JP2008246200A - 血清調製方法及び血清調製装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法において、血液中の血小板の細胞膜を破壊する処理を行う血小板処理工程を設けた。血小板処理工程の後には、血液中の易熱性タンパク質を析出させる析出工程と、この析出工程により析出した易熱性タンパク質を除去する除去工程とを設けることが好ましい。
【選択図】図1
Description
幹細胞の体外培養増殖では、培地に血清を添加すると、培養効率を向上させることが分かっている。
細胞増殖因子は血小板に含有されており、そこから放出される細胞増殖因子の量は、血小板の活性状態に依存し、血小板の活性状態は血小板の鮮度に依存する。特許文献2に開示されている方法は、血液をガラスビーズと接触させることで血小板を自発的に活性化させる方法であるため、使用する血液が古ければ、血液中の血小板の量から推測される量の細胞増殖因子を得ることは困難であり、高い培養効率を奏することが可能な血清を一度に大量に得ることができない。
また、「血清」とは、採取した血液を放置すると流動性が低下し、その後に赤い凝固塊(血餅)から分離される淡黄色の液体、又は細胞増殖因子を多く含む淡黄色の血液の液性成分をいう。
また、「多血小板血漿」とは、通常の全血中の血小板濃度よりも、より多くの血小板を含む血液の液性成分をいう。
また、本発明によれば、例えば成分献血で採取された血液のように、抗凝固処理が施された血液であっても血清を調製することが可能となるため、体調上の問題から全血を採取することが困難な患者であっても、身体に負担をかけることなく血清を製造することが可能となる。
[血清調製方法]
本発明は、少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法であって、前記血液中の血小板の細胞膜を破壊する血小板処理工程を有する血清調製方法である。
凍結融解処理は、凍結と融解の工程を少なくとも1回以上行う処理である。凍結工程における凍結温度は、−196℃〜−1℃、好ましくは−80℃〜−5℃であり、凍結状態保持時間は、容量によって異なるが1秒以上であることが好ましい。また、融解工程における融解温度は、0℃〜56℃、好ましくは4℃〜37℃であり、融解状態の保持時間は容量によって異なるが1秒以上であることが好ましい。
遠心分離処理は、血液を血液バッグ等の容器に収容し、この血液が収容された容器を、10000〜100000G、5〜600分の条件で遠心分離を行う。なお、血小板処理工程として、遠心分離処理を採用する場合には、血液として多血小板血漿を用いることが好ましい。
物理的な負荷をかける処理としては、例えば、血液中にガラスビーズを混和させ、このガラスビーズが混和された血液を、遠心分離機等により撹拌する混和・撹拌処理が挙げられる。
また、献血で採血された血液のように、抗凝固処理が施されたものであってもよい。ここで、「抗凝固処理」とは、採取した血液にCPD液(Citrate−Phosphate−Dextrose solution)やACD−A液(Acid−Citrate−Dextrose−A solution)等の抗凝固剤を添加することをいう。抗凝固剤は予め採血された血液を貯留する血液バッグに添加されていることが好ましい。この抗凝固剤は、「血小板処理工程」を経た後の血液に、塩化カルシウム等に由来するカルシウムイオンを添加して中和することにより除去してもよい。
これによって抗凝固剤が添加された血液を用いた場合であっても、上記のような薬剤を添加することなく、易熱性タンパク質を除去することが可能となる。易熱性タンパク質としては、フィブリノゲン、補体成分が挙げられる。
なお、上述の血液処理工程と同様の理由から、当該「析出工程」も、採取された血液が貯留されている血液バッグや採血管等の容器にそのまま施すことが好ましい。
本実施形態では、抗凝固剤を添加しない状態で血清を調製する点が第1実施形態と異なる。
本実施形態では、血小板処理工程を経た血液は、血小板のみならず、赤血球や白血球の細胞膜も破壊された所謂溶血状態になる。そのため、赤血球中のヘモグロビンや白血球中のDNA及びRNAを取り除くために、血小板処理工程と析出工程の間に、赤血球と白血球に由来する成分を除去する処理を行う。具体的には、吸着カラムやフィルター等を用いて除去する。なお、ヘモグロビンを取り除く場合には吸着カラムを用いることが好ましく、DNA及びRNAを取り除く場合にはフィルターを用いることが好ましい。
[血清調製装置]
次に、上述した本発明の血清を調製する血清調製装置について説明する。
本発明の血清調製装置は、少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製装置であって、前記血液を貯留する血液貯留部と、この血液貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記血液貯留部に貯留された血液より分離された血清を収容する成分収容部と、を備える血清調製装置である。以下、本実施形態に係る血清調製装置について、詳細に説明する。
なお、全血貯留部11は、内部に抗凝固剤が充填されている、所謂血液バッグや分離バッグであってもよい。血液貯留部10の内部は前もって滅菌処理が施されている。本実施形態においては、予め抗凝固剤が添加されたものを用いている。
上記構成を有する血清調製装置1を用いた血清調製操作について、図1及び図2〜3を用いて説明する。なお、特に断りがない限り、符号は図1に記載の符号である。
なお、チューブ43の経路閉鎖は、柔軟性を有するチューブ43を、クランプ90の円板91とベース92との間で挟むことにより行われる。
血小板処理工程S6により、血小板の細胞膜が破壊され、血小板の中の細胞増殖因子が放出される。これによって、血小板又は血液の鮮度に拘らず、血小板が含有している全ての細胞増殖因子を得ることができる。
なお、析出工程S7における加温処理は血清調製装置1全体を加温してもよい。
図4及び図5は、本発明の第4実施形態に係る血清調製装置1Aを示した図である。本実施形態においては、血液貯留部10Aが、全血貯留部と血漿貯留部とで構成されておらず、一つの袋体で構成されており、血液貯留部10Aが多血小板血漿を貯留する血漿貯留部12Aのみから構成されている点が、第3実施形態と異なる。
図4において、血漿貯留部12Aには、例えば成分献血で採取された多血小板血漿が貯留されることになる。この場合、チューブ42Aと血漿貯留部12Aは、始めは接続されていない。使用する際には、チューブ42Aを接続部70に差込み、血漿貯留部12A側のチューブ42A’と連結する。なお、採血時に使用されていたチューブ41Aは、予め溶断されていることが好ましい。接続部70としては、例えば挿入具の挿脱にともなって弁体のスリット状開口部が開閉する機能を有する気密性の高い混注ポート(日本国特許第3389983号等参照)を備えた構成が挙げられる。
なお、本実施形態において、図6に示すように、血漿貯留部12Aとチューブ42Aとが、接続部70を介さず、予め一体的に接続されてなる構成であってもよい。
このような構成にすることによって、献血のように外部で採取された血液を使用することが可能となる。また、成分献血で採取された血液を使用することができるため、体調上の問題から全血を採取することができない患者でも血清を容易に調製することができる。なお、本実施形態におけるその他の構成は、第3実施形態に係る血清調製装置と同様であるためその他の部分についての説明は省略する。
図7及び図8は、本発明の第5実施形態に係る血清調製装置1Bを示した図である。
本実施形態においては、血液貯留部10Bが血漿貯留部12Bのみから構成されており、この血漿貯留部12Bに超音波を発生させる超音波発振子13を収容可能な超音波発振子収容部14が設けられている点が、第1実施形態と異なる。
超音波発振子13は、棒状であり、筒状部材15の開放された一端側から中空部内に挿入される。即ち、本実施形態では、筒状部材15の中空部が超音波発振子収容部14を構成する。
超音波発振子13は、接続線を介して超音波発生装置本体16に接続されており、この超音波発生装置本体16に設けられたスイッチを作動させることにより、超音波を発振する。
また、超音波発振子収容部14を、血漿貯留部12Bの内部空間と外部空間とが隔絶された状態で接続できる。これにより、血漿貯留部12Bの内部空間の無菌性を確保しつつ、血小板処理工程を行うことが可能となる。
血小板処理工程における、血小板の細胞膜を破壊する方法の検討を行った。
まず、全血から多血小板血漿を分離する。始めにヒト血液10mlに、CPD液を1.4ml添加し、20℃のもと3500rpmで8分間遠心分離(遠心分離機:株式会社久保田製作所製)を行った。次いで、分離された血漿層とバフィーコート層を分離し、20℃のもと800rpmで8分間遠心分離を行い、上澄みを多血小板血漿として分離した。これを試験用の検体とした。
(実施例1)−80℃で10分間凍結させ、その後37℃で融解させる処理を3回実施
(実施例2)超音波処理を15分間実施
(実施例3)超音波処理を30分間実施
(実施例4)直径1mmのガラスビーズを多数加えた容器の中で10分間激しく撹拌する処理を実施
(比較例1)直径4mmのガラスビーズ5個と27.8w/v%の塩化カルシウムを10μl添加し、37℃で30分間加温処理を実施
(参考例1)14000Gで10分間遠心分離を1回実施
(参考例2)14000Gで10分間遠心分離を3回実施
10、10A 血液貯留部
11 全血貯留部
110 本体部
110a 外縁部
12 血漿貯留部
20 成分収容部
21〜26 袋体
30 採血針
41〜47,51〜57 チューブ
61〜66 分岐体
70 接続部
71 多血小板血漿
80 加圧機
90 クランプ
91 円板
92 ベース
Claims (10)
- 少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製方法であって、
前記血液中の血小板の細胞膜を破壊する処理を行う血小板処理工程を有する血清調製方法。 - 前記血小板処理工程は、前記血液に、熱処理、超音波処理、遠心分離処理、加圧・減圧処理又はガラスビーズによる混和・撹拌処理の少なくともいずれかの処理を行う工程である請求項1記載の血清調製方法。
- 前記血液として、抗凝固処理が施された血液を用いる請求項1又は2記載の血清調製方法。
- 前記血小板処理工程を経た血液中の易熱性タンパク質を析出させる析出工程を更に有する請求項1〜3のいずれかに記載の血清調製方法。
- 前記析出工程により析出した前記易熱性タンパク質を除去する除去工程を更に有する請求項4記載の血清調製方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の血清調製方法により調製された血清。
- 少なくとも血小板を含有する血液から血清を調製する血清調製装置であって、
前記血液を貯留する血液貯留部と、
該血液貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記血液貯留部に貯留された血液より分離された血清を収容する成分収容部と、を備える血清調製装置。 - 前記血液貯留部は、全血を貯留する全血貯留部と、該全血貯留部に無菌的かつ気密に連結され、前記全血貯留部に貯留された全血より分離された多血小板血漿を貯留する血漿貯留部と、を備える請求項7記載の血清調製装置。
- 前記血液貯留部は、多血小板血漿を貯留する血漿貯留部である請求項7記載の血清調製装置。
- 前記血液貯留部と前記成分収容部とは、これらを分離及び接続可能な接続部により接続される請求項7〜9のいずれかに記載の血清調製装置。
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