CN108368484A - 使用了血液细胞的组织、内脏器官的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明在人组织、内脏器官制作法中以医疗应用为目标，提供一种大幅度改善每1个细胞的功能、实现成本的大规模削减的改良方法。本发明提供一种器官芽的制作方法，该方法包括在血液细胞的存在下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞、以及组织或内脏器官细胞。本发明还提供利用所述方法制作出的器官芽、使用了该器官芽的组织或内脏器官的制作方法、器官芽的移植方法、组织或内脏器官的再生或功能恢复方法、非人嵌合动物的制作方法及评价药剂的方法。
Description
技术领域
本发明涉及使用了血液细胞的组织、内脏器官的制作方法。
背景技术
近年来，利用具有向各种各样的功能细胞分化的能力的iPS细胞等多能性干细胞、通过分化诱导来创制出有益于创制新药筛选、再生医疗的人功能细胞的方法受到关注。目前为止，本发明人等已经确立了由在成体组织中可以观察到的血管内皮细胞、间充质系细胞构成的具有有秩序的立体结构的人组织、内脏器官的重建法(非专利文献1：Takebe T.等，Nature(2013)、专利文献1：人组织、内脏器官的制作方法WO2013/047639A1)。
另一方面，作为此前的关于造血细胞和肝细胞的成熟的见解，提出过在小鼠的生长过程中从造血细胞中产生的细胞因子会促进肝细胞的成熟的报告(非专利文献2：KamiyaA.，等，EMBO J.1999 18：2127-3、非专利文献3：Kinoshita T.，等，Proc Natl Acad Sci US A.1999 96：7265-70(1999))。另外，报告过显示出将造血系细胞与未成熟肝细胞混合后移植到免疫缺陷动物中而同时地成活植入人肝细胞和人造血细胞的研究，然而没有报告过关于由与造血细胞的同时移植所致的肝细胞的成熟度的见解(非专利文献4：Bility MT.，等，Nat Protoc.7：1608-17(2012)、非专利文献5：Washburn ML.，等，Gastroenterology.140：1334-44.(2011))。此外，目前为止还没有通过向体外重建的立体组织中导入造血细胞而显示出对作为目标的功能细胞的成熟的重要性的见解。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Takebe T.等，Nature(2013)
非专利文献2：Kamiya A.，等，EMBO J.1999 18：2127-3
非专利文献3：Kinoshita T.，等，Proc Natl Acad Sci U S A.1999 96：7265-70(1999)
非专利文献4：Bility MT.，等，Nat Protoc.7：1608-17(2012)
非专利文献5：Washburn ML.，等，Gastroenterology.140：1334-44.(2011)
专利文献
专利文献1：WO2013/047639 A1
发明内容
发明所要解决的问题
在以往的人组织、内脏器官制作法中以医疗应用为目标的情况下，以每1名成人作为对象时的制造成本极高，约为1000万日元左右，这成为技术上的普及障碍。鉴于现阶段至少估计存在有2万人以上的绝对适应患者(等待肝衰竭中的适应除外、死亡例的国际估算)的现状，为了将此种治疗技术作为通用技术广泛地应用于患者，目前的状况是期望开发出大幅度改善每1个细胞的功能、实现成本的大规模削减的改良方法。
本发明的目的在于，提供此种改良方法。
用于解决问题的方法
本发明人等通过向对肝内胚层细胞、血管内皮细胞及间充质系细胞进行共培养的培养系统中加入造血细胞，成功地实现了所形成的器官芽的进一步的功能提高。此前为止，还没有技术显示出人组织、内脏器官的三维的重建中的造血细胞的效果，可以认为是新颖性/创造性极高的方法。
本发明的主旨如下所示。
(1)一种器官芽的制作方法，该制作方法包括在血液细胞的存在下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞、以及组织或内脏器官细胞。
(2)根据(1)记载的方法，其中，器官芽是可以通过成熟而分化为器官的结构体。
(3)根据(1)或(2)记载的方法，其中，与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞、以及组织或内脏器官细胞而制作出的器官芽相比，制作了功能提高了的器官芽。
(4)根据(1)～(3)中任一项记载的方法，其中，不使用支架材料地培养细胞。
(5)根据(1)～(4)中任一项记载的方法，其中，血液细胞包括未分化造血细胞。
(6)根据(5)记载的方法，其中，未分化造血细胞为造血前体细胞和/或造血干细胞。
(7)根据(1)～(6)中任一项记载的方法，其中，血液细胞来自于脐带血。
(8)根据(7)记载的方法，其中，血液细胞为脐带血的单核细胞部分的细胞。
(9)根据(1)～(8)中任一项记载的方法，其中，组织或内脏器官细胞是由多能性干细胞诱导出的未分化细胞。
(10)根据(9)记载的方法，其中，多能性干细胞为人工多能性干细胞。
(11)根据(9)或(10)记载的方法，其中，多能性干细胞来自于人。
(12)根据(1)～(11)中任一项记载的方法，其中，器官芽为肝芽。
(13)根据(12)记载的方法，其中，与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞及组织或内脏器官细胞而制作出的肝芽相比，制作了白蛋白的分泌能力提高了的肝芽。
(14)根据(12)或(13)记载的方法，其中，与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞及组织或内脏器官细胞而制作出的肝芽相比，制作了肝细胞分化标记基因的表达升高了的肝芽。
(15)根据(14)记载的方法，其中，肝细胞分化标记基因是选自甲胎蛋白(αフェトプロテイン)、白蛋白、CYP3A7、色氨酸代谢酶TDO2、以及钠/牛磺胆酸协同转运蛋白中的至少1个标记。
(16)一种器官芽，其为利用(1)～(15)中任一项记载的方法制作。
(17)一种组织或内脏器官的制作方法，该方法包括将(16)记载的器官芽移植到非人动物、使之分化为组织或内脏器官。
(18)一种器官芽的移植方法，该方法包括将(16)记载的器官芽移植到人或非人动物。
(19)一种组织或内脏器官的再生或功能恢复方法，该方法包括将(16)记载的器官芽移植到人或非人动物、使之分化为组织或内脏器官。
(20)一种非人嵌合动物的制作方法，该方法包括将(16)记载的器官芽移植到非人动物、使之分化为组织或内脏器官。
(21)一种方法，该方法使用选自(16)记载的器官芽、利用(17)记载的方法制作的组织及内脏器官、以及利用(20)记载的方法制作的非人嵌合动物中的至少一种来评价药剂。
作为此前的关于造血细胞和肝细胞的成熟的见解，提出过在小鼠的生长过程中从造血细胞产生的细胞因子(OSM)会促进肝细胞的成熟的报告(非专利文献2：Kamiya A.，等，EMBO J.1999 18：2127-3、非专利文献3：Kinoshita T.，等，Proc Natl Acad Sci U SA.1999 96：7265-70(1999))。然而，在以往的平面培养中，尽管已经添加了OSM，分化诱导也仍然完全不充分。另一方面，本发明人等的专利(专利文献1：人组织、内脏器官的制作方法WO2013/047639 A1)是由3种细胞来制作器官芽，然而对于可以由包含造血细胞的4种以上的细胞形成器官芽、进一步促进其成熟的方法论，完全没有记载，也没有暗示。由此，对于此前向在体外重建的器官芽中导入第四细胞(造血细胞)、进而显示出对作为目标的功能细胞的成熟的重要性的见解而言有很大的新颖性、创造性。
发明效果
此前，本发明人等成功地构建了利用以往的技术完全没有达成的、用于制成恰当地配置了血管系统的人组织、内脏器官的基础技术(人组织、内脏器官的制作方法)。本发明为了使上述技术飞跃性地发展，新加入造血系细胞这样的参与者，由此通过直接或间接的细胞作用，实现了大幅度促进作为目的的功能细胞的成熟的方法。是实现此前不够充分的代谢功能等、体外的功能成熟的全新的技术。具体而言，利用本技术，对于肝细胞，可以观察到约3-4倍(以白蛋白分泌为指标)的功能提高。由此，可以期待利用以往必需的细胞数的1/3～1/4量发挥同等的功能，其结果是，能够将制造成本压缩为1/3-1/4。如果根据现阶段的成人末期肝衰竭患者每1人的治疗成本来换算，则可以期待实现大约600万日元左右的减少。
此外，作为本发明的功能提高的结果，由于可以期待以往难以评价的药物代谢功能等的检测，因此还能够应用于体外的创制新药筛选。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请、即日本特愿2015‐251140的说明书和/或附图中记载的内容。
附图说明
图1是从脐带血中使用细胞分选仪对包含造血干细胞的细胞部分的分离。
图2是包含血液细胞的肝芽制作(左)、利用包含血液细胞的肝芽向培养基中分泌白蛋白的借助ELISA的测定(右)。
图3是包含血液细胞的肝芽制作中的肝分化标记的基因表达的基于定量PCR法的研究。
图4是包含血液细胞的肝芽制作中的血液细胞添加量的研究。
图5是依赖于血液细胞添加量的白蛋白分泌。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明提供一种器官芽的制作方法，该方法包括在血液细胞的存在下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞、以及组织或内脏器官细胞。
本发明中所谓“器官芽”，是可以通过成熟而分化为器官的结构体，是指包括组织或内脏器官细胞、血管内皮细胞、间充质系细胞(未分化间充质系细胞或由其分化出的细胞)、以及血液细胞这四种细胞的结构体。对于某个结构体是否为器官芽，例如可以通过如下操作来确认，即，将该结构体移植到生物体中，调查是否可以分化为目的器官(如果分化为目的器官则可以判断为器官芽。)，以及/或者调查该结构体是否包含全部的上述四种细胞(如果包含全部四种细胞则可以判断为器官芽。)。器官芽例如可以是分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髄等器官的器官芽等，优选分化为肝脏的器官芽(肝芽)、分化为胰脏的器官芽(胰芽)、分化为肠道的器官芽等分化为内胚层性器官的器官芽。对于某个结构体是否为分化为内胚层性器官的器官芽，可以通过调查成为标记的蛋白质的表达来确认(如果表达出后述的标记蛋白质的任意一个或多个，则可以判断为器官芽。)。例如，就肝芽而言，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记，就胰芽而言，PDX1、SOX17、SOX9等成为标记，就分化为肠道的器官芽而言，CDX2、SOX9等成为标记。在本领域技术人员间所使用的术语中，肝芽、肝憩室、肝类器官、胰腺(背侧或腹侧)芽、胰腺憩室、胰腺类器官、肠芽、肠憩室、肠类器官(K.Matsumoto，等Science.19；294(5542)：559-63.(2001))等包含于本发明的器官芽中。
本发明中，所谓“血液细胞”，是指从生物体内分离出的细胞或从ES细胞、iPS细胞等干细胞分化诱导出的细胞、或者通过向分化细胞中导入基因而直接重编程得到的细胞，并且是具有下述的血液细胞的特征(例如表达CD34、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD41、CD45、CD56、CD66b、或CD235a、CD38、CD90、CD49f、VEGFR2、CD43、CD71、GPA(血型糖蛋白A)、CD42b、c-kit、CD150、Sca-1、Ter119等任意一种)的细胞。对于某个细胞是否为血液细胞，可以通过调查CD34、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD41、CD45、CD56、CD66b、或CD235a、CD38、CD90、CD49f、VEGFR2、CD43、CD71、GPA(血型糖蛋白A)、CD42b、c-kit、CD150、Sca-1、Ter119等的表达来确认。本发明中所用的血液细胞可以是分化了的细胞，也可以是未分化的细胞，然而优选包含造血前体细胞、造血干细胞等未分化的造血细胞。作为未分化造血细胞，可以例示出来自于人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性干细胞(ES细胞)等多能性干细胞的血液细胞、从血液(脐带血、骨髄血、末梢血等)中采集的血液细胞、从其他分化细胞直接分化转换(直接重编程)的血液细胞等。后述的实施例中认为，通过取得脐带血的单核细胞(monocyte)部分，可以浓缩造血前体细胞、造血干细胞。在本领域技术人员间所使用的术语当中，造血干细胞、血液干细胞、造血前体细胞、血液前体细胞、骨髄系前体细胞、粒细胞/单核细胞系前体细胞、粒细胞系前体细胞、粒细胞、骨髄原始细胞、前骨髄细胞、骨髄细胞、后骨髄细胞、杆状核细胞、分叶核细胞(分葉核球)(中性粒细胞)、单核细胞系前体细胞、单核细胞、巨噬细胞、组织细胞(組織球)、肝枯否氏细胞(Kupper cell)、肺胞巨噬细胞、小胶质细胞、破骨细胞、类上皮细胞、巨细胞(朗格罕氏巨细胞、异物巨细胞、图顿型巨细胞)、树状细胞、朗格罕氏细胞、骨髄性单核细胞、骨髄原始细胞、嗜碱性前骨髄球、嗜碱性骨髄细胞、嗜碱性后骨髄细胞、嗜碱性粒细胞、骨髄原始细胞、嗜酸性前骨髄细胞、嗜酸性骨髄细胞、嗜酸性后骨髄细胞、嗜酸性杆状核细胞、嗜酸性分叶核细胞(嗜酸性)、巨核原始细胞、巨核细胞、成红血细胞、网织红血球、肥大细胞前体等包含于本发明的血液细胞中。血液细胞主要使用来自于人的血液细胞，然而也可以使用来自于人以外的动物(例如实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的血液细胞。
本发明中所谓“血管内皮细胞”，是指构成血管内皮的细胞、或可以分化为此种细胞的细胞。对于某个细胞是否为血管内皮细胞，可以通过调查是否表达出标记蛋白质、例如TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD41来确认(如果表达出所述标记蛋白质的任意一种或多种，则可以判断为血管内皮细胞。)。本发明中所用的血管内皮细胞可以是分化了的细胞，也可以是未分化的细胞。对于血管内皮细胞是否为分化了的细胞，可以利用CD31、CD144来确认。在本领域技术人员间所使用的术语当中，内皮细胞、脐静脉内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞、血管性祖细胞、成血管细胞(HJ.joo，等Blood.25；118(8)：2094-104.(2011))等包含于本发明的血管内皮细胞中。优选的血管内皮细胞是来自于脐带静脉的血管内皮细胞。血管内皮细胞可以从血管采集、或从人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性干细胞(ES细胞)等多能性干细胞依照公知的方法制作。血管内皮细胞主要使用来自于人的血管内皮细胞，然而也可以使用来自于人以外的动物(例如实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的血管内皮细胞。
本发明中所谓“间充质系细胞”的概念是指，主要存在于来自于中胚层的结缔组织中、形成以组织发挥作用的细胞的支撑结构的结缔组织细胞，也是包括虽然确定了向间充质系细胞分化的命运、然而还没有分化为间充质系细胞的细胞的概念。本发明中所用的间充质系细胞可以是分化了的细胞，也可以是未分化的细胞。对于某个细胞是否为未分化间充质系细胞，可以通过调查是否表达出标记蛋白质、例如Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin来确认(如果表达出所述标记蛋白质的任意一种或多种，则可以判断为未分化间充质系细胞。)。另外，对于没有表达出前项的标记的任意一种的间充质系细胞可以判断为分化间充质系细胞。在本领域技术人员间所使用的术语当中，间充质干细胞、间充质祖细胞、间充质细胞(R.Peters，等PLoS One.30；5(12)：e15689.(2010))等包含于本发明的间充质系细胞中。优选的间充质系细胞是来自于骨髄的间充质系细胞(特别是间充质系干细胞)。间充质系细胞可以从骨髄、脂肪组织、胎盘组织、脐带组织、牙髓等组织中采集、或从人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性干细胞(ES细胞)等多能性干细胞依照公知的方法制作。间充质系细胞主要使用来自于人的间充质系细胞，然而也可以使用来自于人以外的动物(例如实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的未分化间充质系细胞。
本发明中所谓“组织或内脏器官细胞”，是指构成组织或内脏器官的功能细胞、或向功能细胞分化的未分化细胞。作为“未分化的组织或内脏器官细胞”，例如可以是能够分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髄等器官的细胞等，可以举出能够分化为脑、脊髄、肾上腺髄质、表皮、毛发/爪/皮肤腺、感觉器官、末梢神经、水晶体等外胚层性器官的细胞、能够分化为肾脏、输尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨架、真皮、结缔组织、中皮等中胚层性器官的细胞、能够分化为肝脏、胰脏、肠道、肺、甲状腺、副甲状腺、尿路等内胚层性器官的细胞等。对于某个细胞是否为能够分化为外胚层性器官、中胚层性器官或内胚层性器官的细胞，可以通过调查成为标记的蛋白质的表达来确认(如果表达出标记蛋白质的任意一种或多种，则可以判断为能够分化为内胚层性器官的细胞。)。例如，就能够分化为肝脏的细胞而言，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记，就能够分化为胰脏的细胞而言，PDX1、SOX17、SOX9等成为标记，就能够分化为肠道的细胞而言，CDX2、SOX9等成为标记，就能够分化为肾脏的细胞而言，SIX2、SALL1成为标记，就能够分化为心脏的细胞而言，NKX2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA成为标记，就能够分化为血液的细胞而言，C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4成为标记，就能够分化为脑或脊髄的细胞而言，HNK1、AP2、NESTIN等成为标记。在本领域技术人员间所使用的术语当中，成肝细胞、肝祖细胞、成胰腺细胞、肝前体细胞、成胰腺细胞、胰腺祖细胞、胰腺祖细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、肠祖细胞、肠前体细胞、间介中胚层、后肾间充质前体细胞、多能性肾单位祖细胞、肾祖细胞、心脏中胚层、心血管祖细胞、心脏祖细胞(JR.Spence，等Nature.；470(7332)：105-9.(2011)、Self，等EMBOJ.；25(21)：5214-5228.(2006)、J.Zhang，等CirculationResearch.；104：e30-e41(2009)、G.Lee，等Nature Biotechnology 25，1468-1475(2007))等包含于本发明的未分化的组织或内脏器官细胞中。未分化的组织或内脏器官细胞可以从组织或内脏器官采集、或从人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚性干细胞(ES细胞)等多能性干细胞依照公知的方法制作。另外，未分化的组织或内脏器官细胞也可以是从iPS细胞等多能性干细胞向组织或内脏器官的分化处于中途阶段的细胞，例如可以是原始肠内胚层细胞(Primitive Gut Endoderm Cells：PGECs)(日本专利第5777127号)等。PGECs能够向肝细胞、胰细胞及肠细胞分化(分化功能高)，不表达与癌的恶性度相关的标记(安全性高)，可以从iPS细胞在非饲养环境下分化诱导而制备，因此具有还可以临床应用的优点。而且，PGECs能够大量制备。PGECs可以利用日本专利第5777127号中记载的方法制备。或者可以是通过向无血清培养基中添加激活素(アクチビン)来培养iPS细胞等多能性干细胞而诱导为CXCR4及E-钙粘蛋白两阳性的内胚层系细胞而得，此外也可以是通过将所得的内胚层系细胞添加BMP4、FGF2并培养2天而得的CXCR4阴性HNF4α阳性的肝脏内胚层集团。除此以外，例如，能够分化为肝脏的内脏器官细胞可以依照K.Si-Taiyeb，等Hepatology，51(1)：297-305(2010)、T.Touboul，等Hepatology.51(5)：1754-65.(2010)来制作，能够分化为胰脏的内脏器官细胞可以依照D.Zhang，等Cell Res.；19(4)：429-38.(2009)来制作，能够分化为肠道的内脏器官细胞可以依照J.Cai，等J Mol Cell Biol.；2(1)：50-60(2010)、R.Spence，等Nature.；470(7332)：105-9.(2011)来制作，能够分化为心脏的内脏器官细胞可以依照J.Zhang，等Circulation Research.；104：e30-e41(2009)来制作，能够分化为脑或脊髄的细胞可以依照G.Lee，等Nature Biotechnology 25，1468-1475(2007)来制作。作为“分化了的组织或内脏器官细胞”，可以例示出胰脏的内分泌细胞、胰脏的胰腺管上皮细胞、肝脏的肝细胞、肠道的上皮细胞、肾脏的尿细管上皮细胞、肾脏的肾小球上皮细胞、心脏的心肌细胞、血液的淋巴细胞或粒细胞、红细胞、脑的神经细胞或神经胶质细胞、脊髄的神经细胞或许旺细胞等。组织或内脏器官细胞主要使用来自于人的细胞，然而也可以使用来自于人以外的动物(例如实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，是小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)的组织或内脏器官细胞。
共培养中的四种细胞的培养比只要是可以形成器官芽的范围内，就没有特别限定，合适的细胞的个数比为组织或内脏器官细胞：血管内皮细胞：间充质系细胞：血液细胞＝10：10～5：2～0.1：2～50。可以对组织或内脏器官细胞25万个左右、血管内皮细胞17万个左右、间充质系细胞2.5万个左右、血液细胞10万个左右进行共培养，形成大小为50～250微米左右的器官芽。
培养时使用的培养基只要是可以形成器官芽的培养基，则无论是何种都可以，然而优选使用血管内皮细胞培养用的培养基、组织或内脏器官细胞培养用的培养基、混合了所述2个培养基的培养基等。血管内皮细胞培养用的培养基无论使用何种都可以，然而优选使用包含hEGF(重组人上皮细胞生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、氢化可的松、bFGF、抗坏血酸、IGF1、FBS、抗生素(例如庆大霉素、两性霉素B等)、肝素、L-谷氨酰胺、酚红、BBE的至少1种的培养基。作为血管内皮细胞培养用的培养基，可以使用EGM-2BulletKit(Lonza公司制)、EGM BulletKit(Lonza公司制)、VascuLife EnGS Comp Kit(LCT公司制)、人内皮-SFM基础生长培养基(Invitrogen公司制)、人微小血管内皮细胞增殖培养基(TOYOBO公司制)等。组织或内脏器官细胞培养用的培养基无论使用何种都可以，然而在内脏器官细胞为肝细胞的情况下，优选使用包含抗坏血酸、BSA-FAF、胰岛素、氢化可的松、GA-1000的至少1种的培养基。作为肝细胞培养用的培养基，可以使用从HCM BulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基、向RPMI1640(Sigma-Aldrich公司制)中加入了1％B27Supplements(GIBCO公司制)和10ng/mL hHGF(Sigma-Aldrich公司制)等。关于人肝芽的形成，当将GM BulletKit(Lonza公司制)与从HCM BulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基以1：1混合，向所得的培养基中添加地塞米松、抑瘤素M、HGF时，即判明对于肝芽的成熟有效果。
虽然在细胞的培养时，无需使用支架材料，然而最好在间充质系细胞能够收缩的凝胶状支撑体上培养四种细胞的混合物。
间充质系细胞的收缩可以通过(利用显微镜、或肉眼)在形态学上观察立体组织形成、或伴随着利用药勺等的回收显示出具有保持组织的形状的强度等(Takebe等.Nature499(7459)，481-484、2013))来确认。
支撑体可以是具有合适的硬度(例如杨氏模量为200kPa以下(涂布上Matrigel胶(マトリゲル)的形状为平坦的凝胶的情况等)，支撑体的合适的硬度可以根据涂布和形状而变化。)的凝胶状基材，作为此种基材，可以例示出水凝胶(例如丙烯酰胺凝胶、明胶、Matrigel胶等)等，然而并不限定于它们。需要说明的是，根据作为目的的集合体的形状、尺寸、量，支撑体的硬度未必均匀，可以在硬度上设定空间的、时间的梯度或进行图案化。在支撑体的硬度均匀的情况下，支撑体的硬度优选为100kPa以下，更优选为1～50kPa。凝胶状支撑体可以为平面，或者凝胶状支撑体的进行培养的一侧的截面可以是U或V字的形状。通过使凝胶状支撑体的进行培养的一侧的截面为U或V字的形状，细胞就会集聚在支撑体的培养面，能够以更少数量的细胞和/或组织形成细胞集合体，因此有利。另外，也可以对支撑体实施化学的、物理的修饰。作为修饰物质，可以例示出Matrigel胶、层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白等。
在凝胶状培养支撑体的硬度中设定空间的梯度的一例是中心部的硬度大于周边部的硬度的凝胶状培养支撑体。中心部的硬度适合为200kPa以下，周边部的硬度只要小于中心部即可，支撑体的中心部和周边部的合适的硬度可以根据涂布和形状而变化。在凝胶状培养支撑体的硬度中设定空间的梯度的另一例是周边部的硬度大于中心部的硬度的凝胶状培养支撑体。
图案化了的凝胶状培养支撑体的一例是具有1个以上的中心部的硬度大于周边部的硬度的图案的凝胶状培养支撑体。中心部的硬度适合为200kPa以下，周边部的硬度只要小于中心部即可，支撑体的中心部和周边部的合适的硬度可以根据涂布和形状而变化。图案化了的凝胶状培养支撑体的另一例是具有1个以上的周边部的硬度大于中心部的硬度的图案的凝胶状培养支撑体。周边部的硬度适合为200kPa以下，中心部的硬度只要小于周边部即可，支撑体的中心部和周边部的合适的硬度可以根据涂布和形状而变化。
培养时的温度没有特别限定，优选设为30～40℃，更优选设为37℃。
培养期间没有特别限定，优选设为3～10天，更优选设为6天。
利用本发明的方法制作出的器官芽与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞、以及组织或内脏器官细胞而制作出的器官芽相比，功能可以提高。
例如，在器官芽为肝芽的情况下，利用本发明的方法制作出的肝芽与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞及组织或内脏器官细胞而制作出的肝芽相比，白蛋白的分泌能力可以提高。另外，利用本发明的方法制作出的肝芽与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞及组织或内脏器官细胞而制作出的肝芽相比，肝细胞分化标记基因的表达可以升高。作为肝细胞分化标记基因，可以例示出甲胎蛋白、白蛋白、CYP3A7、色氨酸代谢酶TDO2、钠/牛磺胆酸协同转运蛋白等，然而当然并不限定于它们。
本发明还提供利用上述的方法制作出的器官芽。
通过将利用上述的方法制作出的器官芽移植到非人动物，使之在该非人动物内成熟，就可以制作组织或内脏器官。即，本发明还提供一种组织或内脏器官的制作方法，该方法包括将利用上述的方法制作出的器官芽移植到非人动物、使之分化为组织或内脏器官。作为所使用的非人动物，可以举出实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，可以举出小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等。另外，为了避免免疫排斥反应，所使用的非人动物优选为免疫缺陷动物。
因而，本发明还提供一种器官芽的移植方法，该方法包括将利用上述的方法制作出的器官芽移植到人或非人动物。关于器官芽的移植部位，只要能够移植，则无论是哪个部位都可以，可以例示出颅内、肠系膜、肝脏、脾脏、肾脏、肾被膜下、门静脉上等。在移植到颅内的情况下，移植在体外制作出的1～3个左右的5mm大的器官芽即可，在移植到肠系膜的情况下，移植在体外制作出的1～6个左右的5mm大的器官芽即可，在移植到门静脉上的情况下，移植在体外制作出的1～20个左右的5mm大的器官芽即可。在移植到肾被膜的情况下，移植在体外制作出的1～5个左右的5mm大的器官芽即可，在移植到肝脏、脾脏、肾脏的情况下，移植在体外制作出的100～200个左右的100μm大的器官芽即可。
如上所述地制作出的组织及内脏器官可以用于创制新药筛选、再生医疗等。
因而，本发明提供一种组织或内脏器官的再生或功能恢复方法，该方法包括将利用上述的方法制作出的器官芽移植到人或非人动物、使之分化为组织或内脏器官。作为非人动物，可以举出实验动物、玩赏动物、役用动物、赛马、斗犬等中所利用的动物，具体而言，可以举出小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐鱼、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等。
利用本发明的方法制作出的器官芽可以被制剂化，以再生医疗用组合物的形态使用。可以将本发明的组合物移植到生物体内，制作组织或内脏器官。另外，可以将本发明的组合物移植到生物体内，进行组织或内脏器官的再生或功能恢复。
本发明的组合物被移植到生物体后，器官芽可以分化为具有血管网的组织或内脏器官。在该血管网中可以产生血管灌流。可以认为，通过在血管网中产生血管灌流，可以创制出以与成体组织同等或与之接近的高度具有有秩序的组织结构的组织、内脏器官。
在本发明的组合物中，也可以添加FGF2、HGF、VEGF等组织血管化促进剂、伴随着移植的止血用明胶海绵(商品名：Spongel、Astellas株式会社)、以及移植组织的固定中所用的Bolheal(Teijin Phama株式会社)、Beriplast(CSL Behring株式会社)、Tachocomb(CSLBehring株式会社)等组织胶粘剂等。
另外，本发明还提供一种非人嵌合动物的制作方法，该方法包括将利用上述的方法制作出的器官芽移植到非人动物、使之分化为组织或内脏器官。移植了器官芽的非人动物(例如小鼠)可以模仿器官芽的制作中所用的组织或内脏器官细胞的来源生物种(例如人)的生理功能。
此外，本发明还提供一种方法，该方法使用选自利用上述的方法制作出的器官芽、组织及内脏器官、以及非人嵌合动物中的至少一种来评价药剂。作为药剂的评价，例如可以举出药物代谢的评价(例如药物代谢分布的预测)、药效评价(例如筛选作为医药品而言有效的药剂等)、毒性评价、药物相互作用评价等。
药物代谢的评价是通过在选自利用上述的方法制作出的器官芽、组织及内脏器官、以及非人嵌合动物中的至少一种中，采集、分析施用医药品的候选化合物后的生物试样，而可以取得人型的药物代谢分布。由此就能够预测以往的技术中极难实现的人中的医药品的分布/代谢/排泄过程，可以期待能够飞跃性地加速安全且有效的医药品的开发。
对于作为医药品而言有效的药剂的筛选，通过对选自从由疾病患者确立的细胞利用上述的方法制作出的器官芽、组织及内脏器官、以及非人嵌合动物中的至少一种，施用新的医药品候选化合物，而能够进行分析。由此，就可以期待有可能能够大幅度改善以往的体外试验中不够充分的、实际中向人施用时的药效的预测精度。
对于毒性评价，通过在对选自利用上述的方法制作出的器官芽、组织及内脏器官、以及非人嵌合动物中的至少一种施用被测物质后，测定组织障碍标记等，而能够提高障碍预测的精度。
对于药物相互作用评价，可以通过如下操作来进行，即，使用选自利用上述的方法制作出的器官芽、组织及内脏器官、以及非人嵌合动物中的至少一种，施用多种药剂后，进行其后的各药剂的分布/代谢/排泄过程等药物动态或毒性评价、药效评价。
另外，也可以由利用本发明的方法制作出的组织及内脏器官创制出组织干细胞，本发明能够应用于人组织细胞、内脏器官细胞的大量创制出的细胞操作技术。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行更详细的说明。
〔实施例1〕
[方法]
1、血液细胞的制备
<脐带血的取得>
从脐带(由在横滨市立大学附属医院通过剖腹产产出的患者提供)中使用50mL注射器、18G针头进行采血。血液采集了大约40mL-50mL。
<溶血处理>
向50mL试管中加入40mL的Lysis缓冲液，加入10mL的脐带血。
搅拌并在室温下静置10分钟。
以200G进行10分钟离心分离。
再次悬浮于Lysis缓冲液10mL中，集中5根而设为50mL。
再以200G进行10分钟离心分离。
将沉淀用10mL DMEM+10％FBS悬浮，以200G进行5分钟离心分离。
再次用10mL DMEM+10％FBS悬浮，计测出细胞数。
材料
1)10×Lysis缓冲液的制作(×10液；稀释为1/10后使用。)
·NH4Cl 82.6g
·NaHCO3 11.9g
·EDTA2Na 0.378g
/1L milliQ调节至pH7.3
2)1×Lysis缓冲液的制作
用PBS(优选冷却到4℃。也可以加入2mM EDTA)稀释为×1后使用。
<PI-/CD235-细胞的分离>
对血液细胞使用碘化丙啶(PI)将死细胞染色，使用荧光标记CD235抗体将红细胞/成红血细胞染色，使用细胞分选仪分别分离出没有被染色的细胞(属于活细胞然而并非红细胞/成红血细胞的细胞)。
<单核细胞部分(MNC)细胞的分离>
使用细胞分选仪，将PI-/CD235-细胞用FSC(forward scatter：前向散射光)、以及SSC(side scatter：侧向散射光)展开，分离出相当于单核细胞部分(MNC)细胞的细胞集团。
2、肝内胚层细胞的制作
方法：
剥离未分化iPS细胞(TkDA3(由东京大学提供)、以及从脐带中独自确立的iPS细胞)并单细胞化后，在塑料盘中以5×104cells/cm2的细胞密度在RPMI+1％B27+10uM Rock抑制剂+50ng/mL Wnt3a+100ng/mL激活素A存在下培养1天。接下来，在RPMI+1％B27+50ng/mLWnt3a+100ng/mL激活素A存在下培养6天，得到肝内胚层细胞。
[结果]
1(图1、2、3)
将对肝内胚层细胞(2.5×105细胞)和来自于脐带的血管内皮细胞(1.7×105细胞)(Lonza、Basel、Switzerland)及间充质系细胞(2.5×104细胞)(Lonza、Basel、Switzerland)(10：7：1)使用细胞分选仪分离出的PI-细胞及造血干细胞/造血前体细胞被浓缩了的单核细胞部分(MNC)细胞(图1)悬浮1×105细胞，在Kuraray微孔板上制作出肝芽(liver bud)(大小：50～250微米)。培养15天后，对在各个条件下培养的肝芽的培养上清液中在24小时中分泌出的人白蛋白蛋白质量利用ELISA法进行了分析。其结果是，在添加有PI-细胞或造血干细胞/造血前体细胞被浓缩了的单核细胞部分(MNC)细胞的组中，与作为以往方法的未添加血液细胞组相比，白蛋白分泌量增加(图2)。然后回收在上述的条件下培养的培养第15天的肝芽，利用qPCR研究肝细胞分化标记(甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、CYP3A7、色氨酸代谢酶(TDO2)、钠/牛磺胆酸协同转运蛋白(NTCP))的表达，其结果是，在添加有PI-细胞或单核细胞部分(MNC)细胞的组中，与作为以往方法的未添加血液细胞组相比，基因表达量增加(图3)。
2(图4、5)
然后为了研究所添加的血液细胞的用量依赖性，对肝内胚层细胞(2.5×105细胞)和来自于脐带的血管内皮细胞(1.7×105细胞)及间充质系细胞(2.5×104细胞)(10：7：1)，在血液细胞零添加、血液细胞(PI-细胞)添加1×105细胞、2.5x105细胞、5×105细胞添加组中，研究了肝芽制作第15天的培养液(图4)中的24小时人白蛋白蛋白质分泌量。其结果是发现，与以往方法相比，人白蛋白分泌量依赖于血液细胞的细胞数地得到增强(图5)。
将本说明书中引用的全部的刊物、专利及专利申请直接作为参考并入本说明书中。
产业上的可利用性
本发明成为面向人功能细胞的工业化制造的重要的基础技术。由此，作为以难治性疾病为对象的再生医疗技术，可以应用于移植用的人组织、内脏器官的制造。可以认为，不仅可以期待能够与以往方法相比大幅度实现成本削减，而且还可以利用本技术提高体外的功能成熟，因此可以期待能够适用于以往技术中难以治疗的急性、亚急性的肝衰竭症。
此外，如果确立使用了利用本发明人为地制作的人肝脏组织的药剂评价系统，则可以大量制造创制新药开发中必需的人成熟肝细胞。
Claims (21)
1.一种器官芽的制作方法，该方法包括在血液细胞的存在下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞、以及组织或内脏器官细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
器官芽是能够通过成熟而分化为器官的结构体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞、以及组织或内脏器官细胞而制作出的器官芽相比，制作了功能提高了的器官芽。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
不使用支架材料地培养细胞。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
血液细胞包括未分化造血细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，
未分化造血细胞为造血前体细胞和/或造血干细胞。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
血液细胞来自于脐带血。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，
血液细胞为脐带血的单核细胞部分的细胞。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
组织或内脏器官细胞是由多能性干细胞诱导出的未分化细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，
多能性干细胞为人工多能性干细胞。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，
多能性干细胞来自于人。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
器官芽为肝芽。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，
与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞及组织或内脏器官细胞而制作出的肝芽相比，制作了白蛋白的分泌能力提高了的肝芽。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，
与在不存在血液细胞的条件下、在体外培养血管内皮细胞、间充质系细胞及组织或内脏器官细胞而制作出的肝芽相比，制作了肝细胞分化标记基因的表达升高了的肝芽。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，
肝细胞分化标记基因是选自甲胎蛋白、白蛋白、CYP3A7、色氨酸代谢酶TDO2、以及钠/牛磺胆酸协同转运蛋白中的至少1个标记。
16.一种器官芽，其利用权利要求1～15中任一项所述的方法制作而得。
17.一种组织或内脏器官的制作方法，该方法包括将权利要求16所述的器官芽移植到非人动物、使之分化为组织或内脏器官。
18.一种器官芽的移植方法，该方法包括将权利要求16所述的器官芽移植到人或非人动物。
19.一种组织或内脏器官的再生或功能恢复方法，该方法包括将权利要求16所述的器官芽移植到人或非人动物、使之分化为组织或内脏器官。
20.一种非人嵌合动物的制作方法，该方法包括将权利要求16所述的器官芽移植到非人动物、使之分化为组织或内脏器官。
21.一种方法，该方法使用选自权利要求16所述的器官芽、利用权利要求17所述的方法制作出的组织及内脏器官、以及利用权利要求20所述的方法制作出的非人嵌合动物中的至少一种来评价药剂。
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