이 실시될 수 있는 토끼목 종의 실시예에는 집토끼, 산토끼, 야토, 솜꼬리토끼, 눈신토끼, 그리고 새앙토끼가 포함된다. 닭{Gallus gallus)은 본 개시내용이 실시될 수 있는 조류 종의 실시예이다.
한 실시예에서, 세포는 인간 세포들이다.
본 개시내용의 방법에 유용한 세포는 사용에 앞서, 또는 상층액 또는 가용성 인자를 획득하기에 앞서 보관될 수 있다. 진핵 세포, 특히 포유동물 세포의 보존과 보관을 위한 방법과 프로토콜은 당분야에 공지되어 있다(예로써, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture 프로토콜s, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.를 참고한다). 단리된 줄기 세포, 예를 들면, 간엽성 줄기/기원 세포, 또는 이의 자손의 생물학적 활성을 유지하는 임의의 방법이 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다. 한 가지 실시예에서, 이들 세포는 냉동-보존(cryo-preservation)을 이용함으로써 유지되고 보관된다.
유전자 조작된 세포
한 구체예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손 세포는 예로써, 목적 단백질을 발현시키기 위하여 유전적으로 변형된다. 예를 들면, 세포들은 운동 장애의 치료 또는 뇌졸중의 다른 효과들에 유용한 단백질, 이를 테면, 예를 들면, Meade et al., J Exp Stroke Transl Med 2: 22-40, 2009에서 설명된 신경 성장 인자 또는 펩티드를 발현시키도록 조작된다.
세포를 유전자 조작하기 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 가령, 세포 내에서 발현되는 핵산은 세포 내에서 발현을 유도하기 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 가령, 핵산은 개체의 다양한 세포에서 작동하는 프로모터, 예를 들면, 바이러스 프로모터, 예를 들면, CMV 프로모터(가령, CMV-IE 프로모터) 또는 SV-40 프로모터에 연결된다. 추가 적절한 프로모터는 당분야에 공지되어 있고, 그리고 본 개시내용의 현재 구체예에 준용될 것이다.
한 실시예에서, 핵산은 발현 구조체의 형태로 제공된다. 본 명세서에서, 용어 "발현 구조체"는 세포 내에서, 발현 구조체가 작동가능하게 연결되는 핵산(가령, 리포터 유전자 및/또는 역-선택가능 리포터 유전자)에 발현을 공여하는 능력을 갖는 핵산을 지칭한다. 본 개시내용의 문맥 내에서, 발현 구조체는 이종기원 DNA를 발현가능 형식으로 유지하고 및/또는 복제할 수 있는 플라스미드, 박테리오파아지, 파지미드, 코스미드, 바이러스 하위-게놈 또는 게놈 단편, 또는 기타 핵산이거나, 또는 이를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본 개시내용의 실시를 위한 적절한 발현 구조체의 작제를 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이고, 그리고 예로써, Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) 또는 Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)에서 기술된다. 가령, 발현 구조체의 각 성분은 예로써, PCR을 이용하여 적절한 주형 핵산으로부터 증폭되고, 그리고 적절한 발현 구조체, 예를 들면, 플라스미드 또는 파지미드 내로 차후 클로닝된다.
이런 발현 구조체에 적합한 벡터는 당분야에 공지되어 있고 및/또는 본 명세서에서 기술된다. 가령, 포유동물 세포에서 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 발현 벡터는 예로써, Invitrogen에 의해 공급된 pcDNA 벡터 스위트의 벡터, pCI 벡터 스위트(Promega)의 벡터, pCMV 벡터 스위트(Clontech)의 벡터, pM 벡터(Clontech), pSI 벡터(Promega), VP 16 벡터(Clontech) 또는 pcDNA 벡터 스위트(Invitrogen)의 벡터이다.
당업자는 추가 벡터 및 이런 벡터의 공급원, 예를 들면, Life Technologies Corporation, Clontech 또는 Promega을 인지할 것이다.
발현을 위한 세포 내로 단리된 핵산 분자 또는 이를 포함하는 유전자 구조체를 도입하기 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 소정의 생물체에 대해 이용되는 기술은 공지된 성공적인 기술에 좌우된다. 세포 내로 재조합 DNA을 도입하기 위한 수단에는 그중에서도 특히, 미세주사, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염(transfection), 리포좀(liposome), 예를 들면, 리포펙타민(lipofectamine)(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(cellfectin)(Gibco, MD, USA)에 의해 매개된 형질감염, PEG-매개된 DNA 흡수, 전기천공(electroporation) 및 예로써, DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 입자(Agracetus Inc., WI, USA)를 이용한 미세입자 폭발(microparticle bombardment)이 포함된다.
대안으로, 본 개시내용의 발현 구조체는 바이러스 벡터이다. 적절한 바이러스 벡터는 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 구입가능하다. 핵산의 전달 및 상기 핵산의 호스트 세포 게놈으로의 통합(integration)을 위한 전통적인 바이러스-기초된 시스템에는 예로써, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스 벡터가 포함된다. 대안으로, 아데노바이러스 벡터는 에피솜(episome) 상태로 남아있는 핵산을 호스트 세포 내로 도입하는데 유용하다. 바이러스 벡터는 표적 세포와 조직에서 유전자 전달의 효율적이고 다재다능한 방법이다. 추가적으로, 높은 형질도입(transduction) 효율이 많은 상이한 세포 유형과 표적 조직에서 관찰되었다.
예를 들면, 레트로바이러스 벡터는 일반적으로, 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 포장 수용력(packaging capacity)을 갖는 시스-작용 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR)을 포함한다. 최소 시스(cis)-작용 LTR은 벡터의 복제와 포장에 충분하고, 이것은 이후, 발현 구조체를 표적 세포 내로 통합하여 장기 발현을 제공하는데 이용된다. 폭넓게 이용되는 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SrV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 그리고 이들의 조합에 기초된 것들이 포함된다(예로써, Buchscher et al ., J Virol . 56:2731-2739 (1992); Johann et al , J. Virol . 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al , Virol . 76:58-59 (1990); Wilson et al , J. Virol . 63:274-2318 (1989); Miller et al ., J. Virol . 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al . Proc . Natl . Acad . Sci USA 90:8033-8037, 1993).
핵산 전달을 위해 다양한 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터 시스템 역시 개발되었다. AAV 벡터는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 작제될 수 있다. 예로써, U.S. 특허 번호 5,173,414 및 5,139,941; 국제 공개 번호 WO 92/01070 및 WO 93/03769; Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press);Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol . 755:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994; 그리고 Zhou et al. J Exp . Med . 779:1867-1875, 1994를 참고.
본 발명의 발현 구조체를 전달하는데 유용한 추가 바이러스 벡터에는 예로써, 바이러스의 폭스 패밀리(pox family), 예를 들면, 우두 바이러스(vaccinia virus) 및 조류 폭스바이러스(avian poxvirus) 또는 알파바이러스(alphavirus) 또는 접합체 바이러스 벡터로부터 유래된 것들(가령, Fisher-Hoch et al., Proc. Natl Acad . Sci . USA 56:317-321, 1989에서 기술된 것들)이 포함된다.
세포 및 가용성 인자의 치료적/예방적 잠재력 분석
뇌 기능을 개선시키고 및/또는 운동 장애를 치료하고 및/또는 뇌 뉴런을 재생시키는 세포들 또는 가용성 인자들의 능력을 측정하는 방법들은 당업자들에게 자명할 것이다.
예를 들면, 세포들 또는 가용성 인자들은 뉴런과 배양되고, 축색 성장을 유도하는 세포들 또는 가용성 인자들의 능력은 가령, 현미경 기술로 평가된다. 세포들 및/또는 가용성 인자들을 태아 병아리 뇌로 주입하고, 가령, 본 명세서에서 구체화된 것과 같이 축색의 성장을 평가함으로써 유사한 분석이 생체내에서 실행될 수 있다.
한 실시예에서, 뉴런은 세포들 및/또는 가용성 인자들과의 배양에 앞서 또는 배양 시기에 산소 및/또는 포도당 박탈에 노출된다. 산소 및 포도당 박탈은 허혈의 모델이다.
또다른 실시예에서, 세포들은 가령, 부틸화된 히드록스아니솔(hydroxanisole) 및 발프론산 또는 5-아자시티딘 또는 인도메타신 및 이소부틸메틸산틴 및 인슐인을 포함하는 뉴런 분화를 유도하는 조건하에 성장된다. 뉴런으로 분화되는 세포들은 치료에 적합한 것으로 간주된다.
추가 실시예에서, 세포들 또는 가용성 인자들 (가령, 인자들 또는 단일 인자 또는 인자들의 분획물의 혼합물 (가령, 친화력 크로마토그래피 또는 크로마토그래피에 의해 유도된))은 뇌졸중 모델에 투여되고, 뇌 기능, 뇌 뉴런 재생 및/또는 운동 장애에서 효과가 평가된다.
비-인간 동물 대상에서, 이를 테면, 대동맥/대정맥 폐색, 외부 목 지혈대 또는 부분, 출혈 또는 저혈압, 두개 내 고혈압 또는 보통의 경동맥 동맥 폐색, 2-혈관 폐색 및 저혈압, 4-혈관 폐색, 한측면 공통 경동맥 동맥 폐색 (일부 종의 경우에서만), 동맥 및 정맥의 엔도텔린-1-유도된 수축, 중앙 뇌 동맥 폐색, 자발적 뇌 경색(자연적 고혈압 쥐들에서), 거대구(macrosphere) 색전, 응혈 색전(blood clot embolization) 또는 미소구(microsphere) 색전과 같은 허혈적 뇌졸중을 유도하는 다양한 공지의 기술이 있다. 뇌로 콜라게나제의 주입에 의해 출혈성 뇌졸중을 만들 수 있다.
한 실시예에서, 뇌졸중의 모델은 허혈성 뇌졸중을 만들기 위하여 중앙 뇌 동맥 폐색을 포함한다.
뇌졸중의 효과들을 치료하는 집단 및/또는 후손 및/또는 분비된 인자들의 능력을 테스트하기 위하여, 이 집단 및/또는 후손 및/또는 분비된 인자들은 뇌졸중을 유도한 후, 가령, 1 시간에서부터 뇌졸중후 1일 시점까지 투여된다. 투여 후, 뇌 기능 및/또는 운동 장애의 평가는 가령, 몇 번의 경우에서 이루어진다.
뇌 기능 및/또는 운동 장애의 평가 방법들은 당업자들에게 자명할 것이며, 예를 들면, 로타로드(rotarod), 십자형 높은 미로(elevated plus maze), 오픈-필드(open-field), 모리스 수중 미로(Morris water maze), T-형 미로, 방사선 미로, 움직임의 평가(가령, 일정 시간내 포함된 지역), 꼬리 튀기기(tail flick) 또는 De Ryck의 거동 테스트(De Ryck et al ., Stroke . 20:1383-1390, 1989)를 포함한다. 추가적인 테스트들은 당업자들에게 자명할 것이며 및/또는 본 명세서에서 설명된다.
또다른 실시예에서, 대뇌에서 이 집단 및/또는 후손 및/또는 분비된 인자들의 효과는 영상으로 평가된다. 예를 들면, 아팝토시스, 자식작용(autophagy) 및 신경혈관 단위는 생체내 광학 영상화에 의해 탐지될 수 있고(Liu et al., Brain Res. 2011 Apr 27), 및 PET, MRI 또는 CT는 다양한 인자들, 이를 테면 경색의 크기, 반암부의 크기 및/또는 뇌 손상 정도를 평가하는데 이용될 수 있다.
뇌 뉴런에서 이 집단 및/또는 후손 및/또는 분비된 인자들의 효과 또한 평가된다. 예를 들면, 뇌 또는 이의 대뇌 영역이 제거되고, 뉴런 또는 뉴런의 하위-유형의 수가 평가되거나 또는 산정된다. 이용된 모델에 따라, 이 수는 대조군 동물에서의 수와 비교될 수 있거나, 또는 단지 초점 허혈이 유도된다면, 동일한 동물의 뇌의 대조군 영역과 비교될 수 있다.
세포 조성물
본 개시내용의 한 실시예에서, STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손 세포는 조성물의 형태로 투여된다. 한 실시예에서, 이런 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "담체"와 "부형제"는 활성 화합물의 보관, 투여, 및/또는 생물학적 활성을 용이하게 하기 위해 당분야에서 편의적으로 이용되는 물질의 조성(composition of matter)을 지칭한다(예로써, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)을 참고한다). 담체는 또한, 활성 화합물의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 수 있다. 적절한 담체는 예로써, 안정적인데, 예를 들면, 담체 내에 다른 성분과 반응할 수 없다. 한 실시예에서, 담체는 치료에 이용되는 용량과 농도에서 수용자에서 유의미한 국소 또는 전신 부작용을 발생시키지 않는다.
본 개시내용에 적합한 담체에는 편의적으로 이용되는 것들이 포함된다, 예를 들면, 물, 염수, 수성 덱스트로스, 락토오스, 링거 용액, 완충된 용액, 히알루로난(hyaluronan)과 글리콜은 특히, 용액(등장성일 때)에 대한 선호되는 액체 담체이다. 적절한 제약학적 담체와 부형제에는 전분, 셀룰로오스, 포도당, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아레이트 마그네슘, 스테아레이트 나트륨, 모노스테아레이트 글리세롤, 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다.
또다른 실시예에서, 담체는 예로써, 세포가 성장되거나 현탁되는 배지 조성물이다. 실시예에서, 이런 배지 조성물은 투여되는 개체에서 임의의 유해한 효과를 유도하지 않는다.
예시적인 담체와 부형제는 뇌졸중을 감소, 예방 또는 지연시키는 세포의 능력에 유해한 영향을 주지 않는다.
한 가지 실시예에서, 담체 또는 부형제는 세포 및/또는 가용성 인자를 적절한 pH에 유지시켜 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 완충 활성을 제공한다, 예를 들면, 담체 또는 부형제는 포스페이트 완충된 염수(PBS)이다. PBS는 매력적인 담체 또는 부형제인데, 그 이유는 이것이 세포 및 인자와 최소한으로 상호작용하고 세포 및 인자의 신속한 방출을 가능하게 하기 때문이고, 이런 경우에 본 개시내용의 조성물은 예로써, 주사에 의해 혈류에, 또는 조직 또는 조직을 둘러싸거나 조직에 인접한 구역 내로 직접 적용을 위한 액체로서 생산될 수 있다.
STRO-1+ 세포 및/또는 이들의 후손 세포는 또한, 수용자-화합성이고 수용자에게 유해하지 않는 산물로 분해되는 골격(scaffolds) 내에 함입되거나 끼워 넣어질 수 있다. 이들 골격은 수용자 대상 내로 이식되는 세포에 대한 서포트와 보호를 제공한다. 자연 및/또는 합성 생물분해성 골격은 이런 골격의 실시예이다.
다양한 상이한 골격이 본 발명의 실시예 성공적으로 이용될 수 있다. 예시적인 골격에는 생물학적, 분해성 골격이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 자연 생물분해성 골격에는 콜라겐, 피브로넥틴, 그리고 라미닌 골격이 포함된다. 세포 이식 골격에 적합한 합성 재료는 광범위한 세포 성장과 세포 기능을 지원할 수 있어야 한다. 이런 골격은 또한, 재흡수될 수도 있다. 적절한 골격에는 예로써, Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:153-9 1991에서 기술된 바와 같은 폴리글리콜산 골격; 또는 합성 중합체(synthetic polymer), 예를 들면, 폴리무수물(polyanhydride), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 그리고 폴리락트산(polylactic acid)이 포함된다.
또다른 실시예에서, 이들 세포는 겔 골격(가령, Upjohn Company로부터 겔foam)에 담겨 투여될 수 있다.
본 개시내용에 유용한 세포 조성물은 단독으로, 또는 다른 세포와의 혼합물로서 투여될 수 있다. 본 개시내용의 조성물과 공동으로 투여될 수 있는 세포에는 다능성(multipotent) 또는 만능성(pluripotent) 세포 또는 줄기 세포, 또는 골수 세포가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 상이한 유형의 세포는 투여 직전에 또는 조금 전에 본 발명의 조성물과 혼합되거나, 또는 이들은 투여에 앞서 일정한 기간 동안 함께 공동-배양될 수 있다.
한 실시예에서, 조성물은 효과량 또는 치료적 또는 예방적 효과량의 세포를 포함한다. 가령, 조성물은 약 1x1O5 STRO-1+ 세포/kg 내지 약 1x107 STRO-1+ 세포/kg 또는 약 1x1O6 STRO-1+ 세포/kg 내지 약 5x106 STRO-1+ 세포/kg을 포함한다. 투여되는 세포의 정확한 양은 환자의 연령, 체중과 성별, 그리고 뇌졸중의 정도와 심각도를 비롯한 다양한 인자에 좌우된다.
한 실시예에서, 낮은 약량의 세포들이 대상에게 투여된다. 예시적인 약량은 약 0.1 x 104 내지 0.5 x 106 세포/kg, 예를 들면, 약 0.1 x 105 내지 0.5 x 106 세포/kg, 이를 테면, 약 0.5 x 105 내지 0.5 x 106 세포/kg, 예를 들면, 약 0.1 x 106 내지 0.5 x 106 세포/kg, 가령, 약 0.2 x 106 또는 0.3 x 106 또는 0.4 x 106 세포/kg를 포함한다.
일부 실시예들에서, 세포는 이들 세포가 개체의 순환(circulation) 내로 빠져나가는 것을 허용하지 않지만, 이들 세포에 의해 분비되는 인자가 순화 내로 들어가도록 허용하는 챔버 내에 포함된다. 이러한 방식으로, 가용성 인자는 세포가 이들 인자를 개체의 순환 내로 분비하도록 허용함으로써 개체에 투여될 수 있다. 이런 챔버는 가용성 인자의 국소 수준을 증가시키기 위해 개체 내에 부위에 동등하게 이식될 수 있다, 예를 들면, 이식된 췌장 내에 또는 인근에 이식될 수 있다.
본 개시내용의 일부 구체예들에서, 세포 조성물로 치료의 개시에 앞서 환자를 면역억제하는 것이 필요하거나 바람직하지 않을 수도 있다. 따라서 동종이계, 또는 심지어 이종 STRO-1+ 세포 또는 그의 후손으로 이식이 일부 경우에 관용될 수 있다.
하지만, 다른 경우들에, 세포 조성물에 대항하여 대상의 면역 반응을 감소시키기 위하여, 세포 요법을 시작하기에 앞서, 환자를 약리학적으로 면역억제하는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이것은 전신 또는 국소 면역억제 작용제의 이용을 통해 달성되거나, 또는 캡슐화된 장치에서 세포를 전달함으로써 달성될 수 있다. 세포는 세포 및 세포의 치료 인자에 의해 요구되는 영양소와 산소에 침투성이고, 그리고 면역 체액 인자와 세포에 불침투성인 캡슐 내에 캡슐화될 수 있다. 한 실시예에서, 봉합제(encapsulant)는 저자극성(hypoallergenic)이고, 표적 조직 내에 쉽고 안정되게 위치되고, 그리고 이식된 구조에 부가된 보호를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하기 위한 이들 수단 및 다른 수단은 당분야에 공지되어 있다. 대안으로서, 이들 세포는 그들의 면역원성을 줄이기 위해 유전자 조작될 수 있다.
가용성 인자의 조성물
본 개시내용의 한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 및/또는 후손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자는 예로써, 적절한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다. 한 실시예에서, 담체 또는 부형제는 가용성 인자 또는 상층액의 생물학적 효과에 부정적인 영향을 주지 않는다.
한 실시예에서, 조성물은 상층액의 가용성 인자 또는 성분, 예를 들면, 프로테아제 저해제를 안정화시키는 물질의 조성을 포함한다. 한 실시예에서, 프로테아제 저해제는 개체에 대한 유해한 효과가 나타낼 만큼 충분한 양으로 포함되지 않는다.
STRO-1+ 세포-유래된 및/또는 후손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자를 포함하는 조성물은 예로써, 배양액 배지에서 또는 안정된 담체 또는 완충액 용액, 예를 들면, 포스페이트 완충된 염수에서 적절한 액체 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 담체는 상기 본 개시내용에서 기술된다. 또다른 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 및/또는 자손 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자를 포함하는 현탁액은 주사를 위한 유성 현탁액이다. 적절한 친유성 용매 또는 운반제에는 지방 오일, 예를 들면, 참깨 오일; 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올리에이트 또는 트리글리세리드; 또는 리포좀이 포함된다. 주사에 이용되는 현탁액은 또한, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소르비톨, 또는 덱스트란을 내포할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한, 고도로 농축된 용액의 제조가 가능하도록 화합물의 용해도를 증가시키기 위해 적절한 안정화제 또는 작용제를 내포할 수 있다.
무균 주사가능 용액은 적절한 용매에서 필요한 양으로 상층액 또는 가용성 인자를 필요에 따라, 앞서 열거된 성분 중에서 한 가지 또는 이들의 조합과 통합하고, 그 이후에 여과된 멸균에 의해 제조될 수 있다.
일반적으로, 분산액은 상층액 또는 가용성 인자를 기본 분산 매체 및 앞서 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 미리 무균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조(vacuum drying) 및 냉동-건조(freeze-drying)이다. 본 개시내용의 대안적 측면에 따라서, 상층액 또는 가용성 인자는 용해성을 증강시키는 하나 또는 그 이상의 추가 화합물로 조제될 수 있다.
다른 예시적인 담체 또는 부형제는 예로써, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N. Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y에서 기술된다.
치료적 조성물은 전형적으로, 제조와 보관의 조건 하에 무균이고 안정되어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 기타 정연한 구조로서 조제될 수 있다. 담체는 예로써, 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물을 내포하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성(fluidity)은 예로써, 레시틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우들에서, 조성물 내에 등장성 작용제, 예를 들면, 당, 다가알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염과 젤라틴을 조성물 내에 포함함으로써 달성될 수 있다. 게다가, 가용성 인자는 시한 방출 제제(time release formulation), 예를 들면, 느린 방출 중합체(slow release polymer)를 포함하는 조성물에 담겨 투여될 수 있다. 활성 화합물은 급속한 방출로부터 화합물을 보호하는 담체로, 이식물 및 미세캡슐화된 전달 시스템(microencapsulated delivery system)을 비롯한 방출 제어형 제제(controlled release formulation)로서 제조될 수 있다. 생물분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱, 폴리글리콜릭 공중합체(PLG)가 이용될 수 있다. 이런 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허화되거나, 또는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다.
상층액 또는 가용성 인자는 예로써, 가용성 인자의 느린 방출을 제공하기 위해 적절한 매트릭스와 공동으로 투여될 수 있다.
조성물의 추가 성분들
STRO-1+ 세포-유도된 상층액 또는 가용성 인자들, STRO-1+ 세포들 또는 그의 후손은 다른 유익한 약물들 또는 생물학적 분자들(성장 인자들, 영양에 관한 인자들)과 함께 투여될 수 있다. 다른 물질들과 함께 투여될 때, 이들은 단일 약학 조성물 안에서 함께 투여될 수 있거나, 또는 별도의 약학 조성물로서, 다른 물질들과 동시에 또는 순차적으로(다른 물질들의 투여 전 또는 후) 투여될 수 있다. 함께 투여될 수 있는 생활성 인자들은 항-자가사멸제(apoptotic agent)(가령, EPO, EPO 미메티바디(mimetibody), TPO, IGF-I 및 IGF-II, HGF, 카스파제 억제제들); 항-염증성 물질(가령, p38 MAPK 억제제들, TGF-베타 억제제들, 스타틴, IL-6 및 IL-1 억제제들, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, 그리고 NSAIDs (비-스테로이드성 항-염증성 약물들; 가령, TEPOXALIN, TOLMETIN, SUPROFEN); 면역억제성/면억조절성 물질들(가령, 칼시뉴린 억제제들, 예를 든다면 사이클로스포린, 타크로리무스; mTOR 억제제(가령, SIROLIMUS, EVEROLIMUS); 항-증식제 (가령, 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 코르티코스테로이드(가령, 프레디니솔론, 하이드로코르티손); 항체들 이를 테면, 단클론 항-IL-2R알파 수용체 항체들 (가령, 바실리시마브, 다클리주마브), 다클론성 항-T-세포 항체들 (가령, 항-흉선세포 글로블린(ATG); 항-임파세포 글로블린(ALG); 단클론 항-T 세포 항체 OKT3)); 항-트롬보겐 물질들 (가령, 헤파린, 헤파린 유도체들, 유로키나제, PPack (덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항트롬빈 화합물들, 혈소판 수용체 길항물질들, 항-트롬빈 항체들, 항-혈소판 수용체 항체들, 아스피린, 디피리다몰 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 억제제들, 그리고 혈소판 억제제들); 그리고 항-산화제(가령, 프로부콜, 비타민 A, 아스코르브산, 토코페롤, 코엔자임 Q-10, 글루타티온, L-시스테인, N-아세틸시스테인) 뿐만 아니라 국소 마취제를 포함한다.
한 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 조성물은 뇌 기능을 개선시키고 및/또는 뇌 뉴런을 재생하고 및/또는 운동 장애를 치료하는 추가 인자, 가령, 신경 성장 인자를 포함한다.
대안으로, 또는 추가적으로, 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에 설명된 것과 같이, 세포들, 분비된 인자들 및/또는 조성물은 뇌졸중 효과의 공지된 치료, 가령, 물리요법 및/또는 말하기 요법과 조합된다.
한 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 것과 같이 약학 조성물은 뇌졸중 증상의 치료에 이용된 화합물을 포함한다. 대안으로, 본 개시내용의 임의의 실시예에 따라 설명된 것과 같이 치료/예방 방법은 뇌졸중 증상의 치료에 이용되는 화합물의 투여를 포함한다. 예시적인 화합물들이 본 개시내용에 설명되며, 이들은 본 개시내용의 이들 실시예에 필요한 변경에 의해 적용될 수 있다.
또다른 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 조성물은 선조 세포가 맥관 세포로의 분화를 유도 또는 강화시키는 인자를 추가적으로 포함한다. 예시적인 인자들은 맥관 내피 성장 인자(VEGF), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF; 가령, PDGF-BB), 그리고 FGF를 포함한다.
또다른 실시예에서, 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 조성물은 조직 특이적 결정된(committed) 세포 (TSCC)를 추가적으로 포함한다. 이 점에 있어서, 국제 특허 출원 PCT/AU2005/001445는 TSCC 및 STRO-1+ 세포들의 투여는 TSCC의 강화된 증식을 유도할 수 있다고 설명한다. 한 실시예에서, TSCC는 맥관 세포다. 대상에게 이러한 조성물의 투여는 맥관 구조의 증가된 생산, 가령, 병에 걸린 조직으로 운반될 영양분의 증가로 이어질 수 있다.
의료 장치들
본 개시내용은 임의의 실시예에 따른 본 명세서에서 기술된 방법에 이용되거나 또는 용도의 의료 장치를 또한 제공한다. 예를 들면, 본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 것과 같은 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 얻은 가용성 인자들을 포함하는 주사기 또는 카테테르 또는 다른 적합한 운반 장치를 제공한다. 선택적으로, 주사기 또는 카테테르는 임의의 실시예에 따른 본 명세서에서 기술된 방법에 사용을 위한 지침과 함께 포장된다.
또다른 실시예에서, 본 개시내용은 임의의 실시예에 따라 본 개시내용에서 설명된 것과 같은 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 얻은 가용성 인자들을 포함하는 이식물을 제공한다. 선택적으로, 이식물은 임의의 실시예에 따른 본 명세서에서 기술된 방법에 사용을 위한 지침과 함께 포장된다. 적합한 이식물은 상기 본 개시내용에서 설명된 것과 같이 골격과 STRO-1+ 세포들 및/또는 그의 후손 세포들 및/또는 이로부터 얻은 가용성 인자들로 형성될 수 있다.
투여 방식
STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 외과적으로 이식되거나, 주사되거나, 전달되거나(가령, 카테터 또는 주사기에 의해), 또는 수복 또는 증가가 요구되는 부위, 예를 들면, 지방 패트로 직접적으로 또는 간접적으로 달리 투여될 수 있다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 이의 자손은 대상의 혈류로 전달된다. 가령, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 비경구 전달된다. 비경구 투여의 예시적인 루트에는 복막내, 복막내, 심실내, 뇌실내, 척수강내 또는 정맥내가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 그의 후손은 동맥내, 대동맥 내로, 심장의 심이 또는 심실 내로, 혈관, 예를 들면, 정맥내로 전달된다.
심장의 심이 또는 심실에 세포 전달의 경우에, 세포는 폐에 세포의 급속한 전달로부터 발생할 수 있는 합병증을 피하기 위해 왼쪽 심이 또는 심실에 투여될 수 있다.
한 실시예에서, 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들은 경동맥으로 투여된다.
한 실시예에서, 이 집단 및/또는 후손 및/또는 가용성 인자들은 대상의 뇌 가령, 두개골내로 투여된다. 예를 들면, 이 집단 및/또는 세포들 및/또는 가용성 인자들은 대뇌 및/또는 선택적으로 선조체로 투여된다.
한 실시예에서, 이 집단 및/또는 세포들 및/또는 가용성 인자들은 허혈 부위 및/또는 허혈 부위의 주변으로 투여된다. 이들 부위는 당업계에 공지되어 있는 방법들, 자기 공명 영상 및/또는 컴퓨터 단층 촬영 및/또는 초음파를 이용하여 결정될 수 있다.
치료적 제제에 대한 투여 섭생의 선별은 독립체의 혈청 또는 조직 회전율(turnover rate), 증상의 수준, 그리고 독립체의 면역원성(immunogenicity)을 비롯한 여러 인자에 좌우된다.
한 실시예에서, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 이의 자손은 단일 일시주사 복용량(단일 bolus dose)으로서 전달된다. 대안으로, STRO-1+ 세포-유래된 상층액 또는 가용성 인자, STRO-1+ 세포 또는 이의 자손은 연속 주입(continuous infusion)에 의해, 또는 예로써, 하루, 1주 또는 주당 1-7회의 간격에서 투약에 의해 투여된다. 예시적인 투약 프로토콜은 유의미한 원치 않는 부작용을 회피하는 최대량 또는 투약 빈도를 수반하는 것이다. 총 1주 용량은 이용되는 인자들/세포들의 유형과 활성에 좌우된다. 적절한 용량의 결정은 예로써, 치료에 영향을 주거나, 또는 치료에 영향을 줄 것으로 예측되는 당분야에서 공지되거나 예상되는 파라미터 또는 인자를 이용하여 임상의에 의해 만들어진다. 일반적으로, 투약은 최적 용량(optimum dose)보다 다소 적은 양으로 시작되고, 그 이후 임의의 부정적인 부작용에 비하여 원하는 또는 최적 효과가 달성될 때까지 작은 증분(increment)에 의해 증가된다.
본 개시내용은 다음의 비-제한적 실시예들을 포함한다.
실시예
실시예 1: STRO-3 + 세포의 선별에 의한 MPC의 면역선별
골수(BM)는 건강한 정상 성인 지원자(20-35세 연령)로부터 수확되었다. 간단히 말하면, 40 ml의 BM이 후장골극(posterior iliac crest)으로부터 리튬-헤파린 항응혈약-내포 튜브 내로 흡출된다.
BMMNC는 기존 문헌(Zannettino, A.C. et al. (1998) Blood 92: 2613-2628)에서 기술된 바와 같이, LymphoprepTM(Nycomed Pharma, Oslo, Norway)을 이용한 밀도 구배 분리에 의해 제조된다. 4℃에서 30분 동안 400 x g에서 원심분리 이후에, 연층(buffy layer)은 이전 피펫(transfer pipette)으로 제거되고, 그리고 5% 소 태아 혈청(FCS, CSL Limited, Victoria, Australia)을 내포하는 Hank 균형 염 용액(HBSS; Life Technologies, Gaithersburg, MD)으로 구성되는 "HHF"에서 3회 세척된다.
STRO-3+ (또는 TNAP+) 세포는 기존 문헌(Gronthos et al. (2003) Journal of Cell Science 116: 1827-1835; Gronthos, S. and Simmons, P.J. (1995) Blood 85: 929-940)에서 기술된 바와 같이, 자성 활성화 세포 분리에 의해 차후 단리되었다. 간단히 말하면, 대략 1-3 x 108 BMMNC는 HHF에서 10%(v/v) 정상 토끼 혈청으로 구성되는 차단 완충액에서, 얼음 위에서 20분 동안 배양되었다. 이들 세포는 차단 완충액에서 STRO-3 mAb의 10 ㎍/ml 용액 200 ㎕와 함께, 얼음 위에서 1시간 동안 배양된다. 이들 세포는 400 x g에서 원심분리에 의해 HHF에서 차후 2회 세척된다. HHF 완충액에서 1/50 희석의 염소 항-생쥐 γ-비오틴(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)이 첨가되고, 그리고 이들 세포는 얼음 위에서 1시간 동안 배양된다. 세포는 MACS 완충액(1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 나트륨 아지드로 보충된 Ca2+-와 Mn2+-없는 PBS)에서 상기와 같이 2회 세척되고 0.9 ml MACS 완충액의 최종 부피에서 재현탁되었다.
100 ㎕ 스트렙타비딘 마이크로구슬(Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany)이 세포 현탁액에 첨가되고 얼음 위에서 15분 동안 배양된다. 세포 현탁액은 2회 세척되고, 0.5 ml의 MACS 완충액에서 재현탁되고, 그리고 미니 MACS 칼럼(MS Columns, Miltenyi Biotec) 위에 차후 적하되고, 그리고 STRO-3 mAb(수탁 번호 PTA-7282로 2005년 12월 19일자에 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁됨 - International Publication No. WO 2006/108229를 참고한다)에 결합하지 않은 세포를 회수하기 위해 0.5 ml MACS 완충액으로 3회 세척된다. 추가의 1 ml MACS 완충액의 첨가 후, 칼럼은 자석으로부터 제거되고, 그리고 TNAP+ 세포는 정압(positive pressure)에 의해 단리된다. 각 분획으로부터 세포의 분취량(aliquot)은 스트렙타비딘-FITC로 염색될 수 있고, 그리고 순도는 유세포분석법에 의해 평가될 수 있다.
실시예 2: STRO-3 mAb에 의해 선별된 세포는 STRO-1 밝음 세포이다
세포 STRO-1밝음 세포를 단리하기 위한 단일 반응물로서 STRO-3 mAb를 이용하는 잠재력을 확증하기 위한 실험이 설계되었다.
STRO-3(IgG1)은 STRO-1(IgM)의 것과 상이한 아이소타입이라는 점을 고려하여, 클론원성 CFU-F를 확인하는 STRO-3의 능력은 MACS 절차를 이용하여 단리된 STRO-1- 세포와의 공동-발현에 기초하여 이중-칼라 FACS 분석에 의해 평가되었다(도 1). 점도표 히스토그램은 리스트모드 데이터로서 수집된 5 x 104 사건을 나타낸다. 수직선과 수평선은 동일한 조건 하에 처리된 아이소타입-정합된 대조 항체, 1B5(IgG)와 1A6.12(IgM)로 획득된 <1.0% 평균 형광의 반응성 수준으로 설정되었다. 이들 결과는 STRO-1밝음 세포의 소수 집단이 TNAP(위쪽 오른쪽 사분면)을 공동-발현하지만, 나머지 STRO-1+ 세포가 STRO-3 mAb와 반응하지 않는다는 것을 증명한다. 4개의 사분면 모두로부터 FACS에 의해 단리된 세포는 CFU-F의 발생에 대해 차후 검정되었다(표 1).
Figure 112013120507777-pct00001
실시예 3: STRO-1 둔감 및 STRO-1 밝음 세포들의 상대적인 유전자 및 표면 단백질 발현
첫 번째 연속 실험에서, 반-정량적 RT-PCR 분석을 이용하여 형광 활성화된 세포 분류에 의해 단리된 STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 집단에 의해 발현되는 다양한 계통-연합된 유전자들의 유전자 발현 프로파일을 검사하였다(도 2A). 두 번째 연속 실험에서, 유동 세포분석법 및 평균 채널 형광 분석을 이용하여 형광 활성화된 세포 분류에 의해 단리된 STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 집단에 의해 발현되는 다양한 계통-연합된 단백질들의 표면 단백질 발현 프로파일을 검사하였다.
총 세포성 RNA는 2 x 106 STRO-1밝음 또는 STRO-1둔감 분류된 1차 세포들, 연골세포 펠렛 및 기타 유도된 배양물로부터 준비하였고, 그리고 제조업자의 권장에 따라 RNAzolB 추출 방법(Biotecx Lab. Inc., Houston, TX)을 이용하여 추출하였다. 각 하위집단으로부터 단리된 RNA를 제 1 가닥 cDNA 합성 키트 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 준비된 cDNA 합성을 위한 주형으로 이용하였다. 다양한 전사체들의 발현은 이미 설명된 표준 프로토콜(Gronthos et al., J. Bone and Min. Res. 74:48-57, 1999)을 이용하여 PCR 증폭에 의해 산정되었다. 본 연구에 이용된 프라이머 세트는 표 2에 나타낸다. 증폭 후, 각 반응 혼합물은 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었고, 그리고 에티디움 브롬화물 착색으로 시각화되었다. RNA 일체성은 GAPDH의 발현에 의해 평가되었다.
각 세포 표식에 대한 상대적인 유전자 발현은 ImageQant 소프트웨어를 이용하여 하우스-키핑 유전자, GAPDH의 발현을 참고하여 평가되었다(도 2B, C). 추가적으로, 이중-색 유동 세포분석을 이용하여 STRO-1 항체와 조합된 광범위한 세포 계통-연합된 표식의 발현에 기초하여 탈체 확장된 MPC의 단백질 발현 프로파일을 검사하였다. STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 배양된 세포들의 유전자 및 단백질 발현에 기초하여 일반적인 유전자형의 요약은 표 3에 제시된다. 이 데이터에서 탈체 확장된 STRO-1밝음 MPC는 혈관 주위 세포들과 연합된 앙기오포에틴-1, VCAM-1, SDF-1, IL-1p, TNFα, 및 RANKL을 포함하는 표식들을 차등적으로 더 많이 발현하였다는 것을 나타낸다. STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 배양된 세포들의 단백질 및 유전자 발현 프로파일의 비교는 표 3 및 4에 요양된다.
공제(substractive) 혼성화 연구를 또한 실행하여 STRO-1밝음 세포들에 의해 독특하게 발현되는 유전자를 확인하였다. 간략하게 설명하자면, STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 은 상기에서 설명된 것과 같이 단리되었다(도 3A 참고). RNA STAT-60 시스템(TEL-TEST)을 이용하여 5가지 상이한 골수 시료로부터 모은 STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 세포들로부터 총 RNA가 준비되었다. 제 1-가닥 합성은 SMART cDNA 합성 키트(Clontech Laboratories)를 이용하여 실행되었다. 생성된 mRNA/단일-가닥으로된 cDNA 하이브리드는 제조업자의 설명에 따라 첫 RT 과정 동안 형성된 3' 및 5' 프라임 말단에서 특이적 프라이머 부위들을 이용하여 먼-거리(long-distance) PCR(Advantage 2 PCR 키트; Clontech)에 의해 증폭되었다. STRO-1밝음 cDNA의 Rsa1 절단 이후, Clontech PCR-Select cDNA Substraction 키트를 이용하여 상이한 특이적 어뎁터 올리고뉴클레오티드를 결찰시키는데 2 분획(aliquots)이 이용되었다. 2회의 공제 혼성화는 제조업자의 프로토콜에 따라, STRO-1밝음 (테스터) 및 STRO-1둔감 (드라이버) cDNA를 이용하여, 그리고 반대경우도 마찬가지로, 실행되었다. 이 과정은 STRO-1밝음 드라이버 cDNA에 대항하여 혼성화된 STRO-1둔감 테스터 cDNA를 이용하여 또한 실행되었다.
STRO-1밝음 집단에 의해 독특하게 발현되는 유전자를 확인하기 위하여, STRO-1밝음-공제된 cDNA를 이용하여 T/A 클로닝 벡터안에 결찰된 STRO-1밝음 공제된 cDNA로 형질변환된 200개의 무작위로 선택된 세균 클론을 포함하는 모사(replicate) 저-밀도 마이크로어래이 필터를 구축하였다. 마이크로어래이는 [32P] dCTP라벨된 STRO-1밝음또는 STRO-1둔감 공제된 cDNA로 후속적으로 프로브되었다(도 3B-C). 분별 스크리닝으로 총 44개의 클론이 확인되었는데, 이들은 STRO-1둔감 및 STRO-1밝음 하위집단 사이에 매우 차등적으로 발현되었다. 차등적으로 발현된 모든 클론의 DNA 서열과에서 오직 1개의 클론이 공지의 기질(stromal) 세포 미토겐; 즉, 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF)를 나타내었다(Gronthos and Simmons, Blood . 85: 929-940, 1995). 흥미로운 것은, 44개의 클론중 6개는 케모킨, 기질-유도된 인자-1(SDF-1)에 대응하는 DNA 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 인간 STRO-1밝음 세포들에서 SDF-1 전사체들의 매우 풍부함은 새로 분류된 STRO-1밝음, STRO-1둔감, 그리고 STRO-1음성 골수 하위집단으로부터 준비된 총 RNA의 반정량적 RT-PCR에 의해 확인되었다(도 3D 및 표 3).
Figure 112013120507777-pct00002
Figure 112013120507777-pct00003
단백질 표면 발현과 STRO-1 발현의 밀도와의 상관관계를 위하여, 탈체 확장된 세포들 유도된 골수 MPC의 단일 세포 현탁액을 트립신/EDTA 분리에 의해 준비하였고, 후속적으로 세포 계통-연합된 광범위한 표식들을 확인하는 항체와 함께 STRO-1 항체로 항온처리되었다. STRO-1은 염소 항-뮤린 IgM-플루오레세인 이소티오시아네이트를 이용하여 확인되었으며, 모든 다른 표식들은 염소 항-마우스 또는 항-토끼 IgG-피코에리트린을 이용하여 확인되었다. 세포내 항원을 확인하는 이들 항체의 경우, 세포 조제물을 우선 STRO-1 항체로 라벨시키고, 차가운 70% 에탄올에 고정시켜, 세포 막이 삼투성이 되도록 하고, 그 다음 세포내 항원-특이적 항체와 함께 항온처리되었다. 아이소타입 정합된 대조군 항체들이 동일한 조건에서 이용되었다. 이중-색조 유동 세포분석은 COULTER EPICS 유동 세포측정기를 이용하여 실행하였고, 리스트 모드 데이터가 수집되었다. 점도표는 각 계통 세포 표식 (y-축) 및 STRO-1 (x-축)에 대한 형광 강도 수준을 나타내는 5,000개 리스트모드 이벤트를 나타낸다. 수직 및 수평 사분면은 아이소타입 정합된 음성 대조군 항체를 기준하여 확립되었다.
Figure 112013120507777-pct00004
실시예 4: 인간 치수 줄기 세포들 ( hDPSC )는 뉴런으로 분화된다
DPSC들과 인간 포피 섬유아세포의 단리
DPSCs 및 인간 박탈된 유치(SHEDs)는 Gronthos et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A 97:1362513630, 2000에서 설명된 것과 같이 기본적으로 단리되었다. University of Adelaide and Institute of Medical and Veterinary Science Human Subjects Research Committees (H-73-2003)에 의해 정해진 승인된 지침하에 Dental Clinic of the University of Adelaide의 치과에서 일상적인 발치를 경험하는 환자들의 정보동의서와 함께, 간단하게 설명하자면, 버려진 정상적인 인간의 치조에 매복된 세 번째 어금니를 성인들로부터 수거하고(19-35세) 또는 박탈된 치아(7-8세)를 수집하였다. 치아 표면을 깨끗하게 닦고, 치수(pulp) 방이 들어나도록 바이스(vice)를 이용하여 금이간 부분을 개방하였다. 치수 조직을 크라운과 치근으로부터 부드럽게 분리시키고, 그 다음 3 mg/ml 콜라게나제 유형 I 및 4 mg/ml 디스파제(디스파제) 용액에서 37℃에서 1시간 동안 절단시켰다. 단일-세포 현탁액들은 이 세포들을 70-μM 여과기(strainer)를 통하여 통과시킴으로써 획득되었다. 치수의 단일-세포 현탁액 (1 - 2 × 105)을 성장 배지(20% 태아 송아지 혈청, 100 μM 1-아스코르브산 2-포스페이트, 2 mM 1-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 그리고 100 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 Eagle 배지의 α-변형)가 있는 T-25 플라스크에 접종시켜 배양물을 확립하였고, 그 다음 37℃, 5% CO2에서 항온처리하였다.
인간 포피 섬유아세포 (HFFs)는 부모의 동의와 함께 신생 남아의 포피 생검의 외식편으로부터 콜라게나제/디스파제 절단(digestion)에 의해 단리되었다.
신경 유도 분석
조직 배양 플라스크 또는 웰은 실온에서 하룻밤 동안 폴리오르니틴 (10 μg/ml 최종 농도)으로 피복시켰다. 플라스크 및 웰은 물로 2회 세척되었고, 그 다음 습도 배양기에서 37℃에서 하룻밤 동안 라미닌(5 μg/ml 최종 농도)으로 피복시켰다. 플라스크 및 웰은 인산염-완충된 염수 (PBS)로 세척되었고, 그 다음 세포들을 추가하기 전 성장 배지로 세척되었다. 세포들은 해동시키고, 80% 합류가 될 때까지 T25-피복된 플라스크에서 성장되었다. 세포들은 6-웰 피복된 플레이트에서 3일 동안 2 ml/웰 성장 배지에서 1.5 × 105/웰의 밀도로 재접종되었고, 또는 8-웰 피복된 챔버 슬라이드에서 2 × 103 세포로 재접종되었다. 그 다음 세포들 은 3주 동안 배지 A 또는 배지 B에서 배양되었다. 배지 A는 Neurobasal A 배지 (10888-022; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 100 U/ml 페니실린, 1× B27 보충물, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml 상피 성장 인자 (EGF, 100-15; PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), 및 40 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자 (FGF, 번호 104FGFB01; Prospec Tany Techno Gene, Rehovot, Israel)로 구성된다. 배지 B는 3-주 기간 동안 3가지 별도 배지 조건을 포함하는데: 첫 번째 배양은 7일간을 위한 배지 A이며, 그 다음 50:50 비율의 Dulbecco 변형된 Eagle 배지(DMEM, 12100-046; Invitrogen)와 F12 배지 (21700-075; Invitrogen)로 구성된 배지로 교환하고, 그리고 인슐린-트란스페린-나트륨-셀레나이트 보충물 (ITTS, 11074547001; Roche Diagnostics, Basel, Switzerland), 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 그리고 40 ng/ml FGF으로 7일간. 배양의 최종 7일간은 50:50 비율의 DMEM과 F12 배지, ITTS, 100 U/ml 페니실린 그리고 100 μg/ml 스트렙토마이신, 40 ng/ml FGF, 및 0.5 μM 레티논산(RA, R2625; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 포함하는 배지로 구성되었다. 대조군 샘플들은 뉴런 유도성 분석 동안 성장 배지에서 유지되었다. 모든 조건에 대한 배지는 2주간 것으로 교체되었다.
전기생리학(Electrophysiology)
3-주 뉴런 분화 분석이 종료될 때, 세포들은 트립신으로 해방되었고, 염산으로 처리된 유리 커버 슬립상에서 뉴런 분화 배지 또는 성장 배지에서 2 × 104 세포들/500 μL의 농도로 재도말되었고, 24 시간동안 항온처리되었다. 전(whole)-세포 패치 클램핑(patch clamping)은 컴퓨터 기반 패치 클램프 증폭기(EPC-9; HEKA Electronics, Lambrecht/Pfalz, Germany) 및 PULSE 소프트웨어(HEKA Electronics)를 이용하여 실행되었다. 수조(bath) 용액은 다음을 포함한다(mM): NaCl, 140; KCl, 4; CaCl2, 2; MgCl2, 2; 포도당, 10; 및 HEPES, 10; NaOH로 pH 7.4로 조정됨. K+ 채널을 차단하고, Na+ 전류를 구별하기 위하여, 내부 용액에 있는 K 글루타메이트와 KCl은 동몰량의 Cs 글루타메이트와 CsCl로 대체되었다. 패치 피펫을 붕규산염 유리로부터 뽑아내고, 그리고 화염 연마시켰다; 피펫 저항성은 2 - 4 MΩ 범위내에 있었다. JPCalc (Dr. P.H. Barry, University of New South Wales, Sydney, Australia, 1994에서 제시된)에 의해 측정되었을 때 나타낸 모든 전압은 액간 전위에 대해 교정되었다(K+- 및 Cs+-기반의 내부 용액의 경우, -14 mV 및 -18 mV). 보유 전위는 전체적으로 -90 mV이었다.
조류 배 주사(Avian Embryo Injections)
계란(백색 레그혼(leghorn); HICHICK Breeding Company, Bethal, Australia)을 계란 틀에 세로로 배치하였고, 주사전 단계 10-12에 도달되도록 37℃에서 대략 40시간 동안 가습 배양기에서 항온처리되었다. 녹색 형광 단백질(GFP)-형질변환된 성인 인간 DPSCs 또는 HFFs (5 × 103 세포들∧L)를 발생단계의 조류 배(embryo)로 주사하였다. 빠른 녹색 염료(2 μL)를 이 세포들에 추가하여, 주사 과정 동안에 이들을 볼 수 있도록 하였다. 배(Embryos)는 계란을 70% 에탄올로 닦아서 준비하였고, 바늘을 이용하여 계란으로부터 알부민을 추출하고, 계란 위 부분에 잘라내어 창을 만들고, 배는 배의 아래에 Indian 잉크(Winsor and Newton, Middlesex, England) (Ringer 용액[1 L ddH2O에서 7.2 g NaCl2, 0.17 g CaCl2, 0.37 g KCl, 0.115 g Na2HPO4, pH 7.4로 조정하고, 멸균 여과됨]에서 1:10으로 준비됨)를 주사하여 볼 수 있었다. Ringer 용액을 배의 상단에 배치시켜 수준이 유지되도록 하였다. 난황 막을 텅스턴 와이어를 이용하여 배의 머리 주변으로부터 제거하였다. 세포들은 25 볼트로 설정된 극미조작장치 및 압력 주입기(Narishage, Tokyo)에 부착된 유리 모세관 바늘(GC1OOTF-10; SDR Clinical Technology, Sydney, Australia,)에 위치시켰다. 극미조작장치를 이용하여 바늘이 발생중인 후뇌에서 능형분절(rhombomere) 2에 바로 인접한 영역으로 유도되도록 하였다. 세포들은 압력 주입기에 부착된 발로밟는 펌프를 이용하여 배(embryo)로 주사되었다. 유리 바늘을 빼내고, Ringer 용액 몇 방울을 배(embryo)의 상단에 위치시켰다. 계란은 접착 테이프로 봉하고, 가습 배양기로 되돌려 보냈다. 항온처리 기간후, 배(embryo)를 계란으로부터 잘라내고, 차가운 PBS에 두었다; GFP-주사된 세포들은 형광 해부 현미경으로 시각화되었다. 그 다음 배(Embryos)를 잘게 전단하였고; 머리는 공개되도록 절단되었는데, 이를 테면, 복부를 따라 코로부터 후뇌쪽으로 머리길이 정도 아래로 절단되었다. 잘게 절단된 배(embryos)는 실온에서 2시간 또는 4℃에서 하룻밤 정도 4% PFA에서 고정되었고, 그 다음 면역형광 착색에 앞서 PBS로 2회 세척되었다.
배양된 세포 준비물의 면역세포화학
챔버 슬라이드는 실온에서 30분 동안 4% PFA에서 고정되었고, 그 다음 PBS 및 0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich) (PBS-T)으로 세척되었다. 배양물은 실온에서 30분 동안 차단되었고(PBS-T에서 10% 말 혈청) 그리고 4℃에서 하룻밤 동안 차단 용액내에서 1차 항체 (1:100 네스틴 (611658; BD Biosciences, San Diego, USA); 1:500 폴리시알산-신경 세포 흡착 분자(PSA-NCAM) (Dr. T. Seki로부터 제공받음), 1:500 β-III 튜블린 클론, TUJ1 (MMS-435P, 1 mg/ml; Covance, Princeton, NJ, USA); 1:200 NF-M (13-0700, 0.5 mg/ml; Zymed, South San Francisco, CA); 1:500 NF-H (AB1991; Chemicon, Temecula, CA, USA)와 함께 항온처리되었다. 마우스, 염소, 그리고 토끼 (Ig) 대조군은 동일한 조건하에서 처리되었다. 세척 후 2차 항체 (1:200 염소 항-마우스 Alexa 488 [A11029, 1.5 mg/ml; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA]; 1:200 염소 항-토끼 Alexa 488 [A1 1034, 2 mg/ml [Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA])를 어두운 상태에서 실온에서 2시간 동안 차단 용액에 추가하였다. 끝으로, 슬라이드는 세척하고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI, P36931; Invitrogen)와 함께 Prolong 골드 안티페이드(antifade)로 덮었다.
결과
도 4에서 나타낸 것과 같이, hDPSC가 뉴런 유도성 배지에서 성장할 때, 이들은 나트륨 전류를 실행하기 위한 생물물리적 성질을 가진 다중진행(multiprocess) 뉴런-유사 세포들로 분화된다. 더욱이, hDPSC가 병아리 배의 뇌로 이식될 때, 이들은 신경섬유(neurofilament)를 발현시키는 뉴런-유사 세포들로 분화된다.
실시예 4: hDPSC 처리는 설치류 모델에서 뇌졸중 이후 앞다리 운동 기능을 개선시킨다
hDPSC의 치료 효과는 허혈성 뇌졸중을 초래하는 중앙 뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델에서 평가되었다. MCAO는 인간에서 가장 흔하게 나타나는 허혈성 뇌졸중이며, 그리고 MCAO의 전(pre)-임상 설치류 모델은 인간 조건에서 재현된다. 이 모델에서, MCAO는 중앙 뇌 동맥을 폐색시키기 위하여 내부 경동맥 안으로 나일론 섬유를 전방으로 밀어 넣어 삽입시킴으로써 일으키게 되고, 나일론 섬유는 내부 경동맥의 말단부에 있게 된다.
방법
인간 DPSC 배양 및 준비
인간 DPSC들은 치수 조직의 절단(digestion)에 의해 성인의 치조에 매복된(예상된 위치로 충분히 돌출되지 못한) 셋째 어금니로부터 단리시키고, 그리고 형광 표식 녹색 형광 단백질(GFP)과 함께 레트로바이러스적으로 형질변환되었다. 3-5 계대에서 DPSC들은 태아 송아지 혈청내 10% 디메틸 술폭시드에서 냉동보존되었다. 세포들은 해동되었고, 뇌 안으로 이식하는데 이용되기에 앞서 최소한 1번 계대되었다. DPSC들은 20% 태아 송아지 혈청, 100 DM L-아스코르브산 2-포스페이트(Wako, Richmond, VA), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 변형된 Eagle 배지(Sigma-Aldrich, St. Louis, http://www.sigmaaldrich.com)내에서 5% CO2, 37℃에서 배양되었다. 세포들은 트립신으로 분리되었고, 보충물없이 변형된 Eagle 배지에서 마이크로리터당 1.5 x 105 세포의 최종 농도로 재현탁되었다. 세포 생존능은 트립판 블루 염료 배제 방법으로 측정되었다.
설치류 중앙 뇌 동맥 폐색 및 뇌안으로 이식
300±20 g 무게가 나가는 44마리 다자란 수컷 Sprague-Dawley 쥐들을 음식과 물에 임의 접근을 허용하면서 12시간 명/암 주기에서 유지시켰다.
쥐들은 이소플루란으로 마취시키고, 관강내 기부 중앙 뇌 동맥 폐색 (MCAo)을 통하여 일과성, 초점 뇌 허혈이 되도록 하였다[Aspey et al., Neuropathol Appl Neurobiol., 26: 232-242, 2000 and Spratt et al., J Neurosci Methods, 155: 285-290, 2006에서 기본적으로 설명된 것과 같이]. 직장 온도는 발열 패드를 이용하여 37 ± 1℃에서 유지되었고, 혈액 산소 포화 및 맥박수를 모니터하였고, 펄스 산소농도계(모델 8500AV; Nonin Medical, Plymouth, MN)로 생리학적 매개변수 범위내에서 유지시켰다. 요약하면, 우측 총경동맥, 외경동맥(ECA), 내경동맥(ICA), 및 익두개와동맥(pterygopalatine artery)은 둔적박리(blunt dissection)를 통하여 노출시켰고, ECA의 소작(cauterization) 및 결찰이 있었다. 실리콘-피복된 팁(직경 0.35 mm, 길이 5 mm)과 함께 4-0 단섬유 나일론 실 (Dynek, Hendon, SA, Australia)은 ECA 기부로부터 ICA를 통하여 우측 중앙 뇌 동맥 (MCA)의 원점까지 진전되었다. 실을 적소에서 고정시키고, 절개를 닫았다. 폐색 2시간 후, 쥐들을 다시 마취시키고, 실을 빼내어 재관류를 허용하였다. 쥐들은 외과술로부터 회복되도록 두었고, 간단하게 꼬리로 동물을 매달아 반대측 앞다리 골곡을 평가하였고, 2시간 시점에서 MCAo을 실증하기 위하여 마루에서 빙글빙글 도는 거동을 평가하였다. MCAo 이후 24시간 시점에서, 동물을 무작위로 선택하여 인간 DPSC (n = 31) 처리를 제공받거나 또는 비이클(n = 23) 처리를 하였다(처리 일정을 나타내는 도 5 참고). 몸에서 같은 쪽 유조직(parenchyma)으로 2개의 정위 좌표 (전정에 대해 전-후, 중간-측면; 경뇌막으로부터 배면-복부)로 총 용적 4μl의 세포 현탁액 (6x105 세포들)을 주사하였고(1 μE/분): 정위 프레임(Kopf Instruments, Tujunga, CA)을 이용하여 2 μl는 선조체로 (-0.40, +4.00; -5.50 mm) 그리고 또다른 2μl는 피질로(-0.40, +4.00; -1.75 mm). 비이클 동물들도 비이클로 α-변형된 Eagle 배지를 투여하여 유사하게 처리되었다. 모든 동물들은 매일 피하로 10 mg/kg 사이클로스포린 A (Novartis, Basel, Switzerland) 주사를 맞았다.
2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드 착색
2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드 (TTC) 착색은 허혈을 확인하기 위하여 실행되었다. 신선한 뇌를 2-mm 조각으로 절단하고, 어두운 상태에서 10분간 37℃에서 2% TTC (Sigma-Aldrich)에서 항온처리되었다. LiDE210 평상 스캐너(Canon, Tokyo)를 이용하여 뇌 절단면을 컬러 영상화시켰다.
기능적 평가
동물들은 MCAo에 앞서 3일 연속 훈련받았고, 셋째 세션(1일차)은 수술전 기준으로 이용되었다. 거동의 블라인드 평가는 1일 차(DPSC 이식에 앞서), MCAo 이후 7, 14, 21, 및 28일차(각 테스트에서 3회 시도)에서 밝은 주기 동안 실행되었다(도 1C). 전(pre)-MCAo 신경거동 훈련을 실패한(이때 동물은 각 테스트헤어 기선 득점을 획득하지 못하였다) 그리고 MCAo 이후 최소한 1주일 시점에서 매우 적거나 아예 없는 또는 매우 심각한 기능적 결함을 나타내는 동물들은 배제되었다. 실험은 무작위 처리 할당과 블라인드 결과 평가로 실시되었고, 이는 Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) 및 유사한 지침에 따른 것이다.
신경득점(Neuroscore)
MCAo 이후 각 동물에서 총체적 신경 기능이상은 기존 연구로부터 변형된 득점 체계를 이용하여 평가되었다[Barry et al., Brain Res, 1389: 143-151, 2011; Bederson Stroke, 17: 472-476, 1986; 그리고 Thal et al., J. Neurol. Sci, 286: 150-159, 2008]. 득점이 높을수록 신경 손상이 더 크다는 것을 나타낸다.
접착 테이트 제거 테스트
접착 라벨(15 mm2)을 쥐의 앞발의 중앙 면에 두었다[Bouet et al., Nat Protoc 4: 1560-1564, 2009]. 반대측 또는 몸에서 같은 쪽 앞발에 접착 라벨 배치 순서는 무작위로 하였다. 테스트 우리로 돌아왔을 때, 각 발로부터 접착 라벨을 제거하는데 소요된 시간과 라벨을 제거하는데 이용된 전체 시간(최대 2분을 할당)을 기록하였다. 라벨을 제거하는데 사용된 기간(제거를 위한 시도)은 걸린 전체 시간에 대한 비율로 나타내었다.
걸음걸이 테스트
쥐 몸통과 뒷다리를 약간 들어올리기 위하여 오른손으로 각 쥐들을 단단히 잡고, 다른 한 손으로는 앞발중 하나를 억눌러, 억압되지 않은 다른 앞발에 무게가 실리도록 하였다. [Schallert et al., Exp Neurol, 64: 33-43, 1979]. 쥐들을 옆으로 이동시켜(30 cm) 체중을 실은 앞발이 신체 움직임을 조절하기 위하여 손등방향에서 걸음을 걷도록 하였다. 앞발 테스트 순서는 무작위로 하였다. 각 앞다리에서 걷는 걸음수를 기록하였다.
로타로드(Rotarod)
18 x 1-mm 막대의 동력장비가 설치된 회전 앙상블로 구성된 로타로드 장치에 쥐를 두었다[28]. 회전 속도를 2분 이내 0rpm에서 24rpm으로 올리면서 동물들은 장치위에서 걷도록 하였다. 동물이 이 시험을 완료하는 시간, 이 장치에서 떨어지는 시간 또는 가로대를 잡는 시간 및 가로대 위에서 걸으려는 시도없이 2회 연속 회전하는 시간을 기록하였다.
턱이 있는/가늘어진 들보 걷기(Ledged/Tapered Beam Walking)
동물들은 끝이 어두운 상자 안으로 뻗어있는 가늘어진 높이 있는 들보를 횡단하도록 하였고[Schallert T, Woodlee MT. Orienting and placing. In: Whishaw IQ, Kolb B, eds. The Behavior of the Laboratory Rat: A Handbook with Tests. Oxford, U.K.: Oxford University Press 2005;129 - 140], 이들의 거동을 비디오테이프로 기록하였다. 아래에 매달린 턱(위쪽 들보 면으로부터 2cm 아래)에서 각 뒷다리에 의한 발의 미끄러짐 횟수는 들보를 횡단하는 총 걸음 수의 비율로 산출되었다. 걸보 걸음은 뇌졸중 동물의 빙글빙글 도는 거동으로 인하여 MCAo 이후 1일 시점에서는 완성될 수 없을 것이다.
면역조직화학 및 영상화
신경거동 평가의 결말에서, 쥐들을 깊히 마취시키고, 심장으로 직접 1,000U 헤파린을 주사하였고, 경심(transcardially)으로 얼음 냉각된 염수를 관류시키고, 이어서 인산염-완충된 염수 (PBS)에서 4% (wt/vol) 파라포름알데히드로 관류시켰다. 뇌를 제거하였고, 4℃에서 하룻밤 동안 동일한 고착액에서 후고정시켰다. 생존 인간 DPSC들의 발색 탐지를 위하여, 뇌를 파라핀에 내장시키고, 연속적으로 5∧ 관상 절단면으로 절단시켰다. 절단면은 PBS내에서 3% 정상 말 혈청으로 차단시키고, PBS에서 2회 세척시키고, 마우스 항인간 미토콘드리아(1:1,500; Millipore, Billerica)와 함께 항온처리하고, 이어서 바이오티닐화된 항-마우스 IgG (1:250; Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 스트렙타아비딘 양고추냉이 과산화효소접합된 항체(1:1,000; Thermo Scientific, Rockford, IL)로 항온처리되었다. 항체는 차단 용액에서 희석되었다. 항체 착색은 3,3-디아미노벤지딘(Sigma-Aldrich)으로 시각화되었다. 밝은-상 영상이 획득되었고, NanoZoomer Digital Pathology System (Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japan)을 이용하여 분석되었다. 이식후 4주 시점에서 설치류 뇌 (n = 3)에 남아있는 접목된 세포의 수는 매초 5∧ 관상 절단면에서 카운트하였고, 접목된 세포들은 분석되었다.
이중 면역형광 연구용으로, 100∧m 자유-부유 절단면은 0.3% Triton X-100를 함유하는 PBS에서 10% 정상적인 말 혈청으로 차단시키고, 인간 DPSC들은 염소 항-GFP (1:250; Rockland, Gilbertsville, PA)를 이용하여 확인되었고, 성숙한 뉴런은 마우스 항-뉴런 핵(NeuN; 1:500; Millipore)으로 확인되었고 또는 성상세포 토끼 항-신경교 원섬유성 산성 단백질(GFAP; 1:250; DAKO, Glostrup, Denmark)을 이용하여 확인되었다. 이용된 기타 1차 항체는 마우스 항-β-III 튜블린(1:500; Millipore), 마우스 항-네스틴 (1:100; Abcam, Cambridge, U.K.), 마우스 항-폴리시알산-신경 세포 흡착 분자(PSA-NCAM; 1:200; Millipore) 그리고 마우스 항-O4 (1: 500; Sigma-Aldrich)이었다. 2차 항체는 Cy2-접합된 항-염소 IgG, Cy3-접합된 항-토끼 IgG, 또는 Cy3-접합된 항-마우스 IgG (1:300; Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)이었다. 항체는 차단 용액에서 희석되었다. 모든 절단면들은 ProLong Gold 안티페이드 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)과 함께 탑재되었다. NeuN 또는 GFAP를 공동발현시키는 GFP-양성 세포들의 비율을 평가하기 위하여, D40 확대배수에서 z-스택 영상을 DPSC 이식 (n=3 동물) 수준에서 몸에서 같은 쪽 반구에서 2개의 피질층과 3개의 선조체 영역으로 구성된 5개의 장에서 얻었다. TCS SP5 공촛점 현미경을 이용하여 연속적으로 공촛점 영상을 획득하였고, LAS AF 소프트웨어(Leica Microsystems, Wetzlar)를 이용하여 프로세스하였다. ImageJ (NIH)를 이용하여 직각 투사(Orthogonal projections)를 실행하였다.
뇌량 두께의 측정
전정 및 전정±0.1 mm 수준에서 파라핀 절단면들은 0.1% 크레실 바이올렛으로 착색되었다(n = 6 DPSC-처리됨, n = 2 비이클-처리됨). 뇌량 두께의 측정은 뇌의 양쪽 반구 모두에서 중심선 (2개 반구의 중앙점)과 뇌실의 측면 모서리에서 이루어졌다. 측정은 대응하는 중심선 측정의 비율로 나타내었고, AxioVision 영상화 소프트웨어(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 실행되었다.
통계학적 분석
분석은 GenStat (13th edition; VSN International, Hemel Hempstead, U.K.)를 이용하여 실행되었다. 거동 테스트 득점에서 처리 효과는 개별 쥐들의 연속 측정 사이에 상관관계를 설명하기 위하여 Greenhouse-Geisser 교정과, 그리고 쥐들의 초기 능력에서 있을 수 있는 차이를 설명하기 위하여 공동변향(covariates)으로 뇌졸중이전 데이터에 대한 조정과 함께, 가변식 반복-측정 분석(ANOVA)을 이용하여 분석되었다. 사후(post hoc) Fisher의 보호된 최소 유의차(LSD) 테스트는 초기 ANOVA가 유의적일 때 실행되었다. 차이는 p<0.05에서 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되었다. 데이터는 R (버젼 2.10.1; R Development Core Team, Vienna, Austria)을 이용한 상자 플롯으로 나타내거나 또는 Prism (버젼 5.02, GraphPad Software, Inc., San Diego)을 이용한 막대 그래프로 나타내었다. 보고된 값들은 평균 ± SEM이다.
결과
이식된 인간 DPSC들은 뇌졸중 이후 앞다리 감각운동 회복을 강화시켰다.
초점 뇌 허혈 이후 시간에 따라 신경 거동 기능을 개선시키는 인간 DPSC의 치료 능력이 조사되었다. 치사율 또는 유병율에 대해 대조군과 비교하여 DPSC 치료 이후 유해한 효과가 관찰되지는 않았다. 뇌 안으로 이식 이후 획득된 치사율은 두 처리 집단 모두에서 필적하였다(대략 9%).
단측면 MCAo의 임상적으로 관련된 설치류 모델은 설치류 뇌의 몸에서 같은 쪽 반구에서 배면(dorsolateral) 선조체와 과도한 정면/두정부 피질에 실질적인 허혈성 손상을 야기시킨다. 그 결과, 동물들은 뇌졸중 후 1일 시점에서 11.7 ± 0.4 점의 신경 득점의 증가로 설명되는 신경거동 결함이 발생되었다(도 6A). 추가로, 현저한 앞다리 신체감각 및 운동 불균형이 걸음걸이 테스트(도 6B; MCAo 이후 1일 시점에서 반대측 앞다리에 의한 걸음수에서 82.2 ± 6.6% 감소)와 접착 테이트 제거 테스트 (도 6C; MCAo 이후 1일 시점에서 반대측 앞발로부터 외부 자극을 제거하려는 시도하는 시간에서 93.7±2.8% 감소)에서 나타났다.
실험적 뇌졸중에서, 운동 균형 및 협조의 상실은 로타로드 테스트 (도 6D; MCAo이후 1일 시점에서 로타오드에서 보낸 시간에서 53.0 ± 2.0% 감소)에서 또한 관찰되었다.
뇌졸중-영향을 받은 동물들은 1 주 post-MCAo 이후 1주 시점에서 들보 걸음동안 반대쪽 뒷다리 발미끄러짐에서 뒷다리 비대칭을 보여주었다(도 6E, 21.7 ± 6.2%의 증가). 몸에서 같은 쪽 발들은 정상적인 뇌졸중이후 신경거동 기능을 가졌다.
모든 동물들은 뇌졸중이후 4주에 걸쳐 신경거동 기능에서 점진적인 회복을 보였다(도 6). DPSC-치료된 동물들은 비이클-처리된 집단과 비교하여, 특히 뇌졸중이후 21일과 28일 시점에서 전체적인 신경거동 기능이 유의적으로 강화되었고(도 6A; p < 0.018 집단 x 일수 상호작용, 반복된 측정 ANOVA) 그리고 유의적으로 더 낮은 신경득점을 나타내었다(21일 시점: p < 0.05, 사후 분석 Fisher의 보호된 LSD) 과 28 일시점(p<0.01)). 사지-특이적 신경거동 연구에서, DPSC-처리된 동물들은 걸음걸이 테스트(도 6B; p <0.045 전체 집단 효과)와 접착 테이트 제거 테스트 (도 2C; p <0.049 전체 집단 효과)에서 비이클 대조군과 비교하여 유의적으로 강화된 반대측 (뇌졸중-영향을 받은) 앞다리 감각운동 회복을 나타내었다. 이와 함께, DPSC-처리된 동물들은 측정된 모든 날짜에서 반대측 앞다리의 이용에서 뇌졸중이후 결함이 감소된 것을 보여주었다.
처리 집단 사이에 몸에서 같은 쪽 수족 기능에서 유의적인 차이는 없었다. 로타로드(도 6D) 및 턱모양의/가늘어진 들보 걷기 (도 6E) 테스트에서 수행능은 처리 집단 사이에 통계학적으로 유의적인 차이는 없었다(p < 0.05). 수족의 강화된 기능적 개선에서 차이에 대한 한 가지 가능한 설명은 이 설치류 MCAo 모델은 이 영역으로 선호적인 혈액 공급으로 인하여 설치류 뇌에서 앞다리 기능에 대한 감각운동 피질 표현에 대해 더 많은 파괴를 만든다는 것이다[Salo et al., Soc Neurosc Abstr 13: 1268, 1987]. 이를 뒷받침하는 것으로 본 연구의 동물들에서 걸음걸이 및 접착 테이트 제거 테스트에서 측정된 것과 같이 앞다리 기능의 심각한 상실이 있었지만, MCAo 직후 턱모양의/가늘어진 들보 걷기 테스트에 의해 평가된 것과 같이 뒷다리 기능에서는 정도가 덜한 손상이 있었다. 로타로드 달리기 및 들보 걷기는 운동 협조 및 뒷다리 기능을 각각 평가하고[Hicks et al ., Cell stem Cell , 5: 139-140, 2009], 그리고 이들 테스트는 뇌졸중 이후 결함을 탐지하는데 충분한 감도가 있지 않을 수 있다. 비이클-처리된 동물과 비교하여 DPSC 처리 이후 강화된 기능적 개선은 앞다리 4주 분석에서 명백하였지만, 뒷다리 기능에서는 명백하지 않다.
대안 설명은 동물에서 학습된 보상 운동 거동과 관련있을 수 있다. 로타로드 달리기 및 턱모양의/가늘어진 들보 걷기 테스트에서, 반복된 테스트를 통하여 설치류들은 학습된 새로운 방식을 가질 수 있고, 이때 뇌졸중-영향을 받지 않은 수족 또는 꼬리 편향(deviation)를 이용하여 뇌졸중-영향을 받은 수족에서 기능 상실을 보상하는데 이용될 수 있다[Schaar et al., Exp Transl Stroke Med, 2: 13, 2010]. 앞다리-특이적 작업은 걸음걸이 및 접착 테이트 제거 테스트로 측정된 것과 같이, 뇌졸중 이후 감각운동 기능 상실을 극복하기 위한 보상 거동의 최소 이용을 허용하였다.
전술한 데이터는 hDPSC 이식이 뇌졸중 이후 숙주 신경계의 정상 기능에 영향을 주었고, 대조군 동물과 비교하여 개선된 신경 기능의 개선을 달성하였다는 것을 나타낸다. 이론 또는 작용 방식에 결부되지 않고, 이러한 개선은 뇌졸중 이후 뇌안에서 신경가소성 변화를 통하여 발생될 수 있다. 예를 들면, 상기에서 나타낸 것과 같이, STRO-1+ 세포들은 SDF-1 (CXCL-12)를 발현시킨다. hDPSC들은 이 케모킨을 발현시키는 것으로 또한 나타났다. 더욱이, 비록 이들 동물이 나중 시점에서 상당한 기능적 개선을 나타내지만 hDPSC는 병아리 배(embryo)의 머리로 이식 이후 삼차신경 신경절로부터 축색을 화학유인(chemoattract)한다.
이식 4주 차에 허혈성 뇌에서 DPSC들의 생존
DPSC 이식 이후 신경거동 연구로부터 발견된 사항은 신경 득점 및 앞다리 감각운동 기능에서 나중 시점에 절정의 이득을 나타내었다. 후속 연구는 이들 발견을 설명하기 위한 잠재된 세포 기전이 DPSC를 뇌졸중 뇌로 이식한 이후 신경 세포 대체로 인한 것인지를 조사하였다. 예를 들면, 절정의 이득이 관찰되었을 때 걸음걸이 종점에서 생존된 기증 세포들의 수를 측정하였다. 설치류 뇌 안에서 개별 DPSC는 쥐 조직과는 교차-반응하지 않는 인간 미토콘드리아 항원에 대항하는 특이적 항체로 시각화되었다. 라벨된 세포들의 수는 매초 즉, 10-μm 간격에서 관상 뇌 단면에서 수작업으로 카운트되었다. 이식 이후 4주 시점에서 각 동물의 뇌에서 탐지된 인간 미토콘드리아-양성 세포들의 전체 수는 9,458 내지 22,394개의 세포 범위다(표 5). 13,807 - 4,293개의 남아있는 인간 DPSC들의 평균 수를 제공하였고, 원래 이식된 6x105개의 세포의 평균 생존율 2.3±0.7%을 제공하였다. 우리 데이터는 세포 이식은 성공적이었고, 허혈성 뇌 이후 비록 적은 수의 DPSC-유도된 세포들이지만 장기적인 생존 성과를 얻었다는 것을 설명하였다.
이론에 의해 또는 작용 방식에 결부되지 않고, 초기 이식된 hDPSC의 오직 평균 2.3%만이 뇌졸중-후 28일까지 생존하였기 때문에, 뉴런 대체는 hDPSC가 신경 기능의 개선에 의한 주요 작용 기전 같지는 않다. 그러나, 이러한 뉴런 대체는 약간의 치료 장점을 제공할 수 있다. 이러한 개선을 책임질 수 있는 대안 또는 추가 기전은 신경보호, 혈관신생, 면역-조절 및 신경가소성을 포함한다.
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뇌졸중 병소를 향한 DPSC들의 표적화된 이동
허혈성 쥐 뇌로 인간 DPSC들의 이식후 인간 DPSC들의 공각적 분포를 또한 분석하였다. 이식 후 24시간 시점에서, DPSC들은 주사 부위 주변에 군생을 이루는 것으로 발견되었다. 4주 후, 인간 미토콘드리아-라벨된 세포들은 경색 중심 주변 영역에 주로 발견되었는데(도 7, 8A, 8B), 이것은 이식된 세포들이 이식 부위들로부터 허혈성 경색 쪽으로 선호적으로 이동되었고, 허혈성 경계 영역(IBZ)에서 국소화되었다는 것을 설명한다. 소수의 DPSC들은 세포 이식 부위의 반대측 반구(도 7, 8A, 8B) 및 뇌량 (도 8B)에서 관찰되었다. 세포들은 4주 기간에 걸쳐 반대측 반구쪽으로 최소한 4mm 이동되었다. DPSC-유도된 세포들은 신체의 같은 쪽 반구와 비교하여 반대측 반구에 적은 숫자로 넓게 분포되었고, 그리고 반대측 반구의 특정 표적화된 영역으로 DPSC들의 명백한 이동은 없었다. 드문 경우로 DPSC-유도된 세포들은 뇌 미세 혈관 벽으로 또는 주변으로 통합되었는데, 내피 세포들 (도 4C, 화살표), 혈관주위세포, 또는 평활근 세포들 (도 4C, 화살표머리)과 형태학적 외양이 일치된다.
이식된 인간 DPSC들은 생체내에서 뉴런 및 성상세포로 분화된다
허혈성 뇌 이후 4주 시점에서 인간 미토콘드리아 항원-양성 세포들의 형태를 검사하였다. 세포들은 별모양과 유사한 외양으로 설명되는(도 8D, 화살표) 성상세포와 일치되는 모양을 가지는 것으로 나타났고, 반면 추정적 뉴런 세포들은 긴 과정을 나타내었다(도 8D, 화살표머리). 이들 표현형을 확인하기 위하여 이중 면역형광 분석과 공촛점 영상화가 이용되었다. 이식된 인간 DPSC들은 이미 GFP를 발현시키도록 레트로바이러스적으로 형질변환되었고, 이로써 성숙한 뉴런 또는 성상세포를 각각 식별하기 위하여 NeuN 또는 GFAP으로 공동라벨링이 허용되었다. 신경교 반흔내에서 세포들 안에 GFP 발현과 GFAP의 공동국소화는 DPSC-유도된 세포들이 성상세포로 분화되었음을 확인시켰다. 몸에서 같은 쪽 경색 주변 피질 영역내에서, NeuN 및 GFP 이중-양성 세포들은 이식된 DPSC들이 뉴런으로의 분화를 나타내었다. 허혈후 몸에서 같은 쪽 뇌 반구에서 성상세포와 뉴런의 분포는 균일하지 않았다. 선조체 영역내 IBZ에서 DPSC-유도된 성상세포가 주도적이었고(51.0±8.6% GFAP/GFPD 이중-양성 세포들, GFP 단일-라벨화된 세포들의 비율로 나타냄), 반면 비교에서는 더 적은 비율의 DPSC-유도된 뉴런이 있었다(8.7 ± 6.1% NeuN/GFPD 세포들). 경색 주변 피질 영역에서, 성상세포와 뉴런의 비율은 유사하였다(각각 38 ± 0.6% GFAP/GFP세포들 및 32.1 ± 1.8% NeuN/GFPD 세포들). 선조체에서 IBZ를 따라 발견된 이식된 DPSC들은 주로 성상세포로 분화되었고, 신경교 반흔(glial scar)으로 통합된 것으로 보였다. 선조체와 비교하여 경색 주변 피질 영역에 더 많은 DPSC-유도된 뉴런이 있었다. 흥미롭게, 경색 주변 피질 영역내 GFP세포들의 대략 1/3은 초기/중간 뉴런 표식 β-III 튜블린으로 또한 라벨되었다. 그러나, IBZ를 따라 신경교 반흔 내에 많은 GFP 세포들은 신경 선조 표식 네스틴을 공동-발현시켰다. 피질내에서 네스틴/GFPD 세포들의 증거는 거의 없었다. 소수의 GFP 세포들은 경색주변 피질에서 이동 신경아세포 표식 PSA-NCAM에 대해 양성이었다. 드문 경우들에서 DPSC-유도된 희돌기교세포 (O4/GFPD 세포들)들은 이식후 4주차 시점에서 설치류 뇌에서 관찰되었다.
DPSC 처리는 뇌졸중이후 뇌량 위축을 감소시킨다
뇌졸중 공격이후 뇌량을 따라 반구간 접속성 상실에 대해 DPSC 처리 효과를 또한 조사하였다. 뇌졸중-후 4주 시점에서, 비이클-처리된 집단과 비교하여 DPSC-처리된 동물에서 몸에서 같은 쪽 뇌량 위축에 있어서 무시할 정도의 감소가 있었다(DPSC-처리된, 67.6 ± 12.5%, L2 측정은 대응하는 중심선 L1 측정의 비율로 나타냄; 비이클-처리된, 56.6 ± 3.0%; p > .05) (도 9). DPSC-처리된 뇌에서, 몸에서 같은 쪽 반구내 뇌량의 두께는 더 나은 보존 방향으로 지향하는 경향을 보였고, 반대쪽 (뇌졸중-영향을 받지 않은) 반구의 뇌량 두께와 유사하였다. 처리 집단들 사이에 반대측 반구에서 뇌량 두께의 차이는 없었다.(DPSC-처리된, 66.1 ± 14.0%; 비이클-처리된, 66.5 ± 1.6%).
실시예 5: 게잡이원숭이 STRO-3 + MPCs의 특징
원숭이 골수 선조 세포들 (게잡이원숭이로부터; cyno-MPC)는 암컷 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)로부터 수집된 골수 흡출물 ~15ml로부터 단리되었다. 골수 흡출물 현탁액은 Ficoll 기울기를 이용하여 단리되었고, 비-핵형성 세포들(적색 혈액 세포들)을 제거하기 위하여 세척되었다. 핵형성 세포들을 헤아리고, CA12 항체(항-STRO-3)와 Dynalbeads의 부착에 의해 분리되었다. 부착된 항체 및 비드와 함께 있는 세포들은 MPC-1 자석의 자장에서 양성적으로 선택되었다. 양성 선택된 세포들을 헤아리고, 성장 배지(Growth Media)에서 계대(p.) 0에서 T-플라스크에 접종시켰다. 사전-선택, 양성, 및 음성 세포들을 콜로니 형성 분석(CFU-F)에 이용하였다.
cyno-MPC 세포들에게 성장 배지(Growth Media)를 공급하였다. 모든 배양물(p.0 - p.5)은 이들이 원하는 합류에 도달될 때까지 2-4일마다 공급을 받았다. 그 다음 세포들은 HBSS 세척, 그 다음 콜라게나제, 그리고 Trypsin/Versene을 이용하여 계대되고 또는 수확되었다. p.1 세포들을 헤아리고, T-플라스크 안에 접종되었다. p.1 cyno-MPC이 원하는 합류에 도달될 때, 이 세포들은 수확되고, 그리고 제어된 속도 냉동기를 이용하여 냉동고존되었다.
계대 1 냉동보존된 cyno-MPC를 해동시키고, 그리고 T-플라스크(p.2) 안에 접종되었다. p.2 세포들은 p.3에서 Cell Factory 로 계대되었다. p.3 세포들은 수확되고, Cell Factory 안으로 p.4로 계대되었다. 여분의 p.3 세포들은 냉동보존되었다. p.4 세포들은 p.5에서 6 x Cell Factories로 계대되었다. p.5 cyno-MPC가 원하는 합류에 도달되었을 때, 이 세포들은 수확되었고, 제어된 속도 냉동기를 이용하여 냉동보존되었다. 세포들은 50% AlphaMEM, 42.5% Profreeze, 및 7.5% DMSO에서 냉동보존되었다. 샘플은 CFU-F 분석, FACS, 무균성, 미코플라즈마, 그리고 엔도톡신에 대해 테스트되었다.
배양된 cyno-MPCs의 면역표현형의 대표적인 유동세포 분석의 결과는 도 10에 나타낸다. 나타낸 것과 같이, 이들 세포들은 STRO-1+, STRO-4+ 및 CD146+이다.
실시예 6 비-인간 영장류 (nhp) DPSC의 잠재적 단리:
자석 비드 분류를 이용하면 섬유성 치수 조직으로부터 희귀한 DPSC가 정제된다. 치수 조직 수확 및 효소적 절단이후, 대략 1-2 x 10∧ 세포들이 한 명의 성인의 세 번째 어금니로부터 회수될 수 있다. 이 점에 있어서, 다수의 치아로부터 유래된 모아진 세포들은 동일한 동물로부터 수집된다. 비-인간 영장류 치수의 단일 세포 현탁액은 STRO-1 (마우스 IgM 항-인간 MPC; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City, IA, USA); CD146 (마우스 IgG2a 항-인간 CD146/MUC-18; 9); 또는 STRO-4 (마우스 IgG1 항-인간 열 쇼크 단백질-β)를 포함하는, 비인간 영장류 골수 세포들 (도 10)과 이미 반응하는 것을 보여준 인간 MPC-연합된 항원에 대한 항체와 항온처리된다. 라벨된 치수 세포들은 양 항-마우스 IgG-접합된 또는 쥐 항-마우스 IgM-접합된 자석 Dynabeads (세포당 4개 비드: Dynal, Oslo, Norway)와 함께 항온처리된다. 자석 비드-양성 세포들은 제조업자의 추천 프로토콜에 따라 MPC-1 자석 입자 농축기(Dynal)를 이용하여 수집된다. STRO-1, STRO-4 또는 CD146 비드 양성 세포들은 정상적인 성장 배지 (20% (v/v) FBS, 2 mM L-글루타민, 100 mM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 50 U/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 α-MEM)에서 1차 배양물을 생성시키기 위하여 성장 배지에서 ㎠ 당 약 3 x 104의 세포로 접종된다. 약 90% 합류에 도달된 후, 1차 DPSC는 ㎠ 당 약 0.5-1 x 104의 도말 밀도 준배양될 것이다.
실시예 7 nhpDPSC 콜로니-빈도의 평가: 콜로니 형성-섬유아세포 분석을 이용
nhpDPSC를 정제하기 위한 단일 시약으로써 STRO-1, STRO-4 또는 CD146 항체의 효과가 평가된다. 비분획된(Unfractionated) 그리고 STRO-1, STRO-4 또는 CD146 양성 및 음성 선택된 세포 분획물을 정상 성장 배지에서 웰당 0.3, 1.0 및 3.0 x 104 세포들의 농도로 6-웰 배양 플레이트에 삼중으로 접종시키고, 12일 동안 >90% 습도, 5% CO2, 37℃에서 배양시킨다. >50 이상의 세포 응집물은 콜로니-형성 단위-섬유아세포(CFU-F)로 기록된다. 최대의 CFU-F 콜로니 형성을 야기하는 항체 선택 프로토콜이 이용되어 기능적 특징 연구용으로 GLP-등급 nhpDPSC를 생성시킨다.
실시예 8 nhpDPSC의 특징화
유동 세포분석은 탈체(ex vivo) 확장된 DPSC의 면역표현형을 특징화한다. 상이한 세포 계대에서 간엽성 및 비-간엽성 줄기-세포 연합된 표면 표식들의 발현은 상기에서 설명된 것과 같이 평가된다. 동종이계 nhpDPSC가 허혈성 뇌졸중을 치료하는데 이용되기 때문에, 혼합된 임파세포 반응물에서 또는 시험관내에서 미토겐 자극된 임파세포들과 함께 공동-배양될 때 활성화된 면역 세포들을 억제시키는 이들 세포들의 면역조절 능력이 평가된다(가령, Wada et al ., J Cell Physiol , 219: 667-676, 2009에서 설명된 것과 같이).
이들이 유도된 것과 유사한 것들을 포함하는 중배엽 및 외배엽 조직들을 생성시키는 DPSC의 능력은 이들 세포의 특징이다. 시험관에서 상이한 세포 계통으로 분화되는 DPSC의 능력은 유도성 조건하에서 배양됨으로써 조사된다. Grontos et al., J Cell Sci , 116: 1827-2835, 2003에서 설명된 것과 같이, 탈체(Ex vivo) 확장된 nhpDPSC가 이용되어 골아세포 (미네랄 침착물의 알리자린(Alizarin) 적색 착색), 함지방세포 (지질 방울들의 오일 레드(Oil red) O 착색) 및 연골세포 (설페이트화된 프로테오글리칸과 콜라겐 유형 II 발현의 톨루이딘 블루(Toluidine Blue) 착색)으로 다중-계통 분화에 대한 능력이 평가된다.
GFP로 사전-라벨된 탈체(ex vivo) 확장된 nhpDPSC의 단일 세포 현탁액은 운반체 비이클로 세라믹 히드록시아파타이트/인산염 삼칼슘(HA/TCP) 과립들과 복합되어 약 8주 동안 심각하게 면역절충된 면역-결함(NOD/SCID) 마우스(n=3)의 배표면의 피하로 추가 이식된다. 이식 후 8주 뒤, 수취 동물들을 희생시키고, 조직 분석을 위한 이식물이 회수될 것이다.
nhpDPSC가 시험관내에서 신경 세포들로의 분화에 대한 평가는 상기에서 설명된 것과 같이 신경-유도성 배양 조건하에 폴리오르니틴으로 피복된 챔버 슬라이드에서 실행된다.
실시간 PCR 및 면역조직화학을 이용하여 초기 발현(NeuroD, 네스틴, NeuN, b-III 튜블린) 및 후기 발현 (GFAP, 신경섬유 배지 및 중쇄) 유전자 및 단백질을 평가한다.
패치 클램핑은 시험관내에서 분화된 nhpDPSC가 활동 전위(action potential)를 개시하는 능력을 측정하기 위하여 실행된다.
추가적으로, GFP-라벨된 nhpDPSC 신경에 기인된 그리고 신경가소성 전위는 상기에서 설명된 것과 같이 이들 세포를 난자내 병아리 배(embryos)로 주사함으로써 측정된다.
이식된 GFP-라벨된 DPSC의 전기생리학적 성질은 접목 후 7일과 14일 시점에서 뇌 조직의 300mm 절단면 상에서 전위-의존적 나트륨 및 칼륨 채널의 존재를 측정함으로써 평가된다.
집합적으로, 이들 연구는 비-인간 영장류 전(pre)-임상적 연구에서 뇌졸중 치료에 이용된 동종이계 nhpDPSC 집단을 특정시킨다.
실시예 9: 허혈성 뇌졸중의 비-인간 영장류 모델에서 운동 기능을 개선시키는데 nhpDPSC의 용도
복합 인지 능력, 많은 사회적 복합성 및 뇌 조직의 복잡성에 있어서 인간과 비-인간 영장류 사이의 유사성은 신경 질환 및 장애들을 연구하는데 우수한 모델로 만든다.
허혈성 뇌졸중의 비-인간 영장류 모델은 내부 경동맥 동맥을 통하여 나일론 섬유 폐색을 이용한 MCAO 방법으로 만든다(가령, Freret et al., J Cereb Blood Flow Metab., 28: 786-796, 2008에서 설명된 것과 같은). 비-인간 영장류 모델은 게잡이원숭이 짧은꼬리 원숭이, Old World monkey (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에서 만든다. 다음은 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 실험 기획 프로그램이다:
(i) 기선 신경-거동 테스트는 뇌졸중 이전 모든 동물에서 실행된다.
(ii) 허혈성 뇌졸중의 MCAO 모델이 유도된다.
간략하게 설명하자면, 원숭이를 마취되고, 삽관하고, 그리고 혈액 산소 수준, 중심 온도, 혈압, ECG 및 두 개내 혈류의 레이저-흐름측정을 집중 관찰하면서 기계 호흡한다. 외경동맥 및 내경동맥의 분기에서 우측 총경동맥을 노출시키기 위하여 숙련된 신경학자에 의해 섬세한 수술이 실행된다. 외경동맥과 기타 분기 동맥은 소작하여 내부 경동맥을 따라 중앙 뇌 동맥의 원점까지 섬유의 유연한 통과를 담보한다. 0.54 mm 직경의, 3mm 길이 실리콘 고무-피복된 나일론 섬유를 내부 경동맥으로 삽입시키고, 이 섬유가 중앙 뇌 동맥을 폐색하였음을 나타내는 저항이 느껴질 때까지 진전시킨다. 이 섬유는 연결실에 의해 그 위치에 유지된다. MCAO 이후 3시간 시점에서 실리톤 고무-피복된 나일론 섬유를 빼내면 재관류되고, 이는 인간에서 중앙 뇌 동맥 허혈성 뇌졸중에 가깝다.
(iii) MCAO 이후 7일 이내에 MRI를 실시하여 적절한 크기 및 부위의 허혈성 뇌졸중이 야기되었는지를 판단한다.
(iv) 세포 요법 기획안은 뇌졸중-후 1주 시점에서 세 개 집단에게 5x105 또는 1.5x106의 nhpDPSC 또는 배지 단독 (세포없음)의 선조체 내부로 주사하는 것을 포함한다. 설치류들에서와 같이, 상승된 두개내 압력으로 인한 유병율로 인하여 뇌졸중 이후 대뇌로 안전하게 주사되는 유체의 용적에는 제한이 있다. 짧은꼬리원숭이의 경우 12 μL로 예측된다. 따라서, 세포 농도를 변화시키면서 모든 선조체내부 주사는 12 μL가 될 것이다. 이전과 같이 원숭이는 마취되고, 정위법적 선조체 내 주사를 위하여 두개골에 구멍파는 기구로 구멍(burr-hole)을 만든다.
(iv) 신경-거동 테스트는 연구 6주 기간동안 주단위로 실행된다. MCA 허혈성 뇌졸중이후 감각-운동 결손 정도를 적절하게 조사하기 위하여 다음의 테스트들이 이용된다: 원숭이 CANTAB® (CAmbridge Neurophysiological Test Automated Battery), 신경득점(Neuroscore), 힐-밸리 계단(Hill-and-Valley Staircase) 그리고 촉각 앞다리 자극 테스트(Tactile forelimb stimulation tests) (가령, Bihel et al., J Cereb Blood Flow Metab., 30: 273-285, 2010에서 설명된 것과 같은).
(vi) 연구는 뇌졸중이후 6주차에 종료된다.
실시예 10: 합체된 nhpDPSC와 NHP 뇌 조직 사이에 상호작용
10.1 허혈성 반암부의 구출:
허혈성 뇌졸중 주변에는 사멸 위험이 있지만, 구출될 수 있는 허혈성 반암부 조직 영역이 있다. STRO-1- 세포 요법은 이 허혈성 반암부와 상호작용할 수 있고, 따라서 뇌졸중 크기를 제한시킬 수 있다.
원숭이를 마취시키고, .0T Siemens Trio 스캐너에 엎드린 자세로 위치시키고, T2-W 터보-스핀 에코 영상(T2WI, TR/TE=4800/86 ms)은 평면 해상도에서 시계 (180 x 180 mm) 및 0.5 x 0.5의 영상 획득 매트릭스로 획득된다. 12개의 T2WI 관상 영상은 0.2 mm의 간격에서 2mm의 슬라이스 두께로 획득된다. T2WI상에서 경색 용적은 각 원숭이에 대해 Siemens MRI 소프트웨어를 이용하여 정확하게 나타날 것이다.
10.2 NHP 뇌졸중 뇌에서 뉴런 대체 및 접속성
경색으로 한 개 뇌의 반구의 대략 2/3에서 뉴런 및 신경교가 상실된다. 이번 일련의 조사 목적은 다음을 결정하는 것이다: (1) 생존한 nhpDPSC의 수, (2) 뉴런 또는 신경교로 분화된 nhpDPSC의 수, 그리고 (3) nhpDPSC-유도된 뉴런이 기능적 접속을 하는지의 여부. 이 조사를 위하여, nhpDPSC는 GFP를 발현시키도록 레트로바이러스적으로 형질전환되며, 그리고 이식에 앞서 핵 라벨링을 위하여 BrdU (약 20 μM, 24 시간 동안)에서 배양된다. 이들 두 가지 라벨링 방법들은 숙주의 뇌 안에서 합체된 nhpDPSC의 형식적인 식별을 제공한다.
신경 표현형으로 분화되었던 nhpDPSC의 수는 명시된 용적내에서 nhpDPSC의 밀도를 확증함으로써 전형적으로(stereologically) 추정된다. 설치류 연구로부터 우리는 4 주 시점에서, hDPSC는 주사 부위로부터 앞-뒤 방향으로 대략 1mm 정도 뇌졸중 부위로 이동된다는 것을 알았다(이는 뇌의 표면에 있는 반흔으로부터 명백하다). 따라서, 주사 부위에 대해 앞-뒤 축에서 원숭이 뇌의 8 mm 두께는 뇌졸중-후 6주 시점에 이식된 인간 세포들의 대부분을 포함한다. 이 축을 따라 100 mm 일련의 관상 절단면을 얻는다(~ 4x103mm 조직 폭 @ 100 mm = 40개의 관상 절단면-처리된 동물당). 무작위 샘플링 프로토콜 (Image J를 이용)은 표준화된 조직 용적내에서 BrdU-양성 세포들의 수를 헤아리기 위해 구축된다. 양성적으로 착색된 인간 세포들의 직접적인 3-차원 카운팅은 Bio-Rad MRC-1000UV Confocal Microscope (Adelaide Microscopy)을 이용하여 실시된다. 공촛점 현미경은 분화된 세포들에 의해 발현되는 세포질 항원(가령 신경섬유 매체 쇄(NF-M)에 대항하는 항체를 이용한 뉴런 또는 β-III 튜블린, 신경교 섬유성 산성 단백질을 발현시키는 성상세포, GFAP 또는 티로신 히드록시라제)과 공동-국소화되는 GFP-양성 또는 BrdU-양성 nhpDPSC를 확인한다.
원숭이 뇌졸중으로 합체된 nhpDPSC-유도된 뉴런의 전기생리학적 성질 또한 평가된다. 우선, 설치류 뇌졸중 뇌로부터 단리된 단일 nhpDPSC-유도된 뉴런의 생물물리적 성질이 평가된다. 간단히 설명하자면, 동물의 목을 자르고, 뇌를 제거하여, 얼음-냉가된 염수에 둔다. 진동 조직 슬라이스를 이용하여 300-500 mm 두께의 뇌 박편으로 절단하고, 세척하고, 그 다음 트립신 및 콜라게나제 혼합물에 의해 효소적으로 절단한다. 조직의 부드러운 피펫팅에 의해 단일 뉴런이 획득되고, 세척하여, 콜라겐-처리된 유리 커버슬립에 도말하였다. 24-시간 회수 이후, 세포들은 전(whole) 세포 패치 클램핑으로 이용된다.
nhpDPSC-유도된 뉴런은 GFP-양성 세포들로 확인된다. 적절한 전위 프로토콜 및 채널 저해물질을 이용하여 이들 세포에 의해 발현된 전위-케이트 채널의 유형을 확인한다.
작용 전위(APs)를 생성하고 다른 뉴런과의 접속을 형성하는 nhpDPSC-유도된 뉴런의 능력은 뇌 박편에서 세포들의 패치 클램핑 및 영상화에 의해 조사된다. 주사 부위에 근겁하에 비브라톰(vibratome) 상에서 250-400 mm 두께의 뇌 박편으로 절단된다. 실혼 및 일정 산소 공급하에 1-시간 회수후, 개별 박편들은 형광 부착, IR 및 DIC 광학과 함께 직립 BX51WI Olympus 현미경에 탑재된 기록 챔버로 이동된다. nhpDPSC는 GFP 형광를 이용하여 우선 확인되며, 그리고 IR 필터(720-850 nm) 및 Rolera-XR IR-민감성 카메라를 이용하여 시각화된다. 뇌 박편에서 뉴런의 전(whole) 세포 패치 클램핑은 EPC-10 컴퓨터-제어된 증폭기와 연합 장비를 이용하여 실행된다. APs는 감극 전류를 주입하여 재현되고, 전류 클램프 모드에서 기록된다.
nhpDPSC에 의해 생성된 APs가 단단한 졍션(tight junctions) 또는 시냅스적 접속을 통하여 주변 뉴런으로 전달될 수 있는지를 조사하기 위하여 Fura-2 형광을 이용하여 패치 클램핑과 함께 세포내 Ca2- 농도의 변화를 시각화한다. 간략하게 설명하자면, 뇌 박편은 막 침투성 Fura-2AM에 로딩되고, 세척되고, 그리고 기록 챔버에 위치된다. 합체된 nhpDPSC-유도된 뉴런은 GFP 형광과 IR을 이용하여 클램프된 패치에 의해 확인된다. 그 다음 형광 설정은 Fura-2 측정에 적합하도록 변화된다. APs는 감극 전류를 통화시켜 nhpDPSC에서 재현되고, 형광은 설치류 숙주 뉴런 주변에서 측정된다.
10.3 신경가소성을 조사하기 위하여 비-인간 영장류 뇌졸중 뇌의 기능적 MRI (fMRI)와 확산 텐서 영상( DTI ) :
이 기술은 대조군 원숭이와 비교하여 nhpDPSC 처리이후 신경가소성의 비-침습성 조사를 허용한다. 허혈성 뇌졸중 모델에서, nhpDPSC 처리 이후 fJVIRI를 이용하여 앞다리 운동 조절을 평가하고, 운동 피질의 더 큰 활성화가 있는 지를 판단한다. 치료 이후 3주 및 6주 시검에 fJVIRI 연구를 실행한다.
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Claims (29)

  1. STRO-1+ 간엽성 전구 세포들 (mesenchymal precursor cells: MPCs) 또는 그의 후손이 농축된 세포들의 집단을 포함하는, 대상에서 뇌졸중을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 대상에서 뇌 뉴런을 재생시키는 것인 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 뇌 뉴런은 뇌 피질 내에 있는 것인 약학 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 뇌 뉴런은 운동 피질 또는 감각 피질 내에 있는 것인 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 뇌졸중을 앓은 대상에서 뇌 기능이 개선되거나 또는 뇌 기능 상실이 방지되는 것인 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 뇌졸중을 앓은 대상에서 운동 장애가 치료 또는 예방되는 것인 약학 조성물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중인 것인 약학 조성물.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 뇌졸중 후 1 시간 내지 2주 사이에 투여되는 것인 약학 조성물.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 약학 조성물은 뇌졸중 후 24시간 이내에 투여되는 것인 약학 조성물.
  9. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들의 집단은 STRO-1밝음 세포들 또는 그의 후손이 농축된 것인 약학 조성물.
  10. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들의 집단은 골수 또는 치수로부터 유래되는 것인 약학 조성물.
  11. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 대상의 전신으로 또는 상기 대상의 뇌로 국소적으로 투여되는 것인 약학 조성물.
  12. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 복수회로 투여되는 것인 약학 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 약학 조성물은 4주 또는 그 이상의 주마다 1회씩 투여되는 약학 조성물.
  14. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, kg당 0.1 x 106 내지 5 x 106의 STRO-1+ 세포들 또는 그의 후손, 또는 kg당 0.3 x 106 내지 2 x 106의 STRO-1+ 세포들 또는 그의 후손, 또는 kg당 0.1 x 105 내지 0.5 x 106의 STRO-1+ 세포들 또는 그의 후손을 포함하는 것인 약학 조성물.
  15. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, STRO-1+ 세포들 또는 후손 세포들이 농축된 집단은 투여에 앞서 배양 확장된 것인 약학 조성물.
  16. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 뇌졸중 후 24시간 내지 1개월 사이에 투여되는 것인 약학 조성물.
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