CN111448305B - 中空纤维细胞培养装置、细胞培养方法、培养上清液的制造方法 - Google Patents

中空纤维细胞培养装置、细胞培养方法、培养上清液的制造方法 Download PDF

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CN111448305B CN201980006288.4A CN201980006288A CN111448305B CN 111448305 B CN111448305 B CN 111448305B CN 201980006288 A CN201980006288 A CN 201980006288A CN 111448305 B CN111448305 B CN 111448305B
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Abstract

本发明的课题是提供一种培养装置。本发明的解决手段是一种用于制造培养上清液的中空纤维细胞培养装置，具有：过滤器外壳1；中空纤维3，其存在于过滤器外壳的内部，孔径是5nm以上且1μm以下，通过细胞导入部5而将细胞导入内部；中空纤维3的第一末端4a；第一端帽6a，其用于密闭过滤器外壳1；培养液导入部7，其用于将培养液导入过滤器外壳的内部；以及培养液排出部9，其用于将经过过滤器外壳的内部的培养液排出。

Description

中空纤维细胞培养装置、细胞培养方法、培养上清液的制造 方法
技术领域
本发明是关于中空纤维细胞培养装置以及使用所述装置的细胞培养方法、培养上清液的制造方法。
背景技术
日本特开2017-176043号公报中记载一种使用中空纤维的细胞培养方法。在此申请案中，是在中空纤维之中播种间充质干细胞，再使细胞以及培养液在中空纤维之中循环，将由细胞所分泌的具有生理活性的有用成分高浓度地留在中空纤维内，并从中空纤维内回收培养上清液。在此文献中，意图尽可能地限制中空纤维内来自细胞的分泌物流出至在中空纤维的外侧流动的培养液中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2017-176043号公报
发明内容
发明所欲解决的课题
本发明的目的是提供一种技术，其具有在假定培养上清液成为医药品时的高稳健性，有效率且减少生产成本，能活用在大量制造。
解决课题的技术方案
本说明书所记载的解决方法，基本上是基于以下见解：在中空纤维内培养细胞，使培养液在中空纤维的外侧循环，借此可稳定地培养细胞，而且可容易地回收培养上清液，借此可便宜且大量地获得高质量的细胞及培养上清液。
本说明书中所公开的装置是用于制造培养上清液的中空纤维细胞培养装置。而且，此装置具有：
过滤器外壳1；
中空纤维3，其存在于过滤器外壳的内部，孔径是5nm以上且1μm以下，中空纤维3的第一以及第二末端4a、4b连接过滤器外壳1的第一以及第二端部1a、1b，中空纤维3是通过细胞导入部5而将细胞导入内部；
第一端帽6a，其用于密闭中空纤维3的第一末端4a与过滤器外壳1；
培养液导入部7，其连接过滤器外壳1，用于将培养液导入过滤器外壳的内部，且连接用于将培养液供给至过滤器外壳的内部的培养液供给路径8；以及
培养液排出部9，其连接过滤器外壳1，用于将经过过滤器外壳的内部的培养液排出，且连接用于将过滤器外壳的内部的培养液排出的培养液排出路径10。
此装置优选为更具有：培养液供给路径8；以及
送液装置11，其设置在培养液供给路径8，用于经由培养液导入部7而将培养液送至过滤器外壳1内。
此装置优选为中空纤维3在内腔呈圆形时的直径是0.1mm以上且1.6mm以下。
此装置优选为更具有细胞导入部5，
细胞导入部5连接在对应于连结第一端帽6a的中空纤维3的部位，将细胞导入中空纤维过滤器的内腔。
此装置优选为更具有细胞导入部5，
细胞导入部5是具有空间体积的圆筒状的容积部，其设置在对应于连结第一端帽6a的中空纤维过滤器的部位，在圆筒状的容积部的一侧末端插入具有垫片的柱塞，圆筒状的容积部的另一侧末端连结中空纤维过滤器，通过将柱塞压入中空纤维过滤器的方向，而将细胞导入中空纤维过滤器的内腔。
此装置优选为更具有第二端帽6b，其用于密闭中空纤维3的第二末端4b与过滤器外壳1。
可使用此装置制造培养上清液。此制造方法是包含以下工序的培养上清液的制造方法：
细胞导入工序，其经由细胞导入部5而将细胞导入中空纤维3的内部；
培养液供给工序，其经由培养液导入部7而将培养液供给至过滤器外壳内部；
培养液排出工序，其从培养液排出部9排出过滤器外壳内部的培养液；
培养工序，其在中空纤维3的内部培养细胞；以及
培养上清液回收工序，其从通过培养液排出工序而得的排出液回收培养上清液。
发明效果
根据本发明，可提供一种技术，其具有在假定培养上清液成为医药品时的高稳健性，有效率且减少生产成本，能活用在大量制造。
本发明的特征是将细胞密闭在中空纤维的内腔，且所述内腔的培养液的移动主要是经由中空纤维过滤器且由与中空纤维外部的扩散所导致，本发明在如间充质干细胞般细胞彼此会强力稳固地凝聚的细胞中会产生强大效果。在考虑通过至今为止的中空纤维培养法而长时间地培养间充质干细胞的情形，被播种在中空纤维的内腔的间充质干细胞会容易地构成凝聚体，若此时提供能增殖的培养条件，则会以阻塞中空纤维的内腔的形式阻断进行循环的培养液。即使在多根中空纤维中没有全部被细胞阻塞的情形中，被栓塞的中空纤维与未被拴塞的中空纤维，其等的培养条件、细胞特性、质量难以是同等的，预料将其作为均一且稳健的制造方法而采用在医药品开发等是有风险的。并且，在使用中空纤维内腔不会被细胞阻断的程度的粗中空纤维的情形中，在细胞增殖后，有在细胞凝聚块的深层部因营养枯竭而发生细胞死亡之虞。
并且，业界至今为止在使用中空纤维过滤器的细胞培养中只存在使细胞存在侧的培养液循环的方式，其原因被认为是因为对于在中空纤维的内腔有效率地回收来自细胞的产物，需要的不是经由过滤器而回收相反侧的空间的培养液，而是需要回收细胞存在侧的空间的培养液，而在细胞存在于中空纤维的内腔的情形中，在中空纤维的外侧难以有效率地回收分泌成分。
本发明人利用不受限于既知方法的灵活想法，开发了一种方式，其利用细胞阻塞适当内径的中空纤维的内腔，且不进行中空纤维内腔中的培养液的积极送液。作为取代，通过使中空纤维外部的培养液适当地交换、循环，而成功地长期间健全地维持中空纤维内部的细胞，且发现能在所述期间持续地在中空纤维外部回收具有充分生物活性的培养上清液。
借此，完成一种具有高稳健性且能减低制造成本的培养上清液制造方法，且所述制造方法能提供作为能将规模提升到数百至数千公升的培养规模的技术。
附图说明
图1是显示培养装置的构成例的概念图。
图2是显示套圈的例子的概念图。
图3是显示细胞导入部的例子的概念图。
图4是显示从中空纤维内腔所取出的细胞的取代图片的照片。
图5是显示使用ELISA法所测定的TIMP2蛋白质(图5(a))以及HGF蛋白质(图5(b))的定量分析结果的取代图片的图表。
图6是显示dsDNA的定量分析结果的取代图片的图表。
图7是显示葡萄糖的定量分析结果的取代图片的图表。
图8是显示过滤器外壳末端的样子的概念图。
具体实施方式
本说明书所公开的第一形态是关于用于制造培养上清液的中空纤维细胞培养装置。此装置基本上是所谓在中空纤维内培养细胞(例如干细胞)，使培养液在中空纤维的外侧循环，借此可稳定地培养细胞，而且可容易地回收培养上清液。也将此装置称为中空纤维过滤器组件。
图1是显示培养装置的构成例的概念图。如图1所示，此装置具有：过滤器外壳1；中空纤维3，其存在于过滤器外壳的内部；第一端帽6a；培养液导入部7；以及培养液排出部9。
过滤器外壳1是用于收纳中空纤维，且使培养液在内部循环的壳体。可将周知的中空纤维过滤器中的外壳使用作为过滤器外壳。过滤器外壳的大小只要因应想要获得的上清液的量而适当调整即可。
中空纤维3是存在于过滤器外壳的内部的中空纤维(内部有空隙的过滤器)。中空纤维的孔径(标称孔径)的例子是5nm以上且1μm以下，优选为0.1μm以上且0.65μm以下。中空纤维3例如在内腔呈圆形时的直径的例子是0.1mm以上且1.6mm以下。针对构成中空纤维过滤器组件的中空纤维，中空纤维内腔的直径的例子是在0.02mm至1.6mm的范围选择，可为0.1mm以上且1.6mm以下，也可为0.1mm以上且0.5mm以下。作为中空纤维素材，适合选自聚醚砜(PES)、醋酸纤维素(CE)、聚砜(PS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVDF)聚丙烯腈(PAN)等具有亲水性且蛋白质吸附少的素材，但只要是具有作为过滤器的特性且在伽玛射线灭菌、高压釜灭菌、环氧乙烷气体灭菌等任一灭菌工序中不损及作为过滤器的实质性能且显示抗性的素材，则不限定素材。并且，中空纤维膜的标称孔径的例子是5nm(相当于3kDa)至1μm为止的超过滤膜或精密过滤膜，优选为0.1μm至0.65μm的范围的精密过滤膜，能因应作为目标的培养上清液中的回收成分的分子量及立体结构、疏水性、离子的相互作用等的结果的实际穿透率而任意地选择。并且，中空纤维的长径侧的管长，20cm至100cm容易操作而为优选，但在以设计其他构成本发明的中空纤维细胞培养装置为前提所容许的范围中，不受限制。
中空纤维3的第一以及第二末端4a、4b优选为连接过滤器外壳1的第一以及第二端部1a、1b。但是，在以端帽6a、6b分别阻塞同侧的中空纤维3的第一以及第二末端4a、4b与过滤器外壳1的第一以及第二端部1a、1b后，中空纤维3的内腔与过滤器外壳1的内部空间优选为被构成为没有空间上的联系。图8是显示收纳中空纤维后的过滤器外壳的末端的例子的概念图。在图8所示的例子中，在过滤器外壳的壳体21内部收纳中空纤维，联系中空纤维的内腔的开口部23在过滤器外壳的末端排齐。在此状态下，若端帽被安装至过滤器外壳，则开口部23会被端帽密闭，中空纤维的内腔形成闭锁系统，中空纤维3的内腔与过滤器外壳1的内部空间会成为没有空间上的联系。尤其，因中空纤维本体本身存在多个微小孔洞，所以变得能够授受可通过所述微小孔洞的物质。如图8所示的例子，过滤器外壳的末端区域可被中空纤维的空洞以外的部分所集合而成的物体25密闭。如此一来，在通过细胞导入部5而将干细胞导入中空纤维3的内部后，若安装用于安装在前述中空纤维过滤器组件的第一端帽6a，则干细胞及培养液的移动不会通过中空纤维3的第一末端4a的开口部。亦即，呈现培养液不会从中空纤维3的第一末端4a流入的状态。并且，在安装有第二端帽6b的情形，以干细胞及培养液的移动不会通过中空纤维3的第二末端4b的开口部的方式，密闭中空纤维3的第二末端4b。如此一来，呈现培养液不会从中空纤维3的第二末端4b流入的状态。
中空纤维3是通过细胞导入部5而将细胞导入其内部。细胞的例子是干细胞。干细胞的例子是间充质干细胞。细胞的种类未被特别限定。只要是在细胞外分泌或产生目的成分的细胞种类且是目的在于回收所述目的成分的用途即可。可特别享受本发明效果的优选细胞是粘附性细胞，更优选为选择间充质干细胞。间充质干细胞是使用从人、狗、马、猫、猪、小鼠、大鼠等分离、培养的间充质干细胞。作为分离间充质干细胞的组织，可列举脐带、脐带血、骨髓、羊膜、胎盘、牙髓、脂肪、软骨、月经血、母乳等，其来源组织及动物种类并未被特别限定。并且，为了建立永生化细胞株、赋予能承受长期培养的细胞特性、或提升培养上清液的效果性，间充质干细胞也可为使用已进行基因导入及基因改变的间充质干细胞。
针对培养液，其组成及种类并未受到特别限定。可使用与以往利用烧瓶等的粘附培养法同样的培养液。在以间充质干细胞为例的情形，一般是利用含有10％血清的αMEM培养基进行增殖。为了更优异的细胞增殖与工序缩短，也可使用由各公司贩售的培养基、独家配方的培养基。并且，在考虑到培养上清液的产业价值是治疗用途及化妆品原料等用于生物的药剂时，期望培养液的组成不使用人类及动物来源的成分(例：细胞培养试剂盒ProculAD(注册商标)；乐敦制药)。并且，间充质干细胞已报导一种通过各种刺激而增加其作用的技术，除了制备具有更有效的治疗效果的细胞与培养上清液，也可使用活用其等技术的培养液。如此，用于增殖间充质干细胞的培养基存在各式各样的选择项，只要选定适合组织的来源与生物种类的性能的培养基，且使用能制备具有实施者所要求的功能的细胞以及培养上清液的任意培养液即可。
并且，根据培养上清液的制造方法，已报导有一种方法，其在培养上清液的回收阶段，不以细胞增殖为目的，而是以接近基本培养基的培养液进行维持。作为其理由，可列举目的是在以含有血清的培养基进行细胞增殖的情形中，尽可能地排除血清等的携入。
在欲避免播种在中空纤维内的细胞在中空纤维的内部形成不均等凝聚体的可能性的情形中，也可使用以下方法：在培养液中使用纤维素类水溶性高分子的甲基纤维素(MC)、羧甲基纤维素(CMC)、其他纤维素衍生物、或其他水溶性高分子的聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、或海藻酸钠等以及其凝胶化剂，而使培养液的粘度上升。此情形的其等水溶性高分子的浓度可参考已知报告而设定。借此，在中空纤维内的细胞培养空间中，若形成均一尺寸的细胞球，则其等的均匀空间配置是可能的。
第一端帽6a是用于密闭中空纤维3的第一末端4a与过滤器外壳末端1a。端帽是使用于密闭中空纤维过滤器组件的两末端。细胞及培养液的移动优选为以不通过中空纤维的两末端的开口部的方式密闭中空纤维末端4a、4b。因此，作为与中空纤维末端4a、4b接触的端帽，最适合是圆板状的硅垫片，可在其外侧利用套圈连接用夹具等附加用于固定在中空纤维过滤器组件的树脂制零件。端帽是每一个中空纤维过滤器组件准备2个，1个优选为在往中空纤维内腔导入细胞前安装。另1个是在导入细胞后，为了密闭细胞导入侧而安装。在导入细胞后安装的端帽是4a，也可利用被构成为兼具端帽功能的细胞导入部5取代。针对任一侧的端帽，也优选为在细胞导入后的培养上清液回收用的培养期间中不开封。
细胞导入部5的例子是具有套圈连接端口，所述套圈连接端口设置在对应于第一端帽6a的中空纤维3的部位，透过套圈连接端口，细胞被导入中空纤维过滤器的内腔。细胞导入部5的另一例优选为以下装置：是具有空间体积的圆筒状的容积部，其设置在对应于连结第一端帽6a的过滤器外壳末端1a以及中空纤维末端4a的部位，在圆筒状的容积部的一侧末端插入具有垫片的柱塞，圆筒状的容积部的另一侧末端连接中空纤维3，通过将柱塞压入中空纤维3的方向，细胞被导入中空纤维3的内腔。
细胞导入部5被使用作为用于将细胞均匀地导入中空纤维内腔的要素。其形态是依据所使用的中空纤维过滤器组件的尺寸及导入细胞悬浮液量而适宜选择。
例如，在医药品制造等产业化阶段等中，假定每一个中空纤维过滤器组件要导入数公升以上的细胞悬浮液。在所述情形中，另外准备具有套圈连接端口的管状物，其对应于中空纤维过滤器组件末端的套圈连接端口形状，且在其相反侧连接包含细胞悬浮液的加工袋或容器，通过蠕动泵的驱动送液，可将细胞送液往套圈连接端口侧。图2是显示套圈的例子的概念图。图2为引用自日东金属工业株式会社。经由套圈，连接细胞导入部5、过滤器外壳末端1a以及中空纤维末端4a，可无菌地将细胞导入中空纤维过滤器内部。而且，在将细胞导入中空纤维内后，可密封中空纤维过滤器。套圈连接也被称为卫生配管、卫生接头。套圈连接可使用例如套圈、垫片、以及夹环而达成。套圈在连接部具有沟，中间夹着十字形状(或O环形状)的垫片并利用夹环拧紧而固定。
并且，在小规模培养阶段中，将过滤器外壳末端1a、1b设为公或母型的鲁尔锁形状的端口，也可使用具有鲁尔锁形状的前端的市售注射器等(例：Niprosyringe封锁型，医疗器械申报编号27B1X00045000033：尼普洛株式会社)作为细胞导入部。
再者，也能选择将细胞导入部与前述端帽的目的合而为一的零件。图3是显示细胞导入部的例子的概念图。具有如注射等般的结构的细胞导入部5，可具有配合过滤器外壳末端1a、1b的连接形式的连接端口，更优选为两方选择套圈连接端口。根据另一方式，中空纤维过滤器组件与细胞导入部5也可在制造其等时预先被连结。在图3的例子中，在细胞导入部5的内部封入细胞悬浮液。然后，使用套圈连接等，连接过滤器外壳末端1a。然后，通过推压活塞推子，将细胞的悬浮液注入中空纤维3内部。如此一来，可将细胞导入中空纤维内。将细胞注入中空纤维内后，垫片会密封中空纤维末端4a。此细胞导入部5除此之外至少是由外筒、垫片、推子、锁定机构所构成。若使用此，在通过垫片将细胞推压出中空纤维内腔的时间点，细胞导入侧的中空纤维末端4a会被垫片密闭，通过锁定机构，垫片变得会固定在所述位置。借此，在细胞导入后不需要开封细胞导入侧的过滤器外壳末端1a，因此可减低污染风险。并且，为了阻塞细胞导入侧的过滤器外壳末端1a与中空纤维末端4a，也可使用专用的端帽6a。
培养液导入部7连接过滤器外壳1。培养液导入部7也可与过滤器外壳1一体成型。而且，培养液导入部7是用于将培养液导入过滤器外壳1的内部的要素。另一方面，培养液导入部7不连接中空纤维3的内部，而是用于将培养液导入存在于中空纤维周围的过滤器外壳内部的区域。而且，培养液导入部7连接用于将培养液供给至过滤器外壳的内部的培养液供给路径8。培养液供给路径8存在于过滤器外壳1外。借此，培养液被从过滤器外壳1的外部导入至过滤器外壳内。培养液供给路径8例如连接收纳培养液的培养液槽，并供给培养液。
亦即，此装置优选为包含：用于将培养液导入过滤器外壳1内的流路(培养液供给路径8)；以及用于将培养液排出至中空纤维过滤器外壳外的流路(培养液排出路径10)。此等连接中空纤维过滤器组件的培养液导入部7以及培养液排出部9。作为管子的素材，选择硅类、热塑性弹性体类、聚氯乙烯类等作为优选的素材。然而，不一定限定于此等，只要不对细胞培养的结果造成不良影响、素材能灭菌处理、目标物及成分不会变质或进行非预期的吸附、对其等的洗提物无细胞毒性、刺激性、致癌性、发热性等毒性，则能任意地选择。
此外，优选为更具有送液装置11。送液装置11可设置在培养液供给路径8，也可设置在培养液排出路径10。送液装置11是用于经由培养液导入部7而将培养液送至过滤器外壳1内，且经由培养液排出部9而排出培养液的要素。送液装置11的例子是泵。往过滤器外壳1内供给或循环培养液的方法，就在任何制造规模都能活用的方法而言，优选为利用蠕动泵的驱动，但在培养规模大的情形中，也能采用由一次性泵头与泵驱动部所构成的浮动型磁泵(例：PuraLev：LEVITRONIX公司)作为理想的送液方法。然而，作为送液的驱动方式，不限于此等，可进行选择。
培养液蓄液容器例如连接用于将培养液导入过滤器外壳1内的培养液供给路径8。培养液蓄液容器的形状的例子，可为圆筒型的瓶子形状，也可为旋转烧瓶形状，也可为2D加工袋形状，也可为3D加工袋形状，在大规模培养规模的情形中，可为不锈钢槽容器。在通过过滤器外壳1内使培养液回流的情形中，优选为也连接用于排出过滤器外壳1内的培养液的培养液排出路径10。此装置具有用于监视培养状态的培养液的采样端口，并且，优选为具有温度、pH、溶氧浓度、溶解二氧化碳浓度等各种传感器。并且，在不回流的培养方式的情形，除了置入用于导入过滤器外壳1内的培养液的培养液蓄液容器以外，优选为具有另一个培养液蓄液容器，其是用于置入从过滤器外壳1内排出的培养液。
培养液排出部9连接过滤器外壳1。培养液排出部9可与过滤器外壳1一体成形。培养液排出部9是用于排出已经过过滤器外壳的内部的培养液的要素。培养液排出部9不连接中空纤维的内部，而是用于从存在于中空纤维的周围的过滤器外壳内部的区域排出培养液。培养液排出部9连接用于排出过滤器外壳的内部的培养液的培养液排出路径10。培养液排出路径10存在于过滤器外壳1外。借此，将培养液排出至过滤器外壳1外。
针对过滤器外壳、外壳终端连接部、中空纤维固定材料、密封材料、流路形成端口等各要素，可参考既存的技术及产品而设计。例如，针对外壳末端连接部，优选为对应于泛用性高的套圈卫生连接的设计。针对此等，其形状及设计可自由地选择。并且，针对其等的素材，优选为选自在生物技术相关领域一直以来所使用的一般素材，但不一定限定于此等，只要不对细胞培养的结果造成不良影响、素材能灭菌处理、目标物及成分不会变质或进行非预期的吸附、对其等的洗提物无细胞毒性、刺激性、致癌性、发热性等毒性，则能任意地选择。例如，作为用于在过滤器外壳末端束紧并固定中空纤维的中空纤维固定材料，容许是尿烷树脂或环氧树脂。并且，在为了接合各零件而形成完全密闭所使用的密封材料中，优选为硅素材。在过滤器外壳中，推荐选择强韧且刚性高、透明、对各种药品的抗性优异的聚砜等。针对流路形成端口，也同样地可选自聚砜、聚丙烯等。
为了增殖或维持细胞，优选为用于在30℃至42℃的范围控制培养液的装置。更优选为，多数情形选择37℃。只要将细胞存在的中空纤维过滤器组件控制在目标温度，则不问其温度控制样式。具体而言，可将本发明的装置整体设置在恒温装置的腔室内，为了加温，也可利用夹套型的加温装置进行控制。或，采取以下方法：具有机构，所述机构是在往过滤器组件1送液培养基的一侧的流路以及流路形成端口附近进行加温，在即将要将培养液送液至过滤器组件1前，以到达最适温度的方式进行控制，并且过滤器组件1也保持在最适温度；再者，从过滤器组件1排出培养液的一侧的流路形成端口与流路冷却到4至10℃，培养液蓄液容器也冷却到4至10℃，抑制长期培养时培养基成分及细胞分泌成分的变质及分解。
可使用此装置制造培养上清液。此制造方法是包含以下工序的培养上清液的制造方法：
细胞导入工序，其经由细胞导入部5而将细胞导入中空纤维3的内部；
培养液供给工序，其经由培养液导入部7而将培养液供给至过滤器外壳1内部；
培养液排出工序，其从培养液排出部9排出过滤器外壳1内部的培养液；
培养工序，其在中空纤维3内部培养细胞；以及
培养上清液回收工序，其从通过培养液排出工序而得的排出液回收培养上清液。
＜播种细胞的制备＞
在制备往中空纤维3内播种所需要的细胞时，使用上述的培养液与细胞。进行播种的细胞优选为由一般的粘附平面培养所制备且利用剥离剂能容易分散的细胞，但除此以外，也可使用由使用微载体的培养或细胞球培养所制备的细胞，只要为可进入中空纤维过滤器的内孔的尺寸大小，则也可包含不剥离细胞而维持粘附的微载体，或细胞也可形成凝聚体。
＜装置的组装＞
在至少由过滤器外壳1、配置在其内部的中空纤维3、过滤器外壳末端4a、4b、培养液导入部7、培养液排出部9所构成的中空纤维过滤器组件中，有包含端帽6a、6b、垫片以及密封材料的情形则安装至中空纤维过滤器外壳末端4a、4b，再者，将培养液供给路径8、培养液排出路径10分别连接培养液导入部7、培养液排出部9。此处将此等构成品设为构成品1。优选为根据构成品1的素材所容许的方法的灭菌原理，实施灭菌处理。
并且，针对上述用于将细胞导入中空纤维的细胞导入部5，此也不是已灭菌产品，在需要灭菌处理的情形中，优选为根据素材所容许的方法的灭菌原理，实施灭菌处理。
但是，本发明不限于此处所示的代表例，可通过使用既存的生物工艺技术，选择因应实施者目的的最合适装置的连接样式。例如，针对形成培养液的流路的管子等的连接，在利用生物产业中多用的既存无菌连接技术的情形、以及结合不锈钢容器作为培养液蓄液容器的情形等中，能取得因应其等的装置的连接样式。并且，实施者只要因应实施本技术时的制造规模、设施要件、无菌操作相关的整体计划、所使用的容器以及送液线等的要件，而采用制造一般生物技术应用医药品等所使用的技术等而进行设计即可。
＜细胞的导入＞
接下来，将「构成品1」，排除包含端帽6a、垫片、密封材料的情形，在无菌操作区域ISO class 5或能实质上无菌操作的管理区域中连接细胞导入部5。之后，将制备作为播种用的细胞悬浮液置入细胞导入部。细胞悬浮液期望是培养液，但只要是在不对培养造成不良影响的范围内所容许的溶液或增粘剂、凝胶化剂，则未被特别限定。在培养是小规模且细胞导入部5是注射器的情形，取下柱塞而将细胞悬浮液置入外筒，之后安装柱塞并推压柱塞，借此将细胞悬浮液导入往中空纤维内。此时，中空纤维的相反侧的过滤器外壳末端1b与中空纤维末端4b在有包含端帽6b、垫片以及密封材料的情形会被密闭，但超过中空纤维3内部的体积的细胞悬浮液的溶液部分会通过中空纤维3的膜而被从中空纤维内腔往过滤器外壳1的内部排出。中空纤维的膜因为是不使细胞通过的孔径，所以细胞不会被排出至培养液循环流路，而完全被保持在中空纤维内腔。此外，为了避免在中空纤维内腔发生细胞分布有偏差，而期望极力避免在中空纤维内部注入气体。再者，在抑制细胞的凝聚体形成的目的中，可使用以下方法：在细胞悬浮液中添加纤维素类水溶性高分子的甲基纤维素MC、羧甲基纤维素CMC、其他纤维素衍生物、或其他水溶性高分子的聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮PVP、或海藻酸钠等及其凝胶化剂，而使培养液的粘度上升。
并且，针对导入中空纤维内腔的细胞数的范围，若例示间充质干细胞的情形作为代表例，则在构成中空纤维过滤器组件的中空纤维的合计内腔体积每1cm3能选择1×104个至5×107个的范围，更优选为选择1×105个至5×106个的范围，再优选为选择5×105个至1×106个的范围。
接下来，移除细胞导入部5，通过在有包含端帽6a、垫片及密封材料的情形将其等安装在过滤器外壳末端1a与中空纤维末端4a，而密闭中空纤维3内部以及过滤器外壳1内部。将此设为构成品2。密闭后，将中空纤维过滤器组件维持呈水平，目的是避免中空纤维内部的细胞分布的偏移。
＜培养的开始＞
在已无菌地注入培养液的培养液蓄液容器，连接培养液供给路径8。在将培养液设为循环式的情形，与培养液排出路径10同样地连接培养液蓄液容器。在不设为循环式的情形中，在不同于已连接培养液供给路径8的培养液蓄液容器的另一培养液蓄液容器连接培养液排出路径10。将此设为构成品3。
为了增殖或维持细胞，依据细胞的种类及目的差异，需要用于在30℃至42℃的范围内控制中空纤维过滤器组件的装置，更优选为，多数情形选择37℃。并且，在利用碳酸氢钠与二氧化碳系进行培养液的pH控制的情形中，变得也需要控制二氧化碳浓度。作为代表例，将培养液注入后的构成品3置入二氧化碳培养箱，所述二氧化碳培养箱已维持在对于所使用的细胞是最适合的温度与二氧化碳浓度。此情形，二氧化碳从硅素材的培养液流路(培养液供给路径8、培养液排出路径10)浸透培养液，控制pH。然而，只要细胞存在的中空纤维过滤器组件部被控制在目标温度与目标pH，则不问其控制样式。具体而言，可将本发明的装置整体设置在恒温装置的腔室内，为了加温，也可利用夹套型的加温装置进行控制。或，也可采取以下方法：具有机构，所述机构是在往中空纤维过滤器组件送液培养基的侧的培养液供给路径8以及培养液导入部7附近进行加温，在即将要将培养液送液至中空纤维过滤器组件前，以到达最适温度的方式进行控制，并且中空纤维过滤器组件也保持在最适温度；再者，从中空纤维过滤器组件排出培养液的侧的培养液排出部9与培养液排出路径10冷却到4至10℃，培养液蓄液容器也冷却到4至10℃，抑制长期培养时培养基成分及细胞分泌成分的变质及分解。
之后，在培养液流路(培养液供给路径8、培养液排出路径10)的任一者或其两者的培养液流路安装蠕动泵等，通过驱动其而开始培养液的循环。然而，如同上述，培养液的循环形式是选择既存技术且不被特别限定。并且，培养液的送液条件可为间歇的，也可为连续的。并且，在为间歇的情形中，其开与关的间歇间隔可在一连串的培养期间中任意地变更，也可为固定。并且，针对每单位时间的送液量，可因应所使用的细胞、培养液、中空纤维过滤器的种类、中空纤维过滤器组件的规模、培养上清液中回收的目的成分等各种变动要素，而决定最适合的送液速度。
若以间充质干细胞为例，则构成中空纤维过滤器组件的中空纤维的合计内腔体积每1cm3的每1小时的送液量能选择1mL至10,000mL的范围，更优选为选择10mL至1,000mL的范围，再优选为选择50mL至500mL的范围。此外，填充在培养装置的培养液的液量，若以间充质干细胞为例，则在中空纤维的合计内腔体积每1cm3能选择0.01mL至300mL的范围，更优选为选择0.2mL至30mL的范围，再优选为1mL至5mL的范围。在培养初期的细胞数少的阶段减少培养液量、在增殖后的细胞数多的阶段增加培养液量一事，也只要与节约培养液有关而任意地选择即可。
＜培养基交换＞
针对在中空纤维内腔导入细胞，细胞在增殖期的培养基交换，是依据所使用的细胞与培养液的种类等而决定。若以间充质干细胞进行例示，则期望基本上是约4日1次的培养基全交换分批培养。然而，在实施本发明时不限于此，在细胞数增加为止前，也能是因应培养液蓄液容器的半交换的范围。并且，作为培养液的控制组，通过使用补料分批培养及连续培养的技术，也可良好地实施本发明。实施者只要在细胞不死灭且可维持的任意范围中设定即可。
＜培养环境的监视＞
作为非破坏性的评价细胞的增殖程度的方法，可通过测定培养上清液而实施，所述培养上清液是由设置在培养装置的培养液循环流路等的无菌采样端口所分取。作为测定项目的例子，其指标是培养上清液中的目标产生物质的每单位时间的产生量、葡萄糖消耗量、pH、溶氧浓度、溶解二氧化碳浓度、或乳酸浓度等。通过预先评价中空纤维内腔中的细胞增殖程度与此等数值的相关性，可评价中空纤维内腔的细胞增殖程度。依据测定项目，也可进行由设置在培养上清液的流路的非接触型传感器所导致的连续测定。
并且，作为监视细胞的死灭程度的方法，能利用将同培养上清液中的双股DNA(dsDNA)浓度、乳酸脱氢酶(LDH)浓度等进行定量等而评价。通过预先评价中空纤维内腔中的细胞的死灭程度与此等数值的相关性，可评价中空纤维内腔的细胞增殖程度。
通过此等方法，可知道以高浓度含有目标产生物的培养上清液回收的开始时期、以及到达细胞的健全性以及同质性的极限而中止回收为止的期间。
＜培养上清液的制备与回收＞
在细胞进行增殖且可确认分泌期待量的目的成分的时期，开始培养上清液的制备与回收。例如，在培养液是循环式的情形中，作为回收已在中空纤维外壳内循环的培养上清液的时间点，若以间充质干细胞为例，则在采用分批培养制备培养上清液的情形，优选为在即将回收培养上清液前的培养基交换起1日至10日后的回收，再优选为2日至8日后，最适当为第3日至第5日。并且，作为被强调为本发明的极大效果的点，是在将细胞导入中空纤维内腔后，经过非常长的期间仍可继续回收培养上清液这点，在其期间，只要任意地回收需要量的培养上清液即可。间充质干细胞的情形，在利用烧瓶的平面粘附培养中，在到达汇合后，相对于在健全状态下的细胞的维持极限是数日，若根据本发明，则可在中空纤维之中健全地维持通常50日以上。
并且，细胞只存在于中空纤维内腔，作为本发明以前的所属领域的技术常识，作为用于能实质回收包含细胞分泌物的培养上清液的方法，是利用中空纤维膜作为间隔而使细胞存在侧的培养液循环等，并将同侧的培养液回收作为培养上清液的方法(专利文献1)。另一方面，在本发明中，通过由细胞被密闭且无积极循环的中空纤维内腔经由中空纤维膜往中空纤维外部的扩散，而从中空纤维外部回收培养上清液。此外，除了分批培养以外，也可利用由补料分批培养或灌流培养等所导致的连续培养而获得培养上清液。
[实施例]
[实施例1]
1.脂肪组织来源间充质干细胞(AD－MSC)的中空纤维培养与培养上清液的制备
1.1.细胞制备方法
(1)原代培养(P0)
针对由接受使用AD－MSC的再生医学的患者分取成为制备投与用细胞所需要的原料的皮下脂肪组织后的剩余组织，在取得研究用利用用途的同意后，接收皮下脂肪的提供，供至原代培养。皮下脂肪组织供至离心分离(400×g且5分钟)，分离成由上依序是脂质部分、脂肪组织部分、以及水性部分这3层。留下中层的脂肪组织部分，废弃上层与下层。对于残留的脂肪组织部分，每组织重量添加4倍量的0.15％胶原酶酵素溶液，在37℃使其浸透1小时，进行酶处理。在分散脂肪组织后,供至离心分离(400×g且5分钟)，作为包含间充质干细胞的间质血管细胞部分，将沉淀部分以30mL的PBS(-)溶液进行悬浮。之后，在细胞过滤器(70μm径)中将悬浮液进行通液，将通液部分再次供至离心分离(400×g且5分钟)，废弃被细胞过滤器捕捉到的组织残渣等。将沉淀部分以6mL的无血清培养液(Procul AD；乐敦制药)进行悬浮，将全部量播种在T-25烧瓶(CellBIND(注册商标)；康宁公司)，静置在培养箱内(37℃，5％CO2)开始原代培养。
(2)继代培养(P0→P1)
以3日1次的频率实施培养基全交换，废弃上澄清液，选择性地增殖在烧瓶底面上进行增殖的细胞。在播种起第11日，对于在T-25烧瓶增殖至半汇合为止的细胞添加2mL的酶溶液(TrypLE Select(注册商标)；赛默飞世尔科技公司)并进行剥离(37℃，静置5分钟)。将细胞以PBS(-)进行稀释，供至离心分离(400×g且5分钟)。将已沉淀的细胞以培养液进行悬浮，进行利用台盼蓝染色法的细胞数计测，结果可回收1.2×106个的活细胞，将其全量以24mL的无血清培养液播种全量(4,000个/cm2)至2个T-150烧瓶(CellBIND(注册商标)；康宁公司)，静置在培养箱内(37℃，5％CO2)进行継代培养。
以3日1次的频率实施培养基全交换，废弃上澄清液，选择性地增殖在烧瓶底面上进行增殖的细胞。对于从播种起第4日增殖到半汇合为止的细胞添加6mL的酶溶液(TrypLESelect(注册商标)；赛默飞世尔科技公司)并进行剥离(37℃，静置5分钟)。将细胞以PBS(-)进行稀释，供至离心分离(400×g且5分钟)。将已沉淀的细胞以无血清培养液进行悬浮，进行利用台盼蓝染色法的细胞数计测，结果存活率是98.7％，确认回收9.8×106个活细胞数，并在培养开始前保管在4℃。
1.2.中空纤维培养(P2)
(1)装置的组装
过滤器外壳末端1a、1b是卫生连接端口形状，在培养液导入部与培养液排出部使用具有鲁尔锁连接的中空纤维过滤器组件(PES MidiKros TC组件/0.2μm粒级尺寸，过滤器膜面积290cm2，全长44cm；T04-P20U-05-N；Spectrum Laboratories)。将具有套圈卫生连接端口且包含硅垫片与硅密封材料的端帽6b，以阻塞过滤器外壳末端1b与中空纤维末端4b的方式，拧紧夹具而密闭。
再者，在具有套圈卫生连接与管口的细胞导入部的一部分(Pro-Connex3/4”卫生设备；ACPX-SM4-06N；Spectrum Laboratories)的管口安装3cm的硅管，在管口的相反侧安装鲁尔锁端口，将此等利用束绳固定。再者，在鲁尔锁安装鲁尔锁连接用的密闭栓，作为细胞导入部5。
接下来，在过滤器外壳末端1a，在已安装硅垫片的套圈卫生连接端口拧紧夹具而安装上述细胞导入部5。
再者，在中空纤维过滤器组件的培养液导入部7与培养液排出部9，经由鲁尔锁连接，分别安装50cm硅管的培养液导入部8与培养液排出路径10。在培养液导入部8与培养液排出路径10的解放侧末端，安装母型CPC连接器与其盖(公型)并密封。将此等利用高温加压蒸汽灭菌(121℃/20分钟)而进行灭菌处理，准备构成品1。
(2)培养液与细胞的导入
在安全柜内，在2D加工袋(FLEXBOY BAG 500mL MPC MALE COUPLERS；SartoriusStedim Japan)中填充350mL的培养液(Procul AD；乐敦制药)，在同加工袋的2处的CPC连接端口连接已进行灭菌处理的上述构成品1的培养液供给路径8与培养液排出路径10的CPC连接器，形成中空纤维过滤器组件与培养液蓄液容器的密闭型循环路径。
接下来，移除细胞导入部5的鲁尔锁连接的栓，将已移除柱塞的20mL容量的注射筒(Niprosyringe封锁型，医疗器械申报编号27B1X00045000033：尼普洛株式会社)利用鲁尔锁连接而连接过滤器外壳末端(1a)，将已制备成15mL的细胞悬浮液全量导入注射筒(9.0×106个)。将柱塞安装至注射筒，将细胞导入侧朝上，使中空纤维过滤器组件直立，耗费约10秒钟压入柱塞，以填满中空纤维内腔的方式结束细胞悬浮液的导入。此时，以不让空气进入中空纤维内腔的方式进行操作。通过计算而导出的中空纤维过滤器内腔的总体积约15cm3，因此细胞播种密度约6.0×105个/cm3。接下来，移除夹具并取下细胞导入装置，在裸露出的过滤器外壳末端1a，将具有套圈卫生连接端口且包含硅垫片与硅密封材料的端帽6a，以阻塞过滤器外壳末端1a与中空纤维末端4a的方式，拧紧夹具并密闭。立刻将中空纤维过滤器组件的长轴方向放置呈水平，借此结束细胞往中空纤维3内腔的导入与封入，完成构成品2。
(3)培养液的循环开始
将构成品2置入二氧化碳培养箱(37℃，5％二氧化碳浓度)。培养液(Procul AD；乐敦制药)因为是重碳酸缓冲系统，所以气体交换会经由培养液供给路径以及培养液排出路径的硅管而进行。在培养液供给路径8的1处安装蠕动泵，并将其驱动，借此开始通过中空纤维过滤器外壳内的流路的培养液循环。送液速度设为约30mL/小时，泵的驱动设为连续驱动。此是以中空纤维内腔的体积每1cm3成为2mL/小时的方式而设定。
(4)培养液的交换与培养上清液
从中空纤维培养的开始起至第12日为止，实施3日至4日1次的培养液的半交换。之后设为3日至4日1次的全交换。并且，为了评价培养上清液，将培养开始日(Day0)、培养开始后4日(Day4)、培养开始后7日(Day7)、培养开始后11日(Day11)、培养开始后14日(Day14)、培养开始后18日(Day18)、培养开始后21日(Day21)、培养开始后25日(Day25)、培养开始后28日(Day28)、培养开始后32日(Day32)、培养开始后35日(Day35)、培养开始后39日(Day39)、培养开始后42日(Day42)、培养开始后46日(Day46)、培养开始后50日(Day50)的时间点的培养上清液各3mL，使用注射器从培养液进入的加工袋的采样端口进行分取，在Day50的时间点结束培养。将已分取的培养上清液利用0.2μm的PES注射器过滤器(25mm GD/X注射器过滤器(PES 0.2μm已灭菌)；6896-2502；GE HEALTHCARE JAPAN)进行过滤，在使用于分析前冷冻保管在-28℃。
(5)细胞的确认
培养结束后，分解装置，在中空纤维过滤器组件的外壳内部填充细胞剥离酶溶液TrypLE Select(赛默飞世尔科技公司)。在37℃进行30分钟酶处理，缓和中空纤维膜与细胞的粘附后，取出中空纤维内腔的细胞块，以相位差显微镜进行所述细胞块的观察。图4是显示从中空纤维内腔取出的细胞的取代图片的照片。
[实施例2]
1.脂肪组织来源间充质干细胞(AD－MSC)的平面粘附培养与培养上清液的制备
1.1.细胞制备方法
(1)原代培养(P0)
针对由上述实施例1进行制备且播种在中空纤维过滤器的AD－MSC(P1継代细胞)的残余部分，将8×105个播种在1个T-150烧瓶(CellBIND；康宁国际)。此时，培养液(ProculAD；乐敦制药)的液量设为24mL。从播种起4日后，在到达半汇合的阶段回收培养上清液。之后，也进行3日至4日1次的培养液全交换，在培养液的交换时间点亦即培养开始后7日(Day7)、培养开始后11日(Day11)、培养开始后14日(Day14)，在培养基交换前回收培养上清液。将此等培养上清液利用0.2μm的PES注射器过滤器(25mm GD/X注射器过滤器(PES 0.2μm已灭菌)；6896-2502；GE HEALTHCARE JAPAN)进行过滤，在使用于分析前冷冻保管在-28℃。
[实施例3]
1.培养上清液的分析
1.1.利用ELISA法的定量(TIMP2)
间充质干细胞来源的培养上清液中含有多种蛋白质，被认为至少其等的一部分会发挥药理作用。其中，针对金属蛋白脢(MMP)的内因性抑制剂亦即金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)家族与成长因子亦即肝细胞生长因子(HGF)，是已知在间充质干细胞的培养上清液中高浓度含有的因子。
间充质干细胞的培养上清液中，已被报告存在镇痛作用(Sci.Rep.2017Aug 29；7(1):9904.Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and theirsecretome in experimental diabetic pain)。但TIMP2也被报告同样的治疗效果性(Nat.Med.2008Mar；14(3):331-6.Distinct roles of matrix metalloproteases in theearly-and late-phase development of neuropathic pain.)。并且，间充质干细胞来源的培养上清液被报告对于多发性硬化症的治疗效果，但作为其有效性因子，证实是HGF(Nat.Neurosci.2012Jun；15(6):862-70.Hepatocyte growth factor mediatesmesenchymal stem cell induced recovery in multiple sclerosis models.)。因此，选择TIMP2与HGF作为成为培养上清液的有效性指标的代表性分泌因子，且作为其等含量的评价，使用市售的ELISA试剂盒(Human TIMP2 ELISA Kit；ab188395；abcam，以及，Human HGFELISA Kit；ab100534)，通过操作手册记载的方法，进行由实施例1以及实施例2所制备的上清液的TIMP2以及HGF的定量试验。
将由平面粘附培养所制备的以往方法的培养上清液与根据本发明所制备的培养上清液所含的TIMP2蛋白质以及HGF蛋白质的定量结果显示于表1、表2以及图5。图5是显示使用ELISA法所测定的TIMP2蛋白质(图5(a)以及HGF蛋白质(图5(b)的定量分析结果的取代图片的图表。Day是表示培养日数。
[表1]
[表2]
在平面粘附培养中，通过伴随过剩增殖的细胞劣化，TIMP2的分泌量上限为Day7的159.5ng/mL，显示浓度低下，在超过1周的长期培养中，暗示所回收的培养上清液的质量低下。另一方面，利用本发明而将细胞密闭在中空纤维内腔中，培养液在流动于中空纤维外的崭新方式的中空纤维培养中，在Day32到达最大分泌量亦即201.5ng/mL，而在以150ng/mL以上的浓度被回收的期间，成为Day21至Day50的非常长期间。同样地，关于作为另一个指标的HGF蛋白质，上限为Day7的5,794pg/mL，显示浓度低下，在超过1周的长期培养中，暗示所回收的培养上清液的质量低下。另一方面，利用本发明而将细胞密闭在中空纤维内腔中，培养液在流动于中空纤维外的崭新方式的中空纤维培养中，在Day35到达最大分泌量亦即7,391pg/mL，而在以5,000pg/mL以上的浓度被回收的期间，成为Day21至Day50的非常长期间。
如此，根据本发明，因能长期间持续回收含有高浓度有效性因子的培养上清液，而首次实现将培养上清液的生产效率拉高到产业化水平。
1.2.双股DNA(dsDNA)定量
为了评价在长期间的培养过程中的细胞健全性与细胞毒性，定量因细胞死亡而被分泌到细胞外的培养液中的dsDNA浓度。在dsDNA定量中，遵循操作手册使用市售的试剂盒(QuantiFluor(注册商标)dsDNA System；普洛麦格)。将其结果显示于表3以及图6。
[表3]
图6是显示dsDNA的定量分析结果的取代图片的图表。在T-150烧瓶的平面粘附培养中，在Day7以后确认显着的dsDNA浓度上升，暗示细胞因过度增殖而导致细胞死亡。另一方面，在由本发明的中空纤维培养所致的培养上清液中，在Day50为止的培养期间中没有确认到显着的dsDNA浓度上升，借此确认到在中空纤维内的密闭空间中以凝聚体的形态增殖的间充质干细胞即使在长期间的培养中也维持细胞的健全性。
1.3.葡萄糖定量
将细胞的主要能量来源亦即葡萄糖进行定量以评价在长期间的培养过程中的培养液中的浓度变化。在葡萄糖定量中，遵循操作手册使用市售的试剂盒(GlucoseColorimetric Assay Kit2；BioVision)。将其结果显示于表4以及图7。
[表4]
图7是显示葡萄糖的定量分析结果的取代图片的图表。在由本发明的中空纤维培养所致的培养上清液中，在Day50为止的培养期间中，葡萄糖并未完全耗尽，但在Day18以后维持在1nmol/μL以下的低浓度。
产业上的可利用性
本发明在产业上的利用用途是制造作为医药品以及化妆品原料的培养上清液。通过活用本发明的技术，相较于利用以往的粘附培养方法制造培养上清液，可达成减少制造区域占地面积、减少制造要员、增大每制造单位的制造规模等。借此，减低培养上清液的制造原价与抑制产品价格，而且赋予最适合且有效的制法开发的方法。

Claims (7)

1.一种中空纤维过滤器组件，其特征在于，是用于制造培养上清液的中空纤维细胞培养装置用的中空纤维过滤器组件，其具有：
过滤器外壳(1)；
中空纤维(3)，其存在于所述过滤器外壳的内部，孔径是5nm以上且1μm以下，内腔呈圆形时的直径是0.1mm以上且1.6mm以下，所述中空纤维(3)的第一以及第二末端(4a、4b)连接所述过滤器外壳(1)的第一以及第二端部(1a、1b)，所述中空纤维(3)是通过细胞导入部(5)而将干细胞导入内部；
第一端帽(6a)，其是在通过所述细胞导入部(5)而将所述干细胞导入所述中空纤维(3)的内部后，用于安装在所述中空纤维过滤器组件的第一端帽(6a)，且用于以所述干细胞及培养液的移动不会经过所述中空纤维(3)的第一末端(4a)的开口部的方式密闭所述中空纤维(3)的第一末端(4a)与所述过滤器外壳(1)；
培养液导入部(7)，其连接所述过滤器外壳(1)，用于将培养液导入所述过滤器外壳的内部，且连接用于将培养液供给至所述过滤器外壳的内部的培养液供给路径(8)；
培养液排出部(9)，其连接所述过滤器外壳(1)，用于将经过所述过滤器外壳的内部的包含培养上清液的培养液排出，且连接用于将所述过滤器外壳的内部的包含培养上清液的培养液排出的培养液排出路径(10)；以及
第二端帽(6b)，其以所述干细胞及培养液的移动不会经过所述中空纤维(3)的第二末端(4b)的开口部的方式密闭所述中空纤维(3)的第二末端(4b)与所述过滤器外壳(1)，
所述培养液不会从所述中空纤维(3)的第一末端(4a)以及所述中空纤维(3)的第二末端(4b)流入，
所述中空纤维细胞培养装置是利用所述干细胞阻塞所述中空纤维(3)的内腔，使在所述中空纤维(3)外部循环的培养液与所述中空纤维(3)内部交换，使通过所述干细胞而产生的培养上清液往所述中空纤维(3)外部移动，借此，可使包含培养上清液的培养液从所述培养液排出部(9)排出。
2.根据权利要求1所述的中空纤维过滤器组件，其特征在于，所述孔径是0.1μm以上且0.65μm以下。
3.根据权利要求1所述的中空纤维过滤器组件，其特征在于，所述干细胞是间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的中空纤维过滤器组件，其特征在于，其更具有所述细胞导入部(5)，
所述细胞导入部(5)是具有空间体积的圆筒状的容积部，其设置在对应于连结第一端帽(6a)的中空纤维过滤器的部位，在圆筒状的容积部的一侧末端插入具有垫片的柱塞，圆筒状的容积部的另一侧末端连结中空纤维过滤器，通过将柱塞压入中空纤维过滤器的方向，而将细胞导入中空纤维过滤器的内腔。
5.一种中空纤维细胞培养装置，其是包含根据权利要求1所述的中空纤维细胞培养装置用的中空纤维过滤器组件且用于制造培养上清液的中空纤维细胞培养装置，其特征在于，包含：
培养液供给路径(8)，其连接所述培养液导入部(7)，用于将培养液导入所述培养液导入部(7)；以及
培养液排出路径(10)，其连接所述培养液排出部(9)，用于回收从所述培养液排出部(9)所排出的包含所述培养上清液的培养液，
利用所述干细胞阻塞所述中空纤维(3)的内腔，使在所述中空纤维(3)外部循环的培养液与所述中空纤维(3)内部交换，使通过所述干细胞而产生的培养上清液往所述中空纤维(3)外部移动，借此，使包含培养上清液的培养液从所述培养液排出部(9)排出，并回收所述培养上清液。
6.根据权利要求5所述的中空纤维细胞培养装置，其特征在于，更具有：送液装置(11)，其设置在所述培养液供给路径(8)，用于经由所述培养液导入部(7)而将培养液送至所述过滤器外壳(1)内。
7.一种间充质干细胞的培养上清液的制造方法，其特征在于，是使用根据权利要求5所述的装置的培养上清液的制造方法，且包含以下工序：
细胞导入工序，其在所述中空纤维(3)的内部，经由所述细胞导入部(5)导入间充质干细胞；
密闭工序，其在所述细胞导入工序后，以所述间充质干细胞及培养液的移动不会通过所述中空纤维(3)的第一末端(4a)的开口部的方式，使用第一端帽(6a)密闭所述中空纤维(3)的第一末端(4a)与所述过滤器外壳(1)；
培养液供给工序，其经由所述培养液导入部(7)而将所述培养液供给至所述过滤器外壳内部；
培养液排出工序，其从所述培养液排出部(9)排出所述过滤器外壳内部的培养液；
培养工序，其接续所述培养液供给工序以及所述培养液排出工序，经由所述培养液导入部(7)而将所述培养液供给至所述过滤器外壳内部，在排出所述过滤器外壳内部的培养液且所述培养液不会从所述中空纤维(3)的第一末端(4a)以及所述中空纤维(3)的第二末端(4b)流入的状态下，在所述中空纤维(3)的内部培养所述间充质干细胞；以及
培养上清液回收工序，其从通过所述培养液排出工序而得的排出液回收培养上清液。
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