KR20210053191A

KR20210053191A - 친환경 스마트 혈액 모듈레이션 장치

Info

Publication number: KR20210053191A
Application number: KR1020200132968A
Authority: KR
Inventors: 김진왕; 이정옥; 김현지; 김현우
Original assignee: 김진왕; 김현지; 김현우; 이정옥
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2021-05-11
Also published as: KR102252218B1; US20220111401A1; US12036565B2

Abstract

본 발명은 혈액공급부; 원심분리기; 광조사부; 여과장치; 및 혈액수집부를 포함하는 혈액처리장치로서, 상기 장치는 혈액공급부로부터 공급된 혈액을 원심분리기에 도입하여 원심분리를 실시하고, 상기 원심분리된 혈액을 광조사부에 구비된 투명 튜브를 통과시키면서 투명 튜브 외부에서 830±5nm 파장의 적외선 램프, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프를 포함하여 구성된 광조사 장치에 의해 광을 조사하고, 상기 광조사가 완료된 혈액을 여과장치를 통하여 여과하여 혈액 수집부로 혈액을 수집하는 것을 특징으로 하는 혈액처리장치를 제공한다.

Description

친환경 스마트 혈액 모듈레이션 장치{Eco-Friendly Smart Blood Modulation Device}

본 발명은 원심분리 및 광조사를 이용하여 혈액 상태를 개선하기 위한 친환경 스마트 혈액 모듈레이션 장치에 관한 것이다.

혈액은 뼈 속의 골수에서 생성되며, 우리 몸은 4~6 리터의 혈액을 보유하고 있다. 혈액은 심장박동으로 동맥, 모세혈관 및 정맥을 통하여 순환된다. 혈액은 산소와 영양분 노폐물을 운반하며, 백혈구와 항체 등을 통해 세균 감염 등의 질병으로부터 우리 몸을 보호한다. 혈액은 혈구와 혈장 성분으로 구성되며, 혈구와 골수의 조혈모 세포로부터 적혈구, 백혈구, 혈소판이 분화되어 생성된다. 혈장은 대부분 수분으로 구성되어 있으며, 단백 성분, 화학물질 및 전해질 등이 함유되어 있다.

혈액은 몸 곳곳에 산소와 영양분을 전달하는 기본적인 기능 외에도 체온을 조절하고, 조직세포에서 필요로 하는 수분량이나 전해질 농도를 일정하게 유지시키는 다양한 일을 하고 있다. 혈액 속 백혈구 등 면역성 물질은 외부 세균으로부터 우리 몸을 보호하며, 인체 내에서 발생하는 암 등의 건강 위협요인을 제거하는 기능을 수행하기도 한다.

그러므로, 혈액에 의한 면역작용은 건강한 신체의 필수 조건이라 할 수 있다. 혈액은 백혈구 등 면역성 물질을 운반할 뿐, 면역성 물질을 생성하는 역할을 하는 것이 아니므로, 혈액 단계에서 면역기능을 향상시키는 방법은 잘 알려져 있지 않다.

대한민국 등록특허 제10-0915559 호

본 발명자는 혈액의 면역기능을 향상시키는 효과적인 방법을 찾기 위하여 예의 노력한 바, 혈액에 대한 원심분리와 광조사를 통하여 혈액의 면역 기능을 향상시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

그러므로, 본 발명은 안전하게 효과적으로 혈액의 면역기능을 향상시킬 수 있는 친환경 스마트 혈액 모듈레이션 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 혈액공급부; 원심분리기; 광조사부; 여과장치; 및 혈액수집부를 포함하는 혈액처리장치로서,

상기 장치는 혈액공급부로부터 공급된 혈액을 원심분리기에 도입하여 원심분리를 실시하고, 상기 원심분리된 혈액을 광조사부에 구비된 투명 튜브를 통과시키면서 투명 튜브 외부에서 830±5nm 파장의 적외선 램프, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프 램프를 포함하여 구성된 광조사 장치에 의해 광을 조사하고, 상기 광조사가 완료된 혈액을 여과장치를 통하여 여과하여 혈액 수집부로 혈액을 수집하는 것을 특징으로 하는 혈액처리장치를 제공한다.

본 발명의 친환경 스마트 혈액 모듈레이션 장치는 안전하게 효과적으로 혈액의 면역기능을 향상시키는 효과를 제공한다.

또한, 본 발명의 친환경 스마트 혈액 모듈레이션 장치는 혈액 상태의 면역기능을 향상시킴으로써, 고형암, 혈액암 등의 항암, 항염 표적세포치료, 자가면역 교정, 심장병, 당뇨병, 폐질환, 간질환, 위장계 질환, 근골격계 질환, 파킨슨병, 뇌종양, 뇌수종, 항노화, 저산소증, 메르스, 에이즈, 에볼라 등의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있다.

도 1 및 2는 본 발명의 혈액처리장치 구조도이다.
도 3은 본 발명의 휴대용 혈액처리장치 구조도이다.
도 4는 본 발명의 중형 혈액처리장치 구조도이다.
도 5는 본 발명의 대형, 수평형 혈액처리장치 구조도이다.

이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 본 발명을 설명하기에 앞서 관련된 공지기능 및 구성에 대한 구체적 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그에 대한 설명은 생략하기로 한다.

아래 설명과 도면은 당업자가 설명되는 장치와 방법을 용이하게 실시할 수 있도록 특정 실시예를 예시한다. 다른 실시예는 구조적, 논리적으로 다른 변형을 포함할 수 있다. 개별 구성 요소와 기능은 명확히 요구되지 않는 한, 일반적으로 선택될 수 있으며, 과정의 순서는 변할 수 있다. 몇몇 실시예의 부분과 특징은 다른 실시예에 포함되거나 다른 실시예로 대체될 수 있다.

도 1 및 2는 본 발명의 친환경 스마트 혈액 모듈레이션 장치의 구성을 모식적으로 도시한 도면이다. 도 1 및 2에 예시된 바와 같이, 본 발명은 혈액공급부(10); 원심분리기(20); 광조사부(30); 여과장치(40); 및 혈액수집부(50)를 포함하는 혈액처리장치로서, 상기 장치는 혈액공급부(10)로부터 공급된 혈액을 원심분리기(20)에 도입하여 원심분리를 실시하고, 상기 원심분리된 혈액을 광조사부(30)에 구비된 투명 튜브(32)를 통과시키면서 투명 튜브 외부에서 830±5nm 파장의 적외선 램프, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프를 포함하여 구성된 광조사 장치(31)에 의해 광을 조사하고, 상기 광조사가 완료된 혈액을 여과장치(40)를 통하여 여과하여 혈액 수집부(50)로 혈액을 수집하는 것을 특징으로 하는 혈액처리장치에 관한 것이다.

본 발명의 혈액처리장치에 있어서, 상기 각 구성요소들은 혈액이 이동할 수 있는 의료용 관에 의해 연결될 수 있으며, 혈액의 자동 흐름은 이 분야의 공지의 기술에 의해 구현될 수도 있음을 밝혀둔다.

상기 혈액공급부(10)는, 도 1에 나타낸 바와 같이, 헌혈에 의해 채취된 혈액이 담긴 용기(예: 혈액백)로 구성될 수 있으며, 도 2에 나타낸 바와 같이, 인체로부터 직접 혈액을 채취하는 장비로 구성될 수도 있다.

상기 원심분리기(20)는 혈액을 원심분리하기 위한 장치로서, 혈액의 원심분리에 의해 혈액에서 자체적으로 광감작제를 생성하기 위한 목적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 혈액처리장치는 외부에서 광감작제를 투여하는 방식으로 운용될 수도 있다. 상기 광감작제로는 Porphyrin계인 photofrin(캐나다), photogem(러시아), photosan(독일), 5-ALA(Amino levulinic acid)(캐나다), Chlorine계인 Phthalocyanines, Benzoporphyrin, ladaChlorine, Tin-etio-Purpurin, Antrine, Texaphyrin, merocyanines-540, 8-MOP(Psorane) 등을 들 수 있다. 위의 성분들은 헤모글로빈 생성과정에서 발생하는 물질이므로, 인체 혈액 내에서도 원심분리 등에 의해서 자체적으로 생성이 유도될 수도 있다.

,

광의 종류 중 엘이디로는 레이저 엘이디, 큐엘이디, 오엘이디 등이 사용될 수 있다. 상기에서 광조사는 연속파, 단파, 펄스파 등의 형태로 조사될 수 있다.

본 발명의 혈액처리장치에서 상기 원심분리는 1,000 내지 4,500 rpm, 더욱 바람직하게는 2,500 내지 3,500 rpm으로 회전하는 원심분리기(20)에서 10초 내지 3 분간, 더욱 바람직하게는 15초 내지 1분간 실시될 수 있다.

또한, 상기 광조사는 10초 내지 30분간, 더욱 바람직하게는 1분 내지 10 분간 실시되는 것이 바람직하다. 상기에서 광조사 시간은 예를 들어, 혈액이 830±5nm 파장의 적외선 램프광, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프광, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프광, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프광, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프광, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프광 모두에 일시에 노출되는 시간 또는 순차적으로 노출되는 시간의 총합을 의미한다.

본 발명에 있어서, 원심분리, 광조사, 필터링, 산소공급 등의 강도와 적용 시간은 환자의 건강상태에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 환자맞춤형으로 조절될 수 있다.

본 발명의 혈액처리장치는, 도 1 또는 도 2에 도시된 바와 같이, 원심분리기(20)에 의하여 원심분리된 혈액에 산소를 공급하는 산소공급장치(60)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 혈액처리장치는 산소공급장치(60)를 이용한 산소공급은 항노화, 체내 독소 제거, 혈관청소 및 혈액정화 등의 효과를 제공한다.

본 발명의 혈액처리장치는 상기 여과장치(40)에 의하여 여과된 혈액에 영양성분을 주입하는 영양성분 주입부(70)를 더 포함할 수 있다.

상기 혈액처리장치는, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 원심분리기(20)에 의하여 1차 원심분리된 혈액을 2차로 1회 더 원심분리시키기 위하여 원심분리기(20)를 하나 더 구비한 것일 수 있다. 상기와 같이 원심분리기를 중복적으로 구성하는 경우, 광감작제 생성을 향상시킬 수 있다.

상기 1차 원심분리기 및 2차 원심분리기의 작동방법은 상기에서 언급된 조건에 따른다.

본 발명의 혈액처리장치에서 상기 광조사부(30)는 830±5nm 파장의 적외선 램프존, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프존, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프존, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프존, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프존, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프존이 배열된 광조사 장치(31)의 광조사 영역을 투명 튜브(32)가 통과하도록 구비된 것일 수 있다.

상기 튜브는 의료용으로 사용 가능한 투명 튜브일 수 있다.

상기 광조사부(30)는 830±5nm 파장의 적외선 램프, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프가 번갈아 가면 배치된 광조사 장치(31)의 광조사 영역을 투명 튜브(32)가 통과하도록 구비된 것일 수 있다.

상기 번갈아 가면서 배치되는 형태는 규칙적인 형태 또는 랜덤한 형태일 수 있다.

본 발명의 혈액처리장치에서 상기 투명 튜브(32)는 지그재그로 광조사 영역을 통과하는 것일 수 있다.

상기 여과장치(40)는 혈액을 깨끗하게 걸러내기 위한 것으로 혈액투석 등 이 분야에서 일반적으로 사용되는 것이 사용될 수 있다.

<혈액 골수 줄기 세포>

본 발명의 혈액처리장치는, 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 모니터장치 및 상기 모니터장치와 연계되어 환자의 상태를 모니터하는 체온감지센서 등의 모니터용 센서를 더 구비할 수 있다. 상기 모니터용 센스는 인체에 부착할 수 있는 형태로 구비될 수 있다.

또한, 본 발명의 혈액처리장치는 음파 발생기 및 초음파 발생기를 더 구비할 수 있다. 상기 음파발생기 및 초음파 발생기의 설치위치는 예를 들어, 산소공급기와 광조사부 사이가 될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 처리 혈액에 광촉매를 적용하기 위한 광촉매 고정부를 더 구비할 수 있다. 상기 광촉매 고정부의 설치위치는 예를 들어, 산소공급기와 광조사부 사이의 혈액과 접촉이 가능한 위치가 될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 혈액처리장치는 혈액의 면역력을 강화하는 효과를 제공한다. 더 나아가서, 고형암, 혈액암 등의 항암, 항염 표적세포치료, 자가면역 교정, 고혈압 심장병, 당뇨, 폐질환, 간질환, 위장계 질환, 근골격계 질환, 치매, 중풍, 간질, 파킨슨병, 뇌종양, 뇌수종, 항노화, 저산소증, 메르스, 에이즈, 에볼라 등의 예방 및 치료에 적용할 수 있다. 특히, 본 발명의 혈액장치를 통하면 줄기세포 항암 엑소솜(exosome)이 친환경으로 얻어질 수 있다.

<스마트 바이오 모둘레이터 원천기술 플랫폼>

(HGF, IGF, EGF, Eotaxin, FGF-2(bFGF), Flt-3 Ligand, Fractalkine, GM-CSF, IFNα2a, IFNγ, IL-10, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-AA, PDGF-BB, RANTES, sCD40L, TNFα, TNFβ, TNGα, VEGF, G-CSF, 줄기세포, 이중항체, CAR T, 면역관문억제제, 면역항암제, 면역 모듈레이터 병행치료, 줄기세포 증강 인체내 자가배양 치료 및 시술, PIP, EIS, BIO COM, SCIO, GDV, 큐비트, 양자 컴퓨터 분석 생물학)

이하에서, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 적절히 수정, 변경될 수 있다.

실시예 1.

6 주령의 특정병원체 부재(Specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 본 발명의 혈액처리장치에 의한 혈액처리를 실시하였다.

즉, SD계 랫트로부터 3일 1회씩 혈액 3ml씩을 추출하여 3,500 rpm으로 회전하는 원심분리기에서 20 초간 실시한 후, 원심분리가 완료된 혈액을 투명 튜브를 통하여 공급하면서 투명 튜브 외부에서 830±5nm 파장의 적외선 램프, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프, 및 UV-B 램프가 이 순서대로 배치된 광조사 장치에 의해 5분간 조사하였다. 다음으로 광조사가 완료된 혈액을 여과장치를 통하여 여과한 후, 다시 SD계 랫트에 투여하였다.

실시예 2.

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하되, 원심분리가 완료된 혈액에 산소혈액장치를 사용하여 산소를 공급한 후, 투명 튜브에 공급하는 과정을 추가하여 실시하였다.

실험예 1: 급성독성실험

6 주령의 특정병원체 부재(Specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 독성실험을 실시하였다. 5마리의 동물에서 3일 1회씩 혈액 3ml씩을 추출하여 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 처리한 후, 다시 투여하면서, 6주간 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

본 실험 수행 결과, 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 혈액처리를 하여 재 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

실험예 2: in vivo 상에서의 체중, 각종 장기 등에 대한 변화 실험

in vivo에서 면역결핍 유도된 C57BL/6 마우스에서 혈액을 뽑아 본 발명의 혈액처리장치에 의하여 처리된 혈액을 주입하고 마우스의 체중, 각종 장기 등에 대한 변화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Ho JN, Kang ER, Yoon HG, Jeon H, Jun W, Watson RR, Lee J, Biosci biotechnol biochem. 2011 Jul;75(7):1234-9).

2-1: LP-BM5 바이러스의 제작

마우스에서 백혈병을 유발하여 면역 체계의 붕괴를 유도하는 설치류성 AIDS 바이러스인 LP-BM5 MuLV 바이러스 혼합물은 비종양성 림프증식성 질환을 가진 성체 마우스에서부터 만들어졌다.

골수의 기질 세포는 바이러스에 감염된 쥐로부터 분리해냈고 그 바이러스를 가진 세포 cell line으로 증식시킨다. 설치류성 RNA 종양 바이러스의 감염은 주로 비장과 림프절과 같은 림프상 기관의 거대화를 유발한다. 또한, 숙주의 반응에서 기회감염성 병원균이나 악성 신생물에 대한 저항성을 감소시키는 엄청난 면역 억제를 일으킨다.

BM5 ecotropic virus의 gag는 65KD 다단백질을 암호화하는 반면에 BM5 defective virus는 60KD의 좀 더 작은 protein을 암호화하고, pol과 env region이 대부분 결손 되어 있어 단독으로는 MAIDS를 유도하지 못하기 때문에 BM5 ecotropic virus와 defective virus를 혼합하여 마우스에 주사하면 MAIDS를 유도한다고 알려져 있다(Cook WJ, Green KA, Obar JJ, Green WR. J Virol methods. 2003. Mar;108(1):49-58).

따라서 마우스의 SC-1 세포에 비종양성 림프증식성 질환을 가진 성체 마우스로부터 만들어진 LP-BM5 바이러스 DNA를 주입해 세포에서부터 배양액으로 바이러스 입자를 방출하게 하였다.

2-2: 실험동물 및 처치

쌤타코 실험동물 사육장으로부터 공급받은 20 g 내외의 4주령 암컷 C57BL/6 마우스를 일주일 동안 설치류 사육실에서 적응시킨 후 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체만 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23±3°C 습도 50±5%에서 Light cycle 12 시간으로 유지하였다.

순화기간 중 건강하다고 판정된 동물의 체중을 측정하고 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 비감염군 5 마리, 감염군 5 마리, 본 발명의 혈액처리장치를 적용할 실험군 5 마리로 무작위법을 이용하여 군 분리를 실시하였다. 면역파괴 유발 동물 모델을 만들기 위하여, 마우스에서 면역체계를 무너뜨리는 바이러스인 LP-BM5를 SC-1 세포(NIH, 1215)의 배양액으로부터 얻은 뒤, 병원균에 민감한 종류인 C57BL/6 마우스에 복강 내 주사로 2회 주입, 바이러스에 감염시켜 백혈병을 유발해 면역을 파괴시켰다. 바이러스에 감염되어 면역 체계가 붕괴 된 마우스를 3일 1회 혈액 3ml씩을 추출하여 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 처리한 후, 다시 투여하면서, 6주간 혈액액처리를 실시하였다. 이때 식이량, 체중을 매주 1회씩 측정하고 6주 후 희생시켰다. 실험결과는 각 군 개체의 평균값으로 나타내었다.

Group	면역파괴유발	제공식이
Wild type	×	AIN 93G
Infection	○	AIN 93G
본 발명의 혈액처리장치에 의하 혈액처리 실험군	○	AIN 93G

2-3: 해부학적 변화 소견 및 장기무게 변화

2-3-1: 림프절 무게 변화

본 실험에서 비감염군에서 림프절을 육안으로 관찰하기 어려웠으나 감염군에서는 크기가 커졌으며 무게도 4.55 ± 0.21 g으로 나타났다. 반면 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 2.88 ± 0.33 g으로 림프절의 무게가 감염군에 유의적으로 감소된 것을 확인하였다.

2-3-2: 비장무게 변화

본 실험에서 정상군의 경우 0.07 ± 0.01 g으로 나타난 반면, 감염군의 경우 0.82 ± 0.12 g으로 유의적으로 비장의 무게가 증가하였음을 확인하였다. 이 결과는 LP-BM5 retrovirus의 감염이 정상적으로 진행이 되었음을 나타내는 결과이며 LP-BM5 외의 다른 병원체에 의한 영향은 없었음을 나타낸 것이다.

본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 0.59 ± 0.11 g으로 나타나 감염군과 비교하였을 비장의 무게가 유의적으로 감소되었음을 확인하였다.

2-4: 몸무게 변화량 및 식이효율

실험동물의 식이섭취는 모든 군에서 통계적 유의성을 나타내지 않았으며 이 결과는 실험의 모든 데이터가 식이섭취율의 차이에 의한 것이 아님을 확인시켜 준 것으로 인식된다. 체중의 증가는 비감염군에 비해 감염군에서 유의적인 증가를 나타내었는데 이것은 LP-BM5 retrovirus 감염 시 부종이 많으며 체내에 염증반응 등으로 체중이 증가하는 현상에 기인한 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군에서도 비감염군에 비하여 체중의 유의적 증가가 나타났으나, 감염군과 비교하여 유의적으로 체중 증가가 감소된 것도 확인되었다.

Group	식이 섭취량 (g/day)	체중 증가 (g/4 weeks)
Wild type	2.45±0.12	2.21±0.32
Infection	2.21±0.19	3.62±0.21
본 발명의 혈액처리장치에 의하 혈액처리 실험군	2.33±0.32	3.01±0.13

실험예 3: in vivo 상에서의 비장세포 사이트카인 생성능에 미치는 영향실험본 발명의 혈액처리장치를 사용하는 혈액처리가 비장세포(splenocyte)의 사이토카인 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Ho JN, Kang ER, Yoon HG, Jeon H, Jun W, Watson RR, Lee J, Biosci biotechnol biochem. 2011 Jul;75(7):1234-9).

3-1: 비장세포 사이토카인 생성 능력 측정(IL-2, -4, -6, -10, -12, -15, TNF-α, IFN-γ)

비장세포(Splenocyte)의 분리 및 배양을 위해 실험중인 마우스를 경추탈골로 희생시킨 다음에 70% 에탄올로 복부를 소독한 후 비장을 무균적으로 적출한 후, 멸균된 homogenizer(Kinematica, PT1200B)로 비장을 균일화 시킨 다음 50 ml Cornig tube(SPL, Korea, 50050)에 40-mesh 크기의 망을 올려놓는다. 10% Fetal Bovine Serum(Hyclone Laboratories, USA, SH30919.03), 1% Penicillin (Hyclone Laboratories, USA, SV30010)이 포함된 RPMI 1640 (Hyclone, USA, SH30027.01) 배양액으로 적신 후에 균일화된 비장을 통과시켜 다시 RPMI 1640으로 2회 세척(washing)하였다.

적혈구를 제거하기 위해 Red blood cell lysing buffer (Sigma, USA, RNBC5060)과 DPBS (Welgene, Korea, LB001-02)를 동량으로 혼합한 용액에서 적혈구를 파괴한 다음에 PBS 용액으로 다시 두 번 동일한 방법으로 세척(washing)하여 trypan blue strain (gibco, USA, lot#1129155) exclusion test로 세포의 생존 정도를 확인한 후에 96-well plate에 각 well 당 1×10⁶cells/200㎕씩 seeding한다. 시딩(Seeding)한 96-well plate에 다음 표 3과 같이 ConA 5㎍/mL 또는 LPS 5㎍/mL의 농도로 웰(well)에 넣은 후 표에 나온 시간 동안 배양하여 생성된 사이토카인(cytokine)의 양을 Duoset sandwich ELISA Mouse kit (R&D system, USA)를 사용하여 측정하였다(IL-2: R&D system, USA, DY402, IL-4: R&D system, USA, DY404, IL-6: R&D system, USA, DY406, IL-10: R&D system, USA, DY417, IL-12: R&D system, USA, DY419, IL-15: R&D system, USA, DY447, TNF-α: R&D system, USA, DY410, IFN-γ: R&D system, USA, DY485),

Cytokine	Mitogen	Incubation time
IL-2	ConA	24h
IL-4	ConA	24h
IL-6	LPS	24h
IL-10	ConA	24h
IL-12	LPS	48h
IL-15	LPS	48h
TNF-α	LPS	24h
TNF-α	ConA	72h

ELISA용 96-well plate(costar, USA, 3590)에 각 cytokine 측정에 특성화 된 1차 항체를 PBS에 희석 후 100 ㎕씩 분주해 하루 동안 처리한 후, 그 다음날, washing buffer(PBST, 0.05% Tween 20(USB Corporation, USA, Lot#123229) in PBS)로 1차 항체를 씻어낸 뒤, 항체가 붙지 않은 plate의 다른 공간을 메워주기 위해 완충액{assay buffer (1% BSA, Sigma, USA, Lot#99H1081) in PBS (IL-4, -6, -10, -12, -15 TNF-α) 또는 0.1% BSA in TBST (IL-2, IFN-γ)}를 넣어 2시간 동안 처리한 뒤 세척용 완충액(washing buffer)으로 씻어낸다. 표준 곡선(Standard curve)를 위한 용액과 위에서 seeding한 splenocyte 세포의 배양액을 100 ㎕씩 각 well에 넣어 2시간 동안 반응시킨 후, 반응이 끝난 뒤 washing buffer로 씻어내고 어세이 완충액(assay buffer)에 2차 항체를 희석시켜 준비한 뒤 각 well에 100 ㎕씩 분주하고 2시간 동안 처리한다. 이 과정이 끝나면 세척용 완충액을 이용해 plate를 씻어내고 발색을 도와주는 기질(substrate) 시약(R&D systems, USA, DY999)을 100 ㎕ 넣어 반응시킨 뒤 ELISA 판독기(reader) (VERSAMAXSL-20 Molecular Devices, Korea) 570 nm에서 흡광도를 측정하고 Standard curve를 이용해 세포에서 생성된 사이토카인(cytokine)의 양을 계산하였다.

3-1-1: IL-2 cytokine 발현 조절

정상군에서는 IL-2 발현이 6519.64 ± 31.29 pg/mL로 나타난 반면, 감염군에서는 61.36 ± 10.75 pg/mL로 유의적으로 크게 감소되었음을 확인하였다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 IL-2 발현이 177.44 ± 11.50 pg/mL로 감염군과 비교하여 감소폭이 크게 감소된 것을 확인하였다.

3-1-2: IFN-γ cytokine 발현

본 실험에서 IFN-γ는 정상군에서 792.08 ± 11.22 pg/mL로 유의적으로 가장 높은 발현을 나타냈으며, 감염군에서는 152.5 ± 11.72 pg/mL로 유의적으로 감소되었음을 확인하였다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 642.12 ± 10.11 pg/mL로 감염군과 비교하여 IFN-γ 감소폭이 크게 감소된 것을 확인하였다.

3-1-3: IL-12 의 발현

본 실험에서 감염군의 IL-12 발현은 정상군에 비해 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 IL-12 발현이 정상군과 유의적 차이를 나타내지 않았다.

3-1-4: IL-15 의 발현

본 실험에서 정상군에서는 IL-15 의 발현량이 45.22 ± 3.02 pg/mL로 나타난 반면, 감염군은 32.81 ± 1.34 pg/mL로 유의적으로 감소되었음을 확인하였다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 은 43.55 ± 3.21 pg/mL로 IL-15 의 발현이 정상군과 유의적 차이를 보이지 않았다.

3-1-5: IL-4 의 발현

본 실험에서는 감염군에서 133.11 ± 6.15 pg/mL로 정상군 8.44 ± 2.74 pg/mL에 비하여 IL-4 발현이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 15.50 ± 4.11 pg/mL로 IL-4 발현이 감염군에 비해 유의적으로 감소된 것이 확인되었다.

3-1-6: IL-6 의 발현

본 실험에서 감염군의 IL-6 발현은 정상군에 비해 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 감염군에 비해 IL-6 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

3-1-7: IL-10 의 발현

본 실험에서는 정상군에서 IL-10 발현량이 32.64 ± 3.71 pg/mL인 반면, 감염군에서는 641.11 ± 33.51 pg/mL으로 IL-10발현이 유의적으로 증가하였다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 325.71 ± 11.43 pg/mL로 IL-10 발현량이 감염군과 비교했을 때 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

3-1-8: TNF-α 의 발현

본 실험에서 감염군의 TNF-α 발현은 322.31 ± 21.36 pg/mL로 정상군 46.34 ± 5.55 pg/mL의 발현과 비교하여 유의적으로 증가되었다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 182.28 ± 2.05 pg/mL로 감염군과 비교하여 크게 감소된 것으로 확인되었다.

실험예 4: in vivo 상에서의 비장세포에서의 T/B 세포의 증식능에 미치는 영향실험

상기 실시예 시료들의 비장세포에서의 T/B 세포의 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Ho JN, Kang ER, Yoon HG, Jeon H, Jun W, Watson RR, Lee J, Biosci biotechnol biochem. 2011 Jul;75(7):1234-9).

4-1: T/B 세포의 증식 능력 측정

마취시켜 혈액을 채취한 마우스를 해부하고 비장을 적출하여 PBS로 세척(washing)한 후 0.45 cell strainer(BD Falcon, USA, REF352340)에 놓고 조직을 갈아낸 뒤 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지(Hyclone, USA, Cat# SH30027.01)에 세포를 모아 원심분리시킨 뒤에 적혈구 분해 용액(Sigma, USA, Lot# RNBC5060)을 넣어 1분간 반응시킨 뒤 2회 더 원심분리 한다. 여기에 Trypan blue 염색약(gibco, lot# 1129155)으로 세포를 염색시켜 숫자를 센 뒤, 96-well plate에 1×10⁷cells/mL의 농도로 세포를 채운 뒤, LPS(Sigma, US, Lot#032M4082v)와 ConA(Sigma, USA, Lot#090M8703v)를 각각 5 ㎍/ml 씩 처리하여 48시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양(incubation)시킨다. 그 후 EZ-CyTox (Deilab INC, Korea, DLS1212)를 10 ㎕씩 분주한 후 4시간 동안 배양(incubation) 시킨뒤에 ELISA reader (VERSAMAXSL-20 Molecular Devices, Korea) 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4-2: T/B 세포의 증식능 반응성 측정

4-2-1: T 세포의 mitogen에 대한 증식능 반응성 측정

정상군의 T 세포 증식능을 100%로 하였을 때 LP-BM5 retrovirus의 감염군은 37.51 ± 22.02%의 증식능을 보여 정상군에 비해 유의적으로 크게 감소하였음을 확인하였다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 77.45 ± 3.51%로 T 세포 증식능이 감염군에 비해 크게 증가한 것을 확인하였다.

4-2-2: B 세포의 mitogen에 대한 증식능 반응성 측정

본 실험에서 정상군의 B 세포 증식능이 100%였을 때 감염군은 38.41 ± 4.21%로 크게 감소되었다. 본 발명의 혈액처리장치를 사용하여 3일 1회 3 ml씩 6 주간 혈액을 처리한 실험군은 71.29 ± 5.12%로 감염군보다 B 세포 증식능이 크게 증가했음을 확인하였다.

Claims

혈액공급부; 원심분리기; 광조사부; 여과장치; 및 혈액수집부를 포함하는 혈액처리장치로서,
상기 장치는 혈액공급부로부터 공급된 혈액을 원심분리기에 도입하여 원심분리를 실시하고, 상기 원심분리된 혈액을 광조사부에 구비된 투명 튜브를 통과시키면서 투명 튜브 외부에서 830±5nm 파장의 적외선 램프, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프를 포함하여 구성된 광조사 장치에 의해 광을 조사하고, 상기 광조사가 완료된 혈액을 여과장치를 통하여 여과하여 혈액 수집부로 혈액을 수집하며,
상기 혈액처리장치는 원심분리기에 의하여 원심분리된 혈액에 산소를 공급하는 산소공급장치를 더 포함하며,
상기 혈액처리장치는 여과장치에 의하여 여과된 혈액에 영양성분을 주입하는 영양성분 주입부를 더 포함하며,
상기 혈액처리장치는 산소공급기와 광조사부 사이에 초음파 발생기 및 광촉매 고정부를 더 포함하며,
상기 광조사부는 830±5nm 파장의 적외선 램프존, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프존, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프존, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프존, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프존, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프존이 배열된 광조사 장치의 광조사 영역을 투명 튜브가 통과하도록 구비되며,
상기 광조사부는 830±5nm 파장의 적외선 램프, 635±6nm 파장의 적색 LED 램프, 420±5nm 파장의 청색 LED 램프, 530±5nm 파장의 녹색 LED 램프, 585±5nm 파장의 노란색 LED 램프, 및 UV-A 및 UV-B 중에서 선택되는 하나 이상의 UV 램프가 이 순서대로 배치된 광조사 장치의 광조사 영역을 투명 튜브가 통과하도록 구비되며,
상기 투명 튜브는 지그재그로 광조사 영역을 통과하도록 구비된 것을 특징으로 하는 혈액처리장치.
제1항에 있어서,
상기 혈액처리장치는 원심분리기에 의하여 1차 원심분리된 혈액을 2차로 1회 더 원심분리시키기 위하여 원심분리기를 하나 더 구비한 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 혈액처리장치.