CN118121725A - 一种用于评估脑梗死药物疗效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于临床科学研究技术领域，具体提供了一种用于评估脑梗死药物疗效的方法，包括以下步骤：(1)构建急性脑缺血动物模型；(2)定点评估模型神经功能；(3)对模型动物施用脑梗死药物；(4)通过延迟反应任务、逆转学习任务、迂回取物任务、眼运动追踪、山谷阶梯评估模型动物的认知功能和感觉运动功能的变化趋势；(5)根据步骤(4)中行为范式变化趋势评估结果判定药效。本发明提供的这种用于评估脑梗死药物疗效的方法通过成套的针对特定认知功能的范式和运动感觉量表评估脑缺血后全脑损伤的情况，为更全面客观的评价脑梗死药物的疗效提供模型和方法，为脑缺血防治提供新的治疗理念和治疗策略。
Description
技术领域
本发明属于临床科学研究技术领域，具体涉及一种用于评估脑梗死药物疗效的方法。
背景技术
脑卒中是一种发病率高、死亡率高、致残率高和复发率高的疾病，是中国和世界人群死亡的主要原因。中国每年约有250万人发病，并有大于160万人因此死亡，造成的经济负担高达每年400亿元。脑缺血性卒中占卒中比例的80％，其中急性脑缺血是致死致残的重大慢性病，发病后极早期静脉溶栓或者血管内支架取栓是目前国际循证指南唯一推荐的治疗手段。这两种方法通过挽救缺血半暗带来改善病情，但是其治疗时间窗窄，只有极少数病人获益。目前临床多数治疗手段和药物集中在脑梗死灶局部和周边，对脑内与梗死灶有纤维联系的远隔部位继发性损害及对全脑功能的影响关注极少。实际上脑梗死不仅导致脑内梗死灶局部缺血性损害，还使与缺血区有联系的远隔部位出现损伤，包括梗死灶上下方锥体束继发性轴索变性、同侧大脑皮层和皮层下特定区域神经元继发性死亡等。这些损伤在梗死后数周到数月内持续存在并阻碍个体康复。
目前临床评估脑缺血患者或者基础研究中评估脑缺血动物模型的方法均以量表为主，检测的方面集中在运动和感觉功能上，忽略了临床脑缺血患者多种认知功能长期损伤的特点。这些量表没有特定认知功能尤其是高级认知功能的评价，无法全面反映脑梗后的神经功能的损伤。此外，这些量表受主观因素如医生或实验人员的经验程度影响较大，在检测认知过程的敏感度、特异性等方面存在很多局限。缺乏客观全面的脑缺血后全脑评估体系，是目前脑缺血治疗领域最突出的问题之一，阻碍了脑缺血相关前期诊断、新型神经保护药物研发、抗法治疗手段等研究的发展。我国临床仍有缺乏循证医学证据的神经保护药物被广泛应用。因此建立一套全面的脑缺血后评估体系，可以从新的角度对这些神经保护药物临床应用的合理性进行评估。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中没有一套同时包含运动症状和认知症状的全脑评估体系的问题。
为此，本发明提供了一种用于评估脑梗死药物疗效的方法，包括以下步骤：
(1)构建急性脑缺血动物模型；
(2)定点评估模型神经功能；
(3)对模型动物施用脑梗死药物；
(4)通过延迟反应任务、逆转学习任务、迂回取物任务、眼运动追踪、山谷阶梯评估模型动物的认知功能和感觉运动功能的变化趋势；
(5)根据步骤(4)中行为范式变化趋势评估结果判定药效。
具体的，上述步骤(2)中神经功能评估指标包括：意识、面部感觉、耳廓反射及痛觉反射、四肢的肌力及肌张力、步态、共济失调、平衡及转圈。
具体的，上述步骤(4)中延迟反应任务评估方法为：在威斯康辛通用测试装置内测试板的左右两侧分别设置一个食槽，两块相同的薄板各自盖住食槽，首先在动物模型的注视下，将食物放置在左侧或右侧食槽内，并同时盖上两块薄板，然后板遮挡动物模型的视线，经过不同时间的延迟后，去掉视线遮挡，让动物模型选择食物所在的食槽，通过比较不同时间点的正确率来评价动物脑缺血前后空间工作记忆的变化趋势。
具体的，上述步骤(4)中逆转学习任务评估方法为：在威斯康辛通用测试装置内测试板的左右两侧分别设置一个食槽，分别用黑、白两块薄板盖住食槽，每次测试食物固定的放置在其中一种颜色的薄板下，而该薄板半随机的放置在两个食槽上；首先遮挡动物模型的视线，将食物放置在某种颜色的薄板下，然后去掉视线遮挡，让动物模型选择食物所在的食槽；进行多组实验，当动物模型连续3组正确率在90％以上时，然后进入逆转阶段；在逆转阶段，食物固定放置在另一种颜色的薄板下，进行相同实验，通过比较逆转前后的正确率来评价动物脑缺血前后学习能力的变化。
具体的，上述步骤(4)中迂回取物任务评估方法为：在测试板上放置一个正方体透明盒，该盒的一面开口允许动物伸手进入盒内取食，首先将透明盒开口的一面朝向动物，训练动物直接依循其视线拿取食物，待训练成功后，进入实验检测阶段；检测阶段设置三个变量：透明盒开口的一面随机朝向动物不同方向、透明盒随机放置在测试板的不同位置、食物随机放置在透明盒内的不同位置；评价指标包括每次取食时长、每次取食触碰透明盒非开口面的次数、一次性取食成功的次数、左右手使用率；通过比较不同检测时间点的指标来评价动物脑缺血前后判断、决策能力和上肢运动能力的变化。
具体的，上述步骤(4)中眼运动追踪评估方法为：给动物呈现四类图片，眼动仪记录动物观看图片时的眼运动轨迹，分析动物注意的空间分布以及对社会刺激的反应，每次测试15-20分钟，通过比较不同检测时间点的指标来评价动物脑缺血前后注意能力、社会交互的变化。
具体的，上述步骤(4)中山谷阶梯评估方法为：动物所在笼具的其中一面为透明板，该透明板下方的左、中、右侧分别有一开口，各开口覆盖有一块挡板，挡板取下时，动物可以从该开口处将上肢伸出笼外以进行取食；在动物面前放置测试板，该板上放置山阶梯或者谷阶梯，每个台阶上均放置一块食物；当放置山阶梯时，透明板左右两侧的开口打开；当放置谷阶梯时，透明板中间的开口打开，记录动物每次取食的成功率，通过比较不同检测时间点的成功率来评价动物上肢运动能力和视空间的变化。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的这种用于评估脑梗死药物疗效的方法将延迟反应任务、黑白逆转学习任务、迂回取物任务、眼运动追踪、山谷阶梯在内的行为范式进行组合，通过成套的针对特定认知功能的范式和运动感觉量表评估脑缺血后全脑损伤的情况，为更全面客观的评价脑梗死药物的疗效提供模型和方法，为脑缺血防治提供新的治疗理念和治疗策略。这套范式可以与现有的多种卒中评价量表、影像学等技术手段结合，从而更好的研究全脑损伤的脑内神经机制。不仅可以研究脑缺血后梗死部位引发的行为障碍，还能进一步研究梗死引发的后继性远隔部位损伤，从而实现对全脑损伤的研究。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是脑缺血后全脑评估流程图。
图2是使用高频电凝的方式阻断食蟹猴单侧大脑中动脉M1段。
图3是延迟反应任务流程示意图。
图4是食蟹猴执行迂回取物任务示意图。
图5是食蟹猴执行山和谷阶梯任务示意图；其中，a为山阶梯装置，b为谷阶梯装置。
图6是使用神经功能评分表评价食蟹猴急性脑缺血后神经功能损伤的情况。
图7是使用山阶梯和谷阶梯任务评价食蟹猴急性脑缺血后上肢运动能力的变化；a为山阶梯，b为谷阶梯。
图8是使用迂回取物任务评价食蟹猴急性脑缺血后运动能力的变化。
图9是使用迂回取物任务检测食蟹猴急性脑缺血后损毁侧上肢的运动功能变化。
图10是使用迂回取物任务检测食蟹猴急性脑缺血后运动计划和认知可塑性变化。
图11是使用眼运动追踪任务检测脑缺血后动物注意力和社会认知能力变化。
图12是使用延迟反应任务检测脑缺血后动物的空间工作记忆变化。
图13是使用逆转学习任务检测脑缺血后动物的学习能力变化。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
下面通过具体实施例对本发明的评估方法的效果进行研究。
实施例1：
一、试验方法
1.制备急性脑缺血食蟹猴模型
将食蟹猴麻醉后，经左侧蝶骨翼点处入路开颅去骨瓣，打开硬脑膜，在显微镜下于左大脑外侧裂处分离出大脑中动脉。该方法与临床上神经外科使用的经外侧裂入路相似。在大脑中动脉发出眶额动脉后使用高频手术电凝颞夹闭M1段上干血管，使血管凝固收缩，达到阻断血流的目的(图2)，造成大脑中动脉皮层支闭塞而不影响中央支的血流。术后24小时由一名盲于动物分组情况的实验人员利用神经功能评分表进行神经功能评定，并进行常规核磁共振MRI扫描(T1，T2，FLAIR及MRA)，由一名盲于动物分组情况的实验人员分析梗死灶累及部位，计算梗死灶大小，排除梗死灶过大(M1段主干闭塞，累及基底节、丘脑、海马等)或过小而缺乏运动障碍症状的动物。
2.神经功能评价
对每只食蟹猴在饲养笼内的日常活动进行录像，录像时间点固定为每天上午10-11点。在每个检测时间点(术前、术后1、4、8、12周)均连续录像3天。利用神经功能评分表对每段录像进行打分，每个检测点的得分通过将该检测点的3天录像得分进行平均得出。通过比较不同检测时间点的得分情况，评价脑缺血前后动物神经功能的变化趋势。评估指标包括：意识、感觉系统(面部感觉、耳廓反射及痛觉反射)、运动系统(四肢的肌力及肌张力)、骨骼肌协调性(步态、共济失调、平衡及转圈)。评估结果如表1所示。
表1神经功能评分表
3.认知功能和感觉运动功能评估
将延迟反应任务、黑白逆转学习任务、迂回取物任务、眼运动追踪、山谷阶梯在内的一套行为范式进行组合，用以评估脑缺血模型动物的认知功能(空间工作记忆、决策、认知可塑性、注意、社会交互)和感觉运动功能的变化趋势。
3.1延迟反应任务评价空间工作记忆功能
实验测试工具为威斯康辛通用测试装置(Wisconsin General Test Apparatus,WGTA)。参照图3，装置内测试板的左右两侧分别设置一个食槽，两块相同的薄板各自盖住食槽。动物需翻开薄板从食槽内获取食物。首先在动物的注视下，将食物放置在左侧或右侧食槽内，并同时盖上两块薄板。然后在动物和测试板之间，降下不透明板遮挡动物的视线。经过一段时间的延迟后，不透明板上升，动物可根据之前形成的工作记忆选择食物所在的食槽，且仅可选择一次。整个过程为一个trail，动物每天完成30个trail(即一组block)。在30个trail内半随机的设置五种延迟时间(0s，10s，20s，30s，40s)，各种延迟时间的trail数均为6次。通过比较不同检测时间点的block的正确率来评价动物脑缺血前后空间工作记忆的变化趋势。
3.2逆转学习任务评价学习能力
实验测试工具为威斯康辛通用测试装置。装置内测试板的左右两侧分别设置一个食槽，分别用黑、白两块薄板盖住食槽。每次测试食物固定的放置在其中一种颜色(如白色)的薄板下，而该薄板半随机的放置在左/右食槽上。具体执行过程是：首先降下动物与测试板之间的不透明板遮挡动物的视线。将食物放置在某种颜色的薄板下。然后升起不透明板，动物可进行选择，且仅可选择一次。而后降下不透明板。此过程为一个trail，动物每天完成30个trail(一组block)。该任务要求动物通过学习trail之间的联系，建立薄板颜色与食物的相关性。当动物连续3组block正确率在90％以上时，说明动物已建立薄板颜色与食物的相关性(即完成了一个session)，然后进入逆转阶段。在逆转阶段，食物固定放置在另一种颜色的薄板下(即，如果食物固定的放置在白色薄板下，在逆转阶段食物则固定放置在黑色薄板下，反之亦然)。猕猴需改变认知策略，重新学习建立新的薄板颜色与食物的相关性。该任务的评价指标包括动物学会食物与颜色的联系所需的trail数、动物逆转成功所需的trail数。通过比较不同检测时间点的指标来评价动物脑缺血前后学习能力的变化。
3.3迂回取物任务评价判断、决策能力和上肢运动能力
实验测试工具如图4所示。动物面前的测试板上放置一个正方体透明盒。该盒的一面开口允许动物伸手进入盒内取食。首先将透明盒开口的一面朝向动物，训练动物直接依循其视线拿取食物。待训练成功后，进入实验检测阶段。为评价动物的运动能力和认知能力，检测阶段设置三个变量：①透明盒开口的一面随机朝向动物的前方、左侧或右侧；②透明盒随机放置在测试板的中间、左侧或右侧；③食物随机放置在透明盒内的中心、左侧或右侧角落。动物需根据上述三个变量做出合适的判断以顺利获取食物。该任务的评价指标包括每次取食时长、每次取食触碰透明盒非开口面的次数、一次性取食成功的次数、左右手使用率。通过比较不同检测时间点的指标来评价动物脑缺血前后判断、决策能力和上肢运动能力的变化。
3.4眼运动追踪评价注意、社会交互能力
该任务要求动物安静的坐在猴椅上观看显示屏上呈现的图片，眼动仪记录动物观看图片时的眼运动轨迹。具体执行过程是：给动物呈现四类图片(单只食蟹猴面部图片20张、食蟹猴社会交互图片25张、复杂物体图片25张、简单背景图片10张)并记录动物观察图片的眼睛运动数据。在食蟹猴面部图片，我们分别记录实验动物视线停留在整体图片上的时间和视线停留在面部图片眼睛、鼻子、嘴巴部位的时间。
分析动物注意的空间分布以及对社会刺激的反应，每次测试15-20分钟。通过比较不同检测时间点的指标来评价动物脑缺血前后注意能力、社会交互的变化。
3.5山谷阶梯任务评价感觉运动能力
实验测试装置如图5所示。动物所在笼具的其中一面为一块透明板，该透明板下方的左、中、右侧分别有一开口，各开口覆盖有一块挡板。挡板取下时，动物可以从该开口处将上肢伸出笼外以进行取食。在动物面前放置一测试板，该板上放置山阶梯或者谷阶梯。山阶梯和谷阶梯均为左右各5个台阶，每个台阶上均放置一块食物。当放置山阶梯时，透明板左右两侧的开口打开；当放置谷阶梯时，透明板中间的开口打开。该任务的评价指标是动物每次取食的成功率。通过比较不同检测时间点的指标来评价动物上肢运动能力和视空间的变化。
二、结果分析
1.脑缺血模型动物神经功能异常
利用神经功能评分量表对脑缺血模型动物进行神经功能评价，发现动物在术后1天的神经功能评分显著升高(Score before＝0VS Score 1day＝46.33,P＝0.025)，动物在意识水平(Score 1day＝10.67)、感觉系统(Score1day＝10.33)、运动系统(Score 1day＝12)和骨骼肌协调性(Score 1day＝13.33)方面均表现出异常，进一步验证了模型构建的成功性。术后1周动物的神经功能评分与术后1天的评分接近，仍保持在较高的水平(Score1week＝39.67)。神经功能评分在术后4周(Score 4week＝19.33)回落并进入平台期：术后12周(Score 12week＝19.33)和术后24周(Score 24week＝18)的评分与术后4周相似(图6)。动物在急性脑缺血后1天的神经功能评分显著升高，表现在意识水平、感觉系统、运动系统和骨骼肌协调性四个方面均异常。并且神经功能损伤能长期存在，表现为脑缺血24周神经功能评分仍高于脑缺血前。
2.脑缺血模型动物运动功能异常
利用山谷阶梯任务检测动物的上肢运动能力，结果显示在山阶梯和谷阶梯实验中，脑缺血1周后动物损伤侧取食得分均显著下降(Before Hill＝13.5±1.17VS AfterHill＝3.84±3.33,P＝0.040；Before Valley＝14.81±0.11VS AfterValley＝4.86±4.21,P＝0.048)，动物在脑缺血4周后，其损伤侧上肢的运动能力显著异常(图7)。
利用迂回取物实验范式检测动物肢体运动能力。结果显示脑缺血1周后，动物的损毁侧上肢整体运动能力受到损伤，表现出反手取食(Awkward reach)现象(P＝0.000)；其精细运动能力同样受损，表现为抓握食物后食物掉落的次数(Impaired hand motorproblem)显著增加(P＝0.000)(图8)。此外动物的损毁侧上肢(右肢)的使用率显著下降(P＝0.017)，该损伤持续至梗死后24周(图9)。
3.脑缺血模型动物运动计划能力异常
利用迂回取物任务来检测脑缺血前后动物的运动计划能力的变化。结果显示大脑中动脉M1段永久闭塞可以导致动物运动计划能力、认知可塑性损伤。脑缺血手术1周后，动物触碰屏障侧(Barrierreach)的次数显著增加(Before＝0.50±0.11VS After＝1.29±0.19,P＝0.006)，并且模型动物保持上一次试验的取食方向而忽略当下试验的取食方向(Perseverative reach)的次数也显著增加(Before＝0.15±0.05VS After＝0.86±0.17,P＝0.001)，提示动物运动计划能力和认知可塑性(cognitive plasticity)降低(图10)。
4.脑缺血模型动物注意、社会认知能力异常
通过给动物呈现多种视觉刺激，对动物进行眼运动追踪来检测脑缺血前后动物的注意和社会认知能力的变化。结果显示动物在脑缺血后，其注意力显著下降，表现为注视视觉刺激的时间减少(图11)。对社会性刺激，如猴脸的注视时间也下降，提示动物的社会认知能力损伤(图11)。
5.脑缺血模型动物空间工作记忆能力无显著异常
利用延迟反应任务来检测脑缺血前后动物的空间工作记忆能力的变化。结果显示在脑缺血后4周，动物在任务中的总正确率与脑缺血前没有显著差异(％Correct before＝91.98％VS％Correct 4week＝90.87％,P＝0.621),术后12周(P＝0.922)和术后24周(P＝0.367)其任务正确率也没有显著差异(图12)。在各项延迟时间下(0s、10s、20s、30s、40s)，动物术后的正确率与术前相比也没有显著性差异(图12)。
6.脑缺血模型动物学习能力无显著异常
利用逆转学习任务来检测脑缺血前后动物的学习能力的变化。结果显示在脑缺血后4周，动物在任务的各个session转换中所需要的trail数没有显著差异(图13)。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于评估脑梗死药物疗效的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建急性脑缺血动物模型；
(2)定点评估模型神经功能；
(3)对模型动物施用脑梗死药物；
(4)通过延迟反应任务、逆转学习任务、迂回取物任务、眼运动追踪、山谷阶梯评估模型动物的认知功能和感觉运动功能的变化趋势；
(5)根据步骤(4)中行为范式变化趋势评估结果判定药效。
2.如权利要求1所述的用于评估脑梗死药物疗效的方法，其特征在于：所述步骤(2)中神经功能评估指标包括：意识、面部感觉、耳廓反射及痛觉反射、四肢的肌力及肌张力、步态、共济失调、平衡及转圈。
3.如权利要求1所述的用于评估脑梗死药物疗效的方法，其特征在于，所述步骤(4)中延迟反应任务评估方法为：在威斯康辛通用测试装置内测试板的左右两侧分别设置一个食槽，两块相同的薄板各自盖住食槽，首先在动物模型的注视下，将食物放置在左侧或右侧食槽内，并同时盖上两块薄板，然后板遮挡动物模型的视线，经过不同时间的延迟后，去掉视线遮挡，让动物模型选择食物所在的食槽，通过比较不同时间点的正确率来评价动物脑缺血前后空间工作记忆的变化趋势。
4.如权利要求1所述的用于评估脑梗死药物疗效的方法，其特征在于，所述步骤(4)中逆转学习任务评估方法为：在威斯康辛通用测试装置内测试板的左右两侧分别设置一个食槽，分别用黑、白两块薄板盖住食槽，每次测试食物固定的放置在其中一种颜色的薄板下，而该薄板半随机的放置在两个食槽上；首先遮挡动物模型的视线，将食物放置在某种颜色的薄板下，然后去掉视线遮挡，让动物模型选择食物所在的食槽；进行多组实验，当动物模型连续3组正确率在90％以上时，然后进入逆转阶段；在逆转阶段，食物固定放置在另一种颜色的薄板下，进行相同实验，通过比较逆转前后的正确率来评价动物脑缺血前后学习能力的变化。
5.如权利要求1所述的用于评估脑梗死药物疗效的方法，其特征在于，所述步骤(4)中迂回取物任务评估方法为：在测试板上放置一个正方体透明盒，该盒的一面开口允许动物伸手进入盒内取食，首先将透明盒开口的一面朝向动物，训练动物直接依循其视线拿取食物，待训练成功后，进入实验检测阶段；检测阶段设置三个变量：透明盒开口的一面随机朝向动物不同方向、透明盒随机放置在测试板的不同位置、食物随机放置在透明盒内的不同位置；评价指标包括每次取食时长、每次取食触碰透明盒非开口面的次数、一次性取食成功的次数、左右手使用率；通过比较不同检测时间点的指标来评价动物脑缺血前后判断、决策能力和上肢运动能力的变化。
6.如权利要求1所述的用于评估脑梗死药物疗效的方法，其特征在于，所述步骤(4)中眼运动追踪评估方法为：给动物呈现四类图片，眼动仪记录动物观看图片时的眼运动轨迹，分析动物注意的空间分布以及对社会刺激的反应，每次测试15-20分钟，通过比较不同检测时间点的指标来评价动物脑缺血前后注意能力、社会交互的变化。
7.如权利要求1所述的用于评估脑梗死药物疗效的方法，其特征在于，所述步骤(4)中山谷阶梯评估方法为：动物所在笼具的其中一面为透明板，该透明板下方的左、中、右侧分别有一开口，各开口覆盖有一块挡板，挡板取下时，动物可以从该开口处将上肢伸出笼外以进行取食；在动物面前放置测试板，该板上放置山阶梯或者谷阶梯，每个台阶上均放置一块食物；当放置山阶梯时，透明板左右两侧的开口打开；当放置谷阶梯时，透明板中间的开口打开，记录动物每次取食的成功率，通过比较不同检测时间点的成功率来评价动物上肢运动能力和视空间的变化。
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