CN117545494A - 用于制备富含单核-血小板的纤维蛋白基质及其化合物的方法和系统 - Google Patents

Abstract

提供了一种纯化的非天然存在的伤口愈合组合物，其包含血小板、单核细胞和淋巴细胞，其中所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞。还提供了一种制备所述纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的系统；一种制备该组合物的方法；以及一种使用该组合物处理伤口的方法。

Description

用于制备富含单核-血小板的纤维蛋白基质及其化合物的方 法和系统

技术领域

本发明总体上涉及血细胞加工技术和装置。在一个实施例中，本发明涉及用于从全血样本中一起分离血小板和单核细胞(诸如淋巴细胞和单核白细胞)的方法和系统，并且具体涉及提供高回收率的血小板和单核细胞而不会被红细胞或多形核粒细胞显著污染的血液分离方法和系统。

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献均出于所有目的通过引用全文并入本文，且其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他参考文献均被具体地和单独地指示为出于所有目的通过引用全文并入本文。本文对参考文献的引用不应被解释为承认这是本发明的现有技术。

背景技术

急性伤口遵循有组织的伤口愈合顺序，并且经常在3周和4周之间愈合。当伤口在受伤后4周仍然存在时，它被定义为慢性伤口。[Demidova-Rice,TN,et al.(2012)Adv SkinWound Care.25(7):304–14]。已经进行了许多关于慢性伤口管理的研究，以解决对有效和负担得起的护理的日益增长的需求。慢性伤口的愈合轨迹预计要花费12周[Sibbald,RG,etal.(2011)Adv Skin Wound Care.24:415–37]。如果伤口出现分子环境改变、慢性炎症或纤维化[-Dorantes,L,et.al.(2019)Int J Inflam.2019:3706315]，或未纠正的预先存在的系统性因素，则该时段可能会延长。

慢性伤口，其中最常见的是糖尿病足溃疡(DFU)、压迫性溃疡(PU)、静脉性腿部溃疡(VLU)和不愈合的外科手术伤口，是一个主要的医疗保健问题。慢性伤口常常发生在患有诸如糖尿病、血管疾病和肥胖症等基础病症的老年人身上[Gould,L,et al.(2015)WoundRepair Regen.23(1):1–13]。受损的免疫和营养状态以及慢性力学应力也已被证明会促成伤口愈合不良[Eming,SA,et al.(2014)Sci Transl Med.6(265):265sr6]。慢性伤口与惊人的高死亡率相关联：缺血性(55％死亡率)、神经性(45％)和神经缺血性(18％)糖尿病足溃疡的5年死亡率[Moulik,PK,et al.(2003)Diabetes Care.26(2):491–4]，高于或类似于与乳腺癌和前列腺癌相关联的死亡率(分别为18％和8％)[Armstrong,DG,et al.(2007)Int.Wound J.4(4):286–287]。慢性伤口还与高昂的健康护理费用相关联：根据对医疗保险5％有限数据集的回顾性分析，在美国，2014年慢性不愈合伤口的总支出估计在281亿美元至968亿美元之间[Nussbaum,SR,et al.(2018)Value Health.21(1):27–32]。尽管发病率惊人且护理费用高昂，但仍然缺乏有效的处理方法。

例如，糖尿病足伤口的复杂性和多样性使其成为极具挑战性的治疗性靶点，并且在鼠模型中看到的不平衡进展突出了对克服工作台至床边障碍的新方法的需求。临床进展需要利用现有知识和跨学科新进展的潜力两者的更创新的研究策略[Barakat,M,et al.(2020)Adv Wound Care.https://doi.org/10.1089/wound2020.1254]。

血小板是小的生物活性无核细胞，其直径在2和4μm之间变化，并且源自骨髓和肺中的成熟巨核细胞[E,et al.(2017)Nature.544(7648):105-109]。血小板对于初级止血至关重要，但它们在组织再生和炎症中也发挥着重要作用[Etulain J.(2018)Platelets.29(6):556-568]。

就血小板内的大小和数目而言，血小板α颗粒构成了主要的颗粒群。它们含有粘附和生长因子，诸如转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF)以及P-选择素、血小板因子4、纤连蛋白、β-血小板球蛋白、血管性血友病因子(vWF)、纤维蛋白原以及凝血因子V和XIII[Eisinger,F,et al.(2018)Front Med.5:317]。

几十年来，血小板一直用于伤口护理。考虑到PRP给药不需要复杂的设备或训练来执行，富血小板血浆(PRP)给药的益处与经济优势相关联。此外，由于其主要的自体来源，可忽略疾病传播或免疫原性反应的问题[Etulain,J.(2018)Platelets.29(6):556-568]。血小板容易从血液中大量获得。正常的血小板计数范围为每微升血液150,000至450,000个血小板。血小板有50-80个α颗粒，它们释放数百种生物活性蛋白[Blair,P,et al.Blood Rev.(2009)23(4):177–189]，包括生长因子、粘附分子和血清素，这些蛋白促进细胞活力、增殖和迁移[Cloutier,N,et al.(2018)PNAS115(7):E1550-E1559]。血小板衍生微粒(PDM)刺激细胞因子的释放，活化细胞内信号传导通路，促进血管生成，并且参与组织再生[Neumüller,J,et al.In:Khan M,ed.Intechopen.London:Intechopen；(2015).pp.255–284]。血小板与免疫细胞相互作用[Hu H,et al.Thromb Haemost(2010)104:1184–1192]并具有镇痛效果[Miyamoto,H,et al.J Oral Max Surgery,Med,and Path.(2020)32(4):237-240]。血小板参与组织重塑[Langer HF,et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol.(2007)27:1463–1470]并募集骨髓来源的祖细胞[Massberg S,et al.J Exp Med.(2006)203:1221–1233]和间充质干细胞[Langer HF,et al.J Mol Cell Cardiol.(2009)47:315–325]。血小板对于维持血管的完整性也很重要[Boulaftali Y,et al.J Clin Invest.(2013)123:908–916]。血小板介质刺激细胞外基质的形成和结缔组织的重建[Xu X,et al.CellsTissues Organs.(2013)197:103–113]。

对于慢性不愈合皮肤伤口的处理，已开发出将浓缩血小板插入伤口中以加速伤口愈合过程的技术。从外周血中分离的血小板是生长因子的自体来源。术语“富血小板血浆”(PRP)是在20世纪70年代引入的，用于描述血浆浓缩物中血小板的自体制备和富集[Pietrzak,WS,et al.(2005)J Craniofac Surg.16:1043–1054]。PRP，也称为自体条件血浆，是源自全血的富含血小板的血浆的浓缩物，离心以去除红细胞和白细胞。自体PRP凝胶由细胞因子、生长因子、趋化因子和源自患者血液的纤维蛋白支架组成[Frykberg,RG,etal.(2010)Ostomy Wound Manage.56(6):36–44]。PRP凝胶的作用机制被认为是类似于血小板活化的正常伤口愈合反应的分子和细胞诱导。

单核白细胞典型地在血液中循环1至3天，然后迁移到组织中，在组织中它们变成巨噬细胞或树突细胞。巨噬细胞表现出可塑性，并且采用促炎、促伤口愈合、促纤维化、抗炎、抗纤维化或组织再生表型。根据巨噬细胞的活化状态和功能，可将它们分为M1型(经典地活化的巨噬细胞)和M2型(另选地活化的巨噬细胞)。M1和M2巨噬细胞之间的平衡在伤口愈合中起着重要作用[Mosser DM,et al.(2008)Nature Rev Immunol.8(12):958-969]。最明显表征的是，M1启动了对病原体定居的促炎性免疫反应[Porta,C,et al.(2015)SeminImmunol.27(4):237-248]。随着炎症的减轻，这些报警蛋白被认为促进了抗炎或伤口愈合反应的开始，该反应通过另选地活化的巨噬细胞或M2表型的存在来表征。

辅助性T细胞2型淋巴细胞(Th2)产生的白细胞介素4(IL-4)可将巨噬细胞转化为抑制炎症的M2型巨噬细胞[Abramson,SL,et al.(1990)J Immunol.144(2):625-630]。M2巨噬细胞主要分泌抗炎细胞因子，其具有减轻炎症的作用，并在伤口愈合和组织修复中发挥重要作用。

代谢通路利用转移表征了巨噬细胞极化，由此产生的代谢和免疫结果影响了伤口愈合期间宿主-病原体的相互作用[Anders,CB,et al.(2019).Curr Opinion InfectDis.32(3):204-209]。巨噬细胞的可塑性对于正常的组织修复以确保从炎症期到增生期的愈合至关重要。

对小鼠的研究表明，生长因子(GF)的特定组合增强了单核细胞的存活、粘附和血管生成潜力[Jin,E,et al.(2013)J Cell.Mol.Med.17(12):1644-1651]。体内伤口愈合结果揭示出，与未处理的伤口相比，GF处理的伤口在第7天和第14天展现出加速的伤口愈合。组织学分析展现出，在GF处理的受试者中，伤口中移植细胞和转分化角质细胞的数目显著更高。这指明用血小板释放的生长因子刺激单核细胞可增强基于细胞的疗法。

巨噬细胞进入伤口并产生IL-10，其然后可促使伤口周围的细胞开始闭合伤口[Quiros,M,et al.(2017)J Clin Invest.127(9):3510–3520]。对粘膜伤口的研究确定了IL-10用来协调伤口修复的信号传导通路中的一些。

淋巴细胞具有调节伤口修复方向的作用，伴有或不伴有疤痕。在小鼠中，T淋巴细胞亚群已被证明减轻炎症程度并促进相关的新血管形成，从而降低真皮瘢痕形成的风险[Wang,X,et al.(2019)Adv in Wound Care 8(11):527-537]。T淋巴细胞渗入伤口中的时间过程表明，CD3+T淋巴细胞在第3天出现在伤口中，在第14天达到峰值，并且持续到第30天，这指明T淋巴细胞在真皮伤口愈合和结疤反应中起重要作用。CD4+T淋巴细胞可能是调节对伤口损伤和修复的反应的关键淋巴细胞群。在炎症和由T淋巴细胞引导的血管生成之间存在平衡，这可能是促成组织修复和疤痕形成的机制的一部分。

向血小板添加单核细胞(淋巴细胞和单核白细胞)可增强伤口愈合。免疫系统在成功的伤口愈合中起着不可或缺的作用。除了有助于宿主防御之外，免疫细胞还通过分泌细胞因子、淋巴因子和生长因子来对伤口愈合进行关键性的调节[Park,JE,et al.Am JSurg.(2004)187(5):S11-S16]。对PRP技术的各种研究揭示出，PRP提取物中的血液组分(包括血小板、红细胞、白细胞、pH和葡萄糖)的广泛变化在成功的伤口愈合中起着重要作用。高浓度的细胞很重要，PRP样品中的白细胞计数也很重要。回收PRP成分的非标准化方法常常被研究者忽略，被认为是无关紧要的。然而，临床使用的PRP制剂缺乏标准化至少在一定程度上促成了PRP使用的不同临床疗效[Fitzpatrick,J,et al.(2017)Orthop J SportsMed.5(1):2325967116675272]。

各种抗凝血剂已单独或与细胞维持溶液结合用于血液收集/分离设备，以便在离心和分析前将血液样品以未凝固状态保存一段时间。例如，一些常见的抗凝血剂包括肝素钠、K₂EDTA、K₃EDTA和各种浓度的柠檬酸钠。特别地，柠檬酸钠溶液已经被用作抗凝血剂很多年了。美国专利5,494,590(通过引用并入)公开了一种基于柠檬酸钠的抗凝血剂溶液，其pH范围为从高于pH 6.0至约pH 8.5，并且柠檬酸钠浓度优选范围为从约0.05M至约0.2M。

已知钙在血液凝固级联中起关键作用。柠檬酸钠溶液阻止钙参与血液凝固。典型地，这些柠檬酸钠溶液被添加到新鲜收集的全血中以防止凝固。随后，可将钙加回全血悬浮液中，以在期望时诱导后续凝固。柠檬酸钠是特别有利的抗凝血剂，因为它在一定pH范围内提供良好的缓冲能力。特别地，柠檬酸钠的缓冲能力归因于化合物的对应酸上存在的三个羧基。由于柠檬酸钠是柠檬酸的对应的基于钠的盐，因此柠檬酸/柠檬酸钠的组合起着执行缓冲化学的作用。

如上所述，柠檬酸(羟基三羧酸)具有3个羧基，并因此具有3个pKa。第一pKa₁出现在约3.06的pH值下。第二pKa₂出现在约4.76的pH值下。第三pKa₃出现在约5.4的pH值下。因此，柠檬酸钠在这些pH值下执行其最有效的缓冲功能，并且当加入到体外细胞悬浮液中时，在执行缓冲功能方面特别有用。因此，柠檬酸钠由于其在一定pH范围内的缓冲能力而在各种血液分离设备中被用作抗凝血剂。柠檬酸盐在三种类型的溶液中普遍用作抗凝血剂。第一类型的溶液被称为缓冲柠檬酸钠。第二类型的溶液典型地被称为CPD溶液或柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖。第三类型被称为ACD或酸-柠檬酸-葡萄糖。这些溶液中的柠檬酸根离子浓度典型地大于执行抗凝血功能所需的浓度。

美国专利4,640,785(通过引用并入)公开了一种用于从血液样品中分离淋巴细胞和单核白细胞的方法。本发明的主要部分是一种改进的血液分离管，其利用比重在1.060g/cm³-1.065g/cm³之间的凝胶状物质来显著增强细胞分离的纯度，同时提供可接受的细胞产量。

美国专利4,816,168(通过引用并入)公开了一种方法，用于抑制血液样品中粒细胞白细胞的漂浮密度的明显变化和/或恢复其漂浮密度的任何损失，从而确保血液样品中淋巴细胞和单核白细胞与粒细胞的分离质量。

美国专利6,368,298(通过引用并入)公开了一种制备固体纤维蛋白网的方法。该方法包括从患者抽取血液，从血液分离血浆，使血浆与钙-凝血活化剂接触，并同时凝固和离心血浆以形成固体纤维蛋白网。该固体纤维蛋白网适用于在活体内使身体组织再生。

美国专利6,979,307(通过引用并入)公开了一种用于制备适用于使活体内的组织再生的自体固体纤维蛋白网的系统。该系统包括含有分离介质和低密度高粘度液体的密封主容器。

美国专利7,745,106(通过引用并入)公开了一种用于制备固体纤维蛋白网的方法和设备。一种方法可包括从患者抽取血液，从血液中分离血浆，使血浆与钙-凝血活化剂接触，同时凝固和轴向离心血浆以形成固体纤维蛋白网。固体纤维蛋白网可适用于在活体内使身体组织再生。

美国专利8,802,362(通过引用并入)公开了一种用于制备固体纤维蛋白网的方法和设备。一种方法可包括从患者抽取血液，从血液中分离血浆，使血浆与钙-凝血活化剂接触，同时凝固和轴向离心血浆以形成固体纤维蛋白网。固体纤维蛋白网可适用于在活体内使身体组织再生。

美国专利8,491,564(通过引用并入)公开了一种用于制备适用于在活体内使组织再生的自体固体纤维蛋白网的系统。该系统包括含有分离介质和低密度高粘度液体的密封主容器。

美国专利10,617,812(通过引用并入)公开了一种用于获得富含血小板的血浆的系统，该系统对大气封闭。该系统包括含有抗凝血剂部分和分离凝胶的收集管。

没有一个系统在不使用凝血酶或巴曲酶的情况下，使用触变凝胶分离器设备和密度梯度介质制备血浆中具有血小板的浓缩单核(单核白细胞和淋巴细胞)细胞制剂。将单核细胞与血小板组合用于伤口愈合的优势是将单核细胞的免疫功能与血小板的细胞信号传导组合。粒细胞被排除在外，因为它们促成炎症。使用富含嗜中性粒细胞的PRP可能导致III型胶原与I型胶原的比率更高，从而加剧纤维化并降低肌腱强度[Zhou,Y,et al.(2016)BioMed Res.Int.2016:1–8]。嗜中性粒细胞介导的其他有害性质包括释放炎性细胞因子和基质金属蛋白酶(MMP)，它们在应用于组织时，会促进促炎和分解代谢效果[Fedorova,NV,et al.(2018)Mediat Inflamm.2018:ID 1574928]。嗜中性粒细胞可产生细胞外陷阱(NET)，这是由解浓缩染色质结合各种胞质和颗粒蛋白组成的大型细胞外网状结构。虽然最初被认为是针对病原体的防御机制，但它们可能阻碍再生[Wong,SL,et al.(2015)NatMed.21(7):815-819]。除了创伤后不久出现嗜中性粒细胞外，嗜中性粒细胞在NET屏障重建后仍留在伤口内。综上所述，研究结果展示出，虽然嗜中性粒细胞受到常见促再生线索的刺激，但它们的存在和NET会阻碍再生[Wier,E,et al.bioRxiv(2020.07.06).189910]。

因此，本领域需要一种纯化的非天然存在的伤口愈合组合物，其包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，其中所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞。此种组合物可用于例如有此需要的受试者的伤口愈合。

发明内容

在本发明的实施例中，提供了一种纯化的非天然存在的伤口愈合组合物，其包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞。在进一步的实施例中，纯化的非天然存在的伤口愈合组合物是富含单核-血小板的纤维蛋白基质。

还提供了一种用于制备纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的系统，该组合物包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞，以及一种使用本发明的系统制备此种组合物的方法。

进一步提供了一种处理伤口的方法，包括向有此需要的受试者施用包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的本发明的纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的步骤，所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞。

附图说明

图1图示了部署在血液收集管和分离组件内的示例性的基于柠檬酸钠的抗凝血剂溶液。

图2图示了用于凝块形成的经加工的血液收集管和离心组件之间的示例性转移设备。

具体实施方式

应理解，本发明的附图和描述已经简化，以说明与清楚理解本发明相关的要素，同时，为了清楚起见，消除了在典型药物组合物和稳定方法中发现的许多其他要素。本领域的普通技术人员将认识到，在实施本发明时，其他要素和/或步骤是期望的和/或需要的。然而，因为此类要素和步骤在本领域中是众所周知的，并且因为它们不便于更好地理解本发明，所以在本文中不提供对此类要素和步骤的论述。本文中的公开内容针对本领域技术人员已知的对此类要素和方法的所有此类变化和修改。此外，本文中识别和图示的实施例仅用于示例性目的，并且不意指在它们对本发明的描述中是排他性的或限制性的。

本发明一般通过离心从全血中分离单核细胞(单核白细胞和淋巴细胞)和血小板。在一个实施例中，本发明是一种利用特定密度的非牛顿触变凝胶的血液收集管。该凝胶定位在血液收集管内，以便在置于凝胶屏障下方的液体密度介质(诸如Paque[SigmaAldrich])和置于凝胶屏障上方的液体抗凝血剂(优选柠檬酸钠)之间形成稳定的屏障。抽空的血液收集管允许在离心之前使用标准静脉穿刺来收集血液样品。血液在抽血时与抗凝血剂混合，以防止血液凝固。离心后，血液组分按其细胞密度进行分离，允许密度较大的红细胞和粒细胞群在凝胶屏障之下迁移，而密度较小的单核细胞和血小板则留在凝胶屏障之上。这些细胞的有效分离和隔离对于各种临床试验以及研究实验室方案经常是至关重要的。隔离的细胞成分的治疗性应用也很重要，诸如在伤口护理中使用富含血小板的血浆。

一旦分离发生，一种应用涉及将单核-血小板血浆悬浮液直接注射到受伤部位中。将单核细胞、血小板和血浆的上层成分，即富含单核-血小板的血浆(“M-PRP”)无菌转移到注射设备，诸如针头和注射器。在PRP收集的血小板通过添加葡萄糖酸钙或氯化钙来活化，作为示例，其诱导从α颗粒中释放因子。该过程增加了单核细胞和血小板的浓度，并然后将浓缩的M-PRP注射到受影响的区域中及其周围，推动并显著增强了身体的自然愈合信号。

类似的应用是将M-PRP悬浮液用作用于分裂厚度皮肤移植的粘合剂。这有助于将移植物紧固到基质，并且M-PRP内含有的细胞加速了移植物的“摄取”。这种用途还消除了将移植物紧固到基底的缝线或缝钉的需要。

在另一种应用中，一旦分离发生，单核细胞、血小板和血浆的上层成分无菌转移到含有氯化钙的第二真空管或小瓶中。接触后，钙离子克服了柠檬酸盐的抗凝血效果，并促使血浆纤维蛋白原活化成纤维蛋白，从而使细胞悬液被截留在纤维蛋白凝块中。在这种凝块形成的背后，有内在的凝血通路，其在因子XII的水平上被试管玻璃表面活化，并且在钙的存在下进行到将凝血酶原转化为凝血酶，随后将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并且因此促进纤维蛋白聚合和交联[Margolis,J.(1956)Nature.178:805–806]。

Ca²⁺诱导的凝块形成的机制包括沉积在白色血栓中的血小板聚集体上的纤维蛋白网。血小板聚集体的功能类似于凝块形成的核，并且主要位于凝块的中心附近或深部区域中，并且该凝块可基本上被分类为白色血栓。在这种情况下，储存在血小板α颗粒中的生长因子可被假定保留相对长的时间。这种类型的凝块用作生长因子的持久载体，具有更好的再生潜力。

随着凝块形成的进行，将第二真空管或小瓶离心，以有利地产生富含单核-血小板的纤维蛋白基质(“M-PRFM”)，其可在离心后直接置于伤口上。这种纤维蛋白基质允许在M-PRFM上操作更容易，并且如果需要可缝合到适当位置，如在某些矫形应用中。

在另一种应用中，一旦分离发生，单核细胞、血小板和血浆的上层成分无菌转移到含有氯化钙的第二真空小瓶中。该小瓶可具有平底部，其在离心后将M-PRFM形成平膜。这种M-PRFM膜具有更大的表面积，并因此创面对M-PRFM有更大的暴露。

某些实施例的描述

“患者”为哺乳动物，例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人类灵长类动物，诸如猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴，并且术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。

就受试者而言，术语“处理”是指改进受试者疾病的至少一种症状。处理可为治愈、改进或至少部分改善疾病。本公开中使用的术语“施用(administer)”、“施用(administering)”或“施用(administration)”是指向受试者施用本发明的组合物。

在一个实施例中，提供了具有自体纤维蛋白分子结构的纤维蛋白基质，其包埋单核细胞(单核白细胞和淋巴细胞)和血小板，并且充当支持细胞迁移和完成微血管化的可生物降解支架。这种有利的富含单核-血小板的纤维蛋白基质(M-PRFM)充当细胞和生长因子的递送系统，从而促进伤口愈合的增强。M-PRFM含有初始血液样本中存在的大部分血小板和单核细胞。血小板大多是活化的，并且起到增强高度聚合的纤维蛋白基质的作用。单核细胞(单核白细胞和淋巴细胞)也被截留在纤维蛋白网络内，并且有助于组织愈合过程。大量的介质，特别是血小板生长因子，被释放到伤口中以活化组织再生过程。

M-PRFM可作为细胞和生长因子的递送系统发挥作用，从而在最初的两周期间增强伤口愈合。血小板大多是活化的，并且充当黏固剂来加强高度聚合的纤维蛋白基质。单核细胞也被捕集在强大的天然纤维蛋白基质中。M-PRFM的细胞组成意指这种生物材料是血液来源的活组织，并且必须小心处理以保持其细胞内容物的活性和稳定性。在M-PRFM的形成期间，原纤维经历侧向关联并形成分支，从而形成复杂的纤维网络。等边原纤维的高度支化引起了膜弹性。在凝胶点之后，纤维蛋白的精细纳米结构已经被物理化学表征以示出不同尺度下的动态行为和复杂层次。

由于交联单体单元提供的设计和弹性，M-PRFM的复杂架构可提供有利的力学行为。M-PRFM的形态和力学行为取决于纤维蛋白原和凝血酶的比率。例如，低浓度的凝血酶导致凝块具有更粗的纤维、更少的分支结构和更大的空隙，因此更不稳定。纤维蛋白纤维直径影响血小板活化期间细胞粘附和相互作用可用的表面积。当使用标准方案时，对根据本发明的实施例形成的示例性纤维蛋白网络的分析产生了具有约90nm厚度的密集纤维网络的M-PRFM。在纤维蛋白网络中发现的微空间被细胞和生长因子填充。

此外，检测到的纤维蛋白纤维之间的交联力学地稳定了纤维蛋白网络的架构，并且控制了纤溶酶的纤维蛋白溶解活性。纤维蛋白不仅充当细胞渗入其中的支架，而且还提供指导细胞功能的分子信号，因为它含有整联蛋白、生长因子和包括纤连蛋白的其他细胞外基质组分的结合位点。M-PRFM使用血浆中所有可用的纤维蛋白原来转化成纤维蛋白，因此确保最大的纤维蛋白密度。总的来说，除了生长因子之外，纤维蛋白纤维的质量和数量均会影响M-PRFM在组织愈合中的效力和功效。

在另一个实施例中，提供了一种用于制备包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的纯化的伤口愈合组合物的系统，该系统包括：

第一容器，其具有用于接收血液样品的可密封开口端和与开口端相对的封闭端；

第一容器含有设置在靠近封闭端的第一位置处的密度分离介质，与设置在开口端和第一位置之间的第二位置处的密度大约为1.055g/cm³至1.080g/cm³的触变凝胶；以及处于开口端和第二位置之间的第三位置处的pH在6.0和8.5的范围内的抗凝血剂溶液，

其中第一容器可用于在离心时从血液样品中产生分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血小板的可提取悬浮液；以及

第二容器，其具有可密封开口端，以用于接收第一容器中产生的分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的提取悬浮液，第二含有凝血活化剂，

其中第二容器可用于在离心时从分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞的悬浮液中产生纯化的伤口愈合组合物。

在一个实施例中，该系统进一步包括适于与第一容器开口端联接和与第二容器开口端联接的转移设备，其中转移设备在联接到第一容器开口端时，产生无菌密封件，以用于接收来自第一容器的分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的悬浮液，并且在联接到第二容器开口端时，产生无菌环境，以用于将分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的悬浮液转移到此类第二容器。

该系统的密度分离介质包含非牛顿凝胶和牛顿液体中的至少一种。在一个实施例中，密度分离介质包含分子量小于约1500的离子物质。在另一个实施例中，密度分离介质选自由泛影酸钠、其衍生物及其组合组成的组。在进一步的实施例中，密度分离介质选自由分子量至少为400,000的蔗糖或表氯醇的聚合物及其衍生物和组合组成的组。

在一个实施例中，该系统进一步包括用于密封第一容器的开口端的第一封闭设备。第一封闭设备适于真空密封第一容器的所述开口端。在一个实施例中，第一封闭设备可被套管刺穿，以用于通过压差将血液样品供应至第一容器。

在一个实施例中，该系统进一步包括用于密封第二容器的开口端的第二封闭设备。在另一个实施例中，第二封闭设备适于真空密封第二容器的所述开口端。在一个实施例中，第二封闭设备可被套管刺穿，以用于通过压差将分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的悬浮液供应至第二容器。

在该系统的另一个实施例中，包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的纯化的伤口愈合组合物是富含单核-血小板的纤维蛋白基质。

在一个实施例中，该系统进一步包括适于接收第一容器和第二容器中的至少一个的离心机。

在进一步的实施例中，该系统的触变凝胶的比重在1.060g/cm³至约1.065g/cm³之间。在另一个实施例中，分离介质的比重在1.065g/cm³至约1.085g/cm³之间，并且优选比重为约1.070g/cm³至约1.080g/cm³，并且最佳比重为1.077g/cm³。

在该系统的另一个实施例中，pH为从约6.5至约7.5，并且优选为6.85至约7.15，并且最佳pH为7.0。

在一个实施例中，柠檬酸钠抗凝血剂的浓度为从约0.05M至约0.20M，其中柠檬酸钠的优选浓度为从约0.08M至约0.13M，其中最佳柠檬酸钠浓度范围为从约0.09M至约0.11M。在一个实施例中，pH为7.0，并且柠檬酸钠的浓度为0.1M。

在进一步的实施例中，抗凝血剂包含每升0.10摩尔294克柠檬酸钠·2H₂O、0.27克柠檬酸·2H₂O；以及pH 7.0。在一个实施例中，凝血活化剂是氯化钙(CaCl₂·2H₂O)凝块活化溶液，其浓度在0.05M至0.3M之间，优选在0.1M至大约0.25M之间，其中最佳浓度为0.2M。

在一个实施例中，还提供了一种用于制备包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的纯化的伤口愈合组合物的系统，该系统包括：

第一容器，其具有用于接收血液样品的可密封开口端和与开口端相对的封闭端；

第一容器含有设置在靠近封闭端的第一位置处的第一密度分离介质，与设置在开口端和第一位置之间的第二位置处的第二密度分离介质；以及处于开口端和第二位置之间的第三位置处的pH在6.0和8.5的范围内的抗凝血剂溶液，

其中第一容器可用于在离心时从血液样品中产生分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的可提取悬浮液；以及

第二容器，其具有可密封开口端，以用于接收第一容器中产生的分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的提取悬浮液，第二含有凝血活化剂，

其中第二容器可用于在离心时从分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的悬浮液中产生纯化的伤口愈合组合物。

在该系统的一个实施例中，第二密度分离介质为密度大约为1.055g/cm³至1.080g/cm³的触变凝胶。在另一个实施例中，第一密度分离介质包含牛顿液体中的至少一种。在进一步的实施例中，第一密度分离介质包含分子量小于约1500的离子物质。第一密度分离介质可选自由泛影酸钠、其衍生物及其组合组成的组。

在该系统的另一个实施例中，第一密度分离介质选自由分子量至少为400,000的蔗糖或表氯醇的聚合物及其衍生物和组合组成的组。

在本发明的一个实施例中，提供了一种系统，其中包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的纯化的伤口愈合组合物是富含单核-血小板的纤维蛋白基质。

在本发明的另一个实施例中，提供了一种纯化的非天然存在的伤口愈合组合物，其包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，其中所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞。在一个实施例中，嗜中性粒细胞的浓度小于分离的白细胞的5％。

本发明的实施例还提供了一种从血液样品中产生包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的方法，包括以下步骤：

将所述血液样品引入第一容器中，该第一容器具有用于接收所述样品的可密封开口端和与开口端相对的封闭端，所述第一容器含有设置在靠近封闭端的第一位置处的密度分离介质，与设置在开口端和第一位置之间的第二位置处的密度为大约1.055至1.080g/cm³的触变凝胶；以及处于开口端和第二位置之间的第三位置处的pH在6.0和8.5的范围内的抗凝血剂溶液；

使所述第一容器离心，以从血液样品中产生分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的可提取悬浮液；

将所述分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞以及血小板的可提取悬浮液提取到第二容器中，该第二容器含有凝血活化剂并具有可密封开口端，以用于接收在第一容器中产生的所述分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞与血浆的提取悬浮液；以及

使所述第二容器离心，以产生包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的纯化的非天然存在的伤口愈合组合物。

在该方法的一个实施例中，伤口愈合组合物基本上不含嗜中性粒细胞。在另一个实施例中，嗜中性粒细胞的浓度低于分离的白细胞的5％。

在该方法的进一步的实施例中，分离介质包含非牛顿凝胶和牛顿液体中的至少一种。在一个实施例中，密度分离介质包含分子量小于约1500的离子物质。在一个实施例中，密度分离介质选自由泛影酸钠、其衍生物及其组合组成的组。例如，密度分离介质选自由分子量至少为400,000的蔗糖或表氯醇的聚合物及其衍生物和组合组成的组。

在一个实施例中，该方法提供了包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的纯化的伤口愈合组合物，其为富含单核-血小板的纤维蛋白基质。在一个实施例中，该方法的触变凝胶的比重在1.060至约1.065g/cm³之间。在另一个实施例中，本发明方法的分离介质的比重在1.065至约1.085g/cm³之间，并且优选比重为约1.070至约1.080g/cm³，并且最佳比重为1.077g/cm³。在又一个实施例中，柠檬酸钠抗凝血剂的pH为从约6.5至约7.5，并且优选为6.85至约7.15，并且最佳pH为7.0；

在一个实施例中，柠檬酸钠抗凝血剂的浓度为从约0.05M至约0.20M，其中柠檬酸钠的优选浓度为从约0.08M至约0.13M，其中最佳柠檬酸钠浓度范围为从约0.09M至约0.11M。在进一步的实施例中，pH为7.0，并且柠檬酸钠的浓度为0.1M；

在进一步的实施例中，抗凝血剂包含每升0.10摩尔294克柠檬酸钠·2H₂O、0.27克柠檬酸·2H₂O；以及pH 7.0。在某个实施例中，凝血活化剂是氯化钙(CaCl₂·2H₂O)凝块活化溶液，其浓度在0.05M至0.3M之间，优选在0.1M至大约0.25M之间，其中最佳浓度为0.2M。

在本发明的另一个实施例中，提供了一种纯化的非天然存在的伤口愈合组合物，其包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞，通过根据上述方法的方法制备。在进一步的实施例中，纯化的非天然存在的伤口愈合组合物是富含单核-血小板的纤维蛋白基质。

在根据本发明的又一种方法中，提供了一种处理伤口的方法，包括向有此需要的受试者施用包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的本发明的纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的步骤，所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞。将M-PRFM从第二小瓶中去除并直接应用于创面。然后用合适的敷料和绷带包裹伤口，以支持创面中的M-PRFM若干天。

根据本发明的另一个实施例，基于柠檬酸钠的抗凝血剂溶液按以下方式制备。将柠檬酸三钠·2H₂O和柠檬酸·HO溶解于水中，其量足以产生具有所期望浓度和pH的柠檬酸钠溶液，该浓度和pH落在下面列出的范围内。例如，pH为7.0(+0.15)的0.1M柠檬酸钠溶液可通过将29.4克柠檬酸钠·2H₂O和0.27克柠檬酸·HO溶解于1升H₂O中来制备。基于柠檬酸钠的溶液的浓度应足以防止加入到血液分离/收集设备的或者在一些其他实验室/临床技术中涉及的血液样品凝固。特别地，柠檬酸钠的浓度应在从约0.05M至约0.2M的范围内，并且在优选从约0.08M至约0.13M的范围内。最优选的范围为从约0.09M至约0.11M。此外，最终的基于柠檬酸钠的溶液的pH范围为从高于pH 6.0至约pH 8.5，并且优选为从约pH 6.5至约pH7.5。在最优选的实施例中，pH范围为从约pH 6.85至约pH 7.15，并且理想情况下pH为7.0。

抗凝血剂溶液可另选地包含，例如，乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸二钾盐和三钾盐及其组合。其他合适的基于柠檬酸盐的抗凝血制剂包括例如缓冲柠檬酸钠，其包含例如每升：0.109摩尔0.129摩尔、24.7克32.0克柠檬酸钠·2H₂O和4.42克4.2克柠檬酸·HO，其中pH为6.1；酸性柠檬酸葡萄糖(ACD-A和ACD-B),其例如包含每升：0.2克0.2克山梨酸钾(抗真菌)、220克13.2克柠檬酸钠·2H₂O、24.5克14.7克葡萄糖·HO和8.0克4.8克柠檬酸·HO，其中pH为5.05(ACD-A)；pH 5.1(ACD-B)；柠檬酸磷酸葡萄糖(CPDA-1含有0.275克腺嘌呤)，其例如包含每升：0.2克山梨酸钾、26.3克柠檬酸钠·2H₂O、3.27克柠檬酸·HO、2.22克磷酸二氢钠·H₂O、25.5克葡萄糖·HO，其中pH为5.8；Alsever溶液，其例如包含每升：8.0克柠檬酸钠·2H₂O、22.6克葡萄糖、4.2克H₂O氯化钠和调节pH至6.1的柠檬酸；以及M-PRFM柠檬酸盐，其例如包含每升：0.10摩尔、294克柠檬酸钠·2H₂O和0.27克柠檬酸·H₂O，其中pH为7.0。

一旦根据上述步骤制备了本发明的溶液，该溶液可用于一些实验室技术中，或加入到本领域中可获得的若干种血液分离和/或收集管中的任一种中，以用于从全血或其预处理细胞成分的较重相中分离淋巴细胞、单核白细胞和血小板。尽管本发明的基于柠檬酸钠的抗凝血剂溶液可用于任何血液分离设备，但当与那些利用触变凝胶层的设备一起使用时，其提供了最大的优势，该触变凝胶层用作细胞密度分离介质或用作在离心之前隔离设备的各种部件的屏障手段。特别地，本发明的解决方案可用于改进的血液分离组件的构造中。该组件的优选实施例包括具有封闭端和开口端的容器。该容器优选是本领域已知的类型，其能够收集血液样品并进行后续离心以用于分离样品。

参考图1，示出了根据本发明的示例性实施例的血液收集和分离系统10。系统10包括容器或管12和定位在管内第一位置处的一层高粘度、低密度的不混溶凝胶14，诸如，例如触变凝胶，以及定位在触变凝胶14正下方的一层液体密度分离介质16，其中一层抗凝血剂溶液18定位在凝胶14上方。附图标记26共同表示包含抗凝血剂溶液18、触变凝胶14和液体密度分离介质层16的分层区段。典型地，液体密度分离介质16将是本领域已知的用于从全血中分离单核细胞和血小板的合适类型，诸如，例如，市售的液体密度梯度分离介质Paque。

本领域已知的各种触变凝胶可用于触变凝胶14，取决于要执行的期望操作。例如，如果触变凝胶既用作分离介质又用作屏障手段，则凝胶的比重应在1.055g/cm³至约1.080g/cm³之间，并且优选比重为约1.060g/cm³至约1.065g/cm³。如果触变凝胶与液体密度梯度材料结合采用，则凝胶主要用作离心之前的临时屏障手段。在此种组件中，凝胶维持递送到管的血液样品与管中驻留的液体密度梯度材料的隔离，直到稍后可执行分析。在此种情形下，触变凝胶的比重应在足够的范围内，以用于允许单核和血小板细胞层与血液样品的其他组分充分分离。优选地，在此种组件中采用的触变凝胶的比重范围从约1.055g/cm³至约1.075g/cm³。触变凝胶在本领域是众所周知的，并且典型地不溶于水，并对血液呈化学惰性。它们通常由二甲基聚硅氧烷或聚酯和沉淀的甲基化二氧化硅配制而成，其中甲基化使材料具有疏水性。本发明的改进的血液分离组件的优选实施例另外包括在容器内在第二位置处采用的合适的液体密度分离介质，该第二位置比触变凝胶层更远离容器的开口端。

根据本发明的一个实施例的示例性方法包括将全血液样品或预处理的血液细胞成分引入含有分层区段26的容器12。然后，在组件10的后续离心作用下，触变凝胶层14从第一位置朝向容器12的顶端15迁移。随着离心的进行，红细胞和粒细胞从单核细胞和血小板成分中分离出来，并且浓缩在触变凝胶正上方的一层中。当触变凝胶朝向管内的新位置移动时，红细胞和粒细胞迁移通过凝胶以使下面的液体密度分离介质移位。当液体密度分离介质被移位时，它向上移动通过触变凝胶，以与单核细胞和血小板成分/抗凝血剂溶液混合。红细胞和粒细胞朝向管底部沉淀，而淋巴细胞、单核白细胞和血小板在触变凝胶层的正上方形成高度纯化的单核-血小板细胞层，从而有利于单核和血小板细胞的隔离和后续去除。

最后，抗凝血剂溶液18定位在触变凝胶层14上方，使得其可充分接触引入管中的全血液样品以用于离心，并随后隔离单核和血小板细胞层。在图1中，抗凝血剂溶液18被示出定位在触变凝胶层14上方，比凝胶更靠近分离管10的开口端。这种抗凝血剂溶液18可具有例如柠檬酸钠的有效浓度，足以防止血液样品在此种样品随后被添加到管以用于离心和后续分析时凝固。抗凝血剂溶液的pH范围为可从高于pH 6.0至约pH 8.5，并且优选为从约pH 6.5至约pH 7.5。最优选地，溶液的pH范围应为从约pH 6.85至约pH 7.15。最佳地，pH应为7.0。在改进的血液分离设备10的一个实施例中，柠檬酸钠的浓度范围应为从约0.05M至约0.2M，并且优选为从约0.08M至约0.13M。最优选地，柠檬酸钠的浓度应为从约0.09M至约0.11M。最佳地，浓度应为0.1M。

虽然适合用作溶液18的抗凝血剂溶液主要由柠檬酸钠组成，但可添加附加的试剂，诸如细胞维持溶液或其他试剂，以向溶液提供附加的性质。本发明的改进的血液分离组件的优选实施例还包括邻近容器或管的开口端的自由空间，该自由空间具有足够的容积来接收全血或其成分的样品(单独或与添加的试剂结合)。图1示出了定位在抗凝血剂溶液16上方的自由空间20，以提供用于容纳待分离的血液样品的合适空间。

此外，本发明的组件可任选地包括封闭元件，以用于密封容器或管的开口端。典型地，封闭元件将适用于提供容器开口端的真空密封，并且可被针刺穿，以使容器适于从测试受试者抽取血液样品。在图1中，封闭元件22，诸如，例如密封件，设置在容器或管的开口端中，以用于产生如上所述的容器的真空密封。在向组件10添加血液样品后，样品与抗凝血剂溶液18混合，典型地通过手动倒置容器12来进行。触变凝胶层14保持在管中暂时固定的第一位置，以用作用于隔离血液样品/抗凝血剂溶液悬浮液与组件的其他组分诸如液体密度分离介质16的任何接触的屏障。

本发明进一步包括从全血液样品或其预处理细胞成分的较重相中分离淋巴细胞、单核白细胞和血小板的方法。该方法包括提供具有开口端和封闭端的容器的步骤。优选地，容器是上述类型的血液收集/分离管。该方法包括在第一位置处将第一层触变凝胶状物质引入容器或管中。该方法进一步包括在比第一触变凝胶层更靠近容器的开口端的第二位置处将抗凝血剂溶液引入容器中。该方法还包括将溶液的pH限制在前面提到的优选范围中的任一个内的步骤，以及将本发明的抗凝血剂溶液引入具有足以防止血液样品凝固的有效浓度的柠檬酸钠的容器中的步骤。此外，该方法包括将溶液中柠檬酸钠的浓度限制在前面抗凝血剂溶液描述中提到的范围中的任一个内的步骤。

本发明的方法还包括将全血液样品或预处理的血液细胞成分引入容器中的步骤，以及随后使容器离心以诱导淋巴细胞、单核白细胞和血小板从样品的较重相中分离的步骤。

许多方法和系统需要将流体从一个容器转移到另一个容器。常见的做法是去除两个容器上的闭合件，并且将一个容器中的液体用移液管移到另一个容器中。然而，这种做法使样品暴露于环境污染物。例如，这种技术用于转移从血液样品中的红细胞中分离出来的血浆。然而，经常需要不同的技术来去除界面弯月面处的血浆。经常地，高密度的、不期望的、低成分的红细胞会污染吸出的样品。为了避免这一问题，移液管可与弯月面(即，血浆和红细胞之间的分界面)维持安全距离，这能可导致样品的不完全转移。所期望成分的不完全转移导致样品试剂和第二容器中的样品试剂的体积产率和非化学计量比低于最佳值。该第二种状况可能是产品性能变化的严重来源。这是许多酶反应中的情况，其中反应速率在某些化学计量比时最大，并且在更高或更低的比率时迅速减小。使用无菌针头和注射器不能改进回收各层血浆或细胞的能力，因为该技术对操作者准确看到各层的能力和他们的经验仍然非常敏感。

伤口护理是医学中最重要的问题中的一种，尤其是关于慢性溃疡。这个问题很重要，不仅因为管理成本高，而且因为成功率不定。与伤口护理相关联的其他问题包括液体流失和发生感染的可能性。合成或动物来源的膜已经在伤口护理中用作敷料或在再骨化过程中将骨腔与软组织分离。

用于伤口护理的一种处理可包括将动物来源的生物组织或海绵(一般基于蛋白)，例如胶原蛋白、纤维蛋白、白蛋白应用于伤口部位。然而，过敏和免疫反应在这些应用中是常见的。这些情况中的大部分不是用单个应用解决的，并且可能需要多个应用。

另一种处理包括皮肤移植，这是针对最困难的情况执行的。然而，皮肤移植是昂贵的，并且显著增加了总的处理成本。一个改良的动物胶原蛋白网被用来支撑新的自体组织。该应用是困难的过程，其可能需要长达20天用于培养皮组织，并有可能污染设备。

总的来说，期望用于制备自体PRP或M-PRP或固体纤维蛋白基质的方法和系统，其能够在活生物体中再生组织。

本发明还提供了用于形成能够在活体内再生组织的固体纤维蛋白基质或自体纤维蛋白膜的系统和方法。在这些方法和系统中，通过使血液样品离心获得含有单核细胞和血小板的抗凝血浆。本文所描述的转移设备使得能够将细胞-血浆悬浮液转移到含有钙-凝血剂的第二容器中，并然后立即离心以获得稳定、致密的自体纤维蛋白单核-血小板网络。本文所描述的转移设备也可用于在其他应用中转移其他液体。换句话说，本文所描述的方法、转移设备和系统使得能够同时进行离心和凝固。

通过使用这些系统和方法，可实现以下中的至少一项：1)以维持无菌的方式操纵样品；2)血浆的总体积被转移以最大化凝块的完全产量；3)抗凝血剂和钙凝血剂的化学计量比维持在窄的范围内，以最小化凝固时间；4)所施加基质的pH接近人体组织的正常pH，因此避免了刺痛的感觉，5)转移快速完成，并且可在血小板衍生生长因子的半衰期内执行手术间转移；6)正常不执行这些操作的健康护理提供者(例如，执业护士)可容易地执行这些方法并操作系统；以及7)设备是一次性使用的，以防止重复使用和可能被血液携带的病原体污染。

一般而言，本发明提供了用于制备固体纤维蛋白基质或自体纤维蛋白膜的集成系统和方法，该固体纤维蛋白基质或自体纤维蛋白膜可用于在活生物体中再生组织。在图2所描绘的一个实施例中，系统包括主容器10诸如图1的容器10、次容器48(或另选容器38)和转移设备18。优选地，主容器10和次容器48是管，或平底小瓶38，并且更具体地说，是试管或小瓶，尽管任何可固持流体或液体并可被离心的容器均适于与本发明一起使用。优选地，容器10、48和38由玻璃或塑料制成。

主容器10应能够使用标准静脉穿刺技术抽取血液。优选地，在抽取血液时，主容器10用密封件22密封，以防止污染，尽管容器10可在此后不久密封。多种密封件22可用于密封主容器10，例如橡胶塞、盖、泡沫、弹性体或其他复合材料。密封件22应能够被刺穿或穿刺，并因此橡胶和硅树脂是制造密封件的优选材料，尽管可使用提供密封件且能够被刺穿的任何材料。主容器10可含有图1的分层区段26。

在操作中，抗凝血剂18趋向于略微稀释主容器10中收集的血液，以使其处于离心条件下。此外，主容器包含密度梯度分离介质26、空气27以及高粘度、低密度凝胶28。

转移设备18可由两件组成，如图2所描绘。转移设备18包括套管，该套管具有带第一开口的第一端42和带第二开口的第二端50。套管的端部42、50是尖锐的或尖的(或者甚至在其上具有斜面地面)，以能够穿刺或穿透主容器10和次容器48或38的密封件22、24。套管凹进并同轴安装在外壳内，以防止在容器的操纵期间手指意外卡住。外壳58具有两个圆柱形的、相对的引导件62、64，这两个引导件62、64与套管一起居中且轴向定向。引导件62、64用于将主容器10和次容器48或38引导到转移设备18的第一端42和第二端50上。

套管的端部42、50可由形成密封件的安全阀、护套或弹性套筒68、72包围或覆盖。安全护套68、72还覆盖第一开口46和第二开口54。当第一端42和第二端50穿刺弹性套筒68、72时，套筒68、72相应地缩回。端部42、50延伸足够远以完全穿刺密封件22、24，但不会另外延伸到容器10、48或38中。这允许倒置的第一容器10的液体体积最大体积地转移到第二容器48或38。弹性套筒68、72在未被穿刺时防止气体或液体的流动。用于套筒68、72的合适材料包括但不限于橡胶种类和热塑性弹性体。

在血液收集管10离心后，在使用转移设备18穿刺密封件22之前，将密封的主固持器10倒置。换句话说，主容器10被倒置，使得密封的开口处于最低的竖直位置。倒置主容器会改变层的布置顺序。在密封件22的上方从下到上依次是以下层：富含单核-血小板的血浆、凝胶14(如图1所示)、残余气体、分离介质16和红细胞。

接下来，将次容器48或38置于竖直位置，其密封开口24位于最高位置，如图2所示。这定位了次容器48或38，以用于转移其中的主固持器的内容物。然后，转移设备的引导件64被放置在次容器48或38上并在其中引导次容器48或38，而倒置的主容器10然后被放置到另一个引导件62中(反之亦然)。换句话说，套管的任一端42、50可用于穿刺任一密封件22、24。因为转移设备18在任一端上是对称的，所以为用户提供了一定程度的防呆操作。然后，用户将容器压在一起，以用每个相应的套管端部42、50穿刺密封件22、24两者。覆盖端部42、50的两个阀套筒68、72进一步增强了防呆操作。首先，如果第一端42穿刺主密封件22(同样，任一端可用于穿刺任一密封件)，覆盖另一端50的未穿刺的套筒72将含有流体，从而防止流体溢出。另一方面，如果另一端50首先穿刺另一密封件24(以及相应的套筒72)，则真空由覆盖第一端42的套筒68维持。

如图所示，一旦端部42、50穿刺套筒68、72和密封件22、24两者，所期望流体通过压差从主容器10转移到次容器48或38(如果使用的话)。换句话说，因为次容器48或38中的压力已经被排空，所以主容器10的内容物(更具体地，富含单核-血小板的血浆)流入次容器48或38(如果使用的话)中。最初处于大气压下的主容器10中的压力随着液位下降和气体体积膨胀而降低。然而，在任何时候，压力均不等于零。因为次容器48或38被完全抽空到等于或略大于零的压力，所以当管被填充时，其中的压力不会增加，因为几乎没有或没有气体压缩。

由于主容器10中各层的顺序布置，富含单核-血小板的血浆可经由转移设备18轻松转移到次容器48或38。此外，因为主容器10也被预设到排空水平，所以容器在血液收集后仅部分填充。这允许“顶部空间”中的气体在其体积膨胀时在转移期间保持显著高于零，从而允许快速且完全地转移到次容器48或38(如果使用的话)。这是由理想气体定律和Poiseuille-Hagen方程决定的。

单核-血小板-血浆成分向次容器48或38的转移完成，从而允许最大产量和维持试剂的适当化学计量比。单核-血小板-血浆然后接触次容器48或38中的凝血活化剂36，从而产生混合物，该混合物可立即离心以形成固体-纤维蛋白网。在整个转移过程中，主容器10和次容器48或38之间的压差基本维持不变，从而允许快速转移。转移设备18不受管接合顺序的影响，使得该系统几乎防呆。最后，转移可在不通风的情况下进行，维持样品的无菌和无污染。

在次容器48或38中，单核-血小板-血浆悬浮液与钙-凝血活化剂36接触，之后立即发生血浆的同时凝固和离心，以形成固体-纤维蛋白网。该固体-纤维蛋白网适用于在活体内使身体组织再生。此种方法减少了在血浆与钙-凝血活化剂36接触之前通过从血浆中去除水来首先预先浓缩血浆的需要。此外，转移设备18可用于在多种应用中转移血液或其他流体。

次容器48的使用允许离心后形成的所得单核-血小板纤维蛋白基质形成第二管14底部的形状，因此形成富含单核-血小板的纤维蛋白基质(M-PRFM)。另选地，使用次小瓶38，离心后，所得富含单核-血小板的纤维蛋白基质形成与次小瓶38直径相同的M-PRFM膜。

在进一步的实施例中，本发明还提供了一种即用型套件，其包括(多个)主容器10、次容器48或38、转移设备18、用于清洁静脉穿刺部位的酒精棉签、多样品血液收集针(21号×1″)、安全固持器、弹性绷带和用于接收M-PRFM基质或膜的无菌培养皿。部件可在套件内以多种方式布置。

现将在以下示例中进一步描述本发明，这些示例旨在仅作为说明，并且不限制本发明的范围。

示例

示例1

从全血中分离单核细胞和血小板实现了相对富集的细胞-血浆悬浮液。使用含有密度梯度流体、触变凝胶和柠檬酸盐抗凝血剂的真空血液收集管进行回收率百分比、纯度百分比、存活率百分比、红细胞污染和粒细胞污染的再现性研究。从一名献血者收集十份血液样品，每管大约8.0mL，其含有1.0mL pH 7.0的柠檬酸盐抗凝血剂。将这些管以1500xg离心20分钟。将所得的单核-血小板成分倒置7次以将细胞重悬于血浆中，从而产生富含单核-血小板的血浆(M-PRP)。使用自动血液分析仪一式两份测定M-PRP。没有执行最终的洗涤步骤。将样品重新悬浮至大约相等的最终体积。通过对每个管的重复读数的平均值求差来计算管之间的差异。

表1

参数	平均值％	SD	CV％
				回收率
单核细胞	70.3	9.7	13.8
				血小板	75	5.5	7.5
回收细胞的纯度
				淋巴细胞	84.4	1.3	1.5
单核白细胞	13.9	1.4	10.4
				存活率	100	0	0
RBC污染	7.4	1.6	21.7
				PMN污染	1.7	0.6	34.5

表1.使用含有密度梯度液体、触变凝胶和柠檬酸盐抗凝血剂(pH 7.0)的真空细胞分离设备，对来自全血的回收率百分比、存活率百分比、RBC百分比和PMN(多形核细胞或粒细胞)污染百分比进行再现性研究。

示例2

使用含有柠檬酸钠抗凝血剂、触变凝胶和密度梯度液体的血液收集管收集全血样本。将管轻轻倒置七次，使抗凝血剂与全血混合。将管置于外摆式桶形转子中，并以1500xg离心20分钟。一旦在凝胶分离管中从全血样本中分离出M-PRP，将M-PRP无菌转移到含有柠檬酸钠的第二小瓶中。将溶液轻轻混合，并且将第二小瓶在3500xg下离心25分钟。第二离心步骤完成后，打开小瓶的盖子，并通过倒置小瓶将内容物倒空到无菌接收设备诸如组织培养皿上来回收M-PRFM。例如，通过无菌镊子取出M-PRFM，并且直接放置到创面上。然后用合适的覆盖物和绷带覆盖伤口，以支持伤口中的M-PRFM若干天。该程序可根据需要每周重复一次。

参考文献

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应理解，本发明不限于上述本发明的特定实施例，因为可对特定实施例进行变更，并且仍然落入所附权利要求的范围内。

Claims (49)

1.一种用于制备纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的系统，所述纯化的非天然存在的组合物包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，并且基本上不含嗜中性粒细胞，所述系统包括：

第一容器，其具有用于接收血液样品的可密封开口端和与所述开口端相对的封闭端；

所述第一容器含有设置在靠近所述封闭端的第一位置处的密度分离介质，与设置在所述开口端和所述第一位置之间的第二位置处的密度为大约1.055g/cm³至1.080g/cm³的触变凝胶；以及处于所述开口端和所述第二位置之间的第三位置处的pH在6.0和8.5的范围内的抗凝血剂溶液，

其中所述第一容器可用于在离心时从所述血液样品中产生分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的可提取悬浮液；以及

第二容器，其具有可密封开口端，以用于接收在所述第一容器中产生的分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的提取悬浮液，所述第二含有凝血活化剂，

其中所述第二容器可用于在离心时从所述分离的血小板、单核白细胞和淋巴细胞的悬浮液中产生所述伤口愈合组合物。

2.根据权利要求1所述的系统，进一步包括适于与所述第一容器开口端和所述第二容器开口端联接的转移设备，其中所述转移设备在联接到所述第一容器开口端时产生无菌密封件，以用于接收来自所述第一容器的所述分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的悬浮液，并且在联接到所述第二容器开口端时产生无菌环境，以用于将所述分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的悬浮液转移到所述第二容器。

3.根据权利要求1所述的系统，其中所述密度分离介质包含非牛顿凝胶和牛顿液体中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的系统，其中所述密度分离介质包含分子量小于约1500的离子物质。

5.根据权利要求4所述的系统，其中所述密度分离介质选自由泛影酸钠、其衍生物及其组合组成的组。

6.根据权利要求1所述的系统，其中所述密度分离介质选自由分子量至少为400,000的蔗糖或表氯醇的聚合物及其衍生物和组合组成的组。

7.根据权利要求1所述的系统，进一步包括用于密封所述第一容器的所述开口端的第一封闭设备。

8.根据权利要求7所述的系统，其中所述第一封闭设备适于真空密封所述第一容器的所述开口端。

9.根据权利要求8所述的系统，其中所述第一封闭设备能够被套管刺穿，以用于通过压差将所述血液样品供应至所述第一容器。

10.根据权利要求1所述的系统，进一步包括用于密封所述第二容器的所述开口端的第二封闭设备。

11.根据权利要求10所述的系统，其中所述第二封闭设备适于真空密封所述第二容器的所述开口端。

12.根据权利要求11所述的系统，其中所述第二封闭设备能够被套管刺穿，以用于通过压差将所述分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的悬浮液供应至所述第二容器。

13.根据权利要求1所述的系统，其中包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的所述纯化的伤口愈合组合物是富含单核-血小板的纤维蛋白基质。

14.根据权利要求1所述的系统，进一步包括适于接收所述第一容器和所述第二容器中的至少一个的离心机。

15.根据权利要求1所述的系统，其中所述触变凝胶的比重在1.060g/cm³至约1.065g/cm³之间。

16.根据权利要求1所述的系统，其中所述分离介质的比重在1.065g/cm³至约1.085g/cm³之间，并且优选比重为约1.070g/cm³至约1.080g/cm³，并且最佳比重为1.077g/cm³。

17.根据权利要求1所述的系统，其中所述pH为从约6.5至约7.5，并且优选为6.85至约7.15，并且最佳pH为7.0。

18.根据权利要求1所述的系统，其中所述柠檬酸钠抗凝血剂的浓度为从约0.05M至约0.20M，其中柠檬酸钠的优选浓度为从约0.08M至约0.13M，其中最佳柠檬酸钠浓度范围为从约0.09M至约0.11M。

19.根据权利要求1所述的系统，其中pH为7.0，并且所述柠檬酸钠的浓度为0.1M。

20.根据权利要求1所述的系统，其中所述抗凝血剂包含每升0.10摩尔294克柠檬酸钠·2H₂O、0.27克柠檬酸·2H₂O；以及pH 7.0。

21.根据权利要求1所述的系统，其中所述抗凝血剂包含乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸二钾盐或三钾盐中的至少一种。

22.根据权利要求1所述的系统，其中所述凝血活化剂是氯化钙(CaCl₂·2H₂O)凝块活化溶液，其浓度在0.05M至0.3M之间，优选在0.1M至大约0.25M之间，其中最佳浓度为0.2M。

23.一种用于制备纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的系统，所述纯化的非天然存在的伤口愈合组合物包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，并且基本上不含嗜中性粒细胞，所述系统包括：

第一容器，其具有用于接收血液样品的可密封开口端和与所述开口端相对的封闭端；

所述第一容器含有设置在靠近所述封闭端的第一位置处的第一密度分离介质，与设置在所述开口端和所述第一位置之间的第二位置处的第二密度分离介质；以及处于所述开口端和所述第二位置之间的第三位置处的pH在6.0和8.5的范围内的抗凝血剂溶液，

其中所述第一容器可用于在离心时从所述血液样品中产生分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的可提取悬浮液；以及

第二容器，其具有可密封开口端，以用于接收在所述第一容器中产生的分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的提取悬浮液，所述第二含有凝血活化剂，

其中所述第二容器可用于在离心时从所述分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的悬浮液中产生所述伤口愈合组合物。

24.根据权利要求23所述的系统，其中所述第二密度分离介质是密度大约为1.055g/cm³至1.080g/cm³的触变凝胶。

25.根据权利要求23所述的系统，其中所述第一密度分离介质包含牛顿液体中的至少一种。

26.根据权利要求23所述的系统，其中所述第一密度分离介质包含分子量小于约1500的离子物质。

27.根据权利要求26所述的系统，其中所述第一密度分离介质选自由泛影酸钠、其衍生物及其组合组成的组。

28.根据权利要求23所述的系统，其中所述第一密度分离介质选自由分子量至少为400,000的蔗糖或表氯醇的聚合物及其衍生物和组合组成的组。

29.根据权利要求23所述的系统，其中包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的所述纯化的伤口愈合组合物是富含单核-血小板的纤维蛋白基质。

30.一种纯化的非天然存在的伤口愈合组合物，所述纯化的非天然存在的伤口愈合组合物包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，其中所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述嗜中性粒细胞的浓度小于所述分离的白细胞的5％。

32.根据权利要求30所述的纯化的非天然存在的伤口愈合组合物，其中所述组合物是富含单核-血小板的纤维蛋白基质。

33.一种处理伤口的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用根据权利要求30所述的纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的步骤。

34.一种从血液样品中产生包含血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的纯化的非天然存在的伤口愈合组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

将所述血液样品引入第一容器中，所述第一容器具有用于接收所述样品的可密封开口端和与所述开口端相对的封闭端，所述第一容器含有设置在靠近所述封闭端的第一位置处的密度分离介质，与设置在所述开口端和所述第一位置之间的第二位置处的密度为大约1.055g/cm³至1.080g/cm³的触变凝胶；以及处于所述开口端和所述第二位置之间的第三位置处的pH在6.0和8.5的范围内的抗凝血剂溶液；

使所述第一容器离心以从所述血液样品中产生分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的可提取悬浮液；

将所述分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血小板的可提取悬浮液提取到第二容器中，所述第二容器含有凝血活化剂并具有可密封开口端，以用于接收在所述第一容器中产生的所述分离的血小板、单核白细胞、淋巴细胞和血浆的提取悬浮液；以及

使所述第二容器离心以产生包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的所述纯化的非天然存在的伤口愈合组合物。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述伤口愈合组合物基本上不含嗜中性粒细胞。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述嗜中性粒细胞的浓度小于所述分离的白细胞的5％。

37.根据权利要求34所述的方法，其中所述密度分离介质包含非牛顿凝胶和牛顿液体中的至少一种。

38.根据权利要求34所述的方法，其中所述密度分离介质包含分子量小于约1500的离子物质。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述密度分离介质选自由泛影酸钠、其衍生物及其组合组成的组。

40.根据权利要求34所述的方法，其中所述密度分离介质选自由分子量至少为400,000的蔗糖或表氯醇的聚合物及其衍生物和组合组成的组。

41.根据权利要求34所述的方法，其中包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞的所述纯化的伤口愈合组合物是富含单核-血小板的纤维蛋白基质。

42.根据权利要求34所述的方法，其中所述触变凝胶的比重在1.060g/cm³至约1.065g/cm³之间。

43.根据权利要求34所述的方法，其中所述分离介质的比重在1.065g/cm³至约1.085g/cm³之间，并且优选比重为约1.070g/cm³至约1.080g/cm³，并且最佳比重为1.077g/cm³。

44.根据权利要求34所述的方法，其中所述pH为从约6.5至约7.5，并且优选为6.85至约7.15，并且最佳pH为7.0。

45.根据权利要求34所述的方法，其中所述柠檬酸钠抗凝血剂的浓度为从约0.05M至约0.20M，其中柠檬酸钠的优选浓度为从约0.08M至约0.13M，其中最佳柠檬酸钠浓度范围为从约0.09M至约0.11M。

46.根据权利要求41所述的方法，其中pH为7.0，并且所述柠檬酸钠的浓度为0.1M。

47.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗凝血剂包含每升0.10摩尔294克柠檬酸钠·2H₂O、0.27克柠檬酸·2H₂O；以及pH 7.0。

48.根据权利要求34所述的方法，其中所述凝血活化剂是氯化钙(CaCl₂·2H₂O)凝块活化溶液，其浓度在0.05M至0.3M之间，优选在0.1M至大约0.25M之间，其中最佳浓度为0.2M。

49.一种纯化的非天然存在的伤口愈合组合物，所述纯化的非天然存在的伤口愈合组合物包含血小板、单核白细胞和淋巴细胞，所述组合物基本上不含嗜中性粒细胞，通过根据权利要求34所述的方法制备。