CN112147340A - 一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法 - Google Patents
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本发明公开了一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法：(1)悬浮神经球贴壁培养；(2)神经干细胞灭活；(3)CFSE标记hPBMC；(4)共培养；(5)淋巴细胞亚群及增殖检测；(6)细胞因子检测；(7)数据处理；(8)结果分析。本发明利用hPBMC，体外模拟人体免疫反应，研究不同来源、不同代次、不同培养方式等神经干细胞的免疫调节作用，从而对神经干细胞的工艺开发提供依据。本发明将悬浮培养的神经球消化成单细胞，然后贴壁，有利于对其进行数量控制和灭活，利用CFSE随细胞分裂在子代中平均分配的特性，结合不同淋巴细胞亚群抗体，可用流式细胞仪直观地检测特定细胞亚群地增殖情况。将各检测指标进行组合，减少操作步骤，节约实验材料，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，属于干细胞技术研究和免疫学领域。
背景技术
神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞技术近年来发展迅速，其在中枢神经损伤疾病等方面有着巨大的临床应用潜力。不仅如此，神经干细胞治疗的优势明显，比如安全、治疗材料来源充足、治疗疾病范围广阔等，许多国家都将其作为重要的研究发展方向之一。
神经干细胞疗法治疗疾病主要有以下作用机制：1、患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。2、缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位。3、神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复。4、神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路。
尽管人们对干细胞的生物学调控机制越来越了解，但神经干细胞治疗的应用仍然具有挑战性。随着越来越多的关于其治疗可塑性证据的出现，证明神经干细胞不仅通过细胞替代，而且通过免疫调节作用来发挥其有益作用，免疫细胞与移植神经干细胞及其子代之间的相互作用似乎决定了内源性再生反应的有效性、作用机制以及移植后神经干细胞的命运和功能整合。因此更好地了解不同来源、不同代次、不同培养方式等不同工艺路线的神经干细胞的免疫调节作用，对于进一步开发有效的神经干细胞治疗药物至关重要，但是目前还没有具体的可应用于神经干细胞免疫调节的检测方法。
动物模型已在干细胞技术领域被广泛应用，但动物模型与人体之间存在种属差异，对神经干细胞在人体内的免疫调节功能检测存在一定局限性，需要开发一种更接近于人体的体外模型或方法。由于人外周血单核细胞(human peripheral blood mononuclearcells，hPBMC)直接来自于人体，研究者们认为其免疫系统几乎与人体的免疫相同，因此我们可以利用人外周血单核细胞在体外进行神经干细胞免疫调节功能检测，为神经干细胞药物的工艺开发提供依据。
发明内容
针对上述神经干细胞研究现状的需求及现有技术的不足，本发明提供了一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，该方法对悬浮培养的神经球适用，采用CFSE标记细胞可以直观地判断神经干细胞对不同免疫细胞亚群增殖的影响，实现细胞增殖、细胞亚群同时检测，节省时间，避免分别检测所造成的材料浪费。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，包括以下步骤：
(1)悬浮神经球贴壁培养：用人层粘连蛋白包被孔板，备用；收集悬浮培养的神经干细胞球，离心，弃上清，加入accutase消化酶消化，加入适量生理盐水稀释消化液，离心，弃上清，取神经干细胞用NSC培养基重悬接种至包被好的孔板，培养；
(2)神经干细胞灭活：向上述贴壁培养的神经干细胞中加入丝裂霉素C，孵育；弃去培养基，加入PBS缓冲液清洗2次，备用；
(3)CFSE标记hPBMC：向hPBMC中加入荧光染料SFSE工作液，快速重悬混匀，室温避光孵育进行CFSE标记；加入培养基终止标记，离心，弃上清，加入适量生理盐水洗涤细胞一次；
(4)共培养：将步骤(3)CFSE标记后的hPBMC用培养基重悬，然后接种至步骤(2)灭活的神经干细胞中，加入PHA和IL-2，进行共培养，至培养终点，加入细胞激活剂孵育；同时设立无NSC孔作为对照组；
(5)淋巴细胞亚群及增殖检测：共培养组和对照组的悬浮细胞，按检测流式抗体组合和同型流式抗体组合分别标记细胞，流式细胞术检测不同细胞亚群比例及不同细胞亚群中CFSE的表达情况；
(6)细胞因子检测：根据免疫调节考察指标，检测培养上清中因子表达情况；
(7)数据处理：用modfit软件对各亚群的CFSE分裂代次进行分析，获得增殖指数，增殖指数越高说明增殖越明显；
(8)结果分析：比较共培养组和对照组不同指标表达差异，判断神经干细胞的免疫调节作用。
进一步地，所述步骤(1)中，人层粘连蛋白的终浓度为10μg/ml。
进一步地，所述步骤(1)中，孔板为24孔板、48孔板或96孔板。
进一步地，所述步骤(1)中，孔板的包被时间为2～24小时。
进一步地，所述步骤(1)中，消化的条件为：37℃消化13～15分钟。
进一步地，所述步骤(1)中，NSC贴壁培养的条件为：37℃，5.0％CO2，培养6～16小时。
进一步的，所述步骤(1)具体为：用终浓度为10μg/ml的人层粘连蛋白包被24孔板或48孔板或96孔板，包被时间2～24小时，备用；收集悬浮培养的神经干细胞球于50ml离心管中，500g离心5分钟，弃上清，加入1ml accutase消化酶，37℃消化13～15分钟，加入20ml生理盐水稀释消化液，500g离心5分钟，弃上清，取消化好的神经干细胞，用NSC培养基重悬接种至以上包被好的孔板，37℃，5.0％CO2培养箱中培养6～16小时。
进一步地，所述步骤(2)中，丝裂霉素C的终浓度为10～30μg/ml，优选20μg/ml。
进一步地，所述步骤(2)中，孵育的条件为：37℃，5.0％CO2，孵育1小时。
进一步地，所述步骤(3)中，CFSE工作液的终浓度为0.05～0.15μM，优选0.1μM。
进一步地，所述步骤(3)中，CFSE工作液的用量为：每1～5×107个细胞用1ml CFSE工作液重悬。
进一步地，所述步骤(3)中，室温避光孵育的时间为30～40分钟，每5分钟轻弹管底使细胞混匀。
进一步地，所述步骤(3)(4)中，培养基是1640培养基与FBS培养基的混合液，二者体积比为9:1。
进一步地，所述步骤(3)中，加入的培养基的量为CFSE工作液体积的5倍。
进一步地，所述步骤(3)中，离心参数为：600g离心5分钟。
进一步地，所述步骤(4)中，神经干细胞与hPBMC共培养的比例为1:1～100。
进一步地，所述步骤(4)中，PHA的终浓度为5～20μg/ml。
进一步地，所述步骤(4)中，IL-2的终浓度为500～1000U/ml。
进一步地，所述步骤(4)中，共培养的条件为：37℃，5.0％CO2。
进一步地，所述步骤(4)中，培养终点是指培养3天、5天或7天。
进一步地，所述步骤(4)中，细胞激活剂是由PMA(丙二醇甲醚醋酸酯)、离子霉素和布雷菲德菌素A组成的，其中，PMA的终浓度为81nM，离子霉素的终浓度为1.4μM，布雷菲德菌素A的浓度为5μg/ml。
进一步地，所述步骤(4)中，孵育时间为4～6小时。
进一步地，所述步骤(5)中，检测流式抗体组合为：CD3、CD4、IL-17、INF-γ和IL-4的抗体组合，用于检测Th1、Th2和Th17；CD4、CD25和Foxp3的抗体组合，用于检测Treg。
进一步地，所述步骤(5)中，同型流式抗体组合为：CD3、CD4、IL-17同型、INF-γ同型和IL-4同型的抗体组合，用于调节Th补偿；CD4、CD25同型和Foxp3同型的抗体组合，用于调节Treg的补偿。
进一步地，所述步骤(6)中，细胞因子是指包含TNF-α、IL-6等在内的所有免疫调节相关的细胞因子，其检测方法可以为Elisa、流式或其它可用方法。
进一步地，所述步骤(8)中，不同指标表达差异，此种差异可为升高、降低或不变。
本发明的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，是为了满足神经干细胞的研究需求而提出的。利用hPBMC，体外模拟人体免疫反应，研究不同来源、不同代次、不同培养方式等神经干细胞的免疫调节作用，从而对神经干细胞的工艺开发提供依据。hPBMC容易获取，方案容易实施。本发明将悬浮培养的神经球消化成单细胞，然后贴壁，有利于对其进行数量控制和灭活，利用CFSE随细胞分裂在子代中平均分配的特性，结合不同淋巴细胞亚群抗体，可用流式细胞仪直观地检测特定细胞亚群地增殖情况。将各检测指标进行组合，减少操作步骤，节约实验材料，降低成本。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：神经干细胞对不同亚群增殖调节。
图2：神经干细胞对不同淋巴亚群调节。
图3：神经干细胞对TNF-α分泌调节。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1神经干细胞的免疫调节功能的检测
神经干细胞为人源悬浮培养的神经球，检测指标为CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD4-细胞亚群增殖及Th和Treg亚群比例，以及TNF-α水平。具体步骤如下：
(1)悬浮神经球贴壁培养：用终浓度为10μg/ml的人层粘连蛋白包被24孔板3小时，收集悬浮培养的神经干细胞球于50ml离心管中，500g离心5分钟，弃上清；加入1mlaccutase消化酶37℃消化15分钟，加入20ml生理盐水稀释消化液，500g离心5分钟，弃上清；取消化好的神经干细胞用NSC培养基重悬接种至以上包被好的孔板，1×105/孔；37℃，5.0％CO2培养箱培养16小时。
(2)神经干细胞灭活：贴壁培养的神经干细胞中加入丝裂霉素C(终浓度20μg/ml)，37℃，5.0％CO2培养箱孵育1小时；弃去培养基，加入PBS清洗2次，待用。
(3)CFSE标记hPBMC：取2×107个hPBMC，加入2ml CFSE工作液(CFSE终浓度0.1μM)，快速重悬混匀；室温避光孵育30分钟，每5分钟轻弹管底使细胞混匀；加入10ml培养基(1640与FBS按体积比9：1混合而成)室温孵育10分钟终止标记；600g离心5分钟，弃上清，加入10ml生理盐水洗涤细胞一次。
(4)共培养：将CFSE标记后的hPBMC用培养基(1640与FBS按体积比9：1混合而成)重悬，调整细胞浓度为1×106/ml，然后接种至上述灭活的NSC中，0.5ml/孔(对应的hPBMC：NSC＝1:5),进行共培养，同时设立无NSC孔作为对照；共培养孔和对照孔均加入PHA(终浓度5μg/ml)和IL-2(终浓度500U/ml)；于37℃，5.0％CO2培养箱培养，培养至第5天，加入细胞激活剂(含有PMA、离子霉素和布雷菲德菌素A的混合液，其终浓度分别81nM、1.4μM和5μg/ml)，孵育6小时。
(5)淋巴细胞亚群及增殖检测：共培养组和对照组的悬浮细胞，各分成4份，第1份标记CD3、CD4、IL-17、INF-γ和IL-4，用于检测Th1、Th2和Th17；第2份标记CD4、CD25和Foxp3，用于检测Treg；第3份标记CD3、CD4、IL-17同型、INF-γ同型和IL-4同型，用于调节Th补偿；第4份标记CD4、CD25同型和Foxp3同型，用于调节Treg的补偿；流式细胞术检测各亚群及细胞增殖情况。
(6)细胞因子检测：取培养基上清，Elisa法检测培养上清中TNF-α的表达情况。
(7)数据处理：比较共培养组和对照组不同指标表达差异，判断神经干细胞的免疫调节作用。
(8)实验结果：由图1可见，当NSC与hPBMC按1：5的比例共培养时，神经干细胞对CD3+、CD3+CD4、CD3+CD4-细胞有抑制作用。由图2可见，当NSC与hPBMC按1：5的比例共培养时，神经干细胞可以下调Th1、Th2和Th17的表达，上调Treg的表达。由图3可见，当NSC与hPBMC按1：5的比例共培养时，神经干细胞可以降低TNF-α的分泌。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)悬浮神经球贴壁培养：用人层粘连蛋白包被孔板，备用；收集悬浮培养的神经干细胞球，离心，弃上清，加入accutase消化酶消化，加入生理盐水稀释消化液，离心，弃上清，取神经干细胞用NSC培养基重悬接种至包被好的孔板，培养；
(2)神经干细胞灭活：向上述贴壁培养的神经干细胞中加入丝裂霉素C，孵育；弃去培养基，加入PBS缓冲液清洗2次，备用；
(3)CFSE标记hPBMC：向hPBMC中加入荧光染料SFSE工作液，快速重悬混匀，室温避光孵育进行CFSE标记；加入培养基终止标记，离心，弃上清，加入生理盐水洗涤细胞一次；
(4)共培养：将步骤(3)CFSE标记后的hPBMC用培养基重悬，然后接种至步骤(2)灭活的神经干细胞中，加入PHA和IL-2，进行共培养，至培养终点，加入细胞激活剂孵育；同时设立无NSC孔作为对照组；
(5)淋巴细胞亚群及增殖检测：共培养组和对照组的悬浮细胞，按检测流式抗体组合和同型流式抗体组合分别标记细胞，流式细胞术检测不同细胞亚群比例及不同细胞亚群中CFSE的表达情况；
(6)细胞因子检测：根据免疫调节考察指标，检测培养上清中因子表达情况；
(7)数据处理：用modfit软件对各亚群的CFSE分裂代次进行分析，获得增殖指数，增殖指数越高说明增殖越明显；
(8)结果分析：比较共培养组和对照组不同指标表达差异，判断神经干细胞的免疫调节作用。
2.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，人层粘连蛋白的终浓度为10μg/ml；
或/和：所述步骤(1)中，孔板为24孔板、48孔板或96孔板；
或/和：所述步骤(1)中，孔板的包被时间为2～24小时；
或/和：所述步骤(1)中，消化的条件为：37℃消化13～15分钟；
或/和：所述步骤(1)中，NSC贴壁培养的条件为：37℃，5.0％CO2，培养6～16小时。
3.根据权利要求1或2所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：用终浓度为10μg/ml的人层粘连蛋白包被24孔板或48孔板或96孔板，包被时间2～24小时，备用；收集悬浮培养的神经干细胞球于50ml离心管中，500g离心5分钟，弃上清，加入1ml accutase消化酶，37℃消化13～15分钟，加入20ml生理盐水稀释消化液，500g离心5分钟，弃上清，取消化好的神经干细胞，用NSC培养基重悬接种至以上包被好的孔板，37℃，5.0％CO2培养箱中培养6～16小时。
4.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，丝裂霉素C的终浓度为10～30μg/ml；
或/和：所述步骤(2)中，孵育的条件为：37℃，5.0％CO2，孵育1小时。
5.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，CFSE工作液的终浓度为0.05～0.15μM；
或/和：所述步骤(3)中，CFSE工作液的用量为：每1～5×107个细胞用1ml CFSE工作液重悬；
或/和：所述步骤(3)中，室温避光孵育的时间为30～40分钟，每5分钟轻弹管底使细胞混匀；
或/和：所述步骤(3)(4)中，培养基是1640培养基与FBS培养基的混合液，二者体积比为9:1；
或/和：所述步骤(3)中，加入的培养基的量为CFSE工作液体积的5倍；
或/和：所述步骤(3)中，离心参数为：600g离心5分钟。
6.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，丝裂霉素C的终浓度为20μg/ml；
或/和：所述步骤(3)中，CFSE工作液的终浓度为0.1μM。
7.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，神经干细胞与hPBMC共培养的比例为1:1～100；
或/和：所述步骤(4)中，PHA的终浓度为5～20μg/ml；
或/和：所述步骤(4)中，IL-2的终浓度为500～1000U/ml；
或/和：所述步骤(4)中，共培养的条件为：37℃，5.0％CO2；
或/和：所述步骤(4)中，培养终点是指培养3天、5天或7天；
或/和：所述步骤(4)中，培养基是1640培养基与FBS培养基的混合液，二者体积比为9:1；
或/和：所述步骤(4)中，细胞激活剂是由PMA、离子霉素和布雷菲德菌素A组成的，其中，PMA的终浓度为81nM，离子霉素的终浓度为1.4μM，布雷菲德菌素A的浓度为5μg/ml；
或/和：所述步骤(4)中，孵育时间为4～6小时。
8.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(5)中，检测流式抗体组合为：CD3、CD4、IL-17、INF-γ和IL-4的抗体组合，用于检测Th1、Th2和Th17；CD4、CD25和Foxp3的抗体组合，用于检测Treg；
或/和：所述步骤(5)中，同型流式抗体组合为：CD3、CD4、IL-17同型、INF-γ同型和IL-4同型的抗体组合，用于调节Th补偿；CD4、CD25同型和Foxp3同型的抗体组合，用于调节Treg的补偿。
9.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中，细胞因子是指包含TNF-α、IL-6等在内的所有免疫调节相关的细胞因子，其检测方法可以为Elisa、流式或其它可用方法。
10.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(8)中，不同指标表达差异，此种差异可为升高、降低或不变。
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| GR01 | Patent grant | ||
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