CN111909895A - 一种骨髓细胞的培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养领域，涉及一种骨髓细胞的培养方法。本发明的方法包括以下步骤：收集样本：将样本离心，弃血清，收集白细胞和红细胞；添加培养基；将离心收集的细胞加入细胞培养基中，均匀分布；孵育培养：将培养在培养基中的骨髓细胞放入细胞培养箱培养。本发明将大量的有核细胞收集、减少流失，获得较好的分裂相便于临床分析。对比全血常规培养法相比离心法，提高培养率、检出率以及方便易推广，为血液病患者的诊断、治疗、预后、疗效监测等提供准确有效的依据。

Description

一种骨髓细胞的培养方法及其应用
技术领域
本申请属于细胞培养领域，涉及一种骨髓染色体细胞培养方法及其用途。尤其是诊断为三系下降和有核细胞计数少于10以下的骨髓细胞的培养方法。
背景技术
骨髓细胞的培养通常被认为比较困难、成功率较低；尤其诊断为三系下降和有核细胞计数少于10以下的，收获染色体瘦小，形态差，可供分析的染色体明显减少，无法分析分裂相甚至无裂相，最终导致培养失败。血液病患者的诊断、治疗、预后、疗效监测等不能到提供准确有效的依据。
三系减少是指红细胞，白细胞，血小板三者都降低，常见于骨髓造血异常和功能亢进。三系细胞减少是吞噬细胞过度活跃引起的。人体血液中的吞噬细胞是一把双刃剑，如果其过度活跃，就会不分敌我，将人体有用的细胞一并吞噬，严重的会将人体组织、器官一点点侵蚀，造成一系列损伤，导致大出血点、肝功能衰竭、呼吸衰竭等严重后果。有核细胞是指有细胞核的细胞，能够分裂，而人体成熟红细胞没有细胞核。有核红细胞比较少，可能是贫血，如果是粒细胞减少，亦可能是粒细胞缺乏症。
骨髓染色体核型分析在恶性血液病的诊断、治疗及预后方面发挥着重要的作用。目前制备骨髓染色体方法主要有直接法、短期培养法和同步化法。
短期培养法操作技术如下：有核细胞计数少于10以下，1ml全血加入5ml的1640培养液中孵育72H(72小时)；另外，有核细胞计数大于50，计数出骨髓的量(使细胞浓度为1-2×106/ml)培养48H。终止培养前4h加终浓度为20μg/ml秋水仙素,4h后将骨髓培养液移入15ml离心管内，1300r/min离心10min，弃上清液后收获细胞。收获细胞：加入0.075mol/L的KCl，混匀后置37℃温浴箱35min。经甲醇：醋酸(3∶1)溶液预固定,2-3次固定后滴片(或置4℃冰箱次日滴片),室温过夜。烤片75℃3H；G显带:0.025％胰酶溶液50ml倒入染缸内,酸碱缓冲液pH为7.0-7.2置37℃水浴箱。将烤好的玻片在胰酶液中作用30-60s,姬姆萨染色2min,水洗。显微镜下观察染色体分裂指数。
但是，滴片可见离心后得到细胞悬液极少满足不了滴片的需求量，诊断结果偏差大、不稳定，无法作为骨髓诊断依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供三系降低或者有核细胞计数少于10的骨髓细胞的培养方法。
本发明提供了一种骨髓细胞培养方法，方便易推广，能够提高骨髓细胞培养率和染色体异常的检出率。
所述的培养方法包括以下步骤：
收集样本：将样本离心，弃血清，收集白细胞和红细胞；
添加培养基；将离心收集的细胞加入细胞培养基中，均匀分布；
孵育培养：将培养在培养基中的骨髓细胞放入细胞培养箱培养。
优选的，所述的收集细胞包括细胞计数的步骤。
优选的，添加培养基后，使细胞浓度为1-2×106/ml。
优选的，所述的细胞计数时，求得大方格平均数N，则50÷N＝所加入的5ml培养基内骨髓血的毫升数，或3600÷N＝应加入5ml培养基内骨髓血的滴数。
优选的，所述的添加培养基是指：
N≤50,接种1.0ml；
50＜N≤100，50÷N＝所加入的5ml培养基内骨髓血的毫升数；
N＞100,3600÷N＝应加入5ml培养基内骨髓血的滴数。
优选的，在收获16H前加入TDR溶液。
TDR可以按照常规方法配制和使用。例如，在本发明的一个优选实施例中，TDR母液配制方法是：称取胸腺嘧啶核苷(TDR)粉末0.2432g，加入去离子水溶解，定容至10ml，配置成10-1mol/L的TDR母液。
使用时，将TDR母液稀释100倍，即成10-3mol/L。过滤分装，置冰箱冷藏备用。
在本发明的一个优选实施中使用PBS，PBS即磷酸盐缓冲液，通常用于维持液体的酸碱度稳定，本发明中细胞培养用PBS可以采用市售的液体PBS或者购置粉状PBS按照产品说明书配制。例如，可以采用1L配方(pH7.4)包括：称取：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27，
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，
氯化钠(NaCl)：8g，
氯化钾(KCl)0.2g。
加去离子水约800mL充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调pH至7.4,最后定容到1L。灭菌，冷藏备用。
优选的，所述培养方法包括收获细胞的步骤：
孵育后的细胞加入加入缓冲液，混匀后固定。
具体的，本发明的方法如下：
将样本进行低速离心10min及以上，弃掉上层的血清，吸取中间的所有白细胞及少量的红细胞；加入1640培养液后放置37℃二氧化碳培养箱培养不少于2天，终止培养前4h加终浓度为20μg/ml秋水仙素,4h后收获将骨髓培养液移入离心管内,不少于10min的低速离心,弃上清液后收获细胞；
收获细胞：加入0.075mol/L的KCl，混匀后置37℃温浴箱半小时以上；
经甲醇∶冰醋酸溶液预固定,2-3次固定后滴片,室温过夜。
在本发明的一个优选实施例中，所述方法如下：
将样本进行离心1200rpm*10min，弃掉上层的血清，用1000ul枪吸取中间的所有白细胞及少量的红细胞；加入5ml 1640培养液后放置37℃二氧化碳培养箱培养72H，终止培养前4h加终浓度为20μg/ml秋水仙素,4h后收获将骨髓培养液移入15ml离心管内,1300r/min离心10min,弃上清液后收获细胞；
收获细胞:加入0.075mol/L KCl，混匀后置37℃温浴箱35min。经甲醇∶冰醋酸溶液预固定,2-3次固定后滴片,室温过夜。
本发明的培养方法用于培养三系下降或者细胞计数小于10个的骨髓细胞样本。
优选的，所述的培养方法获得的细胞用于骨髓染色体核型分析。
为了更好配合临床诊断的需要，提高骨髓细胞培养的成功率，我们对骨髓诊断为增生低下、再障、三系下降、增生综合征以及有核细胞计数少于10个以下的样本，其中对三系减少进行离心法培养和全血培养的比较。由于这些有核细胞数量都比较少，培养5ml培养液中，细胞浓度低其处在一个不是最适生长浓度范围中，细胞生长也处于不佳状态，影响培养质量。而离心法将大量的有核细胞收集减少流失，吸取到的细胞移到培养液中进行有效的培养，从而获得较好的分裂相便于临床分析。
本发明提供一种骨髓细胞的培养方法，通过针对性的添加离心步骤将大量的有核细胞收集、减少流失，获得较好的分裂相便于临床分析。对比全血常规培养法相比离心法，提高培养率、检出率以及方便易推广，为血液病患者的诊断、治疗、预后、疗效监测等提供准确有效的依据。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是离心培养和全血培养法的三系下降比较图。
图2是离心培养和全血培养法的有核细胞计数比较图。
图3是三系减少全血培养法的分裂相图片。
图4是三系减少离心培养法的分裂相图片。
图5是有核细胞计数少于10个全血培养法的分裂相图片。其中，几乎没有成功培养的结果。
图6是有核细胞计数少于10个离心培养法的分裂相图片。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例中涉及到的材料和试剂，实验条件和方法如下：
1.材料和试剂
1.1材料：电动移液枪(5ml注射器)、培养瓶、血球计数板、过滤器；
1.2试剂：
Figure BDA0002615986130000051
1.3仪器：
1.4.1分析天平(感量0.1mg)；
1.4.2离心机；
1.4.3生物安全柜
1.4.4水浴箱
1.4.5干燥箱
1.4.6二氧化碳培养箱
实施例1全血培养
加样枪吸取380μl白细胞稀释液，再1ml注射器抽取少量标本滴2-3滴至塑料纸上，吸取20ul血量；用于进行骨髓有核细胞计数。
细胞计数时，求得大方格平均数N，则50÷N＝所加入的5ml培养基内骨髓血的毫升数，或3600÷N＝应加入5ml培养基内骨髓血的滴数(使细胞浓度为1-2×106/ml)。实际操作时可用以下公式：N≤50,接种1.0ml；50＜N≤100，50÷N＝所加入的5ml培养基内骨髓血的毫升数；N＞100,3600÷N＝应加入5ml培养基内骨髓血的滴数。按细胞计数算出的值进行接种。
实施例2离心法培养
骨髓诊断为三系下降和细胞计数＜10个时，将样本进行离心1200rpm*10min，弃掉上层的血清，用1000ul枪吸取中间的所有白细胞及少量的红细胞；加入5ml 1640培养液后放置37℃二氧化碳培养箱培养72H，在收获16H前加入0.1ml TDR10﹣3M溶液。终止培养前4h加终浓度为20μg/ml秋水仙素,4h后收获将骨髓培养液移入15ml离心管内,1300r/min离心10min,弃上清液后收获细胞。收获细胞:加入0.075mol/L KCl，混匀后置37℃温浴箱35min。经甲醇∶冰醋酸(3∶1)溶液预固定,2-3次固定后滴片(或置4℃冰箱次日滴片),室温过夜。
滴片可见，离心后得到细胞悬液相比全血培养的要多，利于滴片需求；烤片75℃3H。G显带:0.025％胰酶溶液50ml倒入染缸内,酸碱缓冲液pH为7.0-7.2置37℃水浴箱。将烤好的玻片在胰酶液中作用30-60s,姬姆萨染色2min,水洗。分析结果。
骨髓诊断为三系下降和有核细胞计数少于10个的样品，同时进行两种方法培养；另外，在玻片上，随意挑选10个视野进行分裂指数比对，结果如图1和图2所示。
实施例3-7三系减少全血培养条件优化
在实施例1基础上优化实验条件，图3为效果图举例。
具体实验参数的优化如下：
Figure BDA0002615986130000061
实施例8-12三系减少离心培养条件的优化
在实施例2基础上优化实验条件，图4为效果图举例。与图3相比，分裂相明显增加，染色体清晰可见。
具体实验参数的优化如下：
Figure BDA0002615986130000071
可见，离心法培养效果满意，分裂指数相比全血培养法较为高。
实施例13-17有核计数少于10个全血培养条件
在实施例2基础上对有核计数少于10的样本进行优化实验条件和效果测试，图5为效果图举例。
具体实验参数和培养效果如下：
Figure BDA0002615986130000072
实施例18-22有核计数少于10个离心培养条件优化
在实施例2基础上对有核计数少于10的样本进行优化实验条件和效果测试。图6为效果图举例，可见细胞分裂项明显增多，染色体清晰可见。
具体实验参数和培养效果如下：
Figure BDA0002615986130000081
可见，离心法培养效果满意，分裂指数相比全血培养法显著提高。
在血液病中染色体分析首要条件是有足够的分裂才能为患者的诊断、治疗、预后、疗效监测提供准确有效的依据。本发明的离心培养法能够获得足够的骨髓染色体细胞用于临床诊断和检测，为骨髓诊断及相关疾病的后续诊断、治疗和预后提供了有力的保障。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种骨髓细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养方法包括以下步骤：
(1)收集样本：将样本离心，弃血清，收集白细胞和红细胞；
(2)添加培养基：将离心收集的细胞加入细胞培养基中，均匀分布；
(3)孵育培养：将培养在培养基中的骨髓细胞放入细胞培养箱培养。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的收集细胞包括细胞计数的步骤。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，添加培养基后，使细胞浓度为1-2×106/ml。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的细胞计数时，求得大方格平均数N，则50÷N＝所加入的5ml培养基内骨髓血的毫升数，
或3600÷N＝加入5ml培养基内骨髓血的滴数。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的添加培养基是指：
N≤50，接种1.0ml；
50＜N≤100，50÷N＝所加入的5ml培养基内骨髓血的毫升数；
N＞100，3600÷N＝应加入5ml培养基内骨髓血的滴数。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在收获16h前加入TDR溶液。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括收获细胞的步骤：
孵育后的细胞加入加入缓冲液，混匀后固定。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的培养方法如下：
将样本进行低速离心10min及以上，弃掉上层的血清，吸取中间的所有白细胞及少量的红细胞；加入1640培养液后放置37℃二氧化碳培养箱培养不少于2天，终止培养前4h加终浓度为20μg/ml秋水仙素,4h后收获将骨髓培养液移入离心管内,不少于10min的低速离心,弃上清液后收获细胞；
收获细胞：加入0.075mol/L的KCl，混匀后置37℃温浴箱半小时以上；
经甲醇∶冰醋酸溶液预固定,2-3次固定后滴片,室温过夜。
9.根据权利要求1至8之一所述的培养方法的应用，其特征在于，所述培养发方法用于培养三系下降或者细胞计数小于10个的骨髓细胞样本。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述培养方法获得的细胞用于骨髓染色体核型分析。
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