KR101162097B1 - 혈청조제방법 및 혈청조제장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사용하는 혈액의 선도에 관계없이 높은 배양효율을 발휘할 수 있는 혈청을 한번에 대량으로 얻을 수 있는 혈청조제방법 및 혈청조제장치를 제공한다.
적어도 혈소판을 함유하는 혈액으로부터 혈청을 조제하는 혈청조제방법에 있어서, 혈액 중의 혈소판의 세포막을 파괴하는 처리를 행하는 혈소판처리공정을 마련하였다. 혈소판처리공정 후에는, 혈액 중의 이열성 단백질을 석출시키는 석출공정 및 이 석출공정에 의해 석출한 이열성 단백질을 제거하는 제거공정을 마련하는 것이 바람직하다.

Description

혈청조제방법 및 혈청조제장치{SERUM PREPARATION METHOD AND SERUM PREPARATION APPARATUS}

본 발명은 채취된 혈액으로부터 혈청을 조제하는 혈청조제방법 및 혈청조제장치에 관한 것이다.

현재, 재생 의료분야에서는 대상자로부터 채취한 줄기세포를 체외에서 증식 또는 분화시켜 대상자에게 이식하여 대상자의 조직 재생을 촉진하는 연구가 이루어지고 있다.

줄기세포의 체외 배양증식에서, 배지에 혈청을 첨가하면 배양효율을 향상시키는 것으로 알려져 있다.

혈청을 조제하는 방법으로는, 예를 들면 유리 분말로 이루어진 혈액응고 촉진개체가 수용된 채혈관(採血管)을 이용하는 방법이 특허문헌 1에 개시되어 있다. 그리고, 채취한 혈액을, 예를 들면 유리 비드로 이루어진 혈액응고 촉진개체와 접촉시키는 것에 의해, 혈소판을 활성화시켜 세포증식인자를 방출시킨 후에 혈청을 분리하는 방법이 특허문헌 2에 개시되어 있다.

특허문헌 1 특허공개 2000-000228 호 공보

특허문헌 2 특허 제 3788479 호

그러나, 특허문헌 1에 개시되어 있는 방법은, 혈액 검사를 목적으로 하기 때문에 용량이 작은 채혈관으로부터 혈청을 조제하는 것을 전제로 한다. 특허문헌 1에 개시된 방법을 이용하여 혈청을 조제할 경우, 줄기세포 배양에 필요한 양을 확보하기 위해서는 몇 번에 걸쳐 조제 조작을 해야 하므로 실용적이지 못하다.

그리고, 세포배양의 배양효율은 혈청 중에 포함되는 세포증식인자의 양에 의존한다. 만일 한번에 다량의 혈청을 얻을 수 있었다고 해도, 세포증식인자의 양이 적으면 배양효율을 향상시키기 어렵다.

세포증식인자는 혈소판에 함유되어 있으며, 이것으로부터 방출되는 세포증식인자의 양은 혈소판의 활성상태에 의존하고, 혈소판의 활성상태는 혈소판의 선도(鮮度)에 의존한다. 특허문헌 2에 개시되어 있는 방법은, 혈액을 유리 비드와 접촉시켜 혈소판을 자발적으로 활성화시키는 방법이기 때문에, 사용하는 혈액이 오래되면 혈액 중의 혈소판의 양으로부터 추측되는 양의 세포증식인자를 얻기 어려우며, 높은 배양효율을 발휘할 수 있는 혈청을 한번에 대량으로 얻을 수 없다.

또한, 특허문헌 2의 방법은, 혈액을 유리 비드와 접촉시키는 것에 의해, 혈소판을 활성화시키는 동시에 유리 비드에 혈액응고인자를 부착시키고, 제거해 나간다. 이로 인해, 헌혈로 채취된 혈액처럼 항응고 처리된 혈액에서는, 혈액응고인자를 유리 비드에 부착시키고 제거할 수 없기 때문에, 이러한 혈액에 대해서는 적용하기가 비교적 어렵다.

본 발명은 이상과 같은 과제를 감안하여 이루어진 것으로서, 사용하는 혈액의 선도에 관계없이 높은 배양효율을 발휘할 수 있는 혈청을 한번에 대량으로 얻을 수 있는 혈청조제방법 및 혈청조제장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 오래된 혈액이라도 혈소판의 세포막을 파괴하는 것에 의해, 혈소판의 양으로부터 추측되는 양의 세포증식인자를 얻을 수 있다는 것, 즉 혈소판이 함유하고 있는 거의 모든 세포증식인자를 얻을 수 있다는 것, 그리고, 항응고 처리가 이루어진 혈액이라도 소정의 처리를 행하면 사용할 수 있다는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 구체적으로는 이하의 발명이다.

(1) 적어도 혈소판을 함유하는 혈액으로부터 혈청을 조제하는 혈청조제방법으로서, 상기 혈액 중의 혈소판의 세포막을 파괴하는 처리를 행하는 혈소판처리공정을 포함하는 혈청조제방법.

(2) 상기 혈소판처리공정은, 상기 혈액에 열처리, 초음파처리, 원심분리처리, 가압·감압처리 또는 유리 비드에 의한 혼화·교반처리 중 적어도 어느 하나의 처리를 행하는 공정인 청구항 (1)에 기재된 혈청조제방법.

(3) 상기 혈액으로서, 항응고 처리가 이루어진 혈액을 사용하는 청구항 (1)에 기재된 혈청조제방법.

(4) 상기 혈소판처리공정을 거친 혈액 중의 이열성(易熱性) 단백질을 석출시키는 석출공정을 더 포함하는 청구항 (1)에 기재된 혈청조제방법.

(5) 상기 석출공정에 의해 석출한 상기 이열성 단백질을 제거하는 제거공정을 더 포함하는 청구항 (4)에 기재된 혈청조제방법.

(6) 청구항 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 혈청조제방법에 의해 조제된 혈청.

(7) 적어도 혈소판을 함유하는 혈액으로부터 혈청을 조제하는 혈청조제장치로서, 상기 혈액을 저류(貯留)하는 혈액저류부와, 해당 혈액저류부에 무균(無菌)적이면서도 기밀(氣密)하게 연결되어, 상기 혈액저류부에 저류된 혈액으로부터 분리된 혈청을 수용하는 성분수용부를 구비한 혈청조제장치.

(8) 상기 혈액저류부는, 전혈(全血))을 저류하는 전혈저류부와, 해당 전혈저류부에 무균적이면서도 기밀하게 연결되어, 상기 전혈저류부에 저류된 전혈로부터 분리된 다혈소판 혈장을 저류하는 혈장저류부를 구비한 청구항 (7)에 기재된 혈청조제장치.

(9)상기 혈액저류부는, 다혈소판 혈장을 저류하는 혈장저류부인 청구항 (7)에 기재된 혈청조제장치.

(10)상기 혈액저류부와 상기 성분수용부는, 이들을 분리 및 접속가능한 접속부에 의해 접속되는 청구항 (7) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 혈청조제장치.

여기에서, 본 발명에 있어서의 "혈액"이란, 적어도 혈소판을 포함하고, 혈구(적혈구, 백혈구)와 액체성분인 혈장(혈청)으로 이루어진 전혈, 및 이들 중 적어도 1 종을 포함한 액체(예를 들면, 성분헌혈로서 채취된 혈액)을 말한다.

그리고, "혈청"이란, 채취한 혈액을 방치하면 유동성이 저하되고, 그 후에 붉은 응고 덩어리(혈병)로부터 분리되는 담황색의 액체, 또는 세포증식인자를 많이 포함하는 담황색 혈액의 액체 성분을 말한다.

그리고, "다혈소판 혈장"이란, 보통의 전혈 중의 혈소판 농도보다 더 많은 혈소판을 포함하는 혈액의 액체 성분을 말한다.

본 발명에 의하면, 사용하는 혈액의 선도에 관계없이 높은 배양효율을 발휘할 수 있는 혈청을 한번에 대량으로 얻을 수 있는 혈청조제방법 및 혈청조제장치의 제공이 가능해진다.

또한, 본 발명에 의하면, 예를 들면 성분헌혈로서 채취된 혈액처럼 항응고 처리가 이루어진 혈액이라도 혈청을 조제할 수 있기 때문에, 건강상의 문제로 인해 전혈을 채취하기 힘든 환자인 경우에도 신체에 부담을 주지 않고 혈청 제조가 가능해진다.

도 1은 본 발명의 제 3 실시형태에 따른 혈청조제장치를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 제 3 실시형태에 따른 혈청조제장치에 의한 혈액채취에서부터 혈청보존에 이르기까지의 순서를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 제 3 실시형태에 따른 혈청조제장치의 전혈저류부(11) 내에서 조제된 다혈소판 혈장(71)을 혈장저류부(12)에 도출하는 방법을 나타낸 단면도이다.
도 4는 본 발명의 제 4 실시형태에 따른 혈청조제장치에 있어서, 혈장저류부가 분리된 상태를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 제 4 실시형태에 따른 혈청조제장치에 있어서, 혈장저류부가 접속된 상태를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 제 4 실시형태에 따른 혈청조제장치의 변형예를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 제 5 실시형태에 따른 혈청조제장치를 나타낸 도이다.
도 8은 도 7의 부분확대도이다.
도 9는 실시예 2 및 3에 있어서, 초음파 처리시간과 혈소판 잔존율(%)의 관계를 나타낸 도이다.

이하에서는 본 발명의 실시형태에 대해 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정되지 않으며, 본 발명의 목적 범위 내에서 적절히 변경을 가하여 실시할 수 있다. 한편, 설명이 중복되는 부분에 대해서는 적절히 설명을 생략하지만, 발명의 취지를 한정하는 것은 아니다.

<제 1 실시형태>

[혈청조제방법]

본 발명은 적어도 혈소판을 함유하는 혈액으로부터 혈청을 조제하는 혈청조제방법으로서, 상기 혈액 중의 혈소판의 세포막을 파괴하는 혈소판처리공정을 포함하는 혈청조제방법이다.

혈소판이 자발적으로 방출할 수 있는 세포증식인자의 양은 혈소판의 선도에 의존한다. 혈액 중의 혈소판에는 "활성이 높고, 젊은 혈소판"과 "활성이 낮고, 늙은 혈소판"이 혼재되어 있으며, "젊은 혈소판"은 자발적으로 방출할 수 있는 세포증식인자의 양도 많다. 채혈로부터 시간이 지날수록 "늙은 혈소판"의 양도 많아지기 때문에, 오래된 혈액을 사용하여 혈청을 제조하면 세포증식인자의 양이 적은 혈청이 되어버린다. 그러나, 본 실시형태에 따른 발명에 의하면, 혈소판의 세포막을 파괴하는 "혈소판처리공정"을 마련함으로써, 사용하는 혈액(혈소판)의 선도에 관계없이, 혈소판의 양으로부터 상정되는 거의 모든 세포증식인자를 얻을 수 있다. 이에 의해, 배양효율이 높은 혈청을 얻을 수 있다.

"혈소판처리공정"으로는, 혈액에 열처리, 초음파처리, 원심분리처리, 가압·감압처리 등, 물리적인 부하를 주는 처리를 행하는 것을 들 수 있다. 이 중에서도, 효율적으로 세포막을 파괴할 수 있다는 점에서, 열처리나 초음파처리를 행하는 것이 바람직하다. 열처리로는 구체적으로 동결융해처리를 들 수 있다.

동결융해처리는, 동결과 융해공정을 적어도 1회 이상 실시하는 처리이다. 동결공정에 있어서의 동결온도는 -196 ℃ 내지 -1 ℃, 바람직하게는 -80 ℃ 내지 -5 ℃이며, 동결상태 유지시간은 용량에 따라 다르지만 1초 이상인 것이 바람직하다. 그리고, 융해공정에 있어서의 융해온도는 0 ℃ 내지 56 ℃, 바람직하게는 4 ℃ 내지 37 ℃이며, 융해상태 유지시간은 용량에 따라 다르지만 1초 이상인 것이 바람직하다.

또한, 초음파처리는, 그 대상물에 대한 초음파를 음압계로 측정했을 때, 5 mV 이상의 음압이 얻어지는 조건에서 5 분간 내지 60 분간, 바람직하게는 10 분간 내지 30 분간 초음파처리를 행한다. 본 발명에 있어서, 초음파는 통상의 초음파 발생장치를 이용하여 발생시킨다.

원심분리처리는, 혈액을 혈액백 등의 용기에 수용하고, 이 혈액이 수용된 용기를, 10,000 내지 100,000 G, 5 내지 600 분의 조건으로 원심분리를 행한다. 한편, 혈소판처리공정으로서, 원심분리처리를 채용할 경우에는, 혈액으로서 다혈소판 혈장을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 가압·감압처리는, 혈액에 3 내지 275 MPa의 비교적 높은 압력을 가하고, 그 후, 감압하는 조작을 적어도 1회 실시한다. 이에 의해, 효율적으로 혈소판의 세포막을 파괴할 수 있다.

물리적인 부하를 가하는 처리로서는, 예를 들면, 혈액 중에 유리 비드를 혼화시키고, 이 유리 비드가 혼화된 혈액을 원심분리기 등에 의해 교반하는 혼화·교반처리를 들 수 있다.

이들 혈액처리공정은, 채취된 혈액이 저류되어 있는 혈액백 등의 용기에서 그대로 실시하는 것이 바람직하다. 이에 의해, 채혈 또는 처리된 혈액이 외기(外氣)에 접촉되어 오염되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 용기를 바꿔 옮길 필요가 없기 때문에 공정을 간략화할 수 있다.

본 실시형태에 있어서, "혈액"은 적어도 혈소판을 함유하고 있으면 전혈이어도 되고, 다혈소판 혈장처럼 일부 혈액성분이어도 되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 해당 혈액은, 예를 들면 채혈관에 의해 채취된 몇 ml 정도의 혈액이어도 되지만, 한번에 다량의 혈청을 제조할 경우에는, 소위 혈액백에 의해 채혈된 몇백 ml 내지 몇천 ml의 혈액을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 헌혈로 채혈된 혈액처럼 항응고 처리가 이루어진 것이어도 된다. 여기에서, "항응고 처리"란, 채취한 혈액에 CPD액(Citrate-Phosphate-Dextrose solution)이나 ACD-A액(Acid-Citrate-Dextrose-A solution) 등의 항응고제를 첨가하는 것을 말한다. 항응고제는 미리 채혈된 혈액을 저류하는 혈액백에 첨가되어 있는 것이 바람직하다. 이 항응고제는 " 혈소판처리공정"을 거친 후의 혈액에, 염화칼슘 등에서 유래한 칼슘 이온을 첨가하여 중화하는 것에 의해 제거할 수 있다.

본 실시형태는 채취된 혈액에 항응고제가 첨가되어 있기 때문에, 이 상태로는 피브리노겐 등의 이열성 단백질을 함유한 혈액성분이 만들어지게 된다. 혈청이 이열성 단백질을 함유한 상태이면, 피브린의 석출이 발생하여 세포배양을 하기 어려워진다. 그러므로, 상기 혈소판처리공정을 거친 혈액은, "석출공정"에 의해 이열성 단백질을 석출시키고, 그 후의 "제거공정"에 의해 해당 이열성 단백질을 제거하는 것이 바람직하다.

이에 의해, 항응고제가 첨가된 혈액을 사용했을 경우에도, 상기와 같은 약제를 첨가하는 일 없이 이열성 단백질을 제거할 수 있다. 이열성 단백질로는 피브리노겐, 보체(補體) 성분을 들 수 있다.

한편, 상술한 혈액처리공정과 동일한 이유로 인해, 해당 "석출공정"도 채취된 혈액이 저류되어 있는 혈액백이나 채혈관 등의 용기에서 그대로 실시하는 것이 바람직하다.

"석출공정"으로는 가온 처리를 들 수 있다. 가온 조건은 사용하는 혈액의 선도나 양에 따라 다르지만, 통상적으로 45 ℃ 내지 65 ℃ 인 것이 바람직하고, 50 ℃ 내지 60 ℃인 것이 더욱 바람직하며, 55℃ 내지 60 ℃인 것이 가장 바람직하다. 그리고, 가온 시간으로는 10분 내지 60분인 것이 바람직하고, 20분 내지 50분인 것이 더욱 바람직하며, 30분 내지 40분인 것이 가장 바람직하다. 이에 의해, 이열성 단백질을 용이하게 석출시킬 수 있다. 또한, 보체를 실활(失活)시킬 수 있기 때문에, 조제된 혈청을 다시 불활성화할 필요가 없이, 공정을 간략화할 수 있다. 이러한 이유로 인해, 가온 처리는 소위 불활성화와 동일한 조건(56 ℃에서 30 분간 가온)으로 실시해도 된다.

"제거공정"으로는 원심분리, 여과 등의 처리를 행하는 것을 들 수 있다. 원심분리 조건은, 조제한 혈청의 양 및 분리하는 성분의 종류에 따라 설정되지만, 예를 들면 4400(G) × 6 분 및 22 (℃)로 설정되는 것이 바람직하다. 또한, 여과는 예를 들면 오프닝 지름 200 μm의 필터에 의해 여과하는 것이 바람직하다.

<제 2 실시형태>

본 실시형태는 항응고제를 첨가하지 않은 상태에서 혈청을 조제하는 점이 제 1 실시형태와 다르다.

본 실시형태에서는, 혈소판처리공정을 거친 혈액은, 혈소판뿐만아니라, 적혈구나 백혈구의 세포막도 파괴된 소위 용혈상태가 된다. 이로 인해, 적혈구 중의 헤모글로빈이나 백혈구 중의 DNA 및 RNA를 제거하기 위해, 혈소판처리공정과 석출공정 사이에 적혈구와 백혈구로부터 유래한 성분을 제거하는 처리를 행한다. 구체적으로는, 흡착 컬럼이나 필터 등을 이용하여 제거한다. 한편, 헤모글로빈을 제거할 경우에는 흡착 컬럼을 이용하는 것이 바람직하고, DNA 및 RNA를 제거할 경우에는 필터를 이용하는 것이 바람직하다.

<제 3 실시형태>

[혈청조제장치]

다음으로, 상술한 본 발명의 혈청을 조제하는 혈청조제장치에 대해 설명하기로 한다.

본 발명의 혈청조제장치는, 적어도 혈소판을 함유하는 혈액으로부터 혈청을 조제하는 혈청조제장치로서, 상기 혈액을 저류하는 혈액저류부와, 이 혈액저류부에 무균적이면서도 기밀하게 연결되어, 상기 혈액저류부에 저류된 혈액으로부터 분리된 혈청을 수용하는 성분수용부를 구비한 혈청조제장치이다. 이하, 본 실시형태에 따른 혈청조제장치에 대해 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 본 실시형태에 따른 혈청조제장치(1)를 나타낸 도이다. 이 혈청조제장치(1)는, 혈액저류부(10), 성분수용부(20)를 주된 요소로 하여 구성되어 있다. 혈액저류부(10)는 대상자의 전혈을 저류하는 전혈저류부(11), 및 전혈로부터 분리된 다혈소판 혈장을 저류하는 혈장저류부(12)로 구성되어 있다. 이 중, 전혈저류부(11)는, 가요성(可撓性)을 가진 수지재료, 예를 들면, 연질 폴리염화비닐로 이루어진 2장의 시트가 외연부(110a)에서 융착되어 주머니모양으로 형성된 본체부(110)로 구성되어 있다. 혈장저류부(12)도 전혈저류부(11)와 마찬가지로 연질 폴리염화비닐로 이루어진다.

한편, 전혈저류부(11)는, 내부에 항응고제가 충전되어 있는 소위 혈액백이나 분리백일 수 있다. 혈액저류부(10)의 내부는 미리 멸균 처리되어 있다. 본 실시형태에서는 미리 항응고제가 첨가된 것을 사용한다.

성분수용부(20)는 6개의 주머니부(21～26)로 구성되어 있으며, 각각이 전혈저류부(11)와 마찬가지로 연질 폴리염화비닐로 이루어져 있다. 이들은 혈액저류부(10)와 마찬가지로 미리 멸균 처리되어 있다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 전혈저류부(11)의 본체부(110)에 있어서의 상부 가장자리에는, 그 접속구에 2 개의 튜브(41, 42)가 기밀하게 접속되어 있다. 이 중, 튜브(41)는 혈액을 도입하기 위한 도입로의 역할을 하기 때문에, 타단에는 채혈바늘(30) 혹은 채혈바늘과 접속가능한 접속부가 접속되어 있다. 또 하나의 다른 쪽 튜브(42)는, 튜브(43 ～ 47, 51 ～ 57) 및 분기체(61 ～ 66)를 매개로 각 주머니부(21 ～ 26)에 접속되어 있다. 이들은 혈액을 도출하기 위한 도출로의 역할을 한다. 이들 튜브(41 ～ 47, 51 ～ 57)에 대해서는, 유연성을 가진 수지재료, 예를 들면 연질 폴리염화비닐로 구성되어 있다. 여기에서, 성분수용부(20)의 주머니부( 21 ～ 26)와 각 튜브(51 ～ 57)도 기밀하게 접속되어 있다.

전혈저류부(11)와 혈장저류부(12), 및 혈장저류부(12)와 각 주머니부(21 ～ 26)는, 각 튜브(42 ～ 47, 51 ～ 57)를 매개로 하여, 내부 공간이 외부환경과 격리된 상태, 즉, 기밀한 상태로 접속되어 있다. 그리고, 각 튜브(42 ～ 47, 51 ～ 57)와 각 분기체(61 ～ 66)도, 내부에 있어서의 혈액성분이 유통되는 영역이 외부환경과 격리된 상태로 접속되어 있다. 접속방법으로는 용제접착, 열용착 혹은 초음파용착 등을 들 수 있다.

도 1에는 도시하지 않았지만, 본 발명의 제1 실시형태에 따른 혈청조제장치(1)는, 각 튜브(42 ～ 47, 51 ～ 57)의 소요 개소에 클램프로 집어 혈액 및 추출된 혈청을 도출할 때에 그 유로를 바꿀 수 있는 구성으로 되어 있다.

<혈청조제 조작에 대해>

상기 구성을 가진 혈청조제장치(1)를 이용한 혈청조제 조작에 대해, 도 1 및 도 2와 도 3을 이용하여 설명하기로 한다. 한편, 특별히 언급하지 않는 한, 부호는 도 1에 기재된 부호이다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 혈청조제장치(1)를 이용한 혈액분리 조작은 크게 10의 공정(S1 ～ S10)으로 구성되어 있다.

우선, 조작의 제1 단계로서는, 채혈바늘(30)을 대상자(환자)에게 찔러 혈액을 채취한다. 이 때, 채혈바늘(30)로부터 채취된 혈액은 튜브(41)를 통해 아래쪽에 위치한 전혈저류부(11)에 저류된다(이하, 저류 공정 S1이라 한다). 여기에서, 전혈저류부(11)에 채취된 혈액이 혈장저류부(12) 쪽으로 흘러들어가지 않도록 튜브(42)에 있어서의 전혈저류부(11)와의 경계 근방에는 파단 가능한 격벽(미도시)이 마련되어 있다. 혹은, 튜브(42)는 클램프 등을 이용하여 전혈저류부(11)의 밑부분쪽에서 경로가 폐쇄되어 있다. 저류 공정 S1은, 채혈시 환자의 건강상태 등을 고려하여 소요량을 채취하고 종료한다. 여기에서 말하는 소요량이란, 환자의 체격이나 건강상태에 문제가 없을 경우에는 200 내지 600 (ml) 정도이다.

한편, 채혈시에는 헌혈시에 널리 사용되는 채혈기 등을 이용할 수도 있다.

이어서, 대상자에게서 채혈바늘(30)을 빼고, 채혈바늘(30)과 전혈저류부(11)를 연결하고 있는 튜브(41)의 일부를 용단(溶斷)하고, 동시에 그 용단끝을 용착한다(이하, 제1 용단공정 S2라 한다). 한편, 튜브(41)의 용단은 용단기(소위, 씰러)를 이용하여 용단할 수 있다.

이어서, 전혈저류부(11) 안의 전혈로부터 혈장(이하, 본 실시형태에서는 다혈소판 혈장으로 한다)을 분리한다(이하, 제1 분리공정 S3이라 한다). 분리방법으로는 원심분리, 여과, 또는 이들의 조합 등을 들 수 있다. 본 실시형태에서는 원심분리를 한다. 원심분리 조건은, 저류된 혈액의 양 및 분리하는 성분의 종류에 따라 설정되지만, 예를 들면 1100(G) × 6(min) 및 24 (℃)로 설정되는 것이 바람직하다. 한편, 원심분리를 할 때는 혈청조제장치(1)를 접어서 원심분리기에 거는 것이 바람직하다.

이어서, 분리된 다혈소판 혈장을 혈장저류부(12)에 옮긴다(이하, 제1 이송공정 S4라 한다). 본 공정은 도 3을 이용하여 설명하기로 한다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 분리된 다혈소판 혈장(71)을 혈장저류부(12)에 이송하고자 할 경우에는, 클램프(90)를 이용하여 튜브(43)의 경로를 폐쇄해 두고, 이 상태에서 전혈저류부(11)의 외측에 설치한 가압기(80)를 가지고 전혈저류부(11)를 가압(F1)한다. 상술한 바와 같이, 전혈저류부(11)에 기밀하게 접속된 튜브(41)는, 저류공정 S1이 종료한 시점에서, 그 도중(41a)이 용단되고, 또한 동시에 그 단부 및 근방(4lb)이 용착되어 있다.

따라서, 가압(F1)을 받음으로써, 분리에 의해 추출된 상청(上淸)부분인 다혈소판 혈장(71)의 일부는, 튜브(42), 분기체(61) 및 튜브(51)를 통해 혈장저류부(12)에 이송된다.

한편, 튜브(43)의 경로는, 유연성을 가진 튜브(43)를 클램프(90)의 원판(91)과 베이스(92)와의 사이에 끼움으로써 폐쇄된다.

다혈소판 혈장(71)을 이송한 후에 전혈저류부(11)에 남은 적혈구 등의 혈액성분은 생리식염수 등으로 희석하여 도너에게 반환할 수 있다. 또한, 남은 혈액성분에 적혈구 보존액을 가하여 일정 기간 보존한 후, 예를 들면 세포이식시에 도너에게 반환할 수 있다.

다시 도 2를 참조하면, 혈장저류부(12)에 다혈소판 혈장(71)이 충전된 후, 튜브(42)를 용단 및 용착한다(이하, 제2 용단공정 S5라 한다). 이 용단 및 용착은 제1 용단공정 S2와 동일한 방법을 이용하여 이루어진다.

이어서, 혈장저류부(12)에 이송된 다혈소판 혈장 중의 혈소판의 세포막을 물리적으로 파괴한다(이하, 혈소판처리공정 S6이라 한다). 혈소판처리공정 S6으로는, 원심분리처리, 초음파처리, 열처리, 가압·감압처리, 유리 비드에 의한 혼화·교반처리 등을 들 수 있다. 본 실시형태에서, 혈소판처리공정은 열처리로서의 동결융해처리에 의해 혈소판의 처리를 행한다. 동결융해처리는 혈청조제장치(1) 전체를 -80 ℃에서 60 분간 동결시키고, 그 후, 37 ℃까지 승온시켜 20 분간 유지하기를 3회 반복하여 실시한다.

혈소판처리공정 S6에 의해, 혈소판의 세포막이 파괴되어 혈소판 중의 세포증식인자가 방출된다. 이에 의해, 혈소판 또는 혈액의 선도에 관계없이, 혈소판이 함유하고 있는 모든 세포증식인자를 얻을 수 있다.

이어서, 혈소판처리공정 S6을 거친 혈액 중의 이열성 단백질을 석출시킨다(이하, 석출공정 S7이라 한다). 석출 처리는, 상기 혈소판처리공정 S6을 거친 혈장저류부(12)를 가온 처리하는 것에 의해 이루어진다. 본 실시형태에서, 가온 처리는 56 ℃에서 30 분간 실시된다. 석출공정 S7에 의해 이열성 단백질뿐만아니라, 보체도 실활화시킬 수 있다. 보체를 실활화시킴으로써, 배양세포에의 영향을 경감시킬 수 있다.

한편, 석출공정 S7에 있어서의 가온 처리는 혈청조제장치(1) 전체를 가온해도 된다.

이어서, 석출공정 S7에 의해 석출한 이열성 단백질을 제거한다(이하, 제거공정 S8이라 한다). 제거방법으로는, 여과, 원심분리 또는 이들을 조합하여 행하는 방법 등을 들 수 있다. 본 실시형태에서는 4400(G) × 6 분간 원심분리를 행한다. 원심분리할 때는 혈청조제장치(1) 전체를 원심분리기에 거는 것이 바람직하다. 여과할 경우에는, 도 1 중, 튜브(43)의 일부에 필터를 미리 설치해 두면, 후술하는 제2 이송공정을 실시하면서, 석출한 이열성 단백질을 제거할 수 있게 된다.

이어서, 상기 제거공정 S8에 의해 분리된 혈청을 성분수용부(20)의 각각의 주머니부(21 ～ 26)에 이송한다(제2 이송공정 S9). 이송방법은 제1 이송공정 S4과 마찬가지로, 혈장저류부(12)의 외측에 압력을 가하여, 조제한 혈청을 밀어내는 방법이 바람직하다. 혈청은 각각의 주머니부(21 ～ 26)에 수용할 수 있다. 한편, 조제한 혈청의 양이 적을 경우에는, 튜브(44 ～ 47) 중 어느 것을 클램프 등으로 막아 사용하는 주머니부(21 ～ 26)의 수를 조정할 수 있다.

성분수용부(20)에 혈청을 이송한 후, 튜브(52 ～ 57)를 용단 및 용착한다(이하, 제3 용단공정 S10이라 한다). 이 용단 및 용착은 제1 용단공정 S2과 동일한 방법을 이용하여 이루어진다.

본 실시형태에 의하면, 채취된 혈액으로부터 혈청을 외기에 접촉시키지 않고 무균적으로 제조할 수 있게 된다. 이에 의해, 채혈부터 혈청조제까지의 일련의 공정을 외기에 접촉시키지 않고 실시 가능하기 때문에, 미생물에 의한 오염 위험을 저감시킬 수 있다.

한편, 본 실시형태에서는, 혈소판처리공정 S6에 있어서의 열처리로서 동결융해처리를 예로 들었다. 하지만, 본 발명에 있어서의 열처리는 동결융해처리에 제한되지 않는다. 예를 들면, 열처리로서 가온 처리를 행하여도 본 발명의 효과를 달성할 수 있다. 혈소판처리공정 S6의 가온 처리는 예를 들면, 혈청조제장치(1) 전체를 56 ℃에서 60 분간 가온 처리한다. 이에 의해, 혈소판의 세포막이 파괴되어, 혈소판 중의 세포증식인자를 얻을 수 있다. 또한, 혈소판처리공정 S6에 있어서, 56 ℃에서 60 분간 가온 처리하는 것에 의해, 상기 석출공정 S7의 공정을 동시에 실시할 수 있다. 이에 의해, 혈청조제공정의 일련의 공정의 단축화를 도모할 수 있는 효과가 있다.

한편, 본 발명에 따른 혈청조제장치는, 인간의 혈액뿐만아니라, 설치류, 가축류, 영장류 등의 포유류의 혈액에도 사용 가능하기 때문에, 비인간용 혈액성분 분리장치로서 사용하는 것도 가능하다.

<제 4 실시형태>

도4 및 도 5는 본 발명의 제4 실시형태에 따른 혈청조제장치(1A)를 나타낸 도이다. 본 실시형태에서는, 혈액저류부(10A)가, 전혈저류부와 혈장저류부로 구성되어 있지 않고, 하나의 주머니부로 구성되어 있으며, 혈액저류부(10A)가 다혈소판 혈장을 저류하는 혈장저류부(12A)만으로 구성되어 있는 점이 제3 실시형태와 다르다.

도 4에 있어서, 혈장저류부(12A)에는, 예를 들면 성분헌혈로서 채취된 다혈소판 혈장이 저류된다. 이 경우, 튜브(42A)와 혈장저류부(12A)는 처음에는 접속되어 있지 않다. 사용할 시에는, 튜브(42A)를 접속부(70)에 꽂고, 혈장저류부(12A) 측의 튜브(42A')와 연결한다. 한편, 채혈시에 사용되었던 튜브(41A)는 미리 용단되어 있는 것이 바람직하다. 접속부(70)로는, 예를 들면 삽입기구의 삽탈에 따라 밸브요소의 슬릿모양 개구부가 개폐하는 기능을 가진 기밀성 높은 혼합 주사 포트(일본국특허 제 3389983호 등 참조)를 구비한 구성을 들 수 있다.

한편, 본 실시형태에 있어서, 도 6에 나타낸 바와 같이, 혈장저류부(12A)와 튜브(42A)가, 접속부(70)를 매개로 하지 않고, 미리 일체적으로 접속되어 이루어진 구성이어도 된다.

이러한 구성으로 함으로써, 헌혈처럼 외부에서 채취된 혈액을 사용하는 것이 가능해 진다. 또한, 성분헌혈로서 채취된 혈액을 사용할 수 있기 때문에, 건강상 문제로 인해 전혈을 채취할 수 없는 환자인 경우에도 혈청을 용이하게 조제할 수 있다. 한편, 본 실시형태에 있어서의 그 외의 구성은, 제3 실시형태에 따른 혈청조제장치와 동일하기 때문에 그 외 부분에 관한 설명은 생략한다.

<제 5 실시형태>

도 7 및 도 8은 본 발명의 제5 실시형태에 따른 혈청조제장치(1B)를 나타낸 도이다.

본 실시형태에서는, 혈액저류부(10B)가 혈장저류부(12B)만으로 구성되어 있으며, 이 혈장저류부(12B)에, 초음파를 발생시키는 초음파 발진자(13)를 수용가능한 초음파 발진자수용부(14)가 마련되어 있다는 점이 제1 실시형태와 다르다.

초음파 발진자수용부(14)는, 일단이 폐쇄되고, 타단이 개방된 통모양 부재(15)가, 혈장저류부(12B) 상연부로부터, 주머니 모양으로 형성된 본체부(120B)의 내부측으로 돌출되도록 배치되어 형성되어 있다. 통모양 부재(15)는 폐쇄된 일단측이 본체부(120B)의 내부측으로 돌출되도록 배치된다.

초음파 발진자(13)는 봉형상이며, 통모양 부재(15)의 개방된 일단측으로부터 중공부 안으로 삽입된다. 다시 말하면, 본 실시형태에서는, 통모양 부재(15)의 중공부가 초음파 발진자수용부(14)를 구성한다.

통모양 부재(15)의 중공부 형상은 초음파 발진자(13)의 외형과 거의 동일하다. 이에 의해, 초음파 발진자(13)를 초음파 발진자수용부(14)에 수용했을 경우에, 초음파 발진자(13)가 통모양 부재(15)에 밀착된다.

초음파 발진자(13)는, 접속선을 매개로 초음파발생장치 본체(16)에 접속되어 있으며, 이 초음파발생장치 본체(16)에 마련된 스위치를 작동시켜서 초음파를 발진한다.

이상과 같은 구성으로 함으로써, 초음파 발진자(13)로부터 발생하는 초음파를, 본체부(120B)의 내부에 수용된 전혈에 직접 부하할 수 있다. 이에 의해, 효율적인 혈청조제 조작이 가능해 진다. 그 결과, 혈청조제 조작에 드는 에너지 부하를 경감할 수 있고, 또한 혈청조제에 드는 시간을 단축할 수 있다.

또한, 초음파 발진자수용부(14)를, 혈장저류부(12B)의 내부공간과 외부공간이 격리된 상태로 접속할 수 있다. 이에 의해, 혈장저류부(12B)의 내부공간의 무균성을 확보하면서 혈소판처리공정을 실시하는 것이 가능해 진다.

더욱이, 초음파 발진자수용부(14)를, 혈청조제장치(1B)의 혈액저류부(10B)로서의 혈장저류부(12B)에 마련하는 구성으로 함으로써, 혈소판처리공정으로서의 초음파처리에 이용하는 초음파 발진자(13)를 혈청조제장치(1B)에 용이하게 착탈할 수 있고, 혈청조제 조작이 용이해진다. 또한, 소형 초음파발생장치를 사용할 수 있고, 혈청조제장치(1B)의 공간을 절약할 수 있다.

[실시예]

[실시예 1 ～ 4, 비교예 1, 참고예 1 및 2]

혈소판처리공정에 있어서의 혈소판의 세포막을 파괴하는 방법을 검토하였다.

우선, 전혈로부터 다혈소판 혈장을 분리한다. 처음에는 인간 혈액 10 ml에, CPD액을 1.4 ml 첨가하고, 20 ℃에서 3500 rpm으로 8분간 원심분리(원심분리기:(주)구보타제작소 제품)를 실시하였다. 이어서, 분리된 혈장층과 연막(Buffy coat)층을 분리하고, 20 ℃에서 800 rpm으로 8분간 원심분리하여, 상청액을 다혈소판 혈장으로서 분리하였다. 이것을 시험용 검체로 사용하였다.

상기 다혈소판 혈장을 각각 1 ml씩 용기에 나누어 넣고, 이하의 처리를 실시하였다. 한편, 비교예 1에 기재된 처리방법은 특허문헌 2(특허 제 3788479호)에 기재된 방법이다.

(실시예 1) -80 ℃에서 10 분간 동결시키고, 그 후, 37 ℃에서 융해시키는 처리를 3회 실시

(실시예 2) 초음파처리를 15 분간 실시

(실시예 3) 초음파처리를 30 분간 실시

(실시예 4) 지름 1 mm의 유리 비드를 다수 첨가한 용기 안에서 10 분간 격렬하게 교반하는 처리를 실시

(비교예 1) 지름 4 mm의 유리 비드 5개와 27.8 w/v%의 염화칼슘을 10μl 첨가하고, 37 ℃에서 30 분간 가온 처리를 실시

(참고예 1) 14000 G로 10분간 원심분리를 1회 실시

(참고예 2) 14000 G로 10분간 원심분리를 3회 실시

상기 처리후, 3500 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻어진 상청액(혈청)에 대해 세포증식인자의 정량을 실시하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.

세포증식인자량	실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	비교예1	참고예1	참고예2
TGF-β1(pg/ml)	37900	62193.3	62066.7	44173.3	44915.6	193.3	4966.7
PDGF-BB(pg/ml)	3792.9	5652.1	5672.1	1637.9	3325	0	0

실시예 1의 동결융해처리를 행한 것이나 실시예 4의 유리 비드를 첨가하여 교반 처리를 행한 것에서는, 종래의 방법(비교예1)과 거의 동등한 양의 세포증식인자를 얻을 수 있었다. 한편, 실시예 2, 및 실시예 3의 초음파 처리를 행한 것에서는, 인간 혈청이 가진 세포증식인자의 상한치에 가까운 양의 세포증식인자를 얻을 수 있었다.

이어서, 실시예 2 및 실시예 3에 있어서, 초음파 처리시간과 혈소판 잔존율(%)의 관계를 검토하였다. 도 9는 초음파 처리시간과 혈소판수의 관계(n = 5)를 나타낸 도이다. 이로부터 15분간의 초음파처리로 대부분의 혈소판의 세포막이 파괴되는 것을 알 수 있었다.

1, 1A: 혈청조제장치 10, 10A: 혈액저류부
11: 전혈저류부 110: 본체부
110a: 외연부 12: 혈장저류부
20: 성분수용부 21 ～ 26: 주머니부
30: 채혈바늘 41 ～ 47, 51 ～ 57: 튜브
61 ～ 66: 분기체 70: 접속부
71: 다혈소판 혈장 80: 가압기
90: 클램프 91: 원판
92: 베이스

Claims (4)

1. 적어도 혈소판을 함유하는 혈액으로부터 혈청을 조제하는 혈청조제장치로서;
   상기 혈액을 저류(貯留)하는 혈액저류부;
   상기 혈액저류부에 마련되고, 초음파를 발생시키는 초음파 발진자를 수용가능한 초음파 발진자 수용부 및;
   상기 혈액저류부에 무균(無菌)적이면서도 기밀(氣密)하게 연결되어, 상기 혈액저류부에 저류된 혈액으로부터 분리된 혈청을 수용하는 성분수용부
   를 구비한 혈청조제장치.
2. 제1항에 있어서,
   상기 혈액저류부는, 전혈(全血))을 저류하는 전혈저류부와, 해당 전혈저류부에 무균적이면서도 기밀하게 연결되어, 상기 전혈저류부에 저류된 전혈로부터 분리된 다혈소판 혈장을 저류하는 혈장저류부를 구비하고, 상기 초음파 발진자 수용부는 상기 혈장저류부에 마련되는 것인 혈청조제장치.
3. 제1항에 있어서,
   상기 혈액저류부는, 다혈소판 혈장을 저류하는 혈장저류부인 혈청조제장치.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 혈액저류부와 상기 성분수용부는, 이들을 분리 및 접속가능한 접속부에 의해 접속되는 혈청조제장치.

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