CN106701668A - 间质干细胞、其纯株化扩张的方法、其分离方法及其应用 - Google Patents

间质干细胞、其纯株化扩张的方法、其分离方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106701668A
CN106701668A CN201510436042.4A CN201510436042A CN106701668A CN 106701668 A CN106701668 A CN 106701668A CN 201510436042 A CN201510436042 A CN 201510436042A CN 106701668 A CN106701668 A CN 106701668A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
interstital stem
igf1r
cell
isolated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510436042.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106701668B (zh
Inventor
徐伟成
林振寰
李玮
谢佳宏
许重义
蔡长海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilong Pharmaceutical Co ltd In United States
Original Assignee
China Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Medical University filed Critical China Medical University
Priority to CN201510436042.4A priority Critical patent/CN106701668B/zh
Priority to PCT/CN2015/094825 priority patent/WO2017012226A1/zh
Priority to EP15898782.6A priority patent/EP3321356B1/en
Priority to ES15898782T priority patent/ES2900819T3/es
Priority to JP2017567682A priority patent/JP6766082B2/ja
Publication of CN106701668A publication Critical patent/CN106701668A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106701668B publication Critical patent/CN106701668B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种间质干细胞、其纯株化扩张的方法、其分离方法及其应用，所述间质干细胞表现胰岛素样生长因子‑1受体，且本发明的经单离的间质干细胞具有自我更新能力和多能性分化的能力。

Description

间质干细胞、其纯株化扩张的方法、其分离方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种干细胞，特别是一种表现特殊受体的间质干细胞。
背景技术
干细胞(Stem Cell)是为生物体内尚未分化的原生细胞，其具有可以长时间地不断复制、更新，并分化衍生成具有特殊型态和功能的成熟细胞的能力。干细胞依其来源主要可分成胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)及成体干细胞(adult stem cell)两种，胚胎干细胞取自囊胚里的内细胞团，而成体干细胞则来自各式各样的组织。干细胞又依其分化能力，主要可分成三大类，一为全能性干细胞(totipotent stem cells)，全能性干细胞具有完全能力，可分化发育成为完整胚胎或生物体；二为多能性干细胞(pluripotent stem cells)，多能性干细胞具有分化为三个胚层的能力，但无法发育成为完整胚胎或生物体，而可形成某种组织或器官的所有细胞；三为复效性干细胞(multipotent stem cells)，包括特定组织的干细胞，如神经干细胞、血球干细胞、肝脏干细胞、皮肤干细胞等。
间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)为一种成体干细胞，属于多能性干细胞，具有干细胞增生及多向分化的能力，可分化成身体所需的神经细胞、血管细胞、胶质细胞、脂肪细胞或骨头细胞等多种间质组织。间质干细胞可由骨髓、脂肪、牙髓或脐带等间质组织当中取得，依据取得来源的不同，也会有倾向分化为某些特定组织的能力，而当体内组织受损时，间质干细胞能直接或间接进行修复。
间质干细胞可应用于神经、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、骨胳、软骨、视网膜受伤的修复，近年来更发现间质干细胞具有免疫调整功能，可能有助于治疗许多免疫异常的疾病。由于间质干细胞的抗原性比其他干细胞小，临床运用时不像造血干细胞在移植前必须先经过严格配对，也不像胚胎干细胞在使用时有伦理上的考量，因此是很好的细胞治疗来源。在临床的应用上，间质干细胞的自我更新和多能性分化能力至为关键，因此与维持间质干细胞多能性相关的细胞表面受体，已成为干细胞医疗相关技术研发的主要课题之一。
发明内容
依据本发明的一实施例是在提供一种经单离的间质干细胞，其表现胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor 1receptor,IGF1R)。
依据前述经单离的间质干细胞，其中经单离的间质干细胞为多能性。
依据前述经单离的间质干细胞，其中经单离的间质干细胞可为人类细胞，更佳地可为脐带间质干细胞。
借此，本发明的经单离的间质干细胞是于细胞表面表现胰岛素样生长因子-1受体，其具有自我更新和多能性(pluripotent)分化的特性。
本发明的另一实施例是在提供一种间质干细胞纯株化扩张(clonogenicexpansion)的方法，包含于含人类脐带血血清的培养基中培养前述的经单离的间质干细胞，其中经单离的间质干细胞表现胰岛素样生长因子-1受体。
依据前述经单离的间质干细胞纯株化扩张的方法，其中培养基的人类脐带血血清的浓度可为1～10％(v/v)，较佳地可为2％(v/v)。
借此，本发明的间质干细胞纯株化扩张的方法中，培养基是使用人类脐带血血清为原料，脐带血血清中富含生长因子，可使间质干细胞大量表现胰岛素样生长因子-1受体，并维持多能性分化能力，而使用人类脐带血血清的培养基方便获得，且可避免因使用非人类血清所引起的过敏反应及感染病毒或病原菌的危险。
本发明的再一实施例是在提供一种分离多能性的间质干细胞的方法，包含提供来自哺乳动物组织的细胞混合物，进行分离步骤。分离步骤是自细胞混合物单离对于胰岛素样生长因子-1受体呈阳性的细胞，以获得多能性的间质干细胞。
依据前述分离多能性的间质干细胞的方法，其中分离步骤更包含单离对于介白素-22受体(interleukin 22receptor alpha 1,IL22RA1)呈阳性的细胞。
依据前述分离多能性的间质干细胞的方法，其中哺乳动物组织是选自骨髓、牙髓、胎盘、脐带、脐带血及脂肪所组成的族群中。
借此，本发明的分离多能性间质干细胞的方法，可自哺乳动物组织来源的细胞混合物中，筛选对于IGF1R呈阳性的细胞，更佳地，可再筛选对于IL22RA1呈阳性的细胞，筛选出的即为具多能性分化能力的间质干细胞，故可快速且专一的纯化多能性的间质干细胞。
本发明的又一实施例是在提供一种前述的经单离的间质干细胞的用途，其是用于制备治疗缺血性心脏病的药物。
依据前述经单离的间质干细胞的用途，其中缺血性心脏病为心肌梗塞。
依据前述经单离的间质干细胞的用途，其中缺血性心脏病的药物可为减少因心肌梗塞引起的纤维化的药物或减少免疫反应的药物。
借此，将本发明的经单离的间质干细胞用于细胞治疗时，其可以减轻心肌梗塞后左心室的功能障碍、降低梗塞面积、减少因心肌梗塞引起的纤维化的以及减少免疫反应，故可用以治疗个体的缺血性心脏病。
本发明的又一实施例是在提供一种前述的经单离的间质干细胞的用途，其是用于制备治疗个体脑组织损伤的药物。
依据前述经单离的间质干细胞的用途，其中脑组织损伤是由脑缺血疾病造成，例如中风。
依据前述经单离的间质干细胞的用途，其中脑组织损伤是由神经退化性疾病造成，例如帕金森氏症。
依据前述经单离的间质干细胞的用途，其中治疗个体脑组织损伤的药物可为增加葡萄糖代谢活性的药物、促进血管新生的药物或促进神经突再生的药物。
借此，本发明的经单离的间质干细胞用于细胞治疗时，其可以增加葡萄糖的代谢活性、促进血管新生和加强神经突再生，故可用以治疗脑组织损伤的个体。
上述发明内容旨在提供本公开内容的简化摘要，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1A为脐带间质干细胞初代培养的显微照片图；
图1B为本发明的经单离的间质干细胞的胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor 1receptor,IGF1R)表现的结果图；
图1C为本发明的经单离的间质干细胞的介白素-22受体(interleukin 22receptor alpha 1,IL22RA1)表现的结果图；
图1D和图1E为本发明的经单离的间质干细胞的华顿氏胶中细胞的特异性细胞表面分子表现的结果图；
图1F为本发明的经单离的间质干细胞的多能性标记表现的结果图；
图2为本发明的经单离的间质干细胞的扩增指数图；
图3A为人类脐带血血清(human cord blood serum,hUCS)和胎牛血清(FetalCalf serum,FCS)的人类细胞激素晶片分析图；
图3B为hUCS和FCS的ELISA分析图；
图4A为本发明的经单离的间质干细胞导入shRNA后IGF1R表现量分析图；
图4B为本发明的经单离的间质干细胞的扩增趋势图；
图4C为本发明的经单离的间质干细胞的细胞增生分析图；
图5A为本发明的经单离的间质干细胞的流式细胞仪双染法分析图；
图5B为本发明的经单离的间质干细胞的免疫萤光染色双染法的显微照片图；
图5C为间质干细胞表现多能性标记的定量RT-PCR结果图；
图6A为本发明的经单离的间质干细胞分化为不同组织细胞的显微照片图；
图6B为本发明的经单离的间质干细胞分化为神经细胞的显微照片图；
图7A为处理不同剂量的胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF1)至本发明的经单离的间质干细胞后，其IGF1R和趋化因子CXCR4表现量的分析图；
图7B为处理不同剂量的血小板衍生的生长因子-BB(platelet-derivedgrowth factor BB,PDGF-BB)至本发明的经单离的间质干细胞后，其IGF1R和趋化因子CXCR4表现量的分析图；
图7C为同时处理不同剂量的IGF1和PDGF-BB至本发明的经单离的间质干细胞后，其IGF1R表现量的分析图；
图7D为同时处理不同剂量的IGF1和PDGF-BB至本发明的经单离的间质干细胞后，其磷酸化蛋白质激酶B(p-Akt)和磷酸化讯息传递转录活化基因-3(p-Stat3)表现量的分析图；
图8A为大鼠身体摆动测试的结果图；
图8B为阻断试验的大鼠身体摆动测试的结果图；
图9A为大鼠垂直活动测试的结果图；
图9B为大鼠垂直活动时间测试的结果图；
图9C为大鼠垂直运动数量测试的结果图；
图10为大鼠前肢抓握力测试的结果图；
图11A为经细胞治疗后大鼠的[18F]氟-2-脱氧葡萄糖正子造影(FDG-PET)影像图；
图11B为经细胞治疗后大鼠的[18F]FDG-PET影像的量化图；
图12为经细胞治疗后大鼠受损脑组织的抗雕亡蛋白表现量的分析图；
图13A为经细胞治疗后大鼠脑组织中双苯酰亚胺标定的细胞核和人类细胞核抗原共同表现(co-localization)的显微照片图；
图13B为经细胞治疗后大鼠脑组织中植入的本发明的经单离的间质干细胞数量的显微照片图；
图14A为植入中风大鼠受损脑组织的本发明经单离的间质干细胞GFAP与IGF1R或CXCR4共同表现的显微照片图；
图14B为植入中风大鼠受损脑组织的本发明经单离的间质干细胞MAP-2与IGF1R或CXCR4共同表现的显微照片图；
图14C为植入中风大鼠受损脑组织的本发明经单离的间质干细胞NeuN与IGF1R或CXCR4共同表现的显微照片图；
图15A为植入中风大鼠受损脑组织的本发明经单离的间质干细胞vWF与IGF1R或CXCR4共同表现的显微照片图；
图15B为移植本发明经单离的间质干细胞的中风大鼠FITC-葡聚醣灌流的结果图；
图15C为本发明经单离的间质干细胞的中风大鼠血管密度测定的结果图；
图16为移植本发明经单离的间质干细胞的中风大鼠缺血性脑的脑血流量结果图；
图17A为神经突再生体内试验的结果图；
图17B为神经突再生体外试验的结果图；
图18为移植本发明经单离的间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠的心肌梗塞面积图；
图19A为移植本发明经单离的间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠的心脏超音波图；
图19B为移植本发明经单离的间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠心脏超音波的量化图；
图20为移植本发明经单离的间质干细胞3天后的急性心肌梗塞大鼠的免疫组织化学染色法结果图；
图21为移植本发明经单离的间质干细胞3天后的急性心肌梗塞大鼠的免疫萤光染色法结果图；
图22为移植本发明经单离的间质干细胞3天后的急性心肌梗塞大鼠促发炎因子表现量的分析图；
图23为移植本发明经单离的间质干细胞28天后的急性心肌梗塞大鼠的梅生三色染色法结果图。
具体实施方式
本说明书公开内容提出一种经单离的间质干细胞，其表达特定的细胞表面受体，且具自我更新能力和多能性(pluripotent)分化能力。本说明书公开内容另提供一种间质干细胞纯株化扩张(clonogenic expansion)的方法，其可使前述的经单离的间质干细胞大量表现特定的细胞表面受体，并维持多能性分化能力。本说明书公开内容也提供一种分离多能性的间质干细胞的方法，其可由来自哺乳类动物组织的细胞混合物中，快速且专一性的筛选出具多能性分化能力的间质干细胞。此外，本说明书公开内容提供一种前述的经单离的间质干细胞的用途，其可应用于制备治疗缺血性心脏病的药物或制备治疗个体脑组织损伤的药物。
更进一步说，本发明提供一种经单离的间质干细胞，其表现胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor 1receptor,IGF1R)，下文中将以表示本发明的经单离的间质干细胞。IGF1R+间质干细胞为多能性，其来源可为人类细胞，更佳地为脐带间质干细胞。而本发明的间质干细胞纯株化扩张的方法，是将IGF1R+间质干细胞培养于含有人类脐带血血清(human cord blood serum,hUCS)的培养基中，其中hUCS的浓度为1～10％(v/v)，更佳地，hUCS的浓度为2％(v/v)。而本发明的分离具多能性的间质干细胞的方法，是自哺乳动物组织来源的细胞混合物中，筛选对于IGF1R呈阳性的细胞，更佳地，可再筛选对于介白素-22受体(interleukin 22receptor alpha 1,IL22RA1)呈阳性的细胞，即可自细胞混合物中分离多能性的间质干细胞，其中哺乳动物组织是选自骨髓、牙髓、胎盘、脐带、脐带血及脂肪所组成的族群中。
本发明的IGF1R+间质干细胞可应用于制备治疗缺血性心脏病的药物和制备治疗个体脑组织损伤的药物。更进一步地说，本发明的IGF1R+间质干细胞可以减轻心肌梗塞后左心室的功能障碍、降低梗塞面积、减少因心肌梗塞引起的纤维化的以及减少免疫反应，故可用以治疗个体的缺血性心脏病，其中缺血性心脏病可为心肌梗塞。另本发明的IGF1R+间质干细胞可以增加葡萄糖的代谢活性、促进血管新生和加强神经突再生，并藉由IGF1R和趋化因子受体CXCR4的交互作用，具有神经重塑的效果，故可用以治疗脑组织损伤的个体，其中脑组织损伤可为脑缺血疾病或神经退化性疾病，而脑缺血疾病可为中风，神经退化性疾病可为帕金森氏症。
以下为本说明书中所用特定名词的说明：
前述的是胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1receptor,IGF1)的细胞表面受体，属于酪氨酸激酶受体家族。其配体IGF1，是一种在分子结构上与多肽类激素胰岛素类似的激素，在生长发育和成人的合成代谢中有重要作用。
前述的是介白素-22(interleukin 22,IL22)的细胞表面受体，其配体IL-22是一种同时具有抗炎和促炎双重特性的细胞因子，可由多种免疫细胞分泌。
前述的是基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1a,SDF-1)的特异受体，CXCR4在体内大部分组织和器官上都有表达，是由352个胺基酸组成的G蛋白偶联受体(G protein–coupled receptor,GPCR)，具有七次穿膜结构。其配体SDF-1对淋巴细胞有强烈的趋化作用。
兹以下列具体试验例进一步示范说明本发明，用以有利于本发明所属技术领域技术人员，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些试验例视为对本发明范围的限制，但用于说明如何实施本发明的材料及方法。
<试验例>
第一部分：本发明的IGF1R+间质干细胞
1.1：IGF1R+间质干细胞制备
为制备IGF1R+间质干细胞，于本试验例中所使用的哺乳动物组织为人类脐带组织，而人类脐带组织中的人类脐带间质干细胞源自华顿氏胶(Wharton'sjelly)中。将所收集的人类脐带组织先以不含Ca2+和Mg2+的PBS(DPBS，LifeTechnology)洗涤三次后，将人类脐带组织在中线方向以剪刀剪开，并自华顿氏胶中抽出脐动脉血管、脐静脉血管和外膜。再将华顿氏胶的间质组织切割成小于0.5cm3的立方体，以胶原蛋白酶1型(Sigma)处理，并在37℃下于5％CO2、95％饱和湿度培养14-18小时后。再将外植体分别以含有2％hUCS或10％胎牛血清(Fetal Calf serum,FCS)的DMEM为细胞培养基，并在细胞培养基中加入抗生素，在37℃下于5％CO2、95％饱和湿度静置培养5-7天。人类脐带组织的外植体培养，将维持到发现有梭形贴壁细胞自外植体中向外生长。
请参照图1A，为脐带间质干细胞初代培养的显微照片图，其中黑色箭头所指的处为外植体，在培养4至8代后，可见细胞自外植体中迁移，且细胞形态变为均匀的梭状。
后续再以流式细胞仪分析前述初代培养的脐带间质干细胞的细胞表面分子。分析的细胞表面分子包含IGF1R、IL22RA1、华顿氏胶中细胞的特异性细胞表面分子以及多能性标记。华顿氏胶中细胞的特异性细胞表面分子包含CD13、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD117、CD166、HLA-ABC和HLA-DR。多能性标记包含Oct-4、Sox-2、Nanog和SSEA-4。
请参照图1B至图1F，图1B为本发明的经单离的间质干细胞IGF1R表现的结果图，图1C为本发明的经单离的间质干细胞的IL22RA1表现的结果图，图1D和图1E为本发明的经单离的间质干细胞的华顿氏胶中细胞的特异性细胞表面分子表现的结果图，图1F为本发明的经单离的间质干细胞的多能性标记表现的结果图。
图1B中先以由流式细胞仪分析前述初代培养的脐带间质干细胞的IGF1R表现，再以西方墨点法分析不同来源的间质干细胞的IGF1R表现，分析的细胞种类包含人类纤维母细胞、人类牙髓干细胞、脂肪间质干细胞、脐带间质干细胞以及骨髓间质干细胞，图1B的结果显示，不同来源的间质干细胞皆可见IGF1R的表现。
图1C至图1F以流式细胞仪分析前述初代培养的脐带间质干细胞的IL22R1A表现、华顿氏胶中细胞的特异性细胞表面分子表现以及多能性标记表现。由图1C的结果显示，前述初代培养的脐带间质干细胞可见IL22R1A的表现，与对照组相比约有45.4％的脐带间质干细胞表现IL22R1A。由图1D和图1E的结果显示，前述初代培养的脐带间质干细胞可见CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和HLA-ABC的表现，而未见CD34、CD45、CD117和HLA-DR的表现，显示前述初代培养的脐带间质干细胞并非造血干细胞表现型。而由图1F的结果显示，前述初代培养的脐带间质干细胞皆表现Oct-4、Sox-2、Nanog和SSEA-4代表多能性分化能力的多能性标记。
实验上再自前述经流式细胞仪分析的细胞中分选出IGF1R+间质干细胞。纯化的方法如下：将细胞与抗IGF1抗体混合后，使用FACSTAR+流式细胞仪(Becton Dickinson)分选出染上抗IGF1抗体的细胞，再以锥蓝质排除测试(trypan blue exclusion test)分析分选出的细胞，细胞存活率大约为96％。
1.2：IGF1R+间质干细胞培养
分选出的IGF1R+间质干细胞分别以含有2％hUCS或10％FCS的DMEM为细胞培养基，并在细胞培养基中加入抗生素，于37℃下于5％CO2、95％饱和湿度的环境培养。并分别分析培养于含hUCS和FCS的IGF1R+间质干细胞的生长动力学。
请参照图2，为IGF1R+间质干细胞的扩增指数图。由图2的结果显示，培养于含hUCS的培养基中的IGF1R+间质干细胞分裂的速度，较培养于含FCS的培养基中的IGF1R+间质干细胞还快，其倍增一代的时间为22小时，并可扩增超过150天而没有衰老和自发分化的迹象。
为评估使用含hUCS的培养基培养IGF1R+间质干细胞的优点，实验上以人类细胞激素晶片(RayBiotechTM)分析比较hUCS和FCS中多个特定的细胞激素。于本试验例中，共分析42种细胞激素，并透过光密度测定hUCS或FCS中细胞激素的表达水平。
请参照图3A，为hUCS和FCS的人类细胞激素晶片分析图，其中P表示正对照，N表示负对照。由图3A的结果显示，在hUCS中有5种细胞激素的表达水平显著高于FCS，分别为表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF；方框1)、血管生成素(angiogenin,ANG；方框2)、巨噬细胞炎性蛋白(macrophageinflammatory protein,MIP-1δ；方框3)、趋化激素RANTES(regulated onactivation,normal T-cell expressed and presumably secreted,RANTES；方框4)和血小板衍生的生长因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)，此5种细胞激素表达水平相差的倍数分别为2倍、3倍、3倍、2倍和4倍。相较之下，在hUCS和FCS中胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)的表现水平相似。
为了更准确地定量测定hUCS和FCS中PDGF-BB和IGF-1的浓度，本试验例以hUCS和FCS为样品，利用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)进行PDGF-BB和IGF-1浓度分析。
请参照图3B，为hUCS和FCS的ELISA分析图，由图3B的结果显示，2种血清中的IGF1表现水平相似，但在PDGF-BB的部分，hUCS中含有的PDGF-BB浓度显著的高于FCS中的含量(p<0.05)。
1.3：IGF1R+间质干细胞的自我更新能力
为了探讨IGF1R信息途径是否有助于间质干细胞自我更新的调控，实验上使用慢病毒分别导入靶向IGF1R的shRNA(LV-IGF1R-sh,sc-29358-V,SantaCruz Biotechnology)至以含hUCS或FCS的培养基培养的IGF1R+间质干细胞中，以降低IGF1R+间质干细胞中IGF1R的表现，实验上也使用慢病毒分别导入控制组的shRNA(LV-control-sh,Santa Cruz Biotechnology)至以含hUCS或FCS的培养基培养的IGF1R+间质干细胞中做为实验对照组。并在感染慢病毒48小时后，利用西方墨点法分析导入shRNA后IGF1R+间质干细胞的IGF1R的表现量。另分析导入shRNA后IGF1R+间质干细胞的生长动力学。
请参照图4A至图4B，图4A为导入shRNA后IGF1R表现量分析图，图4B为IGF1R+间质干细胞的扩增趋势图。图4A中共有4个组别，分别为使用慢病毒分别导入LV-IGF1R-sh和导入LV-control-sh的IGF1R+间质干细胞，以及未导入shRNA的IGF1R+间质干细胞，在图4A中4个组别的IGF1R+间质干细胞皆是以含hUCS的培养基培养。由图4A的结果显示，在感染慢病毒48小时后，导入LV-IGF1R-sh的组别相较于导入LV-control-sh的组别，其IGF1R的表现量降低，而其它组别的IGF1R表现量相当。而图4B中共有4个组别，分别为以含hUCS的培养基培养并导入LV-control-sh的IGF1R+间质干细胞(LV-control-sh U-IGF1R+间质干细胞)、以含FCS的培养基培养并导入LV-control-sh的IGF1R+间质干细胞(LV-control-sh F-IGF1R+间质干细胞)、以含hUCS的培养基培养并导入LV-IGF1R-sh的IGF1R+间质干细胞(LV-IGF1R-sh-U-IGF1R+间质干细胞)，以及以含FCS的培养基培养并导入LV-IGF1R-sh的IGF1R+间质干细胞(LV-IGF1R-sh-F-IGF1R+间质干细胞)。由图4B的生长动力学结果显示，不论是以含hUCS或FCS的培养基培养的IGF1R+间质干细胞，导入LV-IGF1R-sh后，皆会减缓IGF1R+间质干细胞的增生。
本试验例进一步利用尿密啶类似物(Bromodeoxyuridine,BrdU)标定DNA，以细胞增生分析法(BrdU proliferation assay)进行检测，探讨IGF1R+间质干细胞的增殖潜力。实验上先将IGF1R+间质干细胞培养于未添加补充物的培养基中4至6小时，再将IGF1R+间质干细胞分别培养于含2％hUCS、10％FCS或100ng/mL SDF-1的培养基中2天，并分别导入LV-control-sh或LV-IGF1R-sh，再以BrdU chemiluminescence immunoassay kits(Roche)分析IGF1R+间质干细胞的增生情况。
请参照图4C，为IGF1R+间质干细胞的细胞增生分析图。图4C中共有5个组别，分别为以添加SDF-1的培养基培养的IGF1R+间质干细胞作为正控制组、以含hUCS的培养基培养并导入LV-control-sh的IGF1R+间质干细胞、以含FCS的培养基培养并导入LV-control-sh的IGF1R+间质干细胞、以含hUCS的培养基培养并导入LV-IGF1R-sh的IGF1R+间质干细胞，以及以含FCS的培养基培养并导入LV-IGF1R-sh的IGF1R+间质干细胞。由图4C的结果显示，以含hUCS的培养基培养的IGF1R+间质干细胞，显著地较以含FCS的培养基培养的IGF1R+间质干细胞有更多的BrdU嵌入。相较之下，不论是以含hUCS或FCS的培养基培养的IGF1R+间质干细胞，导入LV-IGF1R-sh后，BrdU的嵌入量将大幅下降，显示IGF1R为间质干细胞增值时不可或缺的细胞表面受体。
1.4：IGF1R+间质干细胞的多能性
为探讨IGF1R与IGF1R+间质干细胞的多能性是否有关，实验上分别将IGF1R+间质干细胞双染IGF1R/Oct-4抗体、IGF1R/Sox-2抗体、IGF1R/Nanog抗体、IGF1R/SSEA4抗体，再分别以流式细胞仪和免疫萤光染色法分析IGF1R和多能性标记共表达的情况。
请参照图5A和图5B，图5A为IGF1R+间质干细胞的流式细胞仪双染法分析图，图5B为IGF1R+间质干细胞的免疫萤光染色双染法的显微照片图，其中IGF1R+间质干细胞的细胞来自5个独立的样本。由图5A和图4E的结果显示，IGF1R+间质干细胞中IGF1R与多能性标记Oct-4、Sox-2、Nanog和SSEA-4共表达，而图5B的结果更显示，IGF1R也与CXCR4共表达。
本试验例进一步以定量RT-PCR(qRT-PCR)探讨IGF1R+间质干细胞和不表现IGF1R的间质干细胞(IGF1R-间质干细胞)其多能性标记的表现差异。请参照图5C，为IGF1R+间质干细胞和IGF1R-间质干细胞表现多能性标记的定量RT-PCR结果图，其中试验的细胞分别为IGF1R+间质干细胞和IGF1R-间质干细胞，并以人类纤维母细胞作为负向控制组，人类诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)作为正向控制组。结果显示，不论Oct-4、Sox-2、SSEA-4或Nanog的表现，IGF1R+间质干细胞皆较IGF1R-间质干细胞的表现量高，显示IGF1R为间质干细胞维持多能性重要的细胞表面受体。
1.5：IGF1R+间质干细胞的分化能力
本试验例以体外分化试验进一步探讨以含hUCS或FCS的培养基培养IGF1R+间质干细胞，是否会影响其多能性分化能力。实验上分别将培养于含hUCS或FCS培养基继代5至10代的IGF1R+间质干细胞，以5×103细胞/cm2的密度种于细胞培养皿中，并分别以含有10％FCS或2％hUCS不同的分化培养基培养IGF1R+间质干细胞，引导其分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、血管形成和神经细胞，并在显微镜下观察细胞型态，以及进一步以染色法确认分化后的细胞种类。
请参照图6A和图6B，图6A为IGF1R+间质干细胞分化为不同组织细胞的显微照片图，图6B为IGF1R+间质干细胞分化为神经细胞的显微照片图。
图6A中利用油红组织染色(oil red O stain)确认分化后的细胞为脂肪细胞，利用茜素红染色(Alizarin red S stain)确认分化后的细胞为成骨细胞，以及利用阿新蓝染色(Alican blue stain)确认分化后的细胞为软骨细胞，并以明视野下的细胞型态确认IGF1R+间质干细胞是否会血管形成。由图6A的结果显示，IGF1R+间质干细胞在分化培养基的培养下，可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞以及血管形成。
图6B中明视野的显微照片显示，培养于神经细胞分化培养基的IGF1R+间质干细胞，可见扩展神经突状结构细胞型态，显示分化后的细胞为神经细胞。本试验例更进一步以免疫萤光染色确认分化后的细胞是否表现成熟神经标记，成熟神经标记包含GFAP(glial fibrillary acidic protein)、MAP-2(microtubule-associated protein 2)、O4和Tuj-1(Neuron-specific class IIIbeta-tubulin)。由图6B的结果显示，分化后的细胞4种成熟神经标记皆有表现，证明分化后的细胞确实为神经细胞。
另请参照下表一，为以含有2％hUCS分化培养基或10％FCS分化培养基培养的IGF1R+间质干细胞，4种成熟神经细胞标记的表现比例。结果显示，以含2％hUCS分化培养基培养的IGF1R+间质干细胞，不论是哪一种成熟神经标记的表现比例皆较以含10％FCS分化培养基培养的高，显示以含hUCS培养基培养的IGF1R+间质干细胞更容易分化为神经细胞。
表一
血清 GFAP MAP-2 O4 Tuj-1
2％hUCS 15.2±3.1％ 12.1±3.1％ 9.4±2.1％ 10.2±1.7％
10％FCS 8.6±2.2％ 7.1±2.7％ 5.8±1.6％ 6.1±1.5％
1.6：IGF1R+间质干细胞的调控机制
本试验例将探讨IGF1R+间质干细胞的IGF1R和CXCR4表现水平是否单独受IGF1调控，或由IGF1和PDGF-BB(hUCS和FCS差异的关键成分)调控。实验上先分别加入不同剂量的IGF1或不同剂量的PDGF-BB处理IGF1R+间质干细胞，并以西方墨点法侦测IGF1R和CXCR4的表现量。
请参照图7A至图7C，图7A为处理不同剂量的IGF1至IGF1R+间质干细胞后，其IGF1R和CXCR4表现量的分析图。图7B为处理不同剂量的PDGF-BB至IGF1R+间质干细胞后，其IGF1R和CXCR4表现量的分析图。图7C为同时处理不同剂量的IGF1和PDGF-BB至IGF1R+间质干细胞后，其IGF1R表现量的分析图。其中*表示实验组(加入不同剂量IGF1或/和PDGF-BB的组别)和控制组(未加入IGF1和PDGF-BB的组别)相比P<0.05，**表示实验组和控制组相比P<0.01。由图7A的结果显示，加入IGF1会降低IGF1R+间质干细胞的IGF1R表现，且两者之间的关系呈现剂量依赖性，但加入IGF1会增加CXCR4的表现，且在加入IGF1浓度为5nM时，CXCR4的表现量最高。而由图7B的结果显示，加入PDGF-BB会同时提高IGF1R和CXCR4的表现，且存在剂量依赖性。但由图7C的结果显示，加入PDGF-BB至IGF1R+间质干细胞中，可以有效抑制因IGF1引导的IGF1R表现降低。
为了进一步确定PDGF-BB是否比IGF1更有效地激活控制细胞增殖的信息途径，IGF1R+间质干细胞分别处理不同浓度的IGF1或不同浓度的PDGF-BB(在无血清的条件下)，并以西方墨点法侦测磷酸化蛋白质激酶(phosphorylated Akt,p-Akt)和磷酸化讯息传递转录活化基因-3(phosphorylatedsignal transducers and activator of transcription 3,p-Stat3)的表现水平。
请参照图7D，为同时处理不同剂量的IGF1和PDGF-BB至IGF1R+间质干细胞后，其p-Akt和p-Stat3表现量的分析图，其中*表示实验组(加入不同剂量IGF1或/和PDGF-BB的组别)和控制组(未加入IGF1和PDGF-BB的组别)相比P<0.05。图7D的结果显示，加入PDGF-BB显著地增加p-Akt和p-Stat3的表现量，但加入IGF1则对增加p-Akt和p-Stat3表现量没有效果。本试验另分别加入p-Akt抑制剂(LY294002)和p-Stat3抑制剂(AG490)至IGF1R+间质干细胞中，发现由PDGF-BB引导的Akt和Stat3磷酸化完全被抑制(结果未显示)。上述结果显示，PDGF-BB比IGF1更有效地激活下游重要的信息传导途径，也显示含hUCS的培养基比含FCS的培养基更适于做为间质干细胞的培养基。
第二部分：IGF1R+间质干细胞用于治疗脑组织损伤
根据前述已知IGF1R+间质干细胞具有自我更新能力及多能分化能力，此部份的试验例将探讨将IGF1R+间质干细胞用于治疗脑组织损伤个体的效果。
2.1：IGF1R+间质干细胞移植改善中风大鼠模型的神经行为
本试验例是以中风大鼠模型评估IGF1R+间质干细胞在体内自我更新能力和的神经再生潜力，并透过3种神经功能缺损模式检测中风前后大鼠的神经行为，以评估神经功能是否恢复。
中风大鼠模型采取脑缺血/再灌注模型(ischemia–reperfusion model)来模拟大鼠中暂时性局部脑缺血的症状，所使用的试验动物为体重250-300克雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠。大鼠的脑缺血/再灌注模型是以阻塞大鼠的双侧颈总动脉(common carotid arteries；CCA)及右侧大脑中动脉(middle cerebralartery；MCA)诱发局部性脑缺血，阻塞90分钟后解除以进行再灌注，1小时后再静脉移植细胞至大鼠中，注射的细胞量为2×106。实验上先将大鼠分成5组，分别注射5种不同细胞或载体进行细胞治疗，组别1的细胞为培养于含hUCS培养基的IGF1R+间质干细胞(U-IGF1R+间质干细胞)，组别2的细胞为培养于含FCS培养基的IGF1R+间质干细胞(F-IGF1R+间质干细胞)，组别3的细胞为培养于含hUCS培养基的间质干细胞(U-间质干细胞)，组别4的细胞为培养于含FCS的培养基的间质干细胞(F-间质干细胞)，组别5则为注射PBS(载体)至大鼠体内作为对照组。而组别1的大鼠将另进行阻断试验，分别注射CXCR4抗体(R&D system)和IGF1R抑制剂(PPP,Santa Cruz Biotechnology)以阻断CXCR4和IGF1R。CXCR4抗体以腹腔注射至大鼠体内2周，注射频率为每周2次。PPP以腹腔注射至大鼠体内3天，注射量为20mg/kg/day。
神经行为的检测时间点为脑缺血/再灌注前5天、细胞移植后第1天、第7天、第14天和第28天。3种神经功能缺损模式分别为评估大鼠的身体左右不对称、活动能力和前肢抓握力。
i.身体摆动测试
大鼠的身体左右不对称是利用身体摆动测试评估，实验上先将大鼠悬空放置在尾巴上方10公分的饲养笼底板上，并记录大鼠的横向移动次数，特别是缺血侧对侧的头部摆动频率是以连续20计数，并以基线评分进行标准化。
请参照图8A和图8B，图8A为大鼠身体摆动测试的结果图，图8B为阻断试验的大鼠身体摆动测试的结果图。由图8A的结果显示，不论移植何种间质干细胞的大鼠，相较于对照组有显著的神经功能恢复。而移植以含hUCS培养基培养的间质干细胞的组别(组别1和组别3)，大鼠神经功能恢复的状况又较以含FCS培养基培养的间质干细胞的组别(组别2和组别4)更好，其中又以组别1(移植U-IGF1R+UMSCs)比其它组别有显著的治疗效果。而由图8B的结果显示，加入CXCR4抗体或PPP阻断CXCR4或IGF1R后，阻断试验组大鼠的神经功能恢复结果和对照组相当，显示阻断CXCR4或IGF1R会抑制移植U-IGF1R+间质干细胞的治疗效果。
ii.活动能力测试
大鼠的活动能力是使用VersaMax动物活动监测系统(AccuscanInstruments)侦测大鼠2小时。VersaMax动物活动监测系统包含16水平红外线感测器和8个垂直红外感测器，垂直感测器分别位于腔室底板上方10mm处，大鼠的活动能力运动由腔室内大鼠因运动打断光束的次数进行定量。测量的3个垂直运动参数为：垂直活动、垂直活动时间以及垂直运动数量。
请参照图9A至图9C，图9A为大鼠垂直活动测试的结果图，图9B为大鼠垂直活动时间测试的结果图，图9C为大鼠垂直运动数量测试的结果图。由图9A至图9C的结果显示，移植间质干细胞的大鼠相较于对照组有显著的活动能力改善。而移植U-IGF1R+间质干细胞的组别又较移植F-IGF1R+间质干细胞的组别改善活动能力的程度又更大，但加入CXCR4抗体或PPP阻断CXCR4或IGF1R的阻断试验组别，大鼠的活动能力的结果和对照组相当，显示阻断CXCR4或IGF1R会抑制移植U-IGF1R+间质干细胞的治疗效果。
iii.前肢抓握力测试
大鼠的前肢抓握力测试是使用握力仪(TSE-Systems)侦测。实验上分开测量大鼠每只前肢的抓握力，计算大鼠拉20次抓握力的平均值，并计算同侧:对侧的抓握力比率。此外，本试验例也计算细胞治疗前和细胞治疗后大鼠抓握力的比率，以评估细胞治疗后大鼠抓握力的改变。
请参照图10，为大鼠前肢抓握力测试的结果图。由图10的结果显示，移植IGF1R+间质干细胞的大鼠相较于对照组的大鼠，在细胞治疗后大鼠的前肢抓握力大幅度的改善。而移植U-IGF1R+间质干细胞的组别又较移植F-IGF1R+间质干细胞的组别改善前肢抓握力的程度又更大，但加入CXCR4抗体或PPP阻断CXCR4或IGF1R的阻断试验组别，大鼠的前肢抓握力和对照组相当，显示阻断CXCR4或IGF1R会抑制移植U-IGF1R+间质干细胞的治疗效果。
上述3个神经功能缺损模式试验呈现相似的结果，显示IGFR-1+间质干细胞可改善中风大鼠的神经行为，而U-IGFR-1+间质干细胞又较F-IGFR-1+间质干细胞更具神经再生的潜力，且此神经再生是透过IGF1R和CXCR4受体途径。
2.2：IGF1R+间质干细胞移植提高葡萄糖代谢
为了探讨移植U-IGF1R+间质干细胞是否影响脑缺血大鼠的葡萄糖代谢活性，本试验例是使用小型动物专用正子扫描仪(microPET)以[18F]氟-2-脱氧葡萄糖正子造影(fluoro-2-deoxyglucose positron emission tomography,FDG-PET)检测细胞治疗后大鼠脑组织的葡萄糖代谢。
请参照图11A和图11B，图11A为经细胞治疗后大鼠的[18F]FDG-PET影像图，图11B为经细胞治疗后大鼠的[18F]FDG-PET影像的量化图，检测的大鼠为经细胞治疗后4周的大鼠，检测的组别共5组，分别为移植U-IGF1R+间质干细胞的大鼠(N＝6)、移植F-IGF1R+间质干细胞的大鼠(N＝6)、移植U-IGF1R+间质干细胞并注射PPP的大鼠(N＝6)、移植U-IGF1R+间质干细胞并注射CXCR4抗体的大鼠(N＝6)以及对照组大鼠(注射PBS,N＝6)。由图11A的结果显示，移植IGF1R+间质干细胞的大鼠可增加受损脑组织(图中右侧脑)的葡萄糖代谢，而移植U-IGF1R+间质干细胞的组别改善受损脑组织葡萄糖代谢的程度又较移植F-IGF1R+间质干细胞的组别更大。图11B是将[18F]FDG-PET的影像图进行半定量，由图11B的结果显示，移植U-IGF1R+间质干细胞增加的葡萄糖代谢活性，在注射PPP或CXCR4抗体阻断CXCR4或IGF1R后，大鼠在受损脑组织的葡萄糖代谢活性与对照组相当，显示阻断CXCR4或IGF1R会抑制移植U-IGF1R+间质干细胞增加葡萄糖代谢活性的效果。
2.3：静脉移植IGF1R+间质干细胞增加抗雕亡蛋白的表达
为探讨以U-IGF1R+间质干细胞治疗中风大鼠是否是藉由增加存活因子的表现改善的神经功能，实验上使用西方墨点法检测经细胞治疗后大鼠受损脑组织中抗雕亡蛋白的表现，检测的抗雕亡蛋白为Bcl-2(B-cell lymphoma 2)和Bcl-xL(B-cell lymphoma-extra large)。本试验例也检测经细胞治疗后大鼠受损脑组织中促雕亡蛋白的表现，检测的促雕亡蛋白为Bax(BCL2-associated Xprotein)和Bad(Bcl-2-associated death promoter)。
请参照图12，为经细胞治疗后大鼠受损脑组织的抗雕亡蛋白表现量的分析图。由图12的结果显示，经IGF1R+间质干细胞治疗的大鼠，在受损脑组织中抗雕亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表现量增加，且以U-IGF1R+间质干细胞治疗的大鼠Bcl-2和Bcl-xL表现量增加更为显著，其中F-IGF1R+间质干细胞组别(N＝6)与对照组(N＝6)相比p<0.05；U-IGF1R+间质干细胞组别(N＝6)与对照组(N＝6)相比p<0.01。相较之下，经IGF1R+间质干细胞(U-IGF1R+间质干细胞和F-IGF1R+间质干细胞)治疗的大鼠，在受损脑组织中的促雕亡蛋白Bax和Bad的表现量和对照组相当。
2.4：IGF1R+间质干细胞治疗增加体内的神经分化
为分析移植的IGF1R+间质干细胞是否可以分化为神经胶质细胞，实验上将经细胞治疗后28天的中风大鼠，利用共轭焦雷射扫描显微镜，以免疫萤光染色法确认植入中风大鼠受损脑组织中IGF1R+间质干细胞的数量，和以免疫萤光双染法确定植入的IGF1R+间质干细胞其分化的细胞型态。
请参照图13A和图13B，图13A为经细胞治疗后大鼠脑组织中双苯酰亚胺标定的细胞核和人类细胞核抗原共同表现(co-localization)的显微照片图，图13B为经细胞治疗后大鼠脑组织中植入的IGF1R+间质干细胞数量的显微照片图。由图13A的结果显示，所有以双苯酰亚胺标定的IGF1R+间质干细胞皆表现人类细胞核抗原(hNA)，确认细胞的来源为人类组织。由图13B的结果显示，移植U-IGF1R+间质干细胞的组别(N＝8)相较移植F-IGF1R+间质干细胞的组别(N＝8)，在受损脑组织中有更多的植入IGF1R+间质干细胞(p<0.05)。但由阻断试验组别(同时移植U-IGF1R+间质干细胞和注射PPP或同时移植U-IGF1R+间质干细胞和注射CXCR4抗体)的结果显示，植入IGF1R+间质干细胞数量的差异会因注射PPP或CXCR4抗体而消失。
为进一步确定植入的IGF1R+间质干细胞分化的细胞型态，实验上以免疫萤光双染法标定特定细胞型态标记、IGF1R和CXCR4，以确认特定细胞型态标记与IGF1R共同表现的情况，以及特定细胞型态标记与CXCR4共同表现的情况，并以双苯酰亚胺(bisbenzimide)标定细胞核，特定细胞型态标记包含星形胶质细胞标记GFAP(glial fibrillary acidic protein)、神经元特异性细胞骨架蛋白MAP-2(microtubule-associated protein 2)和神经核标记NeuN(neuronalnuclear antigen)。
请参照图14A至图14D，图14A为植入中风大鼠受损脑组织的U-IGF1R+间质干细胞GFAP与IGF1R或CXCR4共同表现的显微照片图，图14B为植入中风大鼠受损脑组织的U-IGF1R+间质干细胞MAP-2与IGF1R或CXCR4共同表现的显微照片图，图14C为植入中风大鼠受损脑组织的U-IGF1R+间质干细胞NeuN与IGF1R或CXCR4共同表现的显微照片图。
由图14A至图14C的结果显示，在植入U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠的受损脑组织区域中，一些双苯酰亚胺标定且表现CXCR4的细胞，这些细胞分别共同表现神经细胞标记(GFAP、MAP-2和NeuN)。此外，也可见双苯酰亚胺标定且表现IGF1R的细胞，这些细胞也分别共同表现神经细胞标记(GFAP、MAP-2和NeuN)。
另请参照下表二，为以免疫萤光双染法标定植入的U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠脑组织(N＝8)或F-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠脑组织(N＝8)，并计算免疫萤光双染法中被双苯酰亚胺标定的细胞与GFAP、MAP-2和NeuN共同表现的比例。由表二的结果显示，植入的U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠脑组织细胞，双苯酰亚胺与GFAP、MAP-2或NeuN共同表现的比例(分别为9.5％、12％和10％)皆高于植入的F-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠脑组织细胞(分别为4％、5％和4％)，显示以U-IGF1R+间质干细胞治疗中风大鼠，植入的IGF1R+间质干细胞较易分化为神经细胞。
表二
2.5：IGF1R+间质干细胞移植促进体内的血管新生
本试验以免疫萤光双染法、FITC-葡聚醣灌流和血管密度测定，探讨植入U-IGF1R+间质干细胞增加中风大鼠大脑缺血区域的血管生成。
实验上以免疫萤光双染法标定血管内皮细胞标记vWF(Von Willebrandfactor)、IGF1R和CXCR4，以确认血管内皮细胞标记与IGF1R共同表现的情况，以及血管内皮细胞标记与CXCR4共同表现的情况，并以双苯酰亚胺标定细胞核。请参照图15A，为植入中风大鼠受损脑组织的U-IGF1R+间质干细胞vWF与IGF1R或CXCR4共同表现的显微照片图，由图15A的结果显示，在中风大鼠的缺血性脑半球的血管周围细胞及内皮区域，可见一些被双苯甲亚胺标定的细胞共同表现IGF1R或CXCR4，且这些细胞共同表现血管内皮细胞标记(vWF)。
本试验进一步以FITC-葡聚醣灌流评估中风大鼠缺血脑组织中的微循环，以探讨中风大鼠缺血组织中血管新生的状况，评估的组别为移植U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠(N＝6)、移植F-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠(N＝6)以及注射PBS的对照组中风大鼠(N＝6)。请参照图15B，为移植IGF1R+间质干细胞的中风大鼠FITC-葡聚醣灌流的结果图，由图15B的结果显示，移植U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠与其他组别(移植F-IGF1R+间质干细胞或对照组)相较，显著的增加脑微血管灌流。
本试验例再进一步以免疫萤光染色法标定中风大鼠缺血脑组织切片中的血管内皮细胞标记CD31，以计算血管密度，评估的组别为移植U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠(N＝6)、移植F-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠(N＝6)以及注射PBS的对照组中风(N＝6)。请参照图15C，为移植IGF1R+间质干细胞的中风大鼠血管密度测定的结果图，由图15C的结果显示，移植U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠于缺血脑组织中的血管密度高于其他组别，其中移植U-IGF1R+间质干细胞与移植F-IGF1R+间质干细胞相比p<0.05，移植U-IGF1R+间质干细胞与对照组相比p<0.01。
由上述结果显示，移植IGF1R+间质干细胞至中风大鼠体内进行细胞治疗，可以增加中风大鼠缺血性脑组织中的血管新生，且移植以含hUCS培养基培养的IGF1R+间质干细胞更具有增加缺血性脑组织中血管新生的潜力。
2.6：植入以含hUCS的培养基培养的IGF1R+间质干细胞增加缺血性脑的脑血流量
增加血管密度往往会增加脑血流量(cerebral blood flow,CBF)，进而可以更有效地提供氧气、营养物质以及提高神经元的存活。因此本试验例将进一步监测中风大鼠缺血性脑组织中的脑血流量。实验上先将大鼠以水合氯醛(chloral hydrate)麻醉，以雷射杜卜勒微流仪(Moor Instrutments)监测中风大鼠缺血性脑组织局部血液灌流状况，实验的组别为移植U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠(N＝6)、移植F-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠(N＝6)以及注射PBS的对照组中风(N＝6)。请参照图16，为移植IGF1R+间质干细胞的中风大鼠缺血性脑的脑血流量结果图，由图16的结果显示，移植IGF1R+间质干细胞可增加中风大鼠缺血脑组织中的脑血流量，且移植U-IGF1R+间质干细胞增加中风大鼠缺血脑组织中的脑血流量的幅度更大，其中移植U-IGF1R+间质干细胞与移植F-IGF1R+间质干细胞相比p<0.05，移植U-IGF1R+间质干细胞与对照组相比p<0.01。
2.7：CXCR4和IGF1R的交互作用调节IGF1R+间质干细胞引导的神经再生
本试验例将定量中风大鼠缺血脑组织的神经突再生，以及间质干细胞与初代大脑皮质细胞(primary cortical cells,PCC)共培养(co-culture)后的神经突再生，以探讨IGF1R+间质干细胞和神经组织的交互作用是否刺激体内和体外的神经突生长。
在体内试验的部分，实验上以静脉移植IGF1R+间质干细胞至中风大鼠体内，移植的细胞组别为U-IGF1R+间质干细胞、F-IGF1R+间质干细胞、阻断试验组和对照组，其中阻断试验组是移植导入LV-IGF1R-sh的U-IGF1R+间质干细胞和导入LV-CXCR4-sh的U-IGF1R+间质干细胞至中风大鼠体内，对照组则以静脉注射PBS至中风大鼠体内。牺牲在移植IGF1R+间质干细胞后28天的中风大鼠，将其脑组织切片进行免疫萤光染色以标定神经细胞特异性标记III-tubulin，并以影像分析软体(SigmaScan)计算神经突的长度，并将神经细胞大于细胞体直径2倍以上的细胞计算为神经突细胞(neurite-bearing cells)。
请参照图17A，为神经突再生体内试验的结果图，由图17A的结果显示，移植IGF1R+间质干细胞可改善中风大鼠缺血脑组织中的神经突再生，而移植U-IGF1R+间质干细胞的中风大鼠，于缺血脑组织中的神经突再生数量显著的高于其他组别，且其神经突长度也显著的长于其他组别。但由组断试验组的结果显示，阻断IGF1R或CXCR4会抑制移植U-IGF1R+间质干细胞所增加的神经突长度和神经突细胞数量。
为了评估IGF1R+间质干细胞是否能影响初代大脑皮质细胞氧气和葡萄糖供应不足(oxygen glucose deprivation,OGD)的反应，本试验例进一步将初代大脑皮质细胞与IGF1R+间质干细胞共培养于氧气和葡萄糖供应不足的环境，其中IGF1R+间质干细胞包含U-IGF1R+间质干细胞、F-IGF1R+间质干细胞和阻断试验组，阻断试验组的细胞为导入LV-IGF1R-sh的U-IGF1R+间质干细胞和导入LV-CXCR4-sh的U-IGF1R+间质干细胞，实验上另以于氧气和葡萄糖供应不足的环境单独培养的初代大脑皮质细胞作为对照组。再将共培养后的细胞以免疫萤光染色标定III-tubulin，依前述的方法测定神经突的再生和神经元的存活。
请参照图17B，为神经突再生体外试验的结果图，图17B的结果显示，与IGF1R+间质干细胞共培养可增加初代大脑皮质细胞在氧气和葡萄糖供应不足情况下的神经突细胞数量和神经突长度，显示IGF1R+间质干细胞可帮助氧气和葡萄糖供应不足下初代大脑皮层细胞的神经突再生，而共培养U-IGF1R+间质干细胞的组别神经突再生数量显著的高于其他组别，且其神经突长度也显著的长于其他组别。但由组断试验组的结果显示，阻断IGF1R或CXCR4会抑制U-IGF1R+间质干细胞所增加的神经突长度和神经突细胞数量。
由上述体内和体外神经突再生试验的结果显示，IGF1R+间质干细胞可帮助缺血缺氧性脑组织/脑细胞的神经突再生，且移植以含hUCS培养基培养的IGF1R+间质干细胞更具有增加缺血缺氧性脑组织/脑细胞中神经突再生的潜力，且此神经突再生是透过IGF1R和CXCR4受体途径。
第三部分：IGF1R+间质干细胞用于治疗缺血性心脏病
根据前述试验例已知IGF1R+间质干细胞具有自我更新能力及多能分化能力，且IGF1R+间质干细胞具有治疗脑组织损伤个体的效果，此部份的试验例将探讨将IGF1R+间质干细胞用于治疗缺血性心脏病的效果。
3.1：施用IGF1R+间质干细胞降低心肌梗塞后的左室功能不全以及减少心肌梗塞后的梗塞面积
本试验例是以急性心肌梗塞(acute myocardial infraction,AMI)大鼠模型，评估IGF1R+间质干细胞移植是否改善心肌梗塞后的心肌功能恢复。
急性心肌梗塞大鼠模型是阻塞大鼠的左前下行(left anterior descending,LAD)冠状动脉来模拟大鼠暂时性心脏缺血的症状。本试验中所使用的试验动物为体重250-300克雄性SD大鼠，实验上先将大鼠以2％异氟醚(于100％氧气中)麻醉，全麻后仰置手术台上，口腔插入呼吸器(SN-480-7)，以1mL/100g的潮气量以及80次/分钟的呼吸频率人工通气。再使用肋骨牵开器(MY-9454S)沿胸骨左缘4、5肋间隙纵向切开，并将用左肺以浸泡生理食盐水的纱布放气。剪开心包，然后使用6-0-聚乙烯缝合针线(Ethicon)阻塞左前下行冠状动脉，肉眼观察到阻塞区变白、心电图T坡高耸，将胸部缝合前将肺重新充气，即完成急性心肌梗塞大鼠模型。在将急性心肌梗塞大鼠分成3组，分别静脉移植细胞数为2×106的间质干细胞或IGF1R+间质干细胞，另注射生理盐水作为对照组。本试验中另有假手术组(sham)的大鼠，其为经历上述相同的手术步骤，但未阻塞假手术组的左前下行冠状动脉。
请参照图18，为移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠的心肌梗塞面积图。实验上牺牲移植间质干细胞后28天的急性心肌梗塞大鼠，将心脏组织切片浸泡于三苯基四氮唑氯化物(triphenyltetrazolium chloride)溶液中，再浸泡去氢酶(dehydrogenase)，可发现坏死区域呈现红蓝色，没有梗塞的区域呈现砖红色。由图18的结果显示，移植间质干细胞可改善急性心肌梗塞大鼠的心肌梗塞面积，也可使梗塞区域的动脉血管壁增厚，而移植IGF1R+间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠，其心肌梗塞面积减少的幅度和梗塞区域动脉血管壁增厚的幅度更高于移植间质干细胞的组别。
本试验例进一步藉由M模式的心脏超音波分析心肌梗塞后28天大鼠的左心室功能，以评估IGF1R+间质干细胞治疗缺血性心脏病的效果，分析的组别包含移植间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠、移植IGF1R+间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠、对照组大鼠以及假手术组大鼠。请参照图19A和图19B，图19A为移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠的心脏超音波图，图19B为移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠心脏超音波的量化图。由图19A和图19B的结果显示，移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞的组别相较于对照组，在心脏超音波分析中可侦测到较低的左心室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)/左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)，以及较高的射出分率(ejection fraction,EF)/部分缩短(fraction shortening,FS)，但不影响急性心肌梗塞大鼠的心跳速率，显示移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞可改善急性心肌梗塞大鼠的左心室功能。其中又以移植IGF1R+间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠，其左心室功能改善的幅度更高于其他组别。
3.2：IGF1R+间质干细胞对缺血心肌的抗发炎影响
本试验例将进一步探讨移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞至急性心肌梗塞大鼠中，是否能抑制心肌梗塞后的炎症反应。实验上牺牲移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞后3天的急性心肌梗塞大鼠，将心脏组织切片以免疫组织化学染色法侦测发炎的程度、以免疫萤光染色法侦测巨噬细胞的表现和以定量RT-PCR侦测促发炎因子的表现量。
请参照图20，为移植间质干细胞和IGFIR+间质干细胞3天后的急性心肌梗塞大鼠的免疫组织化学染色法结果图。在图20中，上图为以苏木素-伊红染色(H&E stain)的急性心肌梗塞大鼠心脏组织切片的显微照片图，将心脏组织发炎的情形分为0-5级，级数越高表示发炎程度越严重，并将不同组别所拍摄的结果，依上述标准进行分类和统计，统计的结果如图20的下图所示。图20的结果显示，移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞可改善急性心肌梗塞大鼠心脏组织的发炎程度，且移植IGF1R+间质干细胞改善急性心肌梗塞大鼠心脏组织发炎的能力更好，其中间质干细胞组别与对照组相比p<0.05，IGF1R+间质干细胞组别与对照组相比p<0.01。
为进一步侦测移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞后3天的急性心肌梗塞大鼠于心脏组织中巨噬细胞的表现，实验上将急性心肌梗塞大鼠心脏组织切片以免疫萤光染色法标定巨噬细胞标记CD68，并以萤光显微镜观察结果。请参照图21，为移植间质干细胞和IGFIR+间质干细胞3天后的急性心肌梗塞大鼠的免疫萤光染色法结果图，由图21的结果显示，移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞的组别相较于对照组，心肌梗塞后3天大鼠的心脏组织中，有较少的CD68+细胞浸润在心肌梗塞周围区域，其中移植IGF1R+间质干细胞的组别，CD68+细胞表现量显著少于其他组别。显示移植IGF1R+间质干细胞可以大幅改善急性心肌梗塞大鼠心脏组织的发炎程度。
在缺血心肌观察到发炎细胞的浸润通常会增加促发炎因子的表达，本试验进一步以定量RT-PCR侦测心肌梗塞后3天大鼠的心脏组织中促发炎因子的表现量，侦测的促发炎因子包含IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ，本试验例中另侦测抗发炎因子IL-10的表现量。请参照图22，为移植间质干细胞和IGFIR+间质干细胞3天后的急性心肌梗塞大鼠促发炎因子表现量的分析图。由图22的结果显示，移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞的组别相较于对照组，心肌梗塞后3天大鼠的心脏组织中，促发炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表现量皆降低，其中移植IGF1R+间质干细胞的组别，促发炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表现量降低的幅度更大。而在抗发炎因子的表现量则与促发炎因子的表现量相反，移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞的组别增加抗发炎因子IL-10的表现量，其中移植IGF1R+间质干细胞的组别，抗发炎因子IL-10表现量增加的幅度更大移植，此结果也显示移植IGF1R+间质干细胞可以大幅改善急性心肌梗塞大鼠心脏组织的发炎程度。
3.3：IGF1R+间质干细胞治疗减少心肌梗塞引起的纤维化
心脏的肌纤维与一般的肌纤维不同，能长时间工作把血液打到身体的每一部分。在心肌梗塞时心肌会产生不可逆的坏死，且坏死的部份会由纤维组织替代，在数周后纤维化。本试验例将探讨移植IGF1R+间质干细胞是否能减少心肌梗塞引起的纤维化现象。实验上牺牲移植间质干细胞后28天的急性心肌梗塞大鼠，将心脏组织切片以梅生三色染色法(Masson's trichrome staining)观察大鼠心脏组织纤维化的情况，其中胶原纤维呈现蓝色，肌肉纤维呈现红色，分析的组别包含移植间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠、移植IGF1R+间质干细胞的急性心肌梗塞大鼠、对照组大鼠以及假手术组大鼠。
请参照图23，为移植间质干细胞和IGFIR+间质干细胞28天后的急性心肌梗塞大鼠的梅生三色染色法结果图。在图23中，上图为以梅生三色染色法染色的急性心肌梗塞大鼠心脏组织切片的显微照片图，将心脏组织中纤维化的情形分为0-5级，级数越高表示纤维化程度越严重，并将不同组别所拍摄的结果，依上述标准进行分类和统计，统计的结果如图23的下图所示。图23的结果显示，移植间质干细胞和IGF1R+间质干细胞可改善急性心肌梗塞大鼠心脏组织的纤维化情况，且移植IGF1R+间质干细胞改善急性心肌梗塞大鼠心脏组织纤维化的能力更好，其中间质干细胞组别与对照组相比p<0.05，IGF1R+间质干细胞组别与对照组相比p<0.01。
综合上述，本发明的经单离的间质干细胞是于细胞表面表现胰岛素样生长因子-1受体，其具有自我更新和多能性(pluripotent)分化的特性。本发明之间质干细胞纯株化扩张的方法中，培养基是使用hUCS为原料，hUCS中富含生长因子，特别是PDGF-BB，可使间质干细胞大量表现胰岛素样生长因子-1受体，并维持多能性分化能力，而使用人类脐带血血清的培养基获得方便，且可避免因使用非人类血清所引起的过敏反应及感染病毒或病原菌的危险。本发明的分离多能性间质干细胞的方法，可自哺乳动物组织来源的细胞混合物中，筛选对于IGF1R呈阳性的细胞，更佳地，可再筛选对于IL22RA1呈阳性的细胞，筛选出的即为具多能性分化能力的间质干细胞，故可快速且专一的纯化多能性的间质干细胞。将本发明的经单离的间质干细胞用于细胞治疗时，其可用于治疗个体的脑组织损伤和个体的缺血性心脏病。进一步地说，在治疗个体的脑组织损伤的部份，本发明的经单离的间质干细胞可以增加葡萄糖的代谢活性、促进血管新生和加强神经突再生，并藉由IGF1R和CXCR4的交互作用，具有神经重塑的效果。而在治疗个体的缺血性心脏病的部分，本发明的经单离的间质干细胞可以减轻心肌梗塞后左心室的功能障碍、降低梗塞面积、减少因心肌梗塞引起的纤维化的以及减少免疫反应。
然本发明已以实施方式公开如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (19)

1.一种经单离的间质干细胞，其表现胰岛素样生长因子-1受体。
2.如权利要求1所述的经单离的间质干细胞，其特征在于，所述经单离的间质干细胞为多能性。
3.如权利要求1所述的经单离的间质干细胞，其特征在于，所述经单离的间质干细胞为人类细胞。
4.如权利要求1所述的经单离的间质干细胞，其特征在于，所述经单离的间质干细胞为脐带间质干细胞。
5.一种间质干细胞纯株化扩张的方法，包含：
在含有人类脐带血血清的培养基中培养如权利要求1所述的经单离的间质干细胞，所述经单离的间质干细胞表现胰岛素样生长因子-1受体。
6.如权利要求5所述的间质干细胞纯株化扩张的方法，其特征在于，所述培养基的人类脐带血血清的浓度为1～10％(v/v)。
7.如权利要求5所述的间质干细胞纯株化扩张的方法，其特征在于，所述培养基的人类脐带血血清的浓度为2％(v/v)。
8.一种分离具多能性的间质干细胞的方法，包含:
提供来自一哺乳动物组织的细胞混合物；以及进行分离步骤，所述分离步骤是自所述细胞混合物单离对于胰岛素样生长因子-1受体呈阳性的细胞，以获得所述多能性的间质干细胞。
9.如权利要求8的分离具多能性的间质干细胞的方法，其特征在于，所述分离步骤还包含单离对于介白素22受体呈阳性的细胞。
10.如权利要求8的分离具多能性的间质干细胞的方法，其特征在于，所述哺乳动物组织是选自骨髓、牙髓、胎盘、脐带、脐带血及脂肪所组成的族群中。
11.一种如权利要求1所述的经单离的间质干细胞的用途，其特征在于，所述是用于制备治疗缺血性心脏病的药物。
12.如权利要求11所述的经单离的间质干细胞的用途，其特征在于，所述缺血性心脏病为心肌梗塞。
13.如权利要求11所述的经单离的间质干细胞的用途，其特征在于，所述治疗缺血性心脏病的药物包含减少因心肌梗塞引起的纤维化的药物或减少免疫反应的药物。
14.一种如权利要求1所述的经单离的间质干细胞的用途，所述其用于制备治疗个体脑组织损伤的药物。
15.如权利要求14所述的经单离的间质干细胞的用途，其特征在于，所述脑组织损伤是由脑缺血疾病造成。
16.如权利要求15所述的经单离的间质干细胞的用途，其特征在于，所述脑缺血疾病为中风。
17.如权利要求14所述的经单离的间质干细胞的用途，其特征在于，所述脑组织损伤是由神经退化性疾病造成。
18.如权利要求17所述的经单离的间质干细胞的用途，其特征在于，所述神经退化性疾病为帕金森氏症。
19.如权利要求14所述的经单离的间质干细胞的用途，其特征在于，所述治疗个体脑组织损伤的药物包含增加葡萄糖代谢活性的药物、促进血管新生的药物或促进神经突再生的药物。
CN201510436042.4A 2015-07-22 2015-07-22 间质干细胞、其纯株化扩张的方法及其应用 Active CN106701668B (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510436042.4A CN106701668B (zh) 2015-07-22 2015-07-22 间质干细胞、其纯株化扩张的方法及其应用
PCT/CN2015/094825 WO2017012226A1 (zh) 2015-07-22 2015-11-17 间质干细胞、其克隆源性扩增的方法、其分离方法及其应用
EP15898782.6A EP3321356B1 (en) 2015-07-22 2015-11-17 Mesenchymal stem cell, method for culturing thereof, method for isolating thereof, and uses thereof
ES15898782T ES2900819T3 (es) 2015-07-22 2015-11-17 Célula madre mesenquimal, método de cultivo de la misma, método de aislamiento de la misma y usos de la misma
JP2017567682A JP6766082B2 (ja) 2015-07-22 2015-11-17 間葉系幹細胞、そのクローン原性増殖方法、分離方法及び用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510436042.4A CN106701668B (zh) 2015-07-22 2015-07-22 间质干细胞、其纯株化扩张的方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106701668A true CN106701668A (zh) 2017-05-24
CN106701668B CN106701668B (zh) 2020-12-29

Family

ID=57833810

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510436042.4A Active CN106701668B (zh) 2015-07-22 2015-07-22 间质干细胞、其纯株化扩张的方法及其应用

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP3321356B1 (zh)
JP (1) JP6766082B2 (zh)
CN (1) CN106701668B (zh)
ES (1) ES2900819T3 (zh)
WO (1) WO2017012226A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107748260A (zh) * 2017-08-29 2018-03-02 西安组织工程与再生医学研究所 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法
CN111150743A (zh) * 2018-11-06 2020-05-15 中国医药大学 间质干细胞在治疗多发性硬化症的用途
CN117018295A (zh) * 2023-08-25 2023-11-10 苏州邦伊医疗科技有限公司 一种成活率高的自体脂肪移植方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108642004A (zh) * 2018-05-17 2018-10-12 广东芙金干细胞再生医学有限公司 一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008085564A2 (en) * 2006-09-20 2008-07-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods involving truncated recombinant seven g-protein coupled receptors
CA2669304C (en) * 2006-11-30 2016-10-25 Medipost Co., Ltd. Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells
KR20080049562A (ko) * 2006-11-30 2008-06-04 가톨릭대학교 산학협력단 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경손상 질환 치료제
JP5401669B2 (ja) * 2007-12-06 2014-01-29 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 心筋細胞分化誘導促進方法及び分化誘導方法
CN101215545A (zh) * 2007-12-31 2008-07-09 浙江大学 利用骨髓间充质干细胞诱导获得神经前体细胞的方法
CN101642469B (zh) * 2009-09-09 2012-05-23 中国人民解放军海军总医院 脐带华通胶来源的间充质干细胞在急性心肌梗死细胞移植治疗中的应用
CN101690731B (zh) * 2009-09-09 2013-07-10 中国人民解放军海军总医院 脐带华通胶源间充质干细胞在制备心力衰竭细胞移植材料中的应用
CN103060264B (zh) * 2012-12-20 2015-01-21 上海市第十人民医院 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMER YOUSSEF等: "Low-Oxygen Tension and IGF-I Promote Proliferation and Multipotency of Placental Mesenchymal Stem Cells (PMSCs) from Different Gestations via Distinct Signaling Pathways", 《ENDOCRINOLOGY》 *
MARK L.WEISS等: "Human Umbilical Cord Matrix Stem Cells: Preliminary Characterization And Effect Of Transplantation In A Rodent Model Of Parkinson’s Disease", 《STEM CELLS》 *
SHIH-PING LIU等: "Nonsenescent Hsp27-Upregulated MSCs Implantation Promotes Neuroplasticity in Stroke Model", 《CELL TRANSPLANTATION》 *
SUPHAKDE JULAVIJITPHONG等: "A Xeno-Free Culture Method That Enhances Wharton’s Jelly Mesenchymal Stromal Cell Culture Efficiency Over Traditional Animal Serume Supplemented Cultures", 《INTERNATIONAL SOCIETY FOR CELLULAR THERAPY》 *
武丽萍等: "不同月龄人脐带间充质干细胞移植梗死心肌的血运重建", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107748260A (zh) * 2017-08-29 2018-03-02 西安组织工程与再生医学研究所 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法
CN107748260B (zh) * 2017-08-29 2020-05-15 西安组织工程与再生医学研究所 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法
CN111150743A (zh) * 2018-11-06 2020-05-15 中国医药大学 间质干细胞在治疗多发性硬化症的用途
CN117018295A (zh) * 2023-08-25 2023-11-10 苏州邦伊医疗科技有限公司 一种成活率高的自体脂肪移植方法
CN117018295B (zh) * 2023-08-25 2024-06-07 苏州邦伊医疗科技有限公司 一种成活率高的自体脂肪移植方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3321356A1 (en) 2018-05-16
JP2018530992A (ja) 2018-10-25
CN106701668B (zh) 2020-12-29
ES2900819T3 (es) 2022-03-18
WO2017012226A1 (zh) 2017-01-26
JP6766082B2 (ja) 2020-10-07
EP3321356B1 (en) 2021-11-10
EP3321356A4 (en) 2019-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101748096B (zh) 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
US20230056048A1 (en) Method for enhancing expression of insulin like growth factor 1 receptor in umbilical cord mesenchymal stem cell and method for obtaining multipotent umbilical cord mesenchymal stem cell
JP2005512592A5 (zh)
AU2005293138A1 (en) Novel methods for the in-vitro identification, isolation and differentiation of vasculogenic progenitor cells
CN106701668A (zh) 间质干细胞、其纯株化扩张的方法、其分离方法及其应用
CN108368484A (zh) 使用了血液细胞的组织、内脏器官的制作方法
Lee et al. Role of IGF1R+ MSCs in modulating neuroplasticity via CXCR4 cross-interaction
JP2018530992A6 (ja) 間葉系幹細胞、そのクローン原性増殖方法、分離方法及び用途
CN109890398A (zh) 可用于治疗心脏疾病并含有成纤维细胞的注射用组合物以及用于生产用于治疗用途的成纤维细胞的方法
CN103237887A (zh) 胚胎干细胞来源的心肌细胞以及包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂
CN102703380B (zh) 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
CN102449139B (zh) 对多能性干细胞和心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法
Yim et al. Correlation between the immature characteristics of umbilical cord blood–derived mesenchymal stem cells and engraftment of hematopoietic stem cells in NOD/SCID mice
Lombaert et al. Stem cells in salivary gland development and regeneration
CN106676056A (zh) 诱导脐带间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞分化的方法
CN102822331A (zh) 提高人干细胞活性的方法
CN109652361A (zh) 一种人脐静脉血管内皮细胞的原代分离培养及鉴定方法
CN106676057A (zh) 诱导脐带间充质干细胞向胰岛素分泌样细胞分化的无血清培养基及其制备方法和用途
CN102533641B (zh) 体外无血清成体干细胞放大培养的方法及其培养液
CN110484496A (zh) 一种天然小分子化合物诱导脐带间充质干细胞成骨分化的用途
KR20080094431A (ko) 말초 혈액 유래 단핵 세포로부터 신경 전구 세포를 분리,배양 및 분화하는 방법
US11110129B2 (en) Method for treating multiple sclerosis
WO2023286834A1 (ja) 血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）高発現ペリサイト様細胞
WO2023286832A1 (ja) 血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）高発現ペリサイト様細胞の製造方法
CN106497870A (zh) 一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240423

Address after: West Key Avenue, Rockville, Maryland, United States

Patentee after: Qilong Cell Biotechnology Co.,Ltd. in the United States

Country or region after: U.S.A.

Address before: China Taiwan Road No. 91 in Taichung City

Patentee before: CHINA MEDICAL University

Country or region before: TaiWan, China

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240515

Address after: 9400 West Key Avenue, Rockville, Maryland, USA, Room 200-202

Patentee after: Qilong Pharmaceutical Co.,Ltd. in the United States

Country or region after: U.S.A.

Address before: West Key Avenue, Rockville, Maryland, United States

Patentee before: Qilong Cell Biotechnology Co.,Ltd. in the United States

Country or region before: U.S.A.