JP5185470B2 - 自己血清添加骨髄細胞培養システム、自己血清添加骨髄細胞培養方法および自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法 - Google Patents

自己血清添加骨髄細胞培養システム、自己血清添加骨髄細胞培養方法および自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、自己血清添加骨髄細胞培養システム、自己血清添加骨髄細胞培養方法および自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法に関し、より詳細には、抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養するための自己血清添加骨髄細胞培養システムおよび自己血清添加骨髄細胞培養方法、ならびに抗凝固薬を使用せずに対象者から採取されて前記対象者の血清で培養した自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法に関する。
脳梗塞や脊髄損傷、脱髄疾患などの脳神経疾患の治療方法として、患者の骨髄から得られた単核細胞分画の骨髄細胞を患者に静脈投与する方法が再生医療の一環として開発されている（特許文献１）。この治療法は、患部に直接に細胞を投与せずに静脈に投与する点において処置が容易であり、一般的な医療現場において簡便に行うことができるという利点がある。
このような治療方法においては、患者に静脈投与するのに十分な骨髄細胞を確保することが重要である。そのような技術としては、例えば、骨髄細胞を患者から採取して、そのまま無菌的に、あるいは液密に骨髄細胞を収集してその患者へ投与するシステム（特許文献２）や、採取した骨髄液に含まれる骨髄細胞を、ヘパリンやヒト血清を含む培地で培養する方法（特許文献３）などを挙げることができる。また、従来、骨髄細胞を培養する場合は、骨髄細胞のドナーである患者の血清を用いることが、適合性及び安全性の観点から好ましいとされている（特許文献４、特許文献５および特許文献６）。
国際公開ＷＯ２００５／００７１７６号パンフレット 特表２００８−５３８５１４号公報 特開２００６−０５５１０６号公報 特開２００９−０６５８５４号公報 特開２００９−０６５８８４号公報 国際公開ＷＯ２００９／０３４７０８号パンフレット
患者から採取した骨髄液は速やかに凝固するため、凝固反応を阻害するためにヘパリンなどの抗凝固薬が使用されている。しかしながら、通常、患者から骨髄液を採取する場で医療従事者が直ちに骨髄細胞の培養を行うことは困難である。しかも、培養骨髄細胞の効果と安全性を担保する必要があることから、骨髄採取現場から離れた細胞培養場所である細胞調製施設（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ；ＣＰＣ）で骨髄細胞の培養がされることになり、抗凝固薬の使用は避けて通れないものであった。しかしながら、ヘパリンなどの抗凝固薬が細胞増殖に対して著しく阻害作用を及ぼすという知見がある。
さらに、近年、脳梗塞や脊髄損傷、脱髄疾患などの脳神経疾患の治療に係る再生医療の現場において、骨髄細胞を清潔、安全、確実かつ高効率に培養することが求められているが、従来、そのようなニーズを満足させるようなシステムや方法は存在しなかった。
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を、培地を用いて液密状態で凝固抑制処理し、培養して、液密状態で調製した前記対象者の血清でさらに培養するための自己血清添加骨髄細胞培養システム、自己血清添加骨髄細胞培養方法および自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究の結果、対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と必要最低限の培地とを混合することによって凝固反応を十分な期間抑制できることを見出した。また、骨髄を採取する現場で、これらを液密状態で混合して凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を調製し、これを懸濁液のままＣＰＣへ運搬し培養した後、液密状態で調製した前記対象者の自己血清を用いて培養すること、または骨髄を採取する現場で、対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と培地とを液密状態で混合して凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を調製し、そのまま骨髄細胞を培養してＣＰＣへ運搬した後、さらに液密状態で調製した前記対象者の自己血清を用いて培養することにより、骨髄細胞を清潔、安全、確実かつ高効率に培養することができることを見出し、下記の各発明を完成した。
（１）抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養するための自己血清添加骨髄細胞培養システムであって、対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を採取現場にて前記骨髄液を収容する骨髄液収容シリンジから液密に封止可能な剛性容器である骨髄細胞懸濁液運搬容器に移して培地を混合させることにより凝固抑制処理し、前記骨髄液に前記培地を混合させることにより得られる凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を前記骨髄細胞懸濁液運搬容器に収容したまま懸濁状態にて運搬した後、細胞培養場所において骨髄細胞を培養する骨髄細胞培養容器に前記骨髄細胞懸濁液を移して培養を開始し、所定の培養期間経過後、培養上清を除去し、前記骨髄細胞培養容器内に培地および前記対象者の血清を加えて更なる培養を行う自己血清添加骨髄細胞培養システム。
（２）下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の少なくともいずれかのデバイスを備える、（１）に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ａ）前記骨髄液収容シリンジと、培地を収容する培地収容シリンジと、前記骨髄細胞懸濁液を収容する前記骨髄細胞懸濁液運搬容器と、前記骨髄液と前記培地とが流通可能であって前記骨髄液収容シリンジと前記培地収容シリンジと前記骨髄細胞懸濁液運搬容器とを液密に接続可能な骨髄細胞懸濁用接続手段とを有する骨髄細胞懸濁液収容デバイス、（ｂ）前記対象者の血管に刺される血管穿刺針と、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能な血液収容容器と、血液が流通可能であって前記血管穿刺針と前記血液収容容器とを液密に接続可能な採血用接続手段とを有する採血収容デバイス、（ｃ）前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する遠心手段を有する自己血清取得デバイス、（ｄ）前記骨髄細胞培養容器を有する骨髄細胞培養デバイス。
（３）下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のデバイスを備える、（１）に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ａ）前記骨髄液収容シリンジと、培地を収容する培地収容シリンジと、前記骨髄細胞懸濁液を収容する前記骨髄細胞懸濁液運搬容器と、前記骨髄液と前記培地とが流通可能であって前記骨髄液収容シリンジと前記培地収容シリンジと前記骨髄細胞懸濁液運搬容器とを液密に接続可能な骨髄細胞懸濁用接続手段とを有する骨髄細胞懸濁液収容デバイス、（ｂ）前記対象者の血管に刺される血管穿刺針と、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能な血液収容容器と、血液が流通可能であって前記血管穿刺針と前記血液収容容器とを液密に接続可能な採血用接続手段とを有する採血収容デバイス、（ｃ）前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する遠心手段を有する自己血清取得デバイス、（ｄ）前記骨髄細胞培養容器を有する骨髄細胞培養デバイス。
（４）骨髄細胞懸濁液運搬容器が下記（ｅ）および（ｆ）を有し、かつ骨髄細胞懸濁用接続手段が下記（ｇ）を有する、（２）または（３）に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ｅ）前記骨髄細胞懸濁用接続手段と前記骨髄細胞懸濁液運搬容器の内部空間とを連通する運搬容器チューブ、（ｆ）前記骨髄細胞懸濁液運搬容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない運搬容器通気孔フィルタが設けられている運搬容器通気孔、（ｇ）懸濁用第１ポート、懸濁用第２ポートおよび懸濁用第３ポートの３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる懸濁用コックとを有する骨髄細胞懸濁用三方活栓。
（５）前記血液収容容器が下記（ｈ）および（ｉ）を有する、（２）から（４）のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ｈ）前記採血用接続手段と前記血液収容容器の内部空間とを連通する収容容器チューブ、（ｉ）前記血液収容容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタが設けられている収容容器通気孔。
（６）採血収容デバイスが、前記対象者の血管に刺された状態を維持可能な採血針である留置針と、前記留置針に接続された留置針接続チューブと、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能であるとともに下記（ｊ）および（ｋ）を有する血液収容容器と、前記対象者から液密状態で採血して血液を収容可能であって押し出し可能である採血用シリンジと、血液が流通可能であって前記留置針に接続された留置針接続チューブと前記採血用シリンジと前記血液収容容器とを液密に接続可能であるとともに下記（ｌ）を有する採血用三方接続手段とを有する採血収容デバイスである、（２）から（４）のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ｊ）前記採血用三方接続手段と前記血液収容容器の内部空間とを連通する収容容器チューブ、（ｋ）前記血液収容容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタが設けられている収容容器通気孔、（ｌ）採血用第１ポート、採血用第２ポートおよび採血用第３ポートの３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる採血用コックとを有する採血用三方活栓。
（７）前記骨髄細胞培養容器に前記骨髄細胞懸濁液を移す際に培地および／または前記対象者の血清を加えて培養を開始する（１）から（６）のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム。
（８）抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養するための自己血清添加骨髄細胞培養システムであって、対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を採取現場にて前記骨髄液を収容する骨髄液収容シリンジから前記骨髄液に培地を混合することにより得られる凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を収容して骨髄細胞の培養を開始する、液密に封止可能な剛性容器である骨髄細胞培養運搬容器に移して前記培地を混合させることにより凝固抑制処理するとともに前記骨髄細胞の培養を開始し、前記骨髄細胞培養運搬容器に収容したまま培養状態にて運搬した後、所定の培養期間経過後、培養上清を除去し、細胞培養場所において前記骨髄細胞培養運搬容器内に培地および前記対象者の血清を加えて更なる培養を行う自己血清添加骨髄細胞培養システム。
（９）下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の少なくともいずれかのデバイスを備える、（８）に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ｉ）前記骨髄液収容シリンジと、培地を収容する培地収容シリンジと、前記骨髄細胞培養運搬容器と、前記骨髄液と前記培地とが流通可能であって前記骨髄液収容シリンジと前記培地収容シリンジと前記骨髄細胞培養運搬容器とを液密に接続可能な骨髄細胞懸濁用接続手段とを有する骨髄細胞培養デバイス、（ｉｉ）前記対象者の血管に刺される血管穿刺針と、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能な血液収容容器と、血液が流通可能であって前記血管穿刺針と前記血液収容容器とを液密に接続可能な採血用接続手段とを有する採血収容デバイス、（ｉｉｉ）前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する遠心手段を有する自己血清取得デバイス。
（１０）下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のデバイスを備える、（８）に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ｉ）前記骨髄液収容シリンジと、培地を収容する培地収容シリンジと、前記骨髄細胞培養運搬容器と、前記骨髄液と前記培地とが流通可能であって前記骨髄液収容シリンジと前記培地収容シリンジと前記骨髄細胞培養運搬容器とを液密に接続可能な骨髄細胞懸濁用接続手段とを有する骨髄細胞培養デバイス、（ｉｉ）前記対象者の血管に刺される血管穿刺針と、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能な血液収容容器と、血液が流通可能であって前記血管穿刺針と前記血液収容容器とを液密に接続可能な採血用接続手段とを有する採血収容デバイス、（ｉｉｉ）前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する遠心手段を有する自己血清取得デバイス。
（１１）骨髄細胞培養運搬容器が下記（ｉｖ）および（ｖ）を有し、かつ骨髄細胞懸濁用接続手段が下記（ｖｉ）を有する、（９）または（１０）に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ｉｖ）骨髄細胞懸濁用接続手段と前記骨髄細胞培養運搬容器の内部空間とを連通する培養運搬容器チューブ、（ｖ）前記骨髄細胞培養運搬容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない培養運搬容器通気孔フィルタが設けられている培養運搬容器通気孔、（ｖｉ）懸濁用第１ポート、懸濁用第２ポートおよび懸濁用第３ポートの３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる懸濁用コックとを有する骨髄細胞懸濁用三方活栓。
（１２）血液収容容器が下記（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）を有する、（９）から（１１）のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ｖｉｉ）前記採血用接続手段と前記血液収容容器の内部空間とを連通する収容容器チューブ、（ｖｉｉｉ）前記血液収容容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタが設けられている収容容器通気孔。
（１３） 採血収容デバイスが、前記対象者の血管に刺された状態を維持可能な採血針である留置針と、前記留置針に接続された留置針接続チューブと、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能であるとともに下記（ｉｘ）および（ｘ）を有する血液収容容器と、前記対象者から液密状態で採血して血液を収容可能であって押し出し可能である採血用シリンジと、血液が流通可能であって前記留置針に接続された留置針接続チューブと前記採血用シリンジと前記血液収容容器とを液密に接続可能であるとともに下記（ｘｉ）を有する採血用三方接続手段とを有する採血収容デバイスである、（９）から（１１）のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；（ｉｘ）前記採血用三方接続手段と前記血液収容容器の内部空間とを連通する収容容器チューブ、（ｘ）前記血液収容容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタが設けられている収容容器通気孔、（ｘｉ）採血用第１ポート、採血用第２ポートおよび採血用第３ポートの３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる採血用コックとを有する採血用三方活栓。
（１４）抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養する方法であって、前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、前記対象者から採取され、かつ抗凝固薬が添加されない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で培養する骨髄細胞培養工程と、前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加える自己血清培地添加工程とを有する前記方法。
（１５） 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養する方法であって、前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、前記対象者から採取され、かつ抗凝固薬が添加されない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、前記調製した骨髄細胞懸濁液と培地および／または前記取得した前記対象者の血清とを混合して混合骨髄細胞懸濁液を調製する混合骨髄細胞懸濁液調製工程と、前記調製した混合骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で培養する骨髄細胞培養工程と、前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加える自己血清培地添加工程とを有する前記方法。
（１６） 前記混合骨髄細胞懸濁液において前記骨髄液と混合した培地の量、または前記混合骨髄細胞懸濁液において前記骨髄液と混合した培地の量と前記骨髄液と混合した前記取得した前記対象者の血清の量とを合わせた量が前記骨髄液の４倍量ないし８０倍量である、（１５）に記載の方法。
（１７） 前記骨髄液の量に対応した量が前記骨髄液の１．５倍量ないし６倍量である、（１４）から（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８） 前記骨髄細胞懸濁液または前記混合骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で４日ないし７日間培養する、（１４）から（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９） 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞をそのまま培養して前記対象者の血清でさらに培養する方法であって、前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態の骨髄細胞培養運搬容器中で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を前記骨髄細胞培養運搬容器で培養させながら細胞培養場所へ運搬する骨髄細胞培養運搬工程と、前記対象者から採取され、かつ抗凝固剤が添加されない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養運搬容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養運搬容器に前記対象者の血清と培地とを加える自己血清培地添加工程とを有する前記方法。
（２０） 前記骨髄細胞培養運搬容器が細胞培養フラスコである、（１９）に記載の方法。
（２１） 前記骨髄液の量に対応した量が前記骨髄液の２倍量ないし４倍量である、（１９）または（２０）に記載の方法。
（２２） 前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を前記骨髄細胞培養運搬容器で４日ないし７日間培養する、（１９）から（２１）のいずれかに記載の方法。
（２３） 前記血液収容容器が剛性容器である、（１４）から（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４） 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取されて前記対象者の血清で培養した骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法であって、前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、前記対象者から採取され、かつ抗凝固薬が添加されない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で培養する骨髄細胞培養工程と、前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加えて培養する自己血清培地添加培養工程とを有する前記方法。
（２５） 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取されて前記対象者の血清で培養した骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法であって、前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、前記対象者から採取され、かつ抗凝固薬が添加されない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、前記調製した骨髄細胞懸濁液と培地および／または前記取得した前記対象者の血清とを混合して混合骨髄細胞懸濁液を調製する混合骨髄細胞懸濁液調製工程と、前記調製した混合骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で培養する骨髄細胞培養工程と、前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加えて培養する自己血清培地添加培養工程とを有する前記方法。
（２６） 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取されてそのまま培養して前記対象者の血清でさらに培養した骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法であって、前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態の骨髄細胞培養運搬容器中で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を前記骨髄細胞培養運搬容器で培養させながら細胞培養場所へ運搬する骨髄細胞培養運搬工程と、前記対象者から採取され、かつ抗凝固剤が添加されない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養運搬容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養運搬容器に前記対象者の血清と培地とを加えて培養する自己血清培地添加培養工程とを有する前記方法。
本発明によれば、脳梗塞や脊髄損傷、脱髄疾患などの脳神経疾患の治療に係る再生医療の現場において、骨髄細胞を清潔、安全、確実かつ高効率に採取し、培養に供することおよび清潔、安全、確実かつ高効率に採取して培養した自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物を得ることができる。
本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養システムの第一実施形態を示す図である。 本発明における第一実施形態の骨髄細胞懸濁液収容デバイスを示す図である。 第一実施形態および第二実施形態における採血収容デバイスを示す図である。 第一実施形態および第二実施形態における採血収容デバイスの異なる実施形態を示す図である。 本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養システムの第二実施形態を示す図である。 第二実施形態における骨髄細胞培養デバイスを示す図である。 本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養方法の第一実施形態を示すフロー図である。 第一実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養方法の、混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７をさらに有する態様を示すフロー図である。図中、破線矢印は選択が可能であることを示す。 本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養方法の第二実施形態を示すフロー図である。 本発明に係る自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法の第一実施形態を示すフロー図である。 第一実施形態における自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法の、混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７をさらに有する態様を示すフロー図である。図中、破線矢印は選択が可能であることを示す。 本発明に係る自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法の第二実施形態を示すフロー図である。
以下、本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養システム、自己血清添加骨髄細胞培養方法および自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法について詳細に説明する。本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養システム１の第一実施形態は、抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養するための自己血清添加骨髄培養システムであって、対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を採取現場にて前記骨髄液を収容する骨髄液収容シリンジ２１から液密に封止可能な剛性容器である骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に移して培地を混合させることにより凝固抑制処理し、前記骨髄液に前記培地を混合させることにより得られる凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に収容したまま懸濁状態にて運搬した後、細胞培養場所において骨髄細胞を培養する骨髄細胞培養容器５１に前記骨髄細胞懸濁液を移して培養を開始し、所定の培養期間経過後、培養上清を除去し、骨髄細胞培養容器５１内に培地および前記対象者の血清を加えて更なる培養を行うシステムである。
本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養システム１の第一実施形態は、骨髄細胞懸濁液収容デバイス２、採血収容デバイス３、自己血清取得デバイス４および骨髄細胞培養デバイス５の少なくともいずれかのデバイスを備えることが好ましく、これらすべてのデバイスを備えることがより好ましい。
骨髄細胞懸濁液収容デバイス２は、主として、骨髄液収容シリンジ２１と、培地収容シリンジ２２と、骨髄細胞懸濁液運搬容器２３と、骨髄細胞懸濁用接続手段２４とから構成されている。
骨髄液収容シリンジ２１は、対象者から骨髄細胞を含む骨髄液を液密状態で採取して収容し、かつ押し出すことができるものであれば特に限定されず、例えば、医療分野において通常用いられるものを挙げることができる。
培地収容シリンジ２２は、培地を液密状態で収容して押し出すことができるものであれば特に限定されず、例えば、医療分野において通常用いられるものを挙げることができ、本第一実施形態においては骨髄液収容シリンジ２１と同様のものを用いることができる。
なお、本発明において、培地は、骨髄細胞の種類、所望の分化の方向やレベル、必要とされる増殖率などに応じて適宜選択することができる。例えば、神経系の修復に用いるために骨髄間質細胞などの間葉系幹細胞を増殖させる場合に好適な培地としては、以下に示すダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の他、神経前駆細胞標準培地（ＮＰＢＭ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、αＭＥＭ培地などが挙げることができるが、これらに限定されない。
ＤＭＥＭの組成：〈濃度（ｍｇ／Ｌ）〉
ＣａＣｌ２（無水物）〈１６０〜２４０〉、ＫＣＬ〈３２０〜４８０〉、Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ〈０．０８〜１．２〉、ＭｇＳＯ４（無水物）〈８０〜１２０〉、ＮａＣｌ〈５１２０〜７６８０〉、ＮａＨＣＯ３〈２９６０〜４４４０〉、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ〈１００〜１５０〉、Ｄ−グルコース〈３６００〜５４００〉、フェノールレッド〈１２〜１８〉、ピルビン酸ナトリウム〈８８〜１３２〉、Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ〈６７〜１０１〉、Ｌ−システイン・２ＨＣｌ〈５０〜７６〉、Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ〈３４〜５０〉、Ｌ−イソロイシン〈８４〜１２６〉、Ｌ−ロイシン〈８４〜１２６〉、Ｌ−リジン・ＨＣｌ〈１１７〜１７５〉、Ｌ−メチオニン〈２４〜３６〉、Ｌ−フェニルアラニン〈５３〜７９〉、Ｌ−セリン〈３４〜５０〉、Ｌ−スレオニン〈７６〜１１４〉、Ｌ−トリプトファン〈１３〜１９〉、Ｌ−チロシン（２ナトリウム塩）〈８３〜１２５〉、Ｌ−バリン〈７５〜１１３〉、塩化コリン〈３．２〜４．８〉、Ｄ−Ｃａ−パントテン酸〈３．２〜４．８〉、葉酸〈３．２〜４．８〉、ｉ−イノシトール〈５．８〜８．６〉、ナイアシンアミド〈３．２〜４．８〉、ピリドキサール・ＨＣｌ〈３．２〜４．８〉、リボフラビン〈０．３〜０．５〉、チアミン・ＨＣｌ〈３．２〜４．８〉
また、本発明において、培地には、必要に応じて血清や栄養因子、増殖因子、成長因子、分化誘導因子、抗生物質、アミノ酸などを添加してもよい。これらの物質を培地に添加する場合の濃度は、骨髄細胞の所望の分化の方向やレベル、必要とされる増殖率などに応じて適宜設定することができる。
栄養因子や増殖因子、成長因子、分化誘導因子としては、具体的には、例えば、アスコルビン酸およびニコチンアミドなどのビタミン類、ＮＧＦおよびＢＤＮＦなどの神経栄養因子、ＢＭＰなどの骨形成因子、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、ＩＬ−２などのサイトカインを挙げることができる。
また、抗生物質としては、例えば、ペニシリンやストレプトマイシンなどを挙げることができ、これらを単独で培地に添加してもよく、併用して添加してもよい。抗生物質を添加する場合の濃度としては、例えば、ペニシリンとストレプトマイシンとを併用して添加する場合は、それぞれが培地総量の０．５〜２％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．８〜１．２％（ｖ／ｖ）となるよう添加することができる。
また、アミノ酸としては、例えば、Ｌ-アラニン、Ｌ−アスパラギンサン、Ｌ−システイン、Ｌ-グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−グルタミン酸などを挙げることができる。アミノ酸を添加する場合の濃度として、間葉系幹細胞の迅速な増殖させる場合は、例えば、Ｌ-グルタミンを培地総量の０．１〜２％（ｗ／ｖ）となるよう添加することができる。
骨髄細胞懸濁液運搬容器２３は、骨髄液に培地を混合することにより得られる凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を収容することができ、かつ液密に封止可能な剛性容器であれば特に限定されない。そのような構成としては、例えば、図２に示すように、骨髄細胞懸濁液運搬容器２３の上端が開口されており、その開口に運搬容器蓋２５が液密に封止可能な程度にネジ止めされていて、運搬容器蓋２５には運搬容器チューブ２６と運搬容器通気孔２７とを備える構成などを挙げることができる。運搬容器チューブ２６は、骨髄細胞懸濁用接続手段２４と骨髄細胞懸濁液運搬容器２３の内部空間とを連通しており、運搬容器通気孔２７は、骨髄細胞懸濁液運搬容器２３の内部空間と外部空間とを連通している。運搬容器通気孔２７の先端には菌を通過させない運搬容器通気孔フィルタ２８が設けられている。
なお、本発明において、「培地」は「培養液」と、「凝固抑制処理」は「抗凝固処理」、「凝固停止処理」および「凝固阻止処理」とそれぞれ交換可能に用いる場合がある。
本発明において、剛性容器を構成する素材としては、例えば、金属やガラスなどの他、多少の可撓性を有するポリプロピレンやポリ塩化ビニル、ポリスチレンなどの樹脂を挙げることができる。また、運搬容器チューブ２６を構成する素材としては、例えば、市販の熱シーラやクリップなどでシーリングすることにより液密に封止可能なものを挙げることができる。また、運搬容器通気孔フィルタ２８としては、例えば、フィルタ内部で菌を捕捉可能なデプス・タイプのフィルタや、フィルタ表面で菌を捕捉可能なスクリーン・タイプのフィルタなどを挙げることができる。
骨髄細胞懸濁用接続手段２４は、骨髄液と培地とが流通可能であって骨髄液収容シリンジ２１と培地収容シリンジ２２と骨髄細胞懸濁液運搬容器２３とを液密に接続可能な構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図２に示すように、骨髄細胞懸濁用三方活栓６を有する構成を挙げることができる。骨髄細胞懸濁用三方活栓６は、懸濁用第１ポート６１、懸濁用第２ポート６２、および懸濁用第３ポート６３の３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる懸濁用コック６４とを有する。懸濁用コック６４は、少なくとも懸濁用第１ポート６１と懸濁用第２ポート６２とを連通させた姿勢と、懸濁用第２ポート６２と懸濁用第３ポート６３とを連通させた姿勢とに、回動によって姿勢変化され得る。骨髄細胞懸濁用三方活栓６としては、例えば、一般的なＴ型の医療用三方活栓の他、特開２００９−０７７８７９号公報や特開２００９−１８３５８３号公報に記載されたものを用いることができる。
なお、本第一実施形態では、骨髄細胞懸濁用接続手段２４として骨髄細胞懸濁用三方活栓６を例示したが、これに限られるものではなく、骨髄液収容シリンジ２１および培地収容シリンジ２２を運搬容器チューブ２６に選択的に着脱して連通させる構成を採用してもよい。
採血収容デバイス３は、主として、血管穿刺針３１と、血液収容容器３２と、採血用接続手段３３とから構成されている。
血管穿刺針３１は、対象者の血管に刺して血液が内部を流通可能なもの、医療分野において通常用いられるものであればよい。
血液収容容器３２は、対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能なもの、医療分野において通常用いられるものであれば特に限定されない。そのような構成としては、例えば、図３に示すように、採血用接続手段３３を介して血管穿刺針３１から血液を流入させて液密に封止可能、かつ遠心処理可能なものであって、血液収容容器３２の上端が開口されており、その開口に収容容器蓋７が液密に封止可能な程度にネジ止めされていて、前記収容容器蓋７には収容容器チューブ７１と収容容器通気孔７２とを備える構成などを挙げることができる。収容容器チューブ７１は、採血用接続手段３３と血液収容容器３２の内部空間とを連通しており、収容容器通気孔７２は、血液収容容器３２の内部空間と外部空間とを連通している。収容容器通気孔７２の先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタ７３が設けられている。
採血用接続手段３３は、血液が流通可能であって血管穿刺針３１と血液収容容器３２とを液密に接続可能な構成や機能を有していればよい。
また、採血収容デバイス３の異なる実施態様としては、図４に示すように、主として、留置針３４と、留置針３４に接続された留置針接続チューブ３５と、血液収容容器３２と、採血用シリンジ３６と、採血用三方接続手段３７とから構成されている。なお、採血収容デバイス３の構成のうち、上述した構成と同等または相当する構成については同一の符号を付し、再度の説明を省略する。
留置針３４は、対象者の血管に刺された状態を維持可能な採血針である。留置針３４は、医療分野で通常用いられるものであれば特に限定されないが、対象者の四肢などに固定しやすいという観点から翼状針が好ましい。翼状針としては、例えば、国際公開公報ＷＯ２００６／１２３６４５号パンフレットに記載されたものが挙げられる。
留置針接続チューブ３５の一端には、留置針３４が接続されているとともに、留置針接続チューブ３５の他端には、採血用三方接続手段３７が接続されている。留置針接続チューブ３５を通じて留置針３４から採血用三方接続手段３７へ血液が流通される。なお、留置針接続チューブ３５は、医療用のチューブであれば特に限定されない。
採血用シリンジ３６は対象者から液密状態で採血して収容し、かつ押し出すことができるものであれば特に限定されず、例えば、医療分野において通常用いられるものを挙げることができる。
採血用三方接続手段３７は、血液が流通可能であって、留置針３４に接続された留置針接続チューブ３５と採血用シリンジ３６と血液収容容器３２とを液密に接続可能な構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図４に示すように、採血用三方活栓８を有する構成を挙げることができる。採血用三方活栓８は、採血用第１ポート８１、採血用第２ポート８２、および採血用第３ポート８３の３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる採血用コック８４とを有する。採血用コック８４は、少なくとも採血用第１ポート８１と採血用第２ポート８２とを連通させた姿勢と、採血用第２ポート８２と採血用第３ポート８３とを連通させた姿勢とに、回動によって姿勢変化され得る。採血用三方活栓８としては、例えば、上述した骨髄細胞懸濁用三方活栓６と同様のものを用いることができる。
なお、本第一実施形態では、採血用接続手段３３として、血液収容容器３２と血管穿刺針３１とを連通させる構成と、採血用三方接続手段３７とを例示したが、これに限られるものではなく、他の構成を採用してもよい。
自己血清取得デバイス４は、遠心処理手段４１から構成されている。遠心処理手段４１は、対象者の血液を収容した血液収容容器３２を遠心処理して前記対象者の血清を取得することができるものであれば特に限定されず、例えば、通常用いられる遠心分離機を挙げることができる。
骨髄細胞培養デバイス５は、骨髄細胞培養容器５１から構成されている。骨髄細胞培養容器５１は、前記骨髄細胞懸濁液を移して骨髄細胞を培養するものであれば特に限定されず、例えば、プラスチック製シャーレやガラス製シャーレなどのディッシュ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート、細胞培養シート、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコなどを挙げることができるが、剛性容器であることが好ましい。
次に、本第一実施形態における骨髄細胞懸濁液収容デバイス２、採血収容デバイス３、自己血清取得デバイス４、骨髄細胞培養デバイス５、およびこれらを備えた自己血清添加骨髄細胞培養システム１の作用、自己血清添加骨髄細胞培養方法ならびに自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法について説明する。
骨髄細胞懸濁液収容デバイス２において、対象者から採取された骨髄液と培地とが液密に混合されて凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液が調製され、細胞培養場所である細胞調製施設（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ；ＣＰＣ）へ運搬される。以下、詳述する。
対象者から採取された骨髄液は骨髄液収容シリンジ２１に収容される。骨髄液は対象者から採取されるが、対象者から骨髄液を採取する手法の説明は省略する。図２に示すように、対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を収容した骨髄液収容シリンジ２１は、採取現場にて、骨髄細胞懸濁用接続手段２４たる骨髄細胞懸濁用三方活栓６の懸濁用第１ポート６１に接続される。そして、懸濁用コック６４を回して懸濁用第１ポート６１と懸濁用第２ポート６２とを連通させた状態にする。続いて、骨髄液収容シリンジ２１に収容された骨髄液が骨髄液収容シリンジ２１から押し出されると、骨髄液は懸濁用第１ポート６１から懸濁用第２ポート６２、運搬容器チューブ２６を通じて骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に注入されるとともに、運搬容器通気孔２７を通じて、骨髄細胞懸濁液運搬容器２３の内部空間から空気が排出される。
培地収容シリンジ２２は、骨髄液収容シリンジ２１が懸濁用第１ポート６１に接続される前に、懸濁用第３ポート６３に接続される。そして、懸濁用コック６４を回して懸濁用第２ポート６２と懸濁用第３ポート６３とを連通させた状態に切り換えられる。続いて、培地収容シリンジ２２に収容された培地のうち、骨髄液収容シリンジ２１に収容された骨髄液に対応した量の培地が培地収容シリンジ２２から押し出されると、培地は懸濁用第３ポート６３から懸濁用第２ポート６２、運搬容器チューブ２６を通じて骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に注入されるとともに、運搬容器通気孔２７を通じて、骨髄細胞懸濁液運搬容器２３の内部空間から空気が排出される。これにより、骨髄細胞懸濁液運搬容器２３において、対象者から採取された骨髄液と、その骨髄液の量に対応した量の培地とが液密に混合されて凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液が調製される。
なお、上述した態様では、培地収容シリンジが懸濁用第３ポート６３に接続された後に骨髄液収容シリンジ２１が懸濁用第１ポート６１に接続されているが、これらの接続の順は特に限定されず、骨髄液収容シリンジ２１が懸濁用第１ポート６１に接続された後に、培地収容シリンジが懸濁用第３ポート６３に接続されてもよく、同時に接続されてもよい。また、前記骨髄液の量に対応した培地の量は、骨髄液収容シリンジ２１に収容された骨髄液の１．５倍量ないし６倍量であることが好ましく、そのため培地収容シリンジ２２、骨髄液収容シリンジ２１および骨髄細胞懸濁液運搬容器２３の少なくともいずれかに、内容物の容量を目測するための目盛りが付されていることが好ましい。
その後、運搬容器チューブ２６を熱シーラやクリップにより液密に封止した後、その封止箇所と懸濁用第２ポート６２との間で切断することにより、骨髄液収容シリンジ２１、培地収容シリンジ２２および骨髄細胞懸濁用接続手段２４と骨髄細胞懸濁液運搬容器２３とを切り離し、骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に収容された骨髄細胞懸濁液を懸濁状態にてＣＰＣへ運搬する。
一方、採血収容デバイス３において、対象者の血液が血液収容容器３２に収容される。以下、詳述する。
血管穿刺針３１を対象者の血管に刺して採血する。採血された血液は、採血用接続手段３３および収容容器チューブ７１を通じて血液収容容器３２に注入されるとともに、収容容器通気孔７２を通じて、血液収容容器３２の内部空間から空気が排出される。これにより採血された血液が液密に血液収容容器３２に収容される。
その後、収容容器チューブ７１を熱シーラやクリップにより液密に封止した後、その封止箇所と採血用接続手段３３との間で切断することにより、血管穿刺針３１および採血用接続手段３３と対象者の血液を収容した血液収容容器３２とを切り離す。
一方、上述した採血収容デバイス３の異なる態様を採用する場合、留置針３４は、対象者の血管に刺された状態で留置される。これにより、所望量の血液を得るために複数回に渡って対象者に採血針を刺す必要がない。図４に示されるように、留置針３４が接続されている留置針接続チューブ３５に採血用三方活栓８の採血用第１ポート８１が接続される。これにより、留置針３４から採血用三方接続手段３７へ血液が流入可能となる。採血用三方活栓８の採血用コック８４を回して採血用第１ポート８１と採血用第２ポート８２とを連通させた状態にする。この状態において、採血用シリンジ３６の採血用プランジャ３８が引き出されて対象者から採血される。この採血は、施術者が採血用プランジャ３８を引き出し続けるという能動的な動作により継続される。
採血用シリンジ３６の内部が対象者の血液で満たされると、採血用プランジャ３８の操作が中断される。そして、採血用三方活栓８の採血用コック８４が採血用第２ポート８２と採血用第３ポート８３とを連通させた状態に切り換えられる。再び、採血用プランジャ３８が操作されて、具体的には採血用プランジャ３８が押し込まれて採血用シリンジ３６から血液が流出される。この流出された血液は、採血用三方活栓８を通じて血液収容容器３２に流れ込む。採血用シリンジ３６の血液がすべて血液収容容器３２へ注入されると、採血用プランジャ３８の操作が終了される。血液が注入された血液収容容器３２は、収容容器チューブ７１を熱シーラやクリップにより液密に封止した後、その封止箇所と採血用第３ポート８３との間で切断することにより、留置針３４、留置針接続チューブ３５、採血用シリンジ３６および採血用三方接続手段３７と対象者の血液を収容した血液収容容器３２とを切り離す。
続いて、自己血清取得デバイス４において、対象者の血液から血清が取得される。対象者の血液を収容した血液収容容器３２が遠心処理手段４１において遠心処理された後、上清を回収して対象者の血清を取得する。
さらに、骨髄細胞培養デバイス５において、骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞が培養され、骨髄細胞培養容器５１から浮遊細胞を含む培養上清が除去された後、取得された対象者の血清と新たな培地とが添加されて更に培養される。以下、詳述する。
ＣＰＣに運搬された骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞培養容器５１に移して、この骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を所定の培養期間培養する。なお、当該所定の培養期間は４日ないし７日間が好ましい。
培養後、骨髄細胞培養容器５１から浮遊細胞を含む培養上清を除去し、取得された対象者の血清と新たな培地とを添加して更なる培養が行われる。
なお、ＣＰＣに運搬された骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞培養容器５１に移す際に新たな培地および取得された対象者の血清の少なくともいずれかを添加して、骨髄細胞を所定の培養期間培養してもよい。前記対象者の血清を添加せずに新たな培地を添加する場合は、骨髄液と混合した培地の量のトータル、すなわち骨髄液の採取現場にて骨髄液と混合した培地の量と、当該添加する新たな培地の量とのトータルが、骨髄液収容シリンジ２１に収容された骨髄液の４倍量ないし８０倍量となるように添加することが好ましい。また、取得された対象者の血清のみを添加する場合は、骨髄液と混合した培地および取得された対象者の血清の量のトータル、すなわち骨髄液の採取現場にて骨髄液と混合した培地の量と、当該添加する取得された対象者の血清の量とのトータルが、骨髄液収容シリンジ２１に収容された骨髄液の４倍量ないし８０倍量となるように添加することが好ましい。また、新たな培地および取得された対象者の血清のいずれも添加する場合は、骨髄液と混合した培地および取得された対象者の血清の量のトータル、すなわち骨髄液の採取現場にて骨髄液と混合した培地の量と、当該添加する新たな培地の量と、当該添加する取得された対象者の血清の量とのトータルが、骨髄液収容シリンジ２１に収容された骨髄液の４倍量ないし８０倍量となるように添加することが好ましい。
次に、本第一実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養方法は、図７に示すように、骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１と、採血収容工程Ｓ２と、自己血清取得工程Ｓ３と、骨髄細胞培養工程Ｓ４と、培養上清除去工程Ｓ５と、自己血清培地添加工程Ｓ６とを有しており、骨髄液を採取現場にて骨髄液収容シリンジ２１から骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に移して培地を混合させることにより凝固抑制処理し、骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に収容したまま懸濁状態にて運搬した後、ＣＰＣにおいて骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞培養容器５１に移して培養を開始し、所定の培養期間経過後、浮遊細胞を含む培養上清を除去し、骨髄細胞培養容器５１内に新たな培地および対象者の血清を加えて更なる培養を行う方法である。なお、本第一実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養方法の発明特定事項のうち、上述した本第一実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養システム１における各構成と同等または相当する構成については同一の符号を付し、再度の説明を省略する。
骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１は、骨髄細胞懸濁液収容デバイス２における工程であり、対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液とその骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液を採取した現場で速やかに液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する工程である。なお、骨髄液の量に対応した量が前記骨髄液の１．５倍量ないし６倍量であることが好ましい。
ここで、本発明において、「抗凝固薬」とは、薬物や薬剤として血液成分などの生体成分の凝固を防ぎ、凝塊形成を予防するもの、例えば、ヘパリンナトリウム、ヘパリンカルシウムなどのヘパリン、ダルテパリンナトリウム、パルパリンナトリウム、レビパリンナトリウムなどの低分子ヘパリン、メシル酸ナファモスタット、メシル酸ガベキセート、クエン酸、ＣＰＤ液（Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＡＣＤ−Ａ液（Ａｃｉｄ−Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ−Ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ワルファリン、クマリン、ジクマロール、フェンプロクーモン、アセノクマロール、ビスクマ酢酸エチル、インダネジオン誘導体などをいうが、本発明で用いられる細胞培地のように、結果的には凝固を抑制するものの、本来、薬物や薬剤として血液成分などの生体成分の凝固を防ぎ、凝塊形成を予防するものではないものを含まない趣旨である。すなわち、「抗凝固薬」は、「細胞培地を除く抗凝固剤」、「培地を除く抗凝固剤」と交換可能に用いる場合がある。
採血収容工程Ｓ２は、採血収容デバイス３における工程であり、対象者から採取された、抗凝固薬が添加されていない血液を遠心処理可能な血液収容容器３２へ液密状態で収容する工程である。なお、血液収容容器３２は遠心処理可能な剛性容器であることが好ましい。
自己血清取得工程Ｓ３は、自己血清取得デバイス４における工程であり、対象者の血液を収容した血液収容容器３２を遠心処理して前記対象者の血清を取得する工程である。
骨髄細胞培養工程Ｓ４は、骨髄細胞培養デバイス５における工程であり、調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器５１で培養する工程である。なお、骨髄細胞培養工程Ｓ４においては、骨髄細胞の培養は静置状態での培養が好ましく、また上述のとおり、骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を４日ないし７日間培養するのが好ましい。
培養上清除去工程Ｓ５は、骨髄細胞培養デバイス５における工程であり、培養後の骨髄細胞が付着した骨髄細胞培養容器５１から浮遊細胞を含む培養上清を除去する工程である。
自己血清培地添加工程Ｓ６は、骨髄細胞培養デバイス５における工程であり、骨髄細胞が付着した骨髄細胞培養容器５１に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加える工程である。
なお、本第一実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養方法は、図８に示すように、後述する混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７をさらに有してもよい。この場合、骨髄細胞培養工程Ｓ４における「骨髄細胞懸濁液」は、「混合骨髄細胞懸濁液」と読み替えられる。
混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７は、骨髄細胞培養デバイス５における工程であり、調製した骨髄細胞懸濁液と培地および／または前記取得した前記対象者の血清とを混合して混合骨髄細胞懸濁液を調製する工程、すなわち、骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞培養容器５１に移す際に新たな培地および取得された対象者の血清の少なくともいずれかを添加して、混合骨髄細胞懸濁液を調製する工程である。前記対象者の血清を添加せずに新たな培地を添加する場合は、混合骨髄細胞懸濁液における培地の量のトータル、すなわち骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１で骨髄液と混合した培地の量と、当該混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７で添加する新たな培地の量とのトータルが、骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１において対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液の４倍量ないし８０倍量となるように添加することが好ましい。また、取得された対象者の血清のみを添加する場合は、骨髄液と混合した培地および取得された対象者の血清の量のトータル、すなわち骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１で骨髄液と混合した培地の量と、当該混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７で添加する取得された対象者の血清の量とのトータルが、骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１において対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液の４倍量ないし８０倍量となるように添加することが好ましい。また、新たな培地および取得された対象者の血清のいずれも添加する場合は、骨髄液と混合した培地および血清の量のトータル、すなわち骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１で骨髄液と混合した培地の量と、当該混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７で添加する新たな培地の量と、当該混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７で添加する取得された対象者の血清の量とのトータルが、骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１において対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液の４倍量ないし８０倍量となるように添加することが好ましい。
次に、本第一実施形態における自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法は、図１０に示すように、骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１と、採血収容工程Ｓ２と、自己血清取得工程Ｓ３と、骨髄細胞培養工程Ｓ４と、培養上清除去工程Ｓ５と、自己血清培地添加培養工程Ｓ９とを有しており、骨髄液を採取現場にて骨髄液収容シリンジ２１から骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に移して培地を混合させることにより凝固抑制処理し、骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に収容したまま懸濁状態にて運搬した後、ＣＰＣにおいて骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞培養容器５１に移して培養を開始し、所定の培養期間経過後、浮遊細胞を含む培養上清を除去し、骨髄細胞培養容器５１内に新たな培地および対象者の血清を加えて更なる培養を行う方法である。なお、本第一実施形態における自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法の発明特定事項のうち、上述した本第一実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養システム１および自己血清添加骨髄細胞培養方法の各構成および各発明特定事項と同等または相当する構成および発明特定事項については同一の符号を付し、再度の説明を省略する。
自己血清培地添加培養工程Ｓ９は、骨髄細胞培養デバイス５における工程であり、骨髄細胞が付着した骨髄細胞培養容器５１に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加えて更なる培養を行う工程である。
なお、本第一実施形態における自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法は、図１１に示すように、上述した混合骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ７をさらに有してもよい。この場合、骨髄細胞培養工程Ｓ４における「骨髄細胞懸濁液」は、「混合骨髄細胞懸濁液」と読み替えられる。
以上のような本第一実施形態における骨髄細胞懸濁液収容デバイス２、採血収容デバイス３、自己血清取得デバイス４、骨髄細胞培養デバイス５、およびこれらを備えた自己血清添加骨髄細胞培養システム１、自己血清添加骨髄細胞培養方法ならびに自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法によれば、以下のような効果を奏する。
１．対象者から採取された骨髄液に含まれる骨髄細胞を液密状態で清潔かつ簡便に凝固抑制処理でき、骨髄細胞を効率よく取得することができる。
２．前記対象者の血液を液密状態で清潔かつ簡便に収容して、その血清を効率よく取得することができる。
３．自己血清を用いて対象者の骨髄細胞を培養することで、骨髄細胞を効率よく増殖させ、再生医療に用いることができる。
４．対象者から採取された骨髄液に含まれる骨髄細胞が少量の場合でも、簡便かつ確実に増殖させ、再生医療に用いることができる。
次に、本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養システム１の本第二実施形態について詳細に説明する。本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養システム１の第二実施形態は、抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養するための自己血清添加骨髄細胞培養システムであって、対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を採取現場にて前記骨髄液を収容する骨髄液収容シリンジ２１から前記骨髄液に培地を混合することにより得られる凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を収容して骨髄細胞の培養を開始する、液密に封止可能な剛性容器である骨髄細胞培養運搬容器５２に移して前記培地を混合させることにより凝固抑制処理するとともに前記骨髄細胞の培養を開始し、骨髄細胞培養運搬容器５２に収容したまま培養状態にて運搬した後、所定の培養期間経過後、培養上清を除去し、細胞培養場所において骨髄細胞培養運搬容器５２内に培地および前記対象者の血清を加えて更なる培養を行うシステムである。
本発明に係る自己血清添加骨髄細胞培養システム１の本第二実施形態は、採血収容デバイス３、自己血清取得デバイス４および骨髄細胞培養デバイス５の少なくともいずれかのデバイスを備えることが好ましく、これらすべてのデバイスを備えることがより好ましい。なお、本第二実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養システム１の構成のうち、上述した第一実施形態における各構成と同等または相当する構成については同一の符号を付し、再度の説明を省略する。
本第二実施形態における骨髄細胞培養デバイス５は、主として、骨髄液収容シリンジ２１と、培地収容シリンジ２２と、骨髄細胞培養運搬容器５２と、骨髄細胞懸濁用接続手段２４とから構成されている。
骨髄細胞培養運搬容器５２は、骨髄液に培地を混合することにより得られる凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を収容して骨髄細胞を培養することができ、かつ液密に封止可能な剛性容器であれば特に限定されない。そのような構成としては、例えば、図６に示すように、骨髄細胞培養運搬容器５２の上端が開口されており、その開口に培養運搬容器蓋５３が液密に封止可能な程度にネジ止めされていて、培養運搬容器蓋５３には培養運搬容器チューブ５４と培養運搬容器通気孔５５とを備える構成などを挙げることができる。培養運搬容器チューブ５４は、培養運搬容器蓋５３を貫通して骨髄細胞懸濁用接続手段２４と骨髄細胞培養運搬容器５２の内部空間とを連通しており、培養運搬容器通気孔５５は、培養運搬容器蓋５３を貫通して骨髄細胞培養運搬容器５２の内部空間と外部空間とを連通している。培養運搬容器通気孔５５の先端には菌を通過させない培養運搬容器通気孔フィルタ５６が設けられている。培養運搬容器チューブ５４を構成する素材および培養運搬容器通気孔フィルタ５６は、それぞれ、運搬容器チューブ２６および運搬容器通気孔フィルタ２８と同様のものを用いることができる。
本第二実施形態において、骨髄細胞懸濁用接続手段２４は、骨髄液と培地とが流通可能であって骨髄液収容シリンジ２１と培地収容シリンジ２２と骨髄細胞培養運搬容器５２とを液密に接続可能な構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図６に示すように、骨髄細胞懸濁用三方活栓６を有する構成を挙げることができる。なお、本第二実施形態における骨髄細胞懸濁用三方活栓６の構成は、本第一実施形態と同様である。
次に、本第二実施形態における骨髄細胞培養デバイス５、採血収容デバイス３、自己血清取得デバイス４、およびこれらを備えた自己血清添加骨髄細胞培養システム１の作用、自己血清添加骨髄細胞培養方法ならびに自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法について説明する。
骨髄細胞培養デバイス５において、対象者から採取された骨髄液と培地とが液密に混合されて凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液が調製され、これに含まれる骨髄細胞が培養されるとともにＣＰＣへ運搬される。以下、詳述する。
前記凝固抑制処理されて調製された骨髄細胞懸濁液の骨髄細胞培養運搬容器５２への収容は、第一実施形態における骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞懸濁液運搬容器２３に収容する場合と同様である。なお、本第二実施形態においては、骨髄細胞培養運搬容器５２が培養を開始するとともに培養された骨髄細胞を付着させることができる構成を備えていることから、骨髄細胞懸濁液を調製するとともにこれに含まれる骨髄細胞の培養が開始され、培養された骨髄細胞が骨髄細胞培養運搬容器５２に付着する。
すなわち、骨髄細胞培養運搬容器５２は、培養を開始するとともに培養された骨髄細胞を付着させることができる容器であれば特に限定されないが、細胞培養フラスコであることが好ましい。なお、第二実施形態において培地収容シリンジ２２に収容された培地の量は、骨髄液収容シリンジ２１に収容された骨髄液の２倍量ないし４倍量であることが好ましい。
骨髄細胞培養運搬容器５２に収容された骨髄細胞は、培養状態にてＣＰＣへ運搬された後、所定の培養期間経過後、前記骨髄細胞培養運搬容器５２から浮遊細胞を含む培養上清が除去された後、当該対象者の自己血清と新たな培地とが添加されて更に培養される。なお、本第二実施形態における採血収容デバイス３および自己血清取得デバイス４についての作用は第一実施形態と同様である。また、培養状態にてＣＰＣへ運搬された後の骨髄細胞の培養は静置状態での培養が好ましく、当該所定の培養期間は４日ないし７日間が好ましい。
次に、本第二実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養方法は、抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞をそのまま培養し、その後、前記対象者の血清を用いてさらに培養する方法である。具体的には、図９に示すように、骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１と、骨髄細胞培養運搬工程Ｓ８と、採血収容工程Ｓ２と、自己血清取得工程Ｓ３と、培養上清除去工程Ｓ５と、自己血清培地添加工程Ｓ６とを有しており、骨髄液を採取現場にて骨髄液収容シリンジ２１から骨髄細胞培養運搬容器５２に移して培地を混合させることにより凝固抑制処理するとともに骨髄細胞の培養を開始し、骨髄細胞培養運搬容器５２に収容したまま培養状態にて運搬した後、所定の培養期間経過後、浮遊細胞を含む培養上清を除去し、ＣＰＣにおいて骨髄細胞培養運搬容器５２内に新たな培地および対象者の血清を加えて更なる培養を行う方法である。なお、本第二実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養方法の発明特定事項のうち、上述した第一実施形態あるいは本第二実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養システム１、自己血清添加骨髄細胞培養方法ならびに自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法の各構成および各発明特定事項と同等または相当する構成および発明特定事項については同一の符号を付し、再度の説明を省略する。
骨髄細胞培養運搬工程Ｓ８は、骨髄細胞培養デバイス５における工程であり、調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養運搬容器５２で培養する工程であり、遠隔地で調製した骨髄細胞懸濁液を骨髄細胞培養運搬容器５２に収容し、そのまま培養状態にて運搬する工程である。なお、また上述のとおり、骨髄細胞培養運搬容器５２は細胞培養フラスコであることが好ましく、また、骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１における骨髄液の量に対応した培地の量が骨髄液の２倍量ないし４倍量であることが好ましく、さらには、骨髄細胞培養運搬工程Ｓ８において骨髄細胞を骨髄細胞培養運搬容器５２で４日ないし７日間培養するのが好ましい。
次に、本第二実施形態における自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法は、抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞をそのまま培養し、その後、前記対象者の血清を用いてさらに培養する方法である。具体的には、図１２に示すように、骨髄細胞懸濁液調製工程Ｓ１と、骨髄細胞培養運搬工程Ｓ８と、採血収容工程Ｓ２と、自己血清取得工程Ｓ３と、培養上清除去工程Ｓ５と、自己血清培地添加培養工程Ｓ９とを有しており、骨髄液を採取現場にて骨髄液収容シリンジ２１から骨髄細胞培養運搬容器５２に移して培地を混合させることにより凝固抑制処理するとともに骨髄細胞の培養を開始し、骨髄細胞培養運搬容器５２に収容したまま培養状態にて運搬した後、所定の培養期間経過後、浮遊細胞を含む培養上清を除去し、ＣＰＣにおいて骨髄細胞培養運搬容器５２内に新たな培地および対象者の血清を加えて更なる培養を行う方法である。なお、本第二実施形態における自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法の発明特定事項のうち、上述した第一実施形態あるいは本第二実施形態における自己血清添加骨髄細胞培養システム１および自己血清添加骨髄細胞培養方法の各構成および各発明特定事項と同等または相当する構成および発明特定事項については同一の符号を付し、再度の説明を省略する。
以上のような本第二実施形態における骨髄細胞培養デバイス５、採血収容デバイス３、自己血清取得デバイス４、およびこれらを備えた自己血清添加骨髄細胞培養システム１、自己血清添加骨髄細胞培養方法ならびに自己血清添加培養骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物の製造方法によれば、以下のような効果を奏する。
１．対象者から採取された骨髄液に含まれる骨髄細胞を液密状態で清潔かつ簡便に凝固抑制処理でき、骨髄細胞を効率よく取得することができる。
２．前記対象者の血液を液密状態で清潔かつ簡便に収容して、その血清を効率よく取得することができる。
３．自己血清を用いて対象者の骨髄細胞を培養することで、骨髄細胞を効率よく増殖させ、再生医療に用いることができる。
４．対象者から採取された骨髄液に含まれる骨髄細胞が少量の場合でも、簡便かつ確実に増殖させ、再生医療に用いることができる。
５．遠隔地において対象者から採取された骨髄液に含まれる骨髄細胞でも、確実に培養し、増殖させ、再生医療に用いることができる。
１ 自己血清添加骨髄細胞培養システム
２ 骨髄細胞懸濁液収容デバイス
３ 採血収容デバイス
４ 自己血清取得デバイス
５ 骨髄細胞培養デバイス
６ 骨髄細胞懸濁用三方活栓
７ 収容容器蓋
８ 採血用三方活栓
２１ 骨髄液収容シリンジ
２２ 培地収容シリンジ
２３ 骨髄細胞懸濁液運搬容器
２４ 骨髄細胞懸濁用接続手段
２５ 運搬容器蓋
２６ 運搬容器チューブ
２７ 運搬容器通気孔
２８ 運搬容器通気孔フィルタ
３１ 血管穿刺針
３２ 血液収容容器
３３ 採血用接続手段
３４ 留置針
３５ 留置針接続チューブ
３６ 採血用シリンジ
３７ 採血用三方接続手段
３８ 採血用プランジャ
４１ 遠心手段
５１ 骨髄細胞培養容器
５２ 骨髄細胞培養運搬容器
５３ 培養運搬容器蓋
６１ 懸濁用第１ポート
６２ 懸濁用第２ポート
６３ 懸濁用第３ポート
６４ 懸濁用コック
７１ 収容容器チューブ
７２ 収容容器通気孔
７３ 収容容器通気孔フィルタ
８１ 採血用第１ポート
８２ 採血用第２ポート
８３ 採血用第３ポート
８４ 採血用コック
Ｓ１ 骨髄細胞懸濁液調製工程
Ｓ２ 採血収容工程
Ｓ３ 自己血清取得工程
Ｓ４ 骨髄細胞培養工程
Ｓ５ 培養上清除去工程
Ｓ６ 自己血清培地添加工程
Ｓ７ 混合骨髄細胞懸濁液調製工程
Ｓ８ 骨髄細胞培養運搬工程
Ｓ９ 自己血清培地添加培養工程

Claims (26)

  1. 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養するための自己血清添加骨髄細胞培養システムであって、
    対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と培地とを採取現場にて液密状態で混合するデバイスであって、前記骨髄液と前記培地とを混合することにより得られる凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を収容する骨髄細胞懸濁液収容デバイスと、
    前記骨髄細胞懸濁液収容デバイスから移された前記骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を培養する骨髄細胞培養デバイスと
    を備える自己血清添加骨髄細胞培養システム。
  2. 下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の少なくともいずれかのデバイスを備える、請求項１に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ａ）前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を収容する骨髄液収容シリンジと、培地を収容する培地収容シリンジと、前記骨髄細胞懸濁液を収容する液密に封止可能な剛性容器である骨髄細胞懸濁液運搬容器と、前記骨髄液と前記培地とが流通可能であって前記骨髄液収容シリンジと前記培地収容シリンジと前記骨髄細胞懸濁液運搬容器とを液密に接続可能な骨髄細胞懸濁用接続手段とを有する骨髄細胞懸濁液収容デバイス、
    （ｂ）前記対象者の血管に刺される血管穿刺針と、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能な血液収容容器と、血液が流通可能であって前記血管穿刺針と前記血液収容容器とを液密に接続可能な採血用接続手段とを有する採血収容デバイス、
    （ｃ）前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する遠心手段を有する自己血清取得デバイス、
    （ｄ）骨髄細胞を培養する骨髄細胞培養容器を有する骨髄細胞培養デバイス。
  3. 下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のデバイスを備える、請求項１に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ａ）前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を収容する骨髄液収容シリンジと、培地を収容する培地収容シリンジと、前記骨髄細胞懸濁液を収容する液密に封止可能な剛性容器である骨髄細胞懸濁液運搬容器と、前記骨髄液と前記培地とが流通可能であって前記骨髄液収容シリンジと前記培地収容シリンジと前記骨髄細胞懸濁液運搬容器とを液密に接続可能な骨髄細胞懸濁用接続手段とを有する骨髄細胞懸濁液収容デバイス、
    （ｂ）前記対象者の血管に刺される血管穿刺針と、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能な血液収容容器と、血液が流通可能であって前記血管穿刺針と前記血液収容容器とを液密に接続可能な採血用接続手段とを有する採血収容デバイス、
    （ｃ）前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する遠心手段を有する自己血清取得デバイス、
    （ｄ）骨髄細胞を培養する骨髄細胞培養容器を有する骨髄細胞培養デバイス。
  4. 骨髄細胞懸濁液運搬容器が下記（ｅ）および（ｆ）を有し、かつ骨髄細胞懸濁用接続手段が下記（ｇ）を有する、請求項２または請求項３に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ｅ）前記骨髄細胞懸濁用接続手段と前記骨髄細胞懸濁液運搬容器の内部空間とを連通する運搬容器チューブ、
    （ｆ）前記骨髄細胞懸濁液運搬容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない運搬容器通気孔フィルタが設けられている運搬容器通気孔、
    （ｇ）懸濁用第１ポート、懸濁用第２ポートおよび懸濁用第３ポートの３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる懸濁用コックとを有する骨髄細胞懸濁用三方活栓。
  5. 前記血液収容容器が下記（ｈ）および（ｉ）を有する、請求項２から請求項４のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ｈ）前記採血用接続手段と前記血液収容容器の内部空間とを連通する収容容器チューブ、
    （ｉ）前記血液収容容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタが設けられている収容容器通気孔。
  6. 採血収容デバイスが、前記対象者の血管に刺された状態を維持可能な採血針である留置針と、前記留置針に接続された留置針接続チューブと、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能であるとともに下記（ｊ）および（ｋ）を有する血液収容容器と、前記対象者から液密状態で採血して血液を収容可能であって押し出し可能である採血用シリンジと、血液が流通可能であって前記留置針に接続された留置針接続チューブと前記採血用シリンジと前記血液収容容器とを液密に接続可能であるとともに下記（ｌ）を有する採血用三方接続手段とを有する採血収容デバイスである、請求項２から請求項４のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ｊ）前記採血用三方接続手段と前記血液収容容器の内部空間とを連通する収容容器チューブ、
    （ｋ）前記血液収容容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタが設けられている収容容器通気孔、
    （ｌ）採血用第１ポート、採血用第２ポートおよび採血用第３ポートの３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる採血用コックとを有する採血用三方活栓。
  7. 前記骨髄細胞懸濁液収容デバイスから骨髄細胞培養デバイスへ前記骨髄細胞懸濁液を移す際に培地および／または前記対象者の血清を加えて培養を開始する請求項１から請求項６のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム。
  8. 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養するための自己血清添加骨髄細胞培養システムであって、
    対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と培地とを採取現場にて液密状態で混合するデバイスであって、前記骨髄液と培地とを混合することにより得られる凝固抑制処理された骨髄細胞懸濁液を収容し骨髄細胞の培養を行う骨髄細胞培養デバイスを備える自己血清添加骨髄細胞培養システム。
  9. 下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の少なくともいずれかのデバイスを備える、請求項８に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ｉ）前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を収容する骨髄液収容シリンジと、培地を収容する培地収容シリンジと、液密に封止可能な剛性容器である骨髄細胞培養運搬容器と、前記骨髄液と前記培地とが流通可能であって前記骨髄液収容シリンジと前記培地収容シリンジと前記骨髄細胞培養運搬容器とを液密に接続可能な骨髄細胞懸濁用接続手段とを有する骨髄細胞培養デバイス、
    （ｉｉ）前記対象者の血管に刺される血管穿刺針と、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能な血液収容容器と、血液が流通可能であって前記血管穿刺針と前記血液収容容器とを液密に接続可能な採血用接続手段とを有する採血収容デバイス、
    （ｉｉｉ）前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する遠心手段を有する自己血清取得デバイス。
  10. 下記（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のデバイスを備える、請求項８に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ｉ）前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液を収容する骨髄液収容シリンジと、培地を収容する培地収容シリンジと、液密に封止可能な剛性容器である骨髄細胞培養運搬容器と、前記骨髄液と前記培地とが流通可能であって前記骨髄液収容シリンジと前記培地収容シリンジと前記骨髄細胞培養運搬容器とを液密に接続可能な骨髄細胞懸濁用接続手段とを有する骨髄細胞培養デバイス、
    （ｉｉ）前記対象者の血管に刺される血管穿刺針と、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能な血液収容容器と、血液が流通可能であって前記血管穿刺針と前記血液収容容器とを液密に接続可能な採血用接続手段とを有する採血収容デバイス、
    （ｉｉｉ）前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する遠心手段を有する自己血清取得デバイス。
  11. 骨髄細胞培養運搬容器が下記（ｉｖ）および（ｖ）を有し、かつ骨髄細胞懸濁用接続手段が下記（ｖｉ）を有する、請求項９または請求項１０に記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ｉｖ）骨髄細胞懸濁用接続手段と前記骨髄細胞培養運搬容器の内部空間とを連通する培養運搬容器チューブ、
    （ｖ）前記骨髄細胞培養運搬容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない培養運搬容器通気孔フィルタが設けられている培養運搬容器通気孔、
    （ｖｉ）懸濁用第１ポート、懸濁用第２ポートおよび懸濁用第３ポートの３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる懸濁用コックとを有する骨髄細胞懸濁用三方活栓。
  12. 血液収容容器が下記（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）を有する、請求項９から請求項１１のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ｖｉｉ）前記採血用接続手段と前記血液収容容器の内部空間とを連通する収容容器チューブ、
    （ｖｉｉｉ）前記血液収容容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタが設けられている収容容器通気孔。
  13. 採血収容デバイスが、前記対象者の血管に刺された状態を維持可能な採血針である留置針と、前記留置針に接続された留置針接続チューブと、前記対象者の血液を収容し液密に封止可能であって遠心処理可能であるとともに下記（ｉｘ）および（ｘ）を有する血液収容容器と、前記対象者から液密状態で採血して血液を収容可能であって押し出し可能である採血用シリンジと、血液が流通可能であって前記留置針に接続された留置針接続チューブと前記採血用シリンジと前記血液収容容器とを液密に接続可能であるとともに下記（ｘｉ）を有する採血用三方接続手段とを有する採血収容デバイスである、請求項９から請求項１１のいずれかに記載の自己血清添加骨髄細胞培養システム；
    （ｉｘ）前記採血用三方接続手段と前記血液収容容器の内部空間とを連通する収容容器チューブ、
    （ｘ）前記血液収容容器の内部空間と外部空間とを連通するとともに先端には菌を通過させない収容容器通気孔フィルタが設けられている収容容器通気孔、
    （ｘｉ）採血用第１ポート、採血用第２ポートおよび採血用第３ポートの３つの接続口と、これら接続口を選択的に連通させる採血用コックとを有する採血用三方活栓。
  14. 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養する方法であって、
    前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、
    前記対象者から採取された、抗凝固薬が添加されていない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、
    前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、
    前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で培養する骨髄細胞培養工程と、
    前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、
    前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加える自己血清培地添加工程と
    を有する前記方法。
  15. 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞を前記対象者の血清で培養する方法であって、
    前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、
    前記対象者から採取された、抗凝固薬が添加されていない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、
    前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、
    前記調製した骨髄細胞懸濁液と培地および／または前記取得した前記対象者の血清とを混合して混合骨髄細胞懸濁液を調製する混合骨髄細胞懸濁液調製工程と、
    前記調製した混合骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で培養する骨髄細胞培養工程と、
    前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、
    前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加える自己血清培地添加工程と
    を有する前記方法。
  16. 前記混合骨髄細胞懸濁液において前記骨髄液と混合した培地の量、または前記混合骨髄細胞懸濁液において前記骨髄液と混合した培地の量と前記骨髄液と混合した前記取得した前記対象者の血清の量とを合わせた量が前記骨髄液の４倍量ないし８０倍量である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記骨髄液の量に対応した量が前記骨髄液の１．５倍量ないし６倍量である、請求項１４から請求項１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記骨髄細胞懸濁液または前記混合骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で４日ないし７日間培養する、請求項１４から請求項１７のいずれかに記載の方法。
  19. 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取された骨髄細胞をそのまま培養して前記対象者の血清でさらに培養する方法であって、
    前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態の骨髄細胞培養運搬容器中で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、
    前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を前記骨髄細胞培養運搬容器で培養させながら細胞培養場所へ運搬する骨髄細胞培養運搬工程と、
    前記対象者から採取された、抗凝固薬が添加されていない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、
    前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、
    前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養運搬容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、
    前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養運搬容器に前記対象者の血清と培地とを加える自己血清培地添加工程と
    を有する前記方法。
  20. 前記骨髄細胞培養運搬容器が細胞培養フラスコである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記骨髄液の量に対応した量が前記骨髄液の２倍量ないし４倍量である、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
  22. 前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を前記骨髄細胞培養運搬容器で４日ないし７日間培養する、請求項１９から請求項２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記血液収容容器が剛性容器である、請求項１４から請求項２２のいずれかに記載の方法。
  24. 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取されて前記対象者の血清で培養した骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法であって、
    前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、
    前記対象者から採取された、抗凝固薬が添加されていない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、
    前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、
    前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で培養する骨髄細胞培養工程と、
    前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、
    前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加えて培養する自己血清培地添加培養工程と
    を有する前記方法。
  25. 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取されて前記対象者の血清で培養した骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法であって、
    前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、
    前記対象者から採取された、抗凝固薬が添加されていない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、
    前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、
    前記調製した骨髄細胞懸濁液と培地および／または前記取得した前記対象者の血清とを混合して混合骨髄細胞懸濁液を調製する混合骨髄細胞懸濁液調製工程と、
    前記調製した混合骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を骨髄細胞培養容器で培養する骨髄細胞培養工程と、
    前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、
    前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養容器に前記取得した前記対象者の血清と培地とを加えて培養する自己血清培地添加培養工程と
    を有する前記方法。
  26. 抗凝固薬を使用せずに対象者から採取されてそのまま培養して前記対象者の血清でさらに培養した骨髄細胞を有効成分とする医薬組成物を製造する方法であって、
    前記対象者から採取された骨髄細胞を含む骨髄液と前記骨髄液の量に対応した量の培地とを、前記骨髄液の採取現場にて液密状態の骨髄細胞培養運搬容器中で混合することにより凝固抑制処理し、かつ抗凝固薬が添加されない骨髄細胞懸濁液を調製する骨髄細胞懸濁液調製工程と、
    前記調製した骨髄細胞懸濁液に含まれる骨髄細胞を前記骨髄細胞培養運搬容器で培養させながら細胞培養場所へ運搬する骨髄細胞培養運搬工程と、
    前記対象者から採取された、抗凝固薬が添加されていない血液を遠心処理可能な血液収容容器へ液密状態で収容する採血収容工程と、
    前記対象者の血液を収容した前記血液収容容器を遠心処理して前記対象者の血清を取得する自己血清取得工程と、
    前記培養後の骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養運搬容器から浮遊細胞を含む培養上清を除去する培養上清除去工程と、
    前記骨髄細胞が付着した前記骨髄細胞培養運搬容器に前記対象者の血清と培地とを加えて培養する自己血清培地添加培養工程と
    を有する前記方法。
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