KR20150113978A - 혈소판 용해 및 활성화를 위한 디바이스 및 방법 - Google Patents

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크리스토퍼 제이 센테노
브라이언 제이. 리치
라이안 드리갤라
패트릭 레이쉬링
니콜레트 라이언스
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리제너러티브 사이언시즈, 엘엘씨
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Abstract

환자에게 동시 발생 재주입을 위해 환자 침대 옆에서 변성된 자가 조직의 혈소판 용액의 제조를 위한 디바이스, 시스템 및 방법 실시예가 개시된다. 특정 실시예에서, 혈액 해동, 혈소판 용해, 용액 준비, 및 환자에게로의 재주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 단계들은 환자를 재지정함이 없이 한번의 사무소 또는 병원 방문으로 달성될 수 있다. 따라서, 개시된 장치, 디바이스 및 시스템은 대체로, 혈소판 함유 용액을 수용하고, 혈소판 함유 용액 내의 하나 이상의 혈소판체의 용해를 유도하고, 환자에게 재주입하는데 적절한 방식으로 결과적인 변성 혈소판 용액을 제공하도록 구성된 실질적으로 독립적인 기계, 디바이스 또는 시스템을 포함한다.

Description

혈소판 용해 및 활성화를 위한 디바이스 및 방법{DEVICE AND METHODS FOR PLATELET LYSIS OR ACTIVATION}
본 명세서에 기술된 실시예는 혈소판 용해 또는 활성화를 위한 디바이스, 시스템 및 방법에 관한 것이다. 특히 실시예는 한번의 치료 세션 동안 환자의 침대 옆에서 실행될 수 있는 혈소판 용해 또는 활성화를 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
혈소판(platelets)은 포유동물의 혈액에서 순환하는 작은 디스크 형상의 무핵(non-nucleated) 세포 단편이다. 혈소판은 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 형질전환 성장인자 베타(transforming growth factor beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor), 인슐린-유사 성장인자(insuline-like growth factor), 표피 성장인자(epidermal growth factor), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 앞서 언급한 성장인자들에 추가하여, 혈소판은 또한 알파 과립(α granules), 시토카인(cytokines), 단백질, 세포 성분(cellular components), mRNA, 리보솜 RNA, 전이 RNA, DNA, 화학제, 호르몬 및 신호전달 분자를 포함하는 소분자를 포함한다. 앞서 언급한 성장인자 및 다른 혈소판 내용물은 본 명세서에서 총괄적으로 "치료학적 혈소판 내용물(therapeutic platelet contents)"로서 지칭된다. 치료학적 혈소판 내용물은 인간의 결합 조직을 포함하지만 이에 한정되지 않는 상해(injured) 또는 손상된(damaged) 생물학적 조직의 회복 및 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 보여졌었다. 자가유래(autologous) 혈소판이 풍부한 용액의 투여에 의한 증가된 농도로 다양한 혈소판-유래 치료학적 혈소판 내용물의 국부적인 적용은 상처 치료를 촉진하는 공지의 기술이다.
용액 내로 세포 또는 혈소판의 내용물을 방출할 목적으로 세포 또는 세포 단편 막(cell fragment membrane)의 용해(lysis) 또는 분쇄(disruption)를 유발하거나 또는 유도하는 많은 방법이 공지되어 있다. 전형적인 방법은 6개의 카테고리로 분류될 수 있다: 광학식(optical), 기계식(mechanical), 음향식(acoustic), 전기식(electrical), 화학식(chemical) 및 열식(thermal). 하나 이상의 앞서 언급한 방법들은 혈소판 함유 용액의 배치 용해(batch lysis)를 위해 이용될 수 있다. 대안적으로, 용해 방법은 내용물의 분석을 위하여 단일의 세포에 적용되어 왔다.
혈소판 용해의 공지된 방법은 대규모의 자본 설비, 특화된 폐기성 소모재, 및 복잡한 기술을 요구한다. 추가적으로, 공지의 기술을 사용하여 변성된(modified) 혈소판 용액을 생성하는데 요구되는 시간은 너무 길고, 이는 생혈(freshly drawn) 또는 전처리된(pre-processed) 혈액으로 시작하여 한 번의 방문 시간 내에 주입 가능한 변성된 혈소판 용액을 생성하는데 합리적이지 않다. 게다가, 의료 제공자는 현장에서 적절한 변성 혈소판 용액을 만들고 처리하는데 필요한 클린 룸 및 실험실 설비에 접근하기가 매우 쉽지 않다. 이러한 어려움은 고비용의 특화된 실험실에 대하여 자가유래 혈소판 용해물 치료의 채택을 제한하며, 정상적인 임상현장에서 자가유래 혈소판 용해물 치료도 금지하였다.
본 발명에 개시된 실시예는 상기된 하나 이상의 문제점을 극복하는 것에 관한 것이다.
환자에게 동시에 재주입하기 위하여 환자의 침대 옆에서 변성된 자가유래 혈소판 용액의 생산을 위해 제공하는 디바이스, 시스템 및 방법 실시예가 개시된다. 특정 실시예에서, 채혈, 혈소판 용해/활성화, 용액 준비 및 환자에게로의 재주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 단계는 환자를 이동시키지 않고 한 번의 연구소 또는 병원 방문으로 달성될 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 설명된 장치, 디바이스 및 시스템은 혈소판 함유 용액을 수용하고, 혈소판 함유 용액 내의 일정량의 혈소판체(platelet body)의 용해 또는 활성화를 유도하고, 환자에게로의 주입에 적절한 방식으로 제조된 변성 용액을 제공하도록 구성된, 실질적으로 독립형(stand-alone)인 기계, 디바이스 또는 시스템을 포함한다. 그러므로, 설명된 실시예는 상기 기술된 디바이스 및 관련 소모성 또는 폐기성 장치 또는 부분 외에, 추가의 실험실 기반 설비의 요구 없이 주입 가능한 변성 용액의 생성을 제공한다.
본 명세서에 설명된 한 실시예는 하우징(housing)을 가지는 디바이스이다. 상기 디바이스 내로 혈소판 함유 용액의 투입(input)을 허용하는 투입 포트(input port)가 하우징을 통해 제공된다. 투입 포트로부터 혈소판 함유 용액이 계속 공급되고, 또한 디바이스 하우징 내에 위치된 용해/활성화 챔버 내로 운반되거나 또는 그렇지 않으면 배치된다. 용해/활성화 챔버 내에서, 혈소판 함유 용액 중 하나 이상의 혈소판은 다음에 설명되는 바와 같이 용해 또는 활성화되도록 유발된다. 그러므로, 변성 용액은 용해/활성화 챔버 내에서 형성된다. 배출 포트(outlet port)는, 배출 포트로부터 제거될 변성 용액을 제공하는 용해/활성화 챔버와 유체 소통(fluid communication)하도록 하우징으로부터 제공된다.
용해/활성화 챔버 내에서 혈소판의 용해 또는 활성화는 몇개의 개시된 기술 또는 기술의 임의의 조합에 의해 유발될 수 있다. 예를 들어, 혈소판의 용해 및/또는 활성화는 혈소판 함유 용액이 하나 이상의 전체 또는 부분적인 동결/해동 사이클(freeze/thaw cycles)을 겪는 것에 의하여 유발될 수 있다. 그러므로, 혈소판 용해/활성화 챔버는 디바이스 하우징 내에서 또한 유지되는 가열 및 냉각 모듈과 열 접촉(thermal contact)할 수 있다. 가열 및 냉각 모듈은, 가스, 액체 또는 다른 가열 및 냉각 매체와 용해/활성화 챔버를 접촉시키고, 종래의 냉각 또는 가열 사이클 또는 다른 수단을 적용하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 혈소판 함유 용액을 가열 및 냉각하는 몇개의 기술 중 하나를 이용할 수 있다. 하나의 비제한적인 대표적인 예에서, 용해/활성화 챔버는 하우징 내에서 가열 또는 냉각 매체와 접촉되는 일정 길이의 폐기 가능한 살균 튜브(disposable sterile tubing)를 포함할 수 있다.
디바이스 또는 시스템의 대안적인 실시예는 하우징 내로 및 용해/활성화 챔버와 소통하는 하나 이상의 보충 투입 포트를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 보충 투입 포트는 용해/활성화 챔버 내에서 하나 이상의 혈소판의 용해 또는 활성화를 유발 또는 촉진하도록 혈소판 함유 용액과 접촉하는 물질의 도입을 제공할 수 있다. 용해 또는 활성화 유발 물질은 CaCl2, 대안적인 염(alternative salt), ADP, 에피네프린, 트롬빈, 콜라겐, 또는 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor)를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
다른 대안적인 장치는 혈소판 용해 또는 활성화를 유발하거나 또는 촉진하도록 하우징 내에 제공될 수 있다. 대안적인 장치는, 음향 에너지(acoustic energy)의 적용을 포함하지만 이에 한정되지 않는 공정으로 혈소판 함유 용액이 처리되고, 혈소판 함유 용액에 전단 응력(shear stress)을 가하거나, 혈소판 함유 용액에 삼투압박(osmotic stress)을 가하거나, 또는 혈소판 함유 용액을, 유리 또는 콜라겐을 포함하지만 이에 한정되지 않는 활성화 촉진 표면 또는 물질과 접촉시킬 수 있다. 디바이스 실시예는 열식, 화학식, 기계식 또는 다른 혈소판 용해 또는 활성화 단계의 임의의 조합을 제공하는 요소를 포함할 수 있다.
디바이스 실시예의 배출 포트는 필터를 포함할 수 있다. 추가하여, 특정 실시예에서, 용해/활성화 챔버는 선택된 용해 또는 활성화 단계의 수행 전 또는 후에 혈소판 함유 용액으로부터 혈장과 같은 유체(fluid)의 제거를 제공하는 진공원(vacuum source)과 소통할 수 있다. 또한, 장치는, 용해/활성화 챔버에 결합되고 하우징 내에서 용해/활성화 챔버의 회전을 제공하고, 선택된 용해/활성화 단계 전 또는 후에 혈소판 함유 용액 내의 혈소판의 농축을 유발하는 회전 디바이스(rotation device)를 포함할 수 있다.
대안적인 실시예는 상기된 바와 같은 디바이스의 하나 이상의 실시예를 이용하여 혈소판 함유 용액으로부터 변성 용액을 준비하는 방법을 포함한다. 방법은 하우징을 통해 디바이스의 투입 포트로 혈소판 함유 용액을 도입하는 단계를 포함한다. 방법 실시예는 하우징 내의 용해/활성화 챔버로 혈소판 함유 용액을 유동시키거나 또는 그렇지 않으면 운반하고, 용해/활성화 챔버에 있는 혈소판 함유 용액 내에서 혈소판의 용해 또는 활성화를 유발하기 위한 공정을 또한 포함한다. 그러므로, 방법 실시예는 독립형 디바이스 내에서 준비된 변성 용액을 만들어내고, 이는 환자의 침대 옆 또는 진료소에서 사용하는데 적합하다. 방법 실시예는 환자에게 변성 용액의 재주입을 추가로 포함할 수 있다.
방법 실시예는 용해/활성화 챔버 내에서 혈소판의 전체적 또는 부분적인 용해 및/또는 활성화를 유발하도록 기술의 임의의 조합을 특징으로 할 수 있다. 용해/활성화 기술은 하나 이상의 동결/해동 사이클을 유발하도록 용액을 가열하고 냉각하며, 용액을 건조시키고, 용액에 전단 응력을 가하고, 용액에 음향 에너지를 가하고, 하나 이상의 용해/활성화 유발제와 용액을 혼합하고, 하나 이상의 용해 또는 활성화 유발 표면 위에서 용액을 유동시키고, 용액에 삼투압박 또는 다른 수단에 가하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
도 1은 본 명세서에 설명된 바와 같은 디바이스의 개략도.
도 2는 본 명세서에 설명된 바와 같은 방법을 나타내는 흐름도.
도 3a 내지 도 3i는 대안적인 디바이스 및 방법 실시예를 나타내는 개략도.
도 4는 대안적인 방법 실시예를 나타내는 흐름도.
도 5는 선택된 동결/해동 온도 범위에서 단지 하나의 동결/해동 사이클을 겪은 유사한 샘플과 비교하여 다중의 동결/해동 사이클 후에 선택된 혈소판 용해 또는 활성화 파라미터의 백분율 증가를 보인 비교 그래프.
도 6은 냉각 매체로서 공기를 이용하는 유사한 동결/해동 사이클을 겪은 유사한 샘플과 비교하여 냉각 매체로서 이소프로필 알코올을 이용하는 다중의 동결/해동 사이클 후에 선택된 혈소판 용해 또는 활성화 파라미터의 백분율 증가 또는 감소를 보인 비교 그래프.
도 7은 단독 용해/활성화 단계로서 다중의 동결/해동 및 단 응력 주기를 겪은 유사한 샘플과, 용해/활성화제로서 CaCl2의 첨가를 더한 다중의 동결/해동 사이클 및 전단 응력을 겪은 샘플을 비교하는 선택된 혈소판 용해 또는 활성화 파라미터의 백분율 증가를 보인 비교 그래프.
도 8은 삼투압박(osmotic stress) 하에 배치되지 않은 저장액(hypotonic solution) 및 유사한 샘플과 삼투압박 하에 배치된 샘플을 비교하는 선택된 혈소판 용해 또는 활성화 파라미터의 백분율 증가를 보인 비교 그래프.
도 9는 원심분리에 의한 혈소판 분리없이 하나 이상의 동결/해동 사이클을 겪은 유사한 샘플과 비교하여 원심분리에 의한 혈소판 분리 후의 하나 이상의 동결/해동 사이클 후에 선택된 혈소판 용해 또는 활성화 파라미터의 백분율 증가를 보인 비교 그래프.
도 10은 용액으로부터 원심분리되고 단지 하나 이상의 동결/해동 사이클을 겪은 유사한 샘플과 비교된 삼투압박을 제공하는 선택된 농도의 염화칼슘 및 물에 노출된 혈소판과의 다중의 동결/해동 사이클을 포함하는 대표적인 결합 공정 후에 선택된 혈소판 용해 또는 활성화 파라미터의 백분율 증가를 보인 비교 그래프.
달리 지시되지 않으면, 상세한 설명과 청구항에서 사용되는 성분의 양, 치수적 반응조건 등을 설명하는 모든 숫자는 모든 예에서 용어 "약(about)" 만큼 변성되는 것으로서 이해되어야 한다.
이러한 상세한 설명 및 청구항에서, 단수 표현의 사용은 달리 명시되지 않으면 복수를 포함한다. 덧붙여, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않으면 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 "포함한다"와 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 한정하지 않는다. 또한, "요소" 또는 "구성요소"와 같은 용어는 특별히 언급되지 않으면 하나 이상의 유닛을 포함하는 하나의 유닛 및 요소들 및 구성요소들을 포함하는 요소들과 구성요소들을 포용한다.
본 명세서에서 설명된 다양한 디바이스, 시스템 및 방법 실시예는 환자에게로의 동시 재주입을 위하여 환자의 침대 옆에서 변성된 자가유래 혈소판 용액의 제조를 제공한다. 특정 실시예에서, 채혈, 혈소판 용해 및/또는 혈소판 활성화, 용액 준비 및 환자에게로의 재주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 단계들은 환자를 재지정함이 없이 한번의 진료소 또는 병원 방문으로 달성될 수 있다. 용어 "혈소판 용해"는 본 명세서에서 혈소판 세포막의 파괴를 유발하고, 이에 의해 혈소판으로부터 치료 내용물을 방출하는 공정 또는 방법으로서 정의된다. 용어 "혈소판 활성화"는 본 명세서에서 상처 치료를 촉진하도록 혈소판 응집(platelet aggregation), 특정 단백질 및 성장 인자의 점착과 방출을 제어하는 일련의 이벤트를 촉발하는 공정으로서 정의된다. 혈소판 활성화는 예를 들어, 상처에 반응하여 혈류 내에서 일어날 수 있다. 본 명세서에서 인용되는 혈소판 활성화는 인간의 신체 바깥에서 일어나며, 혈소판 세포막의 파괴를 반드시 유발할 필요없이 혈소판으로부터 치료 내용물의 방출을 유발한다.
따라서, 본 명세서에서 설명된 장치, 디바이스 및 시스템은 대체로, 혈소판 함유 용액을 수용하고 혈소판 함유 용액 내의 하나 이상의 혈소판체의 용해 및/또는 활성화를 유도하고, 환자에게로 재주입하는데 적절한 방식으로 제조된 변성 혈소판 용액을 제공하는 통일된 기계, 디바이스 또는 시스템을 포함한다. 그러므로, 설명된 실시예는 상기된 디바이스 및 관련 소모성 또는 폐기성 장치 또는 부분 외에 추가의 실험실 기반 설비의 요구 없이 주입 가능한 변성 혈소판 용액의 생성을 제공한다.
하나의 디바이스 및 방법 실시예에서, 변성 혈소판 용액은 혈소판 함유 용액을 동결하고 이어서 해동하도록 열에너지를 사용하는 것에 의해 생성되고, 이에 의한 혈소판체의 용해 및/또는 활성화를 통해 그 치료 내용물을 방출한다. 예를 들어, 도 1은 혈소판 함유 용액 중의 일정량의 혈소판의 용해 및/또는 활성화를 유도하기 위해 혈소판 함유 용액의 일부 또는 전부를 동결하도록 하는 가열 및 냉각 장치의 사용을 특징으로 하는 시스템 실시예(100)를 개략적으로 도시한다. 도 1의 시스템(100)에서, 환자의 자가유래 혈소판 함유 용액을 수용하는 주사기, 살균 가방 또는 다른 적절한 용기(104)는 투입 포트(102)에서 시스템(100)에 연결된다. 환자의 자가유래 혈소판 함유 용액은 환자의 혈액으로부터 유래된다. 혈소판 함유 용액은 혈소판을 농축하고, 다른 용액으로 희석, 혼합 또는 그렇지 않으면 변성되도록 예비 처리될 수 있다. 전형적으로, 혈소판 함유 용액은 치료 세션의 착수시에 환자로부터 채혈된 혈액으로부터 예비 처리되고 준비될 것이다. 추가적으로, 혈소판 함유 용액은 초기에 환자로부터 채혈된 혈액으로부터 준비되고 예비 처리 전후에 저장될 수 있다.
혈소판 함유 용액은 시스템(100)을 통해 용해/활성화 챔버(104)로 및 용해/활성화 챔버를 통해 운반된다. 혈소판 함유 용액은 임의의 선택된 형상, 용적 또는 구성을 가지는 유체 경로(105)에서 운반될 수 있다. 도 1의 특정 시스템 실시예에서, 용해/활성화 챔버(104)는 열 용해/활성화 챔버로서 실행된다. 대안적인 용해/활성화 방법에 의지하는 대안적인 용해/활성화 챔버는 다음에 상세히 설명된다. 용해/활성화 챔버(104) 및 이와 관련된 유체 경로(105)는 임의의 적절한 형상 또는 구성의 것일 수 있으며, 임의의 선택된 용적을 가진다. 전형적으로, 혈소판 함유 용액은, 적어도 부분적으로 다음에 설명되는 바와 같이 폐기성 살균 튜브일 수 있는 살균 튜브를 포함하는 유체 경로(105)에서 운반된다. 밸브, 계량기, 펌프, 게이트, 저장 용기 및 다른 유체 제어 장치는 시스템 내에서 유체의 유동을 제어하도록 요구되는 바와 같이 실행될 수 있다. 예를 들어, 배출 밸브(106)는 혈소판 함유 용액이 특정 시간 동안 용해/활성화 챔버 내에 남아있도록 이용될 수 있다.
시스템(100)은 하나 이상의 보충 유체 또는 조성물 포트(108)를 포함할 수 있으며, 보충 포트는 전형적으로 폐기 가능한 용기 또는 다른 투입 구성물 또는 혈소판 용해 및/또는 활성화 공정 동안 사용되는 소모성 부속물, 화학제, 첨가제, 용매 또는 다른 물질의 양을 수용하도록 선택적으로 사용될 수 있다. 보충 포트(108)는 튜브, 파이프, 고체 재료 컨베이어 시스템 또는 다른 재료 취급 장치를 사용하여 용해/활성화 챔버(104) 및/또는 유체 경로(105)와 유체 소통으로 배치된다. 예를 들어, 관련 디지털 제어 장치를 구비하거나 구비하지 않은 하나 이상의 밸브, 펌프 또는 재료 컨베이어는 유체 경로(105) 및/또는 용해/활성화 챔버(104) 내에서 혈소판 함유 용액과의 임의의 필요한 2차 물질의 타이밍 및 혼합율을 제어하도록 실행될 수 있다.
시스템(100) 내로 도입된 혈소판 함유 용액의 양은 용해/활성화 챔버(104) 내의 유체 경로(105)의 용적이 시스템 내로 도입된 혈소판 함유 용액 용적의 전체와 결합되도록 사전 결정될 수 있다. 그러므로, 시스템(100)은 환자 내로의 재주입 또는 치료 용법 전에 한정된 배치(batch)의 혈소판 함유 용액을 처리하도록 이용될 수 있다. 대안적으로, 시스템은, 용액이 시스템(100) 내로 급송되고 환자 내로 재주입됨으로써 혈소판 함유 용액을 연속으로 처리하도록 구성될 수 있다.
상기된 바와 같이, 도 1에 도시된 특정 실행은 열 용해/활성화 챔버(104)를 포함한다. 따라서, 시스템(100)은 용해 챔버(104)와 열 소통하는 가열 및 냉각 모듈(110)을 포함한다. 가열 및 냉각 모듈(110)은 열교환 장치, 종래의 전기, 임의의 형태의 가스 또는 다른 가열 및 냉각 요소 또는 다른 형태의 가열 및 냉각 장치와 함께 실행될 수 있다. 가열 및 냉각 모듈(110)은 열교환면(112)을 통해 용해/활성화 챔버(104)와 열 소통한다. 예를 들어, 열교환면(112)은 열교환면(112)과 열 용해/활성화 챔버(104)의 표면적 접촉이 최대화되도록 구성될 수 있다.
가열 및 냉각 모듈(110)은 혈소판 함유 용액이 부분적으로 또는 전체적으로 동결될 때까지 열교환면(112)을 통해 혈소판 함유 용액으로부터 열을 제거하도록 구성될 수 있다. 이러한 완전한 또는 부분적인 상 변화(phase change)가 일어난 후에, 열은 예를 들어 열교환기, 종래의 히터 또는 다른 수단의 역전 조작(reversed operation)에 의해 가열 및 냉각 모듈(110)과 함께 열 용해 챔버(104)에 적용될 수 있다. 동결된 혈소판 함유 용액을 부분적으로 또는 전체적으로 가열하는 것은 혈소판 함유 용액의 동결된 부분을 해동시킨다. 하나 이상의 완전한 동결/해동 사이클은 용해/활성화 챔버(104) 내에서 실행될 수 있다. 하나 이상의 동결/해동 사이클 동안 혈소판 용해/활성화가 일어나고, 치료학적 혈소판 내용물을 용액 내로 방출시키고, 이에 의해, 온전히 활성화된 혈소판을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 혈소판 용해물 용액(Platelet-Lysate solution, PL 용액)을 생성한다. PL 용액의 최종 해동 및/또는 가온 후에, 밸브(106)는 개방되어 PL 용액이 배출 포트(114)를 향하여, 환자에 대한 PL 용액의 일부 또는 전부를 재투여를 제공하는 매개체로서 사용하는데 적절한 제2 용기(예를 들어, 주사기) 내로 유동하는 것을 허용한다.
시스템(100)은 단일의, 가능한 휴대 가능한 하우징 내에 수용된 제거 가능한 용기(104, 108 및 116)와 다른 모든 요소를 구비한 실질적으로 자체 수용된 디바이스로서 실시될 수 있다. 또한 혈소판 함유 용액에 의해 적셔진 모든 구성 요소는 각 절차 후에 교체되는 폐기성 부분들로 실행된다. 유체 경로(105)의 적어도 일부를 실행하도록 폐기 가능한 튜브 키트의 사용은 각 환자를 위한 살균 장치의 사용을 보장하는데 기여한다.
도 1의 시스템은 도 2에 도시된 비배타적인 방법(200)에 따라서 다음과 같이 이용될 수 있다. 환자의 혈액으로부터 이전에 또는 동시에 유래된 혈소판 함유 용액은 시스템(100) 내로 도입된다(단계 200). 혈소판 함유 용액은 열 용해/활성화 챔버(104)의 유체 경로(105) 내로 적절한 도관 시스템을 통해 루팅된다(단계 204). 상기된 바와 같이, 용해/활성화 챔버(104)는 하나 이상의 냉각 및/또는 가열 사이클에서 열 에너지와 접촉되는 혈소판 함유 용액을 제공한다. 상기된 바와 같이, 가열 및 냉각 모듈(110)의 구성은 다양한 에너지원과 열교환 방법에 의지하는 다양한 구성의 것일 수 있다. 예를 들어, 하나의 특정 디바이스 구성에서, 외피와 튜브 시스템은 혈소판 함유 용액이 먼저 입구 플레넘(inlet plenum) 내로 도입되고, 그런 다음 하나 이상의 튜브 내로 분배되도록 통합될 수 있다. 혈소판 함유 용액의 유동은 혈소판 함유 용액의 일부 또는 전체 양이 상기 튜브의 하나 이상으로 움직이도록 제어된다. 혈소판 함유 용액이 열교환 튜브에 있으면, 유동은 중지될 수 있다.
이러한 특정 실시예에서, 튜브 또는 튜브들은 외피 내에 수용된다. 튜브와 외피 사이에는 유체 소통이 없다. 외피와 튜브 시스템은 외피의 내부 용적과 함께 튜브 또는 튜브들의 표면적이 최대화되도록 구성된다.
열교환 유체는 혈소판 함유 용액의 동결 온도보다 낮은 제1 온도에서 제1 진입 포트를 통해 외피 내로 도입된다. 열교환 유체의 온도는 가열 및 냉각 모듈(110), 관련 센서와 관련 제어 장치에 의해 제어될 수 있다. 열교환 유체는 튜브 또는 튜브들로부터, 그 결과, 그 안에 수용된 혈소판 함유 용액으로부터 열을 제거한다. 열교환 유체는 제1 온도보다 높은 제2 온도로 제2 배출 포트를 통해 외피를 빠져나간다. 그러므로, 열은, 혈소판 함유 용액에서의 충분한 열 온도 강하가 액체 혈소판 함유 용액에서 부분적 또는 전체적인 액체상을 고체상으로 유도할 때까지 혈소판 함유 용액으로부터 제거된다(단계 206). 혈소판막 내의 얼음 결정의 형성은 혈소판 내용물의 용적 확장을 유발하고, 이에 의해 혈소판막에 기계적인 응력을 부과한다. 기계적 응력은 이러한 막의 파괴를 유발하고 주위 용액 내로 다양한 관심 인자를 포함하는 치료학적 혈소판 내용물의 방출을 유발한다. 추가적으로, 다음에 설명되는 바와 같이, 동결은 해동을 겪지 않은 혈소판의 활성화를 유발할 수 있다.
혈소판 함유 용액이 부분적으로 또는 전체적으로 액체로부터 고체로의 상변화를 겪은 후에, 열교환 공정은 혈소판 함유 용액이 고체로부터 액체로 해동 상변화를 겪도록 선택적으로 역전될 수 있다(단계 208). 한 실시예에서, 디지털 제어 시스템과 통신하는 온도 센서는 특정 온도 벤치마크, 예를 들어 동결 또는 해동점이 도달될 때를 결정하도록 혈소판 함유 용액의 온도를 모니터한다. 다른 실시예에서, 제어는, 혈소판 함유 용액의 부분적 또는 완전한 상변화가 일어났는지를 보장하도록 혈소판 함유 용액 열 제거를 위한 시간을 미리 프로그래밍하도록 시스템 거동의 경험적 데이터와 모델링에 기초할 것이다. 충분한 혈소판 용해 및/또는 활성화를 달성하는 것이 필요하면, 동결 및 해동의 사이클은 요구되는 바와 같이 반복될 수 있다(단계 210).
대안적인 방법은 혈소판 함유 용액 내에서 부분적 또는 완전한 상변화의 하나 이상의 사이클을 확인 및/또는 제어하도록 이용될 수 있다. 대안적인 모니터링 및 제어 방법은 혈소판 함유 용액의 용적 변화, 혈소판 함유 용액의 광전송, 혈소판 함유 용액 내에서 음파 전송 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 파라미터를 모니터링하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
하나 이상의 동결/해동 사이클이 충분한 수의 혈소판체의 용해 및/또는 활성화를 보장하도록 수행된 후에, 최종의 가온 또는 해동 단계가 수행될 수 있다. 이 시점에서, 혈소판 함유 용액은 혈소판 용해물 용액(PL 용액)으로서 지칭될 수 있거나, 또는 대안적으로 하나 이상의 용해 또는 활성화된 혈소판체를 함유하는 변성 용액으로서 지칭될 수 있다. PL 용액은 그런 다음 용해/활성화 챔버(104)로부터 환자 내로 재주입하는데 적절한 용기 내로 루팅될 수 있다(단계 214). 상기된 바와 같이, 시스템(100)은 혈소판 함유 용액 또는 PL 용액으로 적셔진 모든 구성요소가 용이하게 대체 가능하고 폐기 가능한 것으로서 설계되도록 구성될 수 있다. 추가하여, 모든 단계들은 의사의 진료소, 병원 또는 종합 병원실에 위치된 자체 수용된, 가능하게 휴대용 시스템에서 수행될 수 있다. 그러므로, 전체 치료 방법이 실행될 수 있는 한편, 환자로부터 단지 한번 또는 제한된 수의 진료소 방문을 요구한다.
시스템(100)은 특별이 상기에서 인용된 요소들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 열 용해/활성화 챔버(104)의 대안적인 구성에서, 혈소판 함유 유체는, 그 주위 벽이 가열/냉각 요소 또는 열교환기와 직접 접촉하는 챔버를 포함하는 유체 경로(105) 내에서 루팅된다. 챔버는, 혈소판 함유 용액 유체와 접촉하는 챔버 주위 벽의 표면적이 최대화되도록 구성될 수 있다. 추가적으로, 챔버는 열교환기와 접촉하는 챔버의 표면적이 최대화되도록 구성될 수 있다. 이 실시예에서, 혈소판 함유 용액은, 혈소판 함유 용액이 챔버의 내부용적의 전체를 점유할 때까지 챔버 내로 루팅되고, 이 시점에서, 유동은 중지된다. 열교환기 또는 다른 가열/냉각 요소는 혈소판 함유 용액의 부분적 또는 완전한 상변화가 일어날 때까지 혈소판 함유 용액으로부터 열을 제거한다. 동결 및 해동의 사이클은, PL 용액이 만들어지고 환자 내로 주입 또는 다른 방법에 의한 재주입을 위하여 시스템으로부터 제거될 때까지 상기된 바와 같이 처리될 수 있다.
직접 또는 간접 열교환에 의지하는 가열 및 냉각 모듈의 많은 가능한 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 한 실시예에서, 가열 및 냉각 요소는 비소모성 열전달 매체를 가진 폐쇄 시스템으로서 실행된다. 따라서, 시스템에서의 열전달 매체의 레벨은 디바이스의 다중의 사용 과정에 걸쳐서 줄어들지 않는다. 이러한 열교환 시스템은 R-11, R-12, R-114, R-22, R123, R-134a, R-502, R-40, R-764, R-170, 또는 R-290와 같은 공지의 열전달 매체를 이용하는 표준 에어컨 장치(standard air conditioning) 또는 냉각 시스템과 유사한 증기 압축 사이클을 이용하는 압축 및 팽창 챔버로 실행될 수 있다.
시스템의 다른 실시예에서, 열전달 매체는 필요성에 기초하여 시스템 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 가스, 액체, 또는 액화 가스의 폐기성 용기(또는 가스 또는 유체 공급부의 연결)는 혈소판 함유 용액으로부터 열을 신속히 제거하도록 사용될 수 있다. 작은 용적을 점유하는 압축 가스가 낮은 압력에서 보다 큰 용적으로 팽창하도록 허용될 때 일어나는 온도 강하는 혈소판 함유 용액으로부터 열을 제거하도록 이용될 수 있다. 개방 단부 시스템에서 사용된 적절한 냉각 가스는 부정적인 결과없이 대기로 방출될 수 있도록 불활성이며 환경적으로 안전할 수 있다. 다른 본질적으로 덜 안전한 가스는 여과, 처리, 또는 회수(recapture)의 수단을 요구할 수 있다. 개방 시스템에 적절한 열전달 매체는 이산화탄소, 산소, 헬륨, 수소, 질소 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 냉각 가스 또는 유체는 실내로 직접 방출될 수 있거나, 또는 빌딩 HVAC로 방출될 수 있거나, 또는 대기로의 직접 장출을 위해 빌딩의 외부로 통기될 수 있다. 개방 단부 실시예에서, 열전달 매체의 용기는 각 절차 또는 필요성에 의존하는 특정 수의 절차 후에 대체될 소모성 제품으로서 설계된다.
대안적인 실시예에서, 온도 유도 상변화와 다른 용해 및/또는 활성화 방법은 혈소판 용해 및/또는 혈소판 활성화를 달성하도록 이용될 수 있다. 예를 들어, 혈소판 함유 용액은 혼합 챔버로서 실시되는 용해/활성화 챔버(104)를 특징으로 하는 시스템(100)으로 도입될 수 있다. 혼합 챔버에서, 혈소판 함유 용액은 염화칼슘(CaCl), 트롬빈 등과 같은 용해 및/또는 활성화 유도 화합물 또는 물질과 혼합된다.
임의의 형태의 용해/활성화 챔버를 특징으로 하는 침대 옆에 위치된 시스템의 유효성은 혈소판으로 하여금 용액 내로 치료 내용물을 방출하도록 다른 약품을 도입하는 것에 의해 향상될 수 있다. 생물학적 메커니즘을 통해 혈소판으로 하여금 그 내용물을 방출하도록 하는 보충적인 방법은 혈소판을 "활성화하는" 방법으로서 본 명세서에서 지칭된다. 혈소판 함유 용액에 첨가되는 선택된 활성화제의 용적은 환자 대 환자(patient-to-patient)에 기반하여 결정될 수 있다. 활성화제의 첨가는 혈소판체로 하여금 상기 혈소판체 내의 치료 내용물을 더욱 효과적으로 방출하도록 한다. 활성화제는 트롬빈, CaCl2, ADP 및 에피네프린을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
혈소판을 활성화하기 위한 방법은 또한 혈소판을 높은 전단 응력에 노출시키는 단계와, 혈소판을 유리 또는 콜라겐 코팅 표면에 노출시키는 단계를 포함한다. 그러므로, 추가의 챔버 또는 유체 경로가 혈소판의 활성화를 향상시키는 챔버 또는 용해/활성화 챔버(104) 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 시스템은 동결 해동 스테이지를 제공하는 하나의 챔버를 포함할 수 있으며, 그 후, 혈소판 함유 용액은 주입을 위한 수집 전에 유리 또는 콜라겐 코팅 튜브를 통해 유동한다. 유사하게, 하나 이상의 동결/해동 사이클은 하나의 챔버에서 제공될 수 있으며, 이어서 각 단계가 필요에 따라서 반복되는 것으로 용해 및 활성화의 양을 최대화하도록, 코팅된 튜브를 통해 동결/해동 챔버 내로 다시 혈소판 용액의 유동이 이어진다.
혈소판 활성화에 적절한 높은 전단 응력은 22g 내지 27g의 니들과 크기가 유사한 매우 작은 튜브를 통해 혈소판 용액을 밀어넣는 것에 의해 얻어질 수 있다. 용해 또는 혈소판 활성화를 유발하는 다양한 방법은 임의의 순서로 제공될 수 있다. 예를 들어, 혈소판 함유 용액은 비교적 좁은 통로 또는 구멍에 공급하는 고압 펌프에 의해 시스템 내로 급송될 수 있다. 그러므로, 혈소판은 전단 응력을 받는다. 용액은 그런 다음 동결/해동 사이클이 적용되거나, 또는 염화물, 트롬빈, ADP 또는 에피네프린과 같은 활성화제가 혈소판 함유 용액과 혼합되는 후속의 처리 챔버로 들어갈 수 있다. 각 분리 공정은 그런 다음 혈소판 용해 및 활성화를 최대화하도록 요구되는 바와 같이 반복될 수 있다.
대안적인 실시예에서, 혈소판체의 용해 또는 활성화는 혈소판 함유 용액의 음향 에너지(초음파 분해)의 적용에 의해 유도된다. 초음파 분해는 혈소판 함유 용액 내에서 용해 및/또는 활성화를 유발하도록 선택 주파수 및 진폭의 음향 에너지의 결합으로 지칭된다. 초음파 분해 실시예에서, 혈소판 함유 용액은 시스템 내로 도입되고, 초음파 분해 챔버로서 실행되는 용해 챔버로 유체 경로(105)를 통해 루팅된다. 초음파 분해 챔버에서, 초음파 진동은 혈소판막의 캐비테이션(cavitation) 및 후속의 전단을 유발하는 국부화된 고압 영역을 유도하는 하나 이상의 적절한 트랜스듀서(118)로부터 용액에 결합된다. 혈소판 함유 용액 온도가 단백질을 파괴하거나, 그렇지 않으면 용액에 대한 되돌릴 수 없는 손상을 유발하는 사전 결정된 임계 온도(critical temperature) 이상 상승하지 않도록, 초음파 분해 챔버의 열관리는 유익하다.
여전히 또 다른 실시예에서, 혈소판의 용해/활성화는 저장액으로 혈소판 함유 용액을 도입하는 것에 의해 유발되는 삼투압박에 의해 유도된다. 삼투압은 주위 용액으로부터 물이 혈소판체에 들어가게 한다. 물은 혈소판의 용해 또는 활성화가 일어나도록, 혈소판막이 기계적으로 응력을 받을 때까지 막을 계속 교차할 것이다. 저장액은 유익하게 주입되는데 안전한 물질, 예를 들어 물이다.
혈소판 용해 및/또는 활성화를 효과적으로 유발하도록 이용될 수 있는 또 다른 대안적인 디바이스 및 방법은 도 3a 내지 도 3i 및 도 4에 개략적으로 도시된다. 도 3 및 도 4의 실시예는 도 1에 도시된 것과 유사한 디바이스(100)의 용해/활성화 챔버(104)와 유체 경로(105)의 조합 내에서 실행될 수 있다. 그러므로, 도 3 및 도 4의 실시예는 치료 의사 진료소, 병실, 병원 또는 그렇지 않으면 환자 침대 옆에 위치된 디바이스 내에서 한 번에 모든 단계를 달성하는 침대 옆 시스템에서 실행될 수 있다.
도 3 및 도 4에 도시된 장치와 방법은 비교적 신속히 실행될 수 있으며, 고품질 용해 또는 활성화된 변성 용액을 유발하게 된다. 특히 도 3 및 도 4에 도시된 용해/활성화 방법 및 장치는 온전한 혈소판 α 소낭을 손상시킬 수 있으며, 원하는 성장 인자의 높은 수율을 초래할 수 있다.
도 3a에 도시된 바와 같이, 도 1의 용해/활성화 챔버(104)와 유체 경로(105)는 임의의 적절한 용적을 가지는 혈소판 풍부 혈장 챔버(platelet-rich plasma chamber, PRP 챔버)(300)로서 부분적으로 실행될 수 있다. PRP 챔버(300)는 혈소판 풍부 혈장, 전형적으로 환자로부터 채혈된 혈액으로부터 준비된 자가유래 PRP를 수용한다. PRP는 투입 포트(302)를 통해 PRP 챔버(300) 내로 투입될 수 있다(도 4, 단계 402). 그 후, 용해/활성화 후에, PL 용액은 배출 포트(304)를 통해 인출될 수 있으며, 치료 목적으로 위하여 본 명세서에서 설명된 바와 같이 사용될 수 있다. 배출 포트(304)는 필터(306), 예를 들어 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터, 폴리비닐 다이플루오라이드(PVDF) 필터, 또는 낮은 단백질 혼합을 최적으로 특징으로 하고 비교적 높은 유량을 소유하는 다른 주사기형 필터를 포함한다. 배출 포트(304)는 PL 용액 수집을 용이하게 하도록 진공 및 수집 챔버(308)와 유체 소통으로 배치된다.
도 3b에 도시된 바와 같이, 용해/활성화 공정은 선택된 레벨로 PRP를 갖는 PRP 챔버를 충전하는 것에 의해 개시될 수 있다. 혈소판 수치는 용해/활성화 전에 얻어질 수 있다. 그런 다음, 도 3c에 도시된 바와 같이, PRP 챔버는 충분히 높은 속도로 원심분리 형태로 회전될 수 있으며, 혈소판이 PRP 챔버(300)의 외벽에 모이도록 한다. 진공은 그런 다음 배출 포트에 적용될 수 있으며, 혈장의 인출을 유발한다(도 3d). 도 3e-도 3f에 도시된 바와 같이, 혈소판은 PRP 벽에 또는 그 부근에서 챔버에 남거나, 또는 필터(306)에 의해 포획된다. 혈소판이 필터 인터페이스에서 모임에 따라서, 진공 사이클은 필터에서 및 그렇지 않으면 PRP 챔버 내에서 부분적으로 건조시키거나 또는 완전히 건조시키도록 계속될 수 있다(도 3g)(도 4, 단계 406).
건조(desiccation)는 혈소판의 용해를 완전히 또는 부분적으로 유발할 수 있다. 도 3h에 도시된 바와 같이, 완전히 또는 부분적으로 건조된 혈소판은 적절한 유체, 예를 들어 살균한 "주입을 위한 물(water for injections)"(WFI)에 현탁될 수 있다(도 4, 단계 408). 현탁된 혈소판은 일정 시간 후에 보충 화학적 용해/활성화제, 예를 들어 CaCl로 처리될 수 있다(도 4, 단계 410). 혈소판 수치는 적시에 다양한 지점에서 결정될 수 있다. 혈소판 건조, 현탁 및 용해/활성화제 첨가의 임의의 조합은 적절한 혈소판 용해/활성화를 유발하도록 이용될 수 있다. 그런 다음, 도 3i에 도시된 바와 같이, PL 용액은 PRP 챔버로부터 인출되고, 주사기와 같은 적절한 용기에 배치되고, 치료 목적을 달성하도록 환자에게 재주입된다(도 4, 단계 412-414).
혈소판은 과립으로 구성된다; 주로 과립이 혈소판 발생 동안 미리 포장되는 α-과립(및 어느 정도 치밀한 과립). 현재의 이론에 따라서, 혈소판이 만들어지고 거핵세포(megakaryocyte)로 방출되면, 이는 지금까지 함유할 모든 성장인자를 함유한다; 그 대부분은 이전의 과립 내에 포장된다. 또한, 모든 혈소판이 과립 함유물에 관하여 동일한 내용물을 가지는 것으로 보이지 않는다. 그래서, 혈소판이 용해 및/또는 활성화되면, 용액에서 성장 인자 함유량을 최대화하도록 과립의 온전성을 파괴하는 것이 유익하다. 예를 들어, 도 3h에 대하여 설명된 바와 같이, 과립 파괴는 도 3 시리즈에서 "필터 건조" 단계 후에 CaCl2의 첨가 동안 일어날 수 있다. 그러나, 여과 공정 동안 온전함을 유지하는 이러한 과립은 기공 크기가 너무 작고, 이에 의해 최종 주입 가능한 가치있는 치료 내용물을 제거하면 제품 수집 용기 내로 보내지지 못하게 될 수 있다. 따라서, 한 실시예는 0.22 ㎛보다 큰, 예를 들어 0.45 ㎛의 필터 기공 크기를 포함한다.
상기된 임의의 실시예에서, 시스템을 통해 혈소판 함유 용액을 움직이는데 요구되는 힘은 몇 개의 대안적인 수단에 따라서 발생될 수 있다. 예를 들어, 혈소판 함유 용액은 주사기로 시스템(100) 내로 도입될 수 있다. 주사기 플런저가 눌려짐으로써, 혈소판 함유 용액은 시스템의 유체 경로(105) 내로 유동된다. 디바이스 작업의 선택된 프로토콜은, 플런저의 완전한 물림이 실질적으로 모든 혈소판 함유 용액을 용해/활성화 챔버 내에 위치시키도록 기계에 첨가될 혈소판 함유 용액의 특정 용적을 확인하도록 실행될 수 있다. 용해/활성화 작업이 완성되면, 배출 밸브(106)는 활성화되고 빈 혈소판 함유 용액 주사기는 분리되고, PL 용액이 열 용해/활성화 챔버 밖으로 유동된다. 유동 유도 및 제어의 다른 실시예는 하나 이상의 연동 펌프 또는 다른 펌프, 조절 가능한 용적, 단면 이용 드립 유동(section utilizing drip flow) 또는 다른 형태의 중력 유도 유동(gravity induced flow)을 포함할 수 있다.
이전의 디바이스와 방법 실시예는 혈소판을 용해하고 활성화하기 위한 몇개의 뚜렷한 방법을 설명한다. 개시된 방법은 임의의 순서로 조합될 수 있다. 다음에 설명되는 바와 같이, 이러한 많은 방법은 용액에서 90% 이상의 혈소판 용해를 초래한다. 예를 들어, 용해, 활성화 및 성장 인자 농도에 특히 잘 적합한 방법의 한 조합은 다중의 동결 해동 단계들이며, 뒤이어 혈소판이 용액으로부터 원심 분리되고 삼투압박을 부과하도록 선택된 농도의 염화칼슘과 물에 노출된다.
실시예들
다음의 예들은 단지 예시의 목적을 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 다음에 상세히 설명되는 각각의 예에서 검사되는 샘플은 4명의 헌혈 대상자로부터 채혈된 혈액으로부터 준비되었다. 초기 채혈은 원심 분리를 통해 분리되었으며, 분리의 혈소판 풍부 혈장 부분은 격리되고 잘 혼합되었다. 혈소판 풍부 혈장은 다음에 상세히 설명되는 바와 같은 상이한 용해/활성화 공정을 거치도록 동등한 용적으로 분할되었다. 각 예에서, 용해 및/또는 혈소판 활성화를 나타내는 4개의 파라미터가 측정되었다. TGF-β 및 VEGF 성장 인자 단백질 농도가 상업적으로 시판중인 ELISA 키트를 사용하여 비교되었다. 혈소판 용해의 양은 용해/활성화 공정 전후에 혈소판의 양을 측정하도록 2개의 포지티브 혈소판 표면 마커 CD41 및 CD61를 갖는 유세포 분석기(flow cytometery)를 사용하여 측정되었다. 혈소판 활성화의 양은 용해가 활성화된 후에 잔류하는 혈소판의 수를 측정하도록 활성화된 혈소판 표면 마커 CD62p를 사용하는 유세포 분석기로 측정되었다.
실시예 1
상기된 바와 같이, 다중의 동결 해동 사이클이 용액에서 혈소판 용해 또는 활성화를 유발하고 혈소판으로부터 치료 내용물의 세포외 배출(exocytosis)을 촉진하도록 이용될 수 있다. 도 5는 하나의 동결 해동 사이클과 적어도 3개의 동결 해동 사이클 사이의 혈소판 용해, 용액에 잔류하는 활성화된 혈소판, 성장 인자 농도의 백분율 증가를 그래프로 도시한다. 유사한 테스트가 2개의 상이한 동결 온도에서 수행되었다. 예 1에서 검사된 샘플은 상기된 바와 같이 준비되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 관측된 용해/활성화 파라미터에서의 증가는 다수의 동결/해동 사이클 후에 주목되었다. 특히, 다중의 동결/해동 사이클은 테스트가 어느 한 온도 범위에서 수행되었을 때 검출된 GF-β 및 VEGF 성장 인자의 큰 백분율 증가를 초래하였다. 혈소판 용해 및 활성화에서의 증가는 -60℃ 내지 -80℃의 온도 외에 다중의 동결/해동 사이클 동안 또한 관측되었다.
실시예 2
대안적인 동결 및 해동 방법이 관측된 용해 및 활성화의 양에 영향을 주도록 측정되었다. 예를 들어, 도 6은 동결 매체로서 공기를 사용하는 것에 대하여 동결 매체로서 이소프로필 알코올(IPA)을 사용한 후에 측정된, 검출 성장 인자 함유량, 혈소판 용해 및 혈소판 활성화에서의 백분율 증가를 그래프로 도시한다. 예 2에서 샘플은 상기된 바와 같이 초기에 준비되었다. 각 샘플은 하나의 동결/해동 사이클을 겪었다. 냉각 매체로서 IPA를 사용하여 테스트 된 혈소판 용액은 냉각된 IPA 조로 -10℃ 내지 -30℃ 범위의 냉온을 겪었으며, 20℃ 내지 50℃의 범위의 온도에서 해동되었다. 냉각 매체로서 공기를 사용하여 검사된 혈소판 용액은 -60℃ 내지 -80℃의 온도에서 순환 공기 동결기에 배치되었고, 20℃ 내지 50℃의 온도의 공기로 해동되었다. 동결 매체로서 이소프로필 알코올의 사용이 냉각 매체로서 압축 공기로 준비된 변성 혈소판 용액과 비교될 때보다 높은 성장 인자 농도, 용해에서 작은 감소를 갖지만, 활성화된 혈소판에서의 증가를 초래한다는 것이 관측될 수 있다. 예 2는 혈소판 활성화가 혈소판 용해의 보다 적은 정도의 존재시에 치료학적 혈소판 내용물의 방출에서 상당한 역할을 할 수 있다는 것을 설명한다.
실시예 3
도 7은 용해/활성화 공정의 하나의 단계로서 용해/활성화제, CaCl2의 첨가에 의한 성장 인자 농도, 혈소판 용해 및 혈소판 활성화에서 백분율 증가를 그래프로 도시한다. 예 3에서 검사된 샘플은 상기된 바와 같이 초기에 준비되었다. 각 샘플은 각 해동 단계와 함께 다중의 동결/해동 사이클을 겪었으며, 이어서 혈소판 용액이 27g 니들을 통하여 적어도 5회 강제되는 전단 공정이 이어졌다. 선택된 샘플은 0.5 내지 4 μΜ CaCl2가 첨가되었다. 도 7은 동일한 동결/해동 및 전단 단계로 준비되지만, 최종의 CaCl2가 없는 샘플과 비교하여 최종적으로 CaCl2가 첨가된 샘플에 대해 관측된 용해/활성화 파라미터의 백분율 증가를 도시한다.
실시예 4
도 8은 삼투압박을 겪지 않은 샘플과 비교되는 저장액으로 삼투압박을 겪은 샘플의 성장 인자 농도, 혈소판 용해 및 혈소판 활성화의 백분율 증가를 그래프로 도시한다. 도 8에서 검사된 샘플은 상기된 바와 같이 초기에 준비되었다. 특정 샘플은 그런 다음 혈소판 풍부 혈장 용액으로부터 혈소판을 제거하도록 원심 분리를 사용하여 처리되었다. 제거된 혈소판은 그런 다음 혈소판이 삼투압박을 격은 저장성 물(hypotonic water)에 현탁되었다. 삼투압박을 겪은 혈소판 용액의 성장 인자 농도는 삼투압박을 겪지 않은 샘플의 성장 인자 농도보다 상당히 높다.
실시예 5
실시예 5는 혈소판이 용액으로부터 뚜렷이 원심 분리된 결과, 옮겨 부어진 상층액(supernatant)과 -10℃ 내지 -30℃에서 동결된 결과적인 펠릿형 혈소판을 예시한다. 혈소판 펠릿은 그런 다음 분석되기 전에, 이전에 인출된 상층액에 다시 현탁되었다. 실시예 5의 제어 그룹은 유사한 온도에서 한번 동결/해동 사이클을 겪는 한편 용액에 잔류하였다. 각 그룹에서 수행된 용해/활성화 분석의 결과의 비교는 도 9에 그래프로 도시된다. 성장 인자 농도, 혈소판 용해 및 혈소판 활성화는, 용액에 남아 있는, 유사하게 처리된 혈소판과 비교될 때, 원심 분리를 사용하여 용액으로부터 제거된 후에 혈소판이 동결/해동 사이클로 처리될 때보다 다소 높다는 것이 관측된다.
실시예 6
도 10은 용해 및 활성화 방법의 대표적인 조합 동안 성장 인자 농도, 혈소판 용해 및 혈소판 활성화의 백분율 증가를 그래프로 도시한다. 예 6의 테스트 혈소판의 하나의 그룹은 용액으로부터 뚜렷이 원심 분리되었다. 결과적인 혈소판 펠릿을 수용하는 용기는 5 내지 60분의 기간동안 -10℃ 내지 -30℃의 IPA 매체에 배치되었다. 혈소판은 저장액에 재현탁 되었으며, 실온에서 1 내지 20분 동안 용해/활성화하도록 허용되었다. 그런 다음 0.5 내지 4 μΜ의 농도 범위의 CaCl2가 용액에 첨가되었으며, 샘플은 다른 동결 사이클 동안 초기 인출된 상층액에 다시 배치되었다. 샘플은 그런 다음 20℃ 내지 50℃의 온도에서 다시 해동되고 분석되었다. 제어 샘플은 순환 매체로서 공기와 함께 동결기에서 단일의 동결/해동 사이클을 겪었다. 성장 인자 농도와 활성화에서 매우 큰 증가가 상기된 단계들의 조합 후에 주목되었다. 그러나, 혈소판 용해의 백분율 증가는 단지 10%인 것으로 관측되었다. 그러므로, 용액에서 수행된 한번의 동결/해동 절차는 혈소판의 대략 90%의 용해를 달성한 반면에, 조합 방법은 혈소판의 대략 99.8%의 용해를 유발하였다는 것으로 결론을 내릴 수 있었다. 용액에 남아있는 활성화된 혈소판의 백분율 증가는 간단한 단일의 동결/해동 방법과 비교하여 조합 방법에서 대략 36%이었다.
본 발명의 다양한 실시예는 각 종속항이 선행 종속항뿐만 아니라 독립항의 각각의 제한을 통합한 다중 종속항인 것처럼 청구항에서 인용된 다양한 구성요소의 순열 조합을 포함할 수 있다. 이러한 순열 조합은 본 발명의 범위 내에서 명시된다.

Claims (24)

  1. 디바이스로서,
    하우징(housing);
    상기 하우징 내로 혈소판 함유 용액의 투입을 제공하는 투입 포트(input port);
    상기 투입 포트와 유체 소통하고 상기 하우징 내에 위치되는 용해/활성화 챔버(lysis/activation chamber)로서, 상기 투입 포트에서 상기 디바이스로 투입된 상기 혈소판 함유 용액 내의 하나 이상의 혈소판이 상기 용해/활성화 챔버에서 용해 또는 활성화를 겪고, 이에 의해 변성 용액(modified solution)을 생성하는, 상기 용해/활성화 챔버; 및
    상기 용해/활성화 챔버와 유체 소통하는 상기 하우징으로부터의 배출 포트(outlet port)로서, 상기 배출 포트를 통해 제거되는 변성 용액을 제공하는, 상기 배출 포트를 포함하는 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 용해/활성화 챔버와 열 소통하는 가열 및 냉각 모듈을 추가로 포함하며, 상기 가열 및 냉각 모듈은 상기 용해/활성화 챔버 내에서 혈소판 함유 용액의 하나 이상의 혈소판의 열 용해 또는 활성화를 제공하는 디바이스.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 용해/활성화 챔버는 일정 길이의 폐기 가능한 살균 튜브를 포함하는 디바이스.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 가열 및 냉각 모듈은 혈소판 함유 용액을 상기 용해/활성화 챔버 내에서 전체적으로 또는 부분적으로 동결하고 전체적으로 또는 부분적으로 해동하는 디바이스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 가열 및 냉각 모듈은 혈소판 함유 용액이 상기 용해/활성화 챔버 내에서 하나 이상의 동결 및 해동 사이클을 겪게 하는 디바이스.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 하우징 내로의 적어도 하나의 보충 투입 포트를 추가로 포함하고, 상기 보충 투입 포트는 상기 용해/활성화 챔버와 소통하며, 상기 용해/활성화 챔버 내에서 하나 이상의 혈소판을 용해 또는 활성화하도록 혈소판 함유 용액과 접촉하는 물질의 도입을 제공하는 디바이스.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 하우징 내의 적어도 하나의 음향 트랜스듀서를 추가로 포함하며, 상기 음향 트랜스듀서는 상기 용해/활성화 챔버에 기계적으로 연결되고, 상기 음향 트랜스듀서는 상기 용해/활성화 챔버에 있는 혈소판 함유 용액 내의 하나 이상의 혈소판을 초음속 용해 또는 활성화하도록 상기 용해/활성화 챔버에 음향 에너지를 소통시키도록 구성되는 디바이스.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 용해/활성화 챔버는, 상기 배출 포트와 작동적으로 결합되어, 상기 배출 포트로부터 유체의 제거를 제공하는 한편 상기 용해/활성화 챔버 내에서 혈소판을 유지하는 필터를 추가로 포함하는 디바이스.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 필터는 0.45㎛ 이하의 필터 기공 크기를 가지는 PVDF 또는 PES 필터를 포함하는 디바이스.
  10. 제8항에 있어서, 상기 필터는 0.22㎛ 이상의 필터 기공 크기를 가지는 PVDF 또는 PES 필터를 포함하는 디바이스.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 하우징 내의 진공 시스템을 추가로 포함하며, 상기 진공 시스템은 상기 배출 포트와 작동적으로 결합하고 혈소판 함유 용액으로부터 혈장의 인출을 제공하는 디바이스.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 용해/활성화 챔버에 결합되고 상기 하우징 내에서 상기 용해/활성화 챔버의 회전을 제공하는 회전 디바이스를 추가로 포함하는 디바이스.
  13. 하우징을 가지는 디바이스의 투입 포트 내로 혈소판 함유 용액을 도입하는 단계;
    상기 투입 포트로부터 상기 하우징 내의 용해/활성화 챔버로 혈소판 함유 용액을 유동시키는 단계;
    변성 용액을 생성하도록 상기 용해/활성화 챔버에 있는 혈소판 함유 용액 내의 하나 이상의 혈소판을 용해 또는 활성화하는 단계; 및
    상기 하우징의 배출 포트를 통해 변성 용액을 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    환자 내로 변성 용액을 재주입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    혈소판 용해 또는 활성화는, 상기 용해/활성화 챔버에 있는 혈소판 함유 용액을 주기적으로 냉각하고 가열하는 것에 의해, 혈소판 함유 용액 내에서 하나 이상의 부분적 또는 완전한 동결 및 해동 사이클을 유발하여, 상기 용해/활성화 챔버 내에서 유발되는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    혈소판 용해 또는 활성화는 상기 용해/활성화 챔버에서 용해 또는 활성화 유발제와 혈소판 함유 용액을 혼합하는 것에 의해 유발되는 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    혈소판 용해 또는 활성화는 상기 용해/활성화 챔버에서 혈소판 함유 용액에 음향 에너지를 적용하는 것에 의해 유발되는 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    혈소판 용해 또는 활성화는 상기 용해/활성화 챔버에서 혈소판 함유 용액이 삼투압 처리되는 것에 의해 유발되는 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    혈소판 용해/활성화는 상기 용해/활성화 챔버에서 혈소판 함유 용액을 부분적으로 또는 완전히 건조시키는 것에 의해 유발되는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    혈소판 용해/활성화는 상기 용해/활성화 챔버에서 용해 또는 활성화 유발제와 건조된 혈소판 함유 용액을 혼합하는 것에 의해 더욱 유발되는 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 용해/활성화 챔버에서 혈소판 함유 용액을 부분적으로 또는 완전히 건조시키기 전에 혈소판 함유 용액으로부터 혈장을 여과하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 용해/활성화 챔버에서 혈소판 함유 용액을 부분적으로 또는 완전히 건조시키기 전에 혈소판 함유 용액에 있는 혈소판을 원심 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    혈소판은 축 주위에서 상기 용해/활성화 챔버를 회전시키는 것에 의해 원심 분리되는 방법.
  24. 제13항에 있어서,
    한번 사용 후에 혈소판 함유 용액 또는 변성 용액 중 하나에 의해 적셔진 적어도 하나의 디바이스 구성요소를 폐기하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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