CN108138098B

CN108138098B - 组织培养设备和方法

Info

Publication number: CN108138098B
Application number: CN201680035339.2A
Authority: CN
Inventors: P·R·邓巴; V·J·菲斯特; R·N·欧斯特贝克; M·C·辛普森; Y·S·桐
Original assignee: Auckland Uniservices Ltd
Current assignee: Auckland Uniservices Ltd
Priority date: 2015-06-25
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2036-06-24
Also published as: EP3313976A1; HK1253060A1; AU2016281433B2; US11802265B2; AU2016281433C1; JP2018518190A; KR20180020283A; CN108138098A; KR102578930B1; IL256372A; MX2017016701A; EP3313976A4; JP7465294B2; WO2016209089A1; JP2024037970A; EA201792635A1; CA2989768A1; IL256372B; US20180187137A1; AU2016281433A1

Abstract

描述一种用于培养细胞或组织的设备，所述设备包括：容器，包括底部和至少一个侧壁，其中所述底部的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；可拆卸顶部，适于与所述容器接合以限定室，其中所述顶部的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及支架，适于接纳上面驻留细胞的基质。所述设备能够在(a)其中所述基质不安置成与气体可渗透材料气体连通的第一模式与(b)其中所述基质安置成与气体可渗透材料气体连通的第二模式之间配置。

Description

组织培养设备和方法

技术领域

本发明涉及一种改进的用于培养细胞或组织(例如，上皮细胞或包括上皮细胞的组织，例如皮肤)的设备和方法。本发明另外涉及使用本发明的设备或通过本发明的方法生产的组织，例如包括上皮细胞的组织，例如全厚皮片，并且使用此类组织用于治疗组织损伤。

背景技术

活体外工程化人类和非人动物细胞或组织具有治疗和商业应用范围。

举例来说，工程化的包括上皮细胞的组织(例如人类皮肤)可用于灼痛或慢性创伤患者的自体移植，或用于医药、美容或其它局部用产品的开发和测试。

非常希望工程化细胞或组织具有与对应的活体内细胞或组织类似或基本上相同的结构和/或功能。然而，具有极大挑战性的是复制在活体内细胞生长和分化以及复杂组织发育所处的高度特异性且严密调控的条件。

对于多数细胞和组织，空气-液体界面处的培养物提供促进细胞增殖和多层细胞或组织生长的高氧环境。一些细胞或组织必须接触空气-液体界面以便生长或分化。举例来说，皮肤中的角质细胞需要与空气-液体界面接触，以便刺激分化并且引发表皮分层。此分化和生长对于全厚度人类皮肤的工程化是至关重要的。

仍需要提供在高氧条件和/或模拟活体内条件的条件下人类和非人类动物细胞或组织的培养和/或工程化的方法和/或设备。

本发明的目标是提供满足此需要或至少为公众提供有用的选择的方法和/或设备。

发明内容

在一个方面中，本发明涉及一种用于培养细胞或组织的设备，所述设备包括

容器，包括第一端壁(底部)和至少一个侧壁，

可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室，以及

支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，

其中所述第一端壁(底部)、所述至少一个侧壁或所述第二端壁(顶部)中的至少一个的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述设备可配置于(a)其中所述基质不安置成与气体可渗透材料气体连通的第一模式与(b)其中所述基质安置成与气体可渗透材料气体连通的第二模式之间。

举例来说，在一个实施例中，本发明涉及一种用于培养细胞或组织的设备，所述设备包括

容器，包括第一端壁(底部)和至少一个侧壁，

支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，

其中所述第一端壁(底部)、所述至少一个侧壁和所述第二端壁(顶部)中的两个或更多个的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中在第一模式中，所述基质不与气体可渗透材料接触，且在第二模式中，所述基质与气体可渗透材料接触。

在一个实施例中，支架可从第一位置移动到第二位置，其中第二位置将所述基质安置于气体可渗透材料处。在一个实例中，当在使用中存在于第一位置处时，浸没所述基质。

在一个实施例中，在第一模式中，支架和/或基质通过可去除的气体不可渗透表面与气体可渗透材料分离。在一个实施例中，通过溶解去除可去除的气体不可渗透表面。在一个实施例中，以物理方式去除可去除的气体不可渗透表面。

在另一方面中，本发明涉及一种用于培养细胞或组织的设备，所述设备包括

容器，包括第一端壁(底部)和至少一个侧壁，其中所述底部的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；

可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室，

其中所述第二端壁(顶部)的至少一部分或所述至少一个侧壁的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，其中所述支架与所述至少一个侧壁接合以(a)允许所述支架至少部分地在所述室的所述第一端壁(底部)和所述第二端壁(顶部)之间大体上线性地移动，并且限制所述支架绕垂直于所述至少一个侧壁的轴线的旋转或倒转，或(b)允许所述支架绕垂直于所述至少一个侧壁的轴线的旋转移动。

在一个实施例中，所述设备的倒转允许所述支架至少部分地在所述室的第一端壁(底部)和第二端壁(顶部)之间大体上线性地移动，以将基质安置在存在于所述第二端壁(顶部)中的气体可渗透材料处。

在一个实施例中，所述设备的旋转允许所述支架绕垂直于所述至少一个侧壁的轴线大体上旋转移动，以将基质安置在存在于所述至少一个侧壁中的气体可渗透材料处。

在一个实施例中，本发明涉及一种用于培养细胞或组织的设备，所述设备包括

容器，包括底部和至少一个侧壁，其中所述底部的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；

可拆卸顶部，适于与所述容器接合以限定室，其中所述顶部的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，其中所述支架与所述至少一个侧壁接合以(a)允许所述支架至少部分地在所述室的所述底部和所述顶部之间大体上线性地移动，并且(b)限制所述支架绕垂直于所述至少一个侧壁的轴线的旋转或倒转。

在一个实施例中，当在使用中且所述底部和所述顶部存在气体可渗透材料时，所述室可与环境液体密封但与所述环境气体连通。

在另一方面中，本发明涉及一种用于在包括至少一个气体可渗透界面的培养设备中培养细胞或组织的支架，所述支架包括

框架，界定内周界和外周界，所述框架包括大体上平面的上表面，

基质，上面驻留细胞，保持在跨越所述框架的所述内周界的大体上平面的布置中，

其中所述支架被配置成当所述支架放置于包括至少一个气体可渗透界面的培养设备中时，使所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织基本上全部与气体可渗透界面接触。

在一个实施例中，所述基质保持在所述框架的平面的上表面上的大体上平面的布置中。

在一个方面中，本发明涉及一种用于培养细胞或组织的支架，其中所述支架适于接纳上面驻留细胞的基质，所述支架包括

第一框架，界定内周界和外周界，所述第一框架包括大体上平面的上表面，

第二框架，界定内周界和外周界，所述第二框架包括大体上平面的上表面，

其中所述第一框架和所述第二框架围绕其周界的至少一部分可拆卸地接合以限定接纳并保持所述基质的界面，

其中当被保持时，所述基质保持在跨越所述第一框架的所述内周界的大体上平面的布置中，

且其中当接合时，所述第一框架的所述上表面和所述第二框架的所述上表面大体上是共平面的。

在一个实施例中，所述第二框架的所述内周界在其上表面处的尺寸大于所述第一框架的所述外周界在其上表面处的尺寸，使得所述第二框架在所述第一框架的至少所述上表面处围绕所述第一框架的所述外周界接合。

在一个实施例中，所述基质保持于在所述第一框架的所述上表面处跨越所述支架的所述内周界的大体上平面的布置中，进而允许所述基质的上表面与例如气体可渗透界面直接接触。

在各种实施例中，所述基质通过第一框架与第二框架的摩擦配合接合保持在所述第一框架和所述第二框架之间。举例来说，所述摩擦配合接合使得其稳固地夹持所述基质，将所述基质维持于跨越所述支架的所述内周界的大体上平面的布置中。举例来说，所述框架接合以当基质与培养基接触时，防止所述基质皱缩、拉伸或变形。

在各种实施例中，所述基质至少部分地通过在第一框架和第二框架之间延伸的一个或多个突起部保持在所述第一框架和所述第二框架之间。在一个实例中，所述一个或多个突起部中的一个或多个在形成于接合的第一框架与第二框架之间的界面内的一点处刺穿所述基质。

在各种实施例中，所述支架的下表面包括跨越支架的外周界和邻近内周界的至少一个区段，所述区段具有朝向支架的上表面凸起的下表面，其中当支架放置在平坦表面上时，所述区段限定一空隙。在一个实施例中，所述区段限定凹部554，提供所述凹部以允许当支架处于浸没培养物中时，容易去除气泡。

在一个实施例中，所述支架包括上面驻留细胞的基质。

在一个实施例中，所述支架的内周界在其上表面处的尺寸大于由所述支架保持的所述基质或所述基质上存在的细胞或组织接触的气体可渗透界面中的一个或多个的尺寸，使得所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织基本上全部能够接触所述气体可渗透界面。

在各种实施例中，所述支架包括跨越所述内周界以提供对所述基质的支撑的一个或多个横向部件。在一个实例中，所述支架包括两个或更多个横向部件。在一个实例中，例如在图11中所描绘，所述支架包括跨越内周界以提供对所述基质的支撑的横向部件栅格。

在一个实施例中，气体可渗透材料是气体可渗透膜。

在一个实施例中，气体可渗透材料是聚二甲基硅氧烷。

在一个实施例中，支架是大体上平面的。在一个实施例中，支架取向成与所述底部或所述顶部或所述底部和所述顶部大体上平行。

在一个实施例中，所述支架与至少一个侧壁接合，以允许所述支架在容器的底部和顶部之间大体上线性地移动。举例来说，所述支架具有与至少一个侧壁中的一个或多个互补凹槽接合的一个或多个凸耳，以允许支架相对于所述至少一个侧壁的平移移动，但限制所述支架相对于所述至少一个侧壁的旋转移动。

在一个实施例中，所述支架接纳所述基质以在所述基质的相对平面侧上呈现培养表面。

在一个实施例中，所述基质是生物相容性材料，例如生物相容性膜。在一个实施例中，所述基质是生物可降解膜。在各种实施例中，所述基质一种共聚物。

在一个实施例中，所述基质是气体可渗透的。在替代实施例中，所述基质是气体不可渗透的。

举例来说，所述基质是或包括聚(乳酸共-乙醇酸)(poly(lactic co-glycolicacid)，PLGA)。在一个实例中，所述基质是或包括静电纺丝PLGA。

在一个实施例中，所述基质包括被处理以改进细胞粘附、细胞迁移或组织分层的表面。

在一个实施例中，所述基质包括辅助细胞粘附和/或迁移和/或分层的一个或多个分子。举例来说，所述基质包括一种或多种蛋白质(例如一种或多种基膜蛋白质、胶原蛋白、纤维结合蛋白、层粘连蛋白或凝集素)、一种或多种碳水化合物(例如一种或多种醣类)，或其中的任两种或更多种的组合。

在其它实施例中，所述基质包括辅助移植物存活力、修护或长久性的一种或多种其它试剂。所述一种或多种其它试剂可在制造时、在培养期间或在所述基质上存在的细胞或组织手术植入之前或期间的任一点处并入到所述基质中。示范性试剂包含一种或多种抗生素(例如胶体银或胶体金，或一种或多种化学抗生素)、一种或多种免疫调节剂(例如一种或多种抗炎剂)、一种或多种愈合或血管形成促进剂(例如VEGF)以及类似者。

在各种实施例中，所述基质包括胶原蛋白I、纤维结合蛋白、胶原蛋白IV、胶原蛋白VII、层粘连蛋白5、来源于前述蛋白质中的一种的一种或多种粘附肽，或其任何两种或更多种的组合。

在一个实施例中，所述基质包括选择性地将特定细胞类型键结或吸引到所述基质或促进或实现特定细胞类型到所述基质的粘附的一种或多种分子。举例来说，在一个实施例中，所述基质包括选择性地键结上皮细胞(例如角质细胞)的一种或多种分子。在另一实施例中，所述基质包括选择性地键结成纤维细胞的一种或多种分子。

在各种实施例中，所述基质包括一种或多种细胞粘附分子(例如一种或多种免疫球蛋白总科细胞粘附分子(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecule，IgSFCAM))、一种或多种整联蛋白、一种或多种钙粘蛋白或一种或多种选择蛋白。在各种实施例中，所述基质包括一种或多种上皮钙粘蛋白(E-钙粘蛋白)、一种或多种胎盘钙粘蛋白(P-钙粘蛋白)、一种或多种神经钙粘蛋白(N-钙粘蛋白)、一种或多种视网膜钙粘蛋白(R-钙粘蛋白)、一种或多种脑钙粘蛋白(B-钙粘蛋白或T-钙粘蛋白)、或一种或多种肌肉钙粘蛋白(M-钙粘蛋白)、E-选择蛋白、L-选择蛋白、P-选择蛋白、α1整合蛋白(ITGA1)、α2整合蛋白(ITGA2)、α2b整合蛋白(ITGA2b)、α3整合蛋白(ITGA3)、α4整合蛋白(ITGA4)、α5整合蛋白(ITGA5)、α6整合蛋白(ITGA6)、α7整合蛋白(ITGA7)、α8整合蛋白(ITGA8)、α9整合蛋白(ITGA9)、α10整合蛋白(ITGA10)、α11整合蛋白(ITGA11)、αD整合蛋白(ITGAD)、αE整合蛋白(ITGAE)、αL整合蛋白(ITGAL)、αM整合蛋白(ITGAM)、αV整合蛋白(ITGAV)、αX整合蛋白(ITGAX)、β1整合蛋白(ITGB1)、β2整合蛋白(ITGB2)、β3整合蛋白(ITGB3)、β4整合蛋白(ITGB4)、β5整合蛋白(ITGB5)、β6整合蛋白(ITGB6)、β7整合蛋白(ITGB7)、β8整合蛋白(ITGB8)，或其任何两种或更多种的组合。

在一个实施例中，所述基质包括辅助上皮分层(例如表皮分层)的一种或多种分子。

在一个实施例中，所述支架的至少一部分包括气体可渗透材料和/或适于与气体可渗透基质接合并且是多孔的以允许跨越气体可渗透基质的气体交换。

在各种实施例中，所述容器或可拆卸顶部包括至少一个可流体密封的进出口。举例来说，所述至少一个侧壁包括至少一个可流体密封的进出口。

在各种实施例中，所述设备是可灭菌的，包含例如通过高压灭菌或伽马照射进行灭菌。

在一个实施例中，当所述设备处于第一模式(例如，直立取向)中时，支架和基质安置于室内，且所述基质被浸没。

在一个实施例中，当所述设备处于第二模式(例如，倒置或旋转取向)中时，所述基质安置于气体可渗透材料处。举例来说，在第二模式中，所述支架和基质限定所述室的底部以包括气体可渗透界面。

在一个实施例中，在使用中时，所述设备被配置成使得当所述设备处于第一模式中(例如，直立取向中)时，所述室容纳足以浸没所述基质的量的培养基。

在一个实施例中，在使用中时，所述设备被配置于第二模式中，其中所述基质处于气体可渗透材料处或邻近。举例来说，在一个实施例中，当所述设备处于第二模式(例如，倒置或旋转取向)中时，所述基质包括气体可渗透界面。

在另一方面中，本发明涉及一种培养细胞的方法，所述方法包括

a)提供包括待在足以支持细胞生长的量的组织培养基中培养的细胞的悬浮液；

b)将所述悬浮液引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室；以及支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，

其中至少所述第一端壁(底部)、所述至少一个侧壁或所述第二端壁(顶部)的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述设备处于其中所述基质浸没于所述悬浮液中并且任选地安置成与气体可渗透材料气体连通的第一模式中，

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间，

d)将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中所述基质任选地安置成与气体可渗透材料气体连通，以及

e)培育所述细胞培养设备达足以允许细胞汇合、细胞增殖、细胞分化、组织分层或组织生长中的一个或多个的时间。

在一个实施例中，在步骤b)中，所述设备处于其中所述基质安置成与气体可渗透材料气体连通的第一模式中。在一个实施例中，在步骤d)中，所述设备处于其中所述基质安置成与气体可渗透材料气体连通的第二模式中。

在另一方面中，本发明涉及一种用于在基质上培养一个或多个汇合细胞层的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包括所述细胞的悬浮液，所述细胞待在足以支持细胞生长的量的组织培养基中培养；

其中所述第一端壁(底部)、所述至少一个侧壁或所述第二端壁(顶部)的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述设备处于其中所述基质浸没于所述悬浮液中并且不与气体可渗透材料气体连通的第一模式中，

d)将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中所述基质安置成与所述气体可渗透材料气体连通，以及

e)培育所述细胞培养设备达足以形成一个或多个汇合细胞层的时间，其中所述一个或多个汇合细胞层安置于所述基质的至少一部分上方。

在各种实施例中，步骤e)包括培育所述细胞培养设备达足以允许细胞分化或细胞增殖中的一个或多个的时间。

在各种实施例中，所述设备是本发明的设备。

在一个实施例中，经由室中存在的的进出口(例如，容器中存在的进出口)引入所述细胞悬浮液。

在另一实施例中，细胞悬浮液在附着顶部之前引入到容器中。

在一个实施例中，待培养的细胞是锚着依赖性细胞。

在一个实施例中，所述细胞包括上皮细胞。在一个实施例中，所述细胞包括角质细胞。在一个实施例中，所述细胞包括成纤维细胞。在一个实施例中，所述细胞包括角质细胞和成纤维细胞。

在一个实施例中，所述细胞悬浮液包括从组织消化物获得的细胞群。

在一个实施例中，所述方法包括在步骤d)和e)之间的以下额外步骤

f)例如经由进出口引入包括待培养的细胞的第二悬浮液，以及

g)培育容纳第二悬浮液的细胞培养设备达足以让第二悬浮液中的细胞中的至少一些粘附到基质的时间，以及任选地

h)调整所述细胞培养设备以将基质或细胞安置成与气体可渗透材料气体连通。

在一个实施例中，所述方法包括步骤f)到h)的一次或多次重复。

在一个实施例中，第二悬浮液包括不同于第一悬浮液中存在的细胞类型的一种或多种细胞类型。举例来说，在一个实施例中，第一悬浮液包括成纤维细胞，且第二悬浮液包括角质细胞。

在一个实施例中，所述基质是生物相容性的。在一个实施例中，所述基质是生物可降解的。

在另一方面中，本发明涉及一种用于培养组织(例如，上皮组织)的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的上皮细胞的悬浮液；

b)将所述悬浮液引入到所述细胞培养设备中，所述设备将所述悬浮液引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及能拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室；以及支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，

其中所述设备处于其中所述基质浸没于所述悬浮液中并且任选地与气体可渗透材料气体连通的第一模式中，

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述上皮细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间，

d)将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中所述基质和/或所述细胞安置成与所述气体可渗透材料气体连通，以及

e)培育所述细胞培养设备达足以允许发生细胞分化、增殖或分层或上皮组织发育的时间。

在一个实施例中，所述方法包括跟在步骤b)之后的以下步骤中的一个或多个：

f)从所述设备去除所述组织培养基，

g)清洗所述基质的表面以去除未粘附细胞，以及/或

h)将新组织培养基添加到所述设备。

在一个实施例中，上皮细胞是角质细胞。

在一个实施例中，所述悬浮液另外包括第二细胞群，例如成纤维细胞。

在一个实施例中，在步骤b)中，所述设备处于其中所述基质任选地安置成与气体可渗透材料气体连通的第一模式中；以及在步骤d)中，所述设备处于其中上皮细胞安置成与气体可渗透材料气体连通的第二模式中。举例来说，所述上皮细胞与气体可渗透材料直接接触。

在另一方面中，本发明涉及一种用于培养分层表皮组织或全厚皮片组织的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的角质细胞和成纤维细胞的悬浮液；

b)将所述悬浮液引入到所述细胞培养设备中，所述设备将所述悬浮液引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室；以及支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以使所述角质细胞和/或成纤维细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间，

e)培育所述细胞培养设备达足以允许发生表皮分层的时间。

在另一方面中，本发明涉及一种用于培养复层上皮组织的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的细胞的第一悬浮液；

b)将所述第一悬浮液引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室，其中所述室包括注射口；以及支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述第一悬浮液中的所述细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间；

d)任选地将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中所述基质不安置成与所述气体可渗透材料气体连通，

e)通过所述注射口将包括上皮细胞的第二悬浮液引入到所述细胞培养设备中，

f)培育容纳所述第二悬浮液的所述细胞培养设备达足以使所述上皮细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间，

g)将所述细胞培养设备调整到所述第一模式，其中所述基质和/或所述上皮细胞安置成与所述气体可渗透材料气体连通，以及

h)培育所述细胞培养设备达足以发生上皮分层的时间。

在另一方面中，本发明涉及一种用于培养全厚皮片组织或分层表皮组织的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的成纤维细胞的悬浮液；

b)将所述悬浮液引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室，其中所述室包括注射口；以及支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述成纤维细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间；

e)通过所述注射口将包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的角质细胞的悬浮液引入到所述细胞培养设备中，

f)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述角质细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间，

g)将所述细胞培养设备调整到所述第一模式，其中所述基质和/或所述角质细胞安置成与所述气体可渗透材料气体连通，以及

h)培育所述细胞培养设备达足以发生表皮分层的时间。

在一个实施例中，在步骤(d)中调整到第二模式会将所述基质的与成纤维细胞锚着的表面相对的表面暴露于气体可渗透材料。

在一个实施例中，所述方法包括

c)其中所述第一端壁(底部)、所述至少一个侧壁或所述第二端壁(顶部)的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述设备处于其中所述基质浸没于所述悬浮液中的第一模式中，

d)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述成纤维细胞中的至少一些粘附到所述基质以及任选地允许成纤维细胞增殖以形成一个或多个真皮层的时间；

g)将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中角质细胞安置成与气体可渗透材料气体连通，以及

h)培育所述细胞培养设备达足以发生表皮分层的时间。

在另一实施例中，所述方法包括：

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述成纤维细胞中的至少一些粘附到所述基质并且任选地允许成纤维细胞增殖以形成一个或多个真皮层的时间，

d)将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中所述成纤维细胞安置成与所述气体可渗透材料气体连通，

g)将所述细胞培养设备调整到第一模式，其中角质细胞安置成与气体可渗透材料气体连通，以及

h)培育所述细胞培养设备达足以发生表皮分层的时间。

在一个实施例中，所述基质对于一个或多个细胞来说是不可渗透的。

在另一实施例中，所述基质对于一个或多个细胞来说是可渗透的。

在一个实施例中，培育所述细胞培养设备达足以允许至少一些成纤维细胞迁移到所述基质中或通过所述基质的时间。

在一个实施例中，培育所述细胞培养设备达足以允许成纤维细胞中的至少一些增殖的时间。

在一个实施例中，培育所述细胞培养设备达足以使成纤维细胞产生加厚真皮的时间。在另一实施例中，培育所述细胞培养设备达足以发生细胞外基质沉积的时间。

在各种实施例中，培育细胞培养设备达至少一周(例如，至少两周或至少三周)的时间段。在某些实施例中，培育所述细胞培养设备达至少约一个月(例如，至少约两个月)的时间段。

b)将所述悬浮液引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室，其中所述室包括适于接纳上面驻留细胞的基质的支架，

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述上皮细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间；

d)将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中所述基质安置成与所述气体可渗透材料气体连通，

e)培育所述细胞培养设备达足以发生上皮分层的时间。

在另一方面中，本发明涉及一种用于培养分层表皮组织的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的角质细胞的悬浮液；

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述角质细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间；

e)培育所述细胞培养设备达足以发生表皮分层的时间。

在一个实施例中，一个或多个成纤维细胞层安置于所述基质的表面的至少一部分上方。

a)提供安置于基质的表面的至少一部分上方的粘附上皮细胞或包括上皮细胞的组织，

b)将所述粘附上皮细胞或包括上皮细胞的组织引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室，且其中所述细胞培养设备容纳培养基；

其中所述设备处于其中所述基质、粘附上皮细胞和/或包括上皮细胞的组织浸没于培养基中并且与气体可渗透材料气体连通的第一模式中，

c)培育容纳所述粘附上皮细胞或包括上皮细胞的组织的所述细胞培养设备达足以发生上皮分层的时间。

在一个实施例中，粘附上皮细胞是角质细胞，且复层上皮组织是分层表皮组织。

在另一方面，本发明涉及一种用于培养全厚皮片组织的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供安置于基质的表面的至少一部分上方的粘附细胞或组织，

b)将所述粘附细胞或组织引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室，且其中所述细胞培养设备容纳培养基；

其中所述设备处于其中所述基质、粘附细胞和/或组织浸没于所述培养基中并且与气体可渗透材料气体连通的第一模式中，

c)培育容纳所述粘附细胞或组织的所述细胞培养设备达足以发生表皮分层和/或生成全厚皮片的时间。

在一个实施例中，所述粘附细胞或组织包括一个或多个细胞群。

在一个实施例中，所述粘附细胞，例如，角质细胞，粘附到基质的表面的至少一部分。

在一个实施例中，所述粘附细胞或组织包括成纤维细胞。在另一实施例中，所述粘附细胞或组织包括角质细胞。在另一实施例中，所述粘附细胞或组织包括成纤维细胞和角质细胞。

在一个实施例中，角质细胞是未分化的。

在一个实施例中，所述基质与所述室内一次性的支架接合。举例来说，所述室包括适于接纳所述基质的支架。在另一实例中，在将支架引入到所述室之前，所述支架接纳所述基质。

在另一方面中，本发明涉及一种用于在生物相容性基质上培养细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供具有至少一个气体可渗透表面的室，其中所述室包括适于接纳大体上平面的生物相容性气体可渗透基质的支架，所述支架能够从第一位置大体上线性地移动到所述气体可渗透表面处或邻近并且与所述气体可渗透表面气体连通的第二位置，

b)将所述室提供于第一模式中，因此所述支架处于所述第一位置，界定所述室内液体不可渗透的容积并且将包括待培养的细胞的悬浮液引入到所述容积，

c)将包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的细胞的第一悬浮液引入到细胞培养设备中，

d)培育所述室达足以允许所述细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间，

e)以第二模式提供所述室，因此所述支架处于第二位置，界定所述室内液体不可渗透的容积，且其中所述基质与所述气体可渗透表面气体连通，以及

f)任选地将包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的细胞的第二悬浮液引入到所述细胞培养设备中，

g)培育所述室达足以允许形成一个或多个汇合细胞层的时间，其中所述一个或多个汇合细胞层安置于所述基质的至少一部分上方。

在一个实施例中，所述方法是培养上皮细胞、表皮细胞或上皮和表皮细胞的方法。

在一个实施例中，第一悬浮液包括成纤维细胞和角质细胞。

a)提供具有至少两个气体可渗透表面的室，其中所述室包括适于接纳大体上平面的生物相容性气体可渗透基质的支架，所述支架能够从第一气体可渗透表面处或邻近并且与所述第一气体可渗透表面气体连通的第一位置大体上线性地移动到第二气体可渗透表面处或邻近并且与所述第二气体可渗透表面气体连通的第二位置，

b)以第一模式提供所述室，因此所述支架处于所述第一位置，界定所述室内液体不可渗透的容积，且其中所述基质与所述第一气体可渗透表面气体连通，

e)以第二模式提供所述室，因此所述支架处于第二位置，界定所述室内液体不可渗透的容积，且其中所述基质与所述第二气体可渗透表面气体连通，以及

f)将包括处于足以支持细胞生长的量的组织培养基中的细胞的第二悬浮液引入到所述细胞培养设备中，

g)培育所述室达足以允许所述细胞中的至少一些粘附到所述基质并且允许形成一个或多个汇合细胞层的时间，其中所述一个或多个汇合细胞层安置于所述基质的至少一部分上方。

在一个实施例中，第一细胞悬浮液包括成纤维细胞。在一个实施例中，第二细胞悬浮液包括角质细胞。

在一个实施例中，一个或多个汇合细胞层的形成是一个或多个分层表皮组织的形成。

在一个实施例中，一个或多个汇合细胞层的形成是全厚皮片的形成。

在一个实施例中，支架的移动是从第一气体可渗透表面处或邻近并且与所述第一气体可渗透表面气体连通的第一位置到第二气体可渗透表面处或邻近并且与所述第二气体可渗透表面气体连通的第二位置的大体上线性移动。在一个实施例中，所述线性移动无支架绕垂直于线性移动的轴线的显著旋转或倒转。

在另一方面中，本发明涉及一种产生分层表皮组织的方法，所述方法包括

a)提供基质，其中粘附角质细胞安置于所述基质的表面的至少一部分上方；

b)提供包括至少一个气体可渗透界面的细胞培养设备；

c)将所述基质引入到所述设备中，使得所述角质细胞与所述气体可渗透界面接触，

d)培育所述细胞培养设备达足以允许发生表皮分层的时间。

在一个实施例中，所述方法包括提供基质，其中粘附成纤维细胞安置于所述基质的表面的至少一部分上方。在一个实施例中，粘附角质细胞和粘附成纤维细胞安置于所述基质的一个表面的至少一部分上方。在一个实施例中，粘附角质细胞安置于所述基质的一个表面的至少一部分上方，且粘附成纤维细胞安置于相对表面的至少一部分上方。

在一个实施例中，所述方法是产生包括分层表皮和真皮的组织的方法。在一个实施例中，所述方法是产生全厚皮片的方法。

在一个实施例中，所述生物相容性基质是膜，且所述支架适于将所述膜保持在拉伸下。

在各种实施例中，所述基质是或包括以下中的一个或多个：无细胞去上皮真皮(人造真皮)；真皮；包含胶原蛋白凝胶的胶原蛋白和包括胶原蛋白的组织；表皮或上皮系的组织或细胞，包含来自脐带、胎盘、粘膜、消化道的组织或细胞；纤维结合蛋白/纤维蛋白；富含血小板的血浆；基质胶；包括细胞外基质(包含由例如成纤维细胞的细胞分泌的细胞外基质)的成分和组织；透明质酸；静电纺丝生物相容性材料，包含PLGA；生物相容性聚合物或生物相容性聚合物的组合，尤其是能够静电纺丝的生物相容性聚合物，包含聚丙烯酸、聚L赖氨酸、胶原蛋白、明胶、尼龙和聚酯；明胶；肽水凝胶；聚乳酸羟基乙酸(polyglactin)支架；人工真皮(dermagraft)；弹性蛋白；壳聚糖；蚕丝蛋白；蜘蛛丝；琼脂糖，和其中任两种或更多种的组合。

应了解，上文所述的细胞和组织可来自任何动物源，包含人类、马、猪、绵羊、鼠、犬、猫和牛。

所属领域的技术人员在阅读本发明时将认识到，包括一个或多个生物衍生产品的基质通常将提供对在本发明的某些实施例中发生的表皮分层的适当刺激且无需另外修改，而包括一种或多种合成材料的基质通常将需要修改(例如，涂层)以提供对表皮分层的刺激。

另外将了解，本发明的方法适合于培养任何动物细胞。特别预期哺乳动物细胞，包含人类。

本发明的方法可用以制备包含以下的组织：上皮，例如单细胞厚角质细胞层；复层上皮，包括基底层、棘层、粒层、透明层和角质层中的至少两个；以及全厚皮片，包括真皮和表皮层。

在各种实施例中，选择气体可渗透材料以用于最佳气体交换和/或细胞生长、增殖和/或分层。

在一个实施例中，所述气体可渗透材料是具有小于250pm的厚度的气体可渗透膜。

在各种实施例中，尤其是在其中将单细胞悬浮液引入到细胞培养设备中的那些实施例中，所述设备具有足以容纳足够用至少10天——例如，至少14天、至少15天、至少16天或至少17天或更长——的生长培养基的容积。

在一个方面中，本发明提供通过如本文中所述的方法或在如本文中所述的培养设备中制备的细胞，例如上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞或角质细胞和成纤维细胞。

在一个实施例中，角质细胞是分化的角质细胞。

在一个实施例中，所述细胞粘附到基质。

在另一方面，本发明提供通过如本文中所述的方法或在如本文中所述的培养设备中制备的组织，例如上皮组织、复层上皮组织、表皮、分层表皮、分层表皮和真皮、或全厚皮片。

在另一方面中，本发明提供通过如本文中所述的方法或在如本文中所述的培养设备中制备的组织，包括包括成纤维细胞的真皮层、包括角质细胞的分层表皮层以及生物相容性基质。

在一个实施例中，生物相容性基质是生物可降解基质。在一个实例中，生物可降解基质存在于真皮和表皮层之间。

在一个实施例中，所述组织包括真皮层和表皮层，所述真皮层包括至少部分地嵌入于基质中或附接到所述基质的成纤维细胞。在另一实施例中，所述组织包括基质、附接到所述基质的一个表面的真皮层以及附接到所述基质的相对表面的表皮层。在另一实施例中，所述组织包括表皮层、附接于表皮层的一个表面上的基质以及附接到表皮层的相对表面的真皮层。

在各种实施例中，真皮层、表皮层或真皮层和表皮层嵌入于所述基质中，或附接到所述基质。

在另一方面中，本发明涉及在治疗有需要的受治疗者的组织损伤时用如本文中所述的方法制备的组织(例如，表皮、分层表皮、分层表皮和真皮或全厚皮片)的用途。

在各种实施例中，所述治疗是针对伤口、烧伤、疤痕(包含手术疤痕)。

在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的患者的组织损伤的方法，所述方法包括以下步骤

a)提供本发明的设备，在所述设备中，已用例如本文中所描述的方法生长例如上皮组织、复层上皮组织、表皮、分层表皮、分层表皮和真皮、或全厚皮片的组织，

b)在无菌条件下从所述设备回收所述组织，以及

c)将所述组织应用于受治疗者。

一般来说，将通过手术将组织应用于受治疗者。在一个实施例中，在无菌条件下回收是在手术期间或紧接在手术前，例如在手术室。

一般来说，组织应用于受治疗者将在组织损伤的部位处或邻近。

在各种实施例中，组织损伤选自伤口、烧伤、疤痕、手术部位以及类似者。

在各种实施例中，上皮组织应用于消化道、皮肤系统、生殖道、呼吸道、感觉系统或泌尿道的区域。在各种实施例中，上皮组织应用于或形成颌下腺管、附着牙龈、舌背、硬腭、食管、胃、大肠、小肠、直肠、肛门、胆囊、甲状腺滤泡、皮肤、汗腺管、体腔间皮、卵巢、输卵管、子宫、子宫颈、阴道、大阴唇、肾直小管、睾丸网、输出小管、附睾、输精管、射精管、尿道球腺、精囊、口咽、喉、喉、声带、气管、呼吸细支气管、角膜、鼻、肾脏近曲小管、肾脏升支细段、肾脏远曲小管、肾脏集合管、肾盂、输尿管、膀胱、前列腺尿道、膜部尿道、阴茎尿道、或外尿道口。

在另一方面，本发明提供一种工程化包括上皮组织的结构的方法，所述方法包括以下步骤

a)提供本发明的设备，在所述设备中，已用例如本文中所描述的方法生长例如上皮组织、复层上皮组织、表皮、或分层表皮的组织，

b)在无菌条件下从所述设备回收所述组织，以及

c)处理所述回收的组织以形成所述结构。

b)在无菌条件下从所述设备回收所述组织，

c)将所述组织应用于受治疗者，以及

d)处理所述组织以形成所述结构。

在各种实施例中，所述结构包括消化道、皮肤系统、生殖道、呼吸道、感觉系统或泌尿道的结构。在各种实施例中，所述结构包括颌下腺管、附着牙龈、舌背、硬腭、食管、胃、大肠、小肠、直肠、肛门、胆囊、甲状腺滤泡、皮肤、汗腺管、体腔间皮、卵巢、输卵管、子宫、子宫颈、阴道、大阴唇、肾直小管、睾丸网、输出小管、附睾、输精管、射精管、尿道球腺、精囊、口咽、喉、喉、声带、气管、呼吸细支气管、角膜、鼻、肾脏近曲小管、肾脏升支细段、肾脏远曲小管、肾脏集合管、肾盂、输尿管、膀胱、前列腺尿道、膜部尿道、阴茎尿道、或外尿道口。

在另一方面，本发明提供一种测试化合物或组合物对组织的毒性的方法，所述方法包括以下步骤

b)将所述化合物或组合物应用于所述组织，以及

c)评估所述组织是否发生组织损伤或细胞死亡。

在另一方面，本发明提供一种测试化合物或组合物的组织渗透性(例如，透皮渗透性)的方法，所述方法包括以下步骤

a)提供本发明的设备，在所述设备中，已用例如本文中所描述的方法生长例如表皮、分层表皮、分层表皮和真皮或全厚皮片的组织，

b)将所述化合物或组合物应用于所述组织，以及

c)评估所述化合物或组合物通过所述组织的所述渗透性。

在另一方面，本发明提供一种测试用于实现组织改变的化合物或美容性、治疗性或营养性组合物的效力的方法，所述方法包括以下步骤

a)提供本发明的设备，在所述设备中，已用例如本文中所描述的方法生长例如上表皮、分层表皮、分层表皮和真皮或全厚皮片的组织，

b)将所述化合物或组合物应用于所述组织，以及

c)评估用于实现所述组织的改变的所述化合物或组合物的所述效力。

在一个实施例中，所述方法另外包括在步骤a)之后从所述设备回收所述组织的步骤。在替代实施例中，所述方法包括在所述设备内将所述化合物或组合物当场应用于组织。

旨在参考本文中公开的数字范围(例如1到10)也并入参考在所述范围内的所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及在所述范围内的有理数的任何范围(例如2到8、1.5到5.5和3.1到4.7)。

对于本发明涉及的领域的普通技术人员，在构造上的许多变化以及本发明的广泛不同的实施例和应用将表明它们自身在不脱离如所附权利要求书中所界定的本发明的范围的情况下。本文中的公开内容和描述仅仅是说明性的且并不意图以任何意义进行限制。

广泛地说，本发明还可以主要在于单独地或共同地在本申请的说明书中提及或指示的零件、元件和特征，和任何两个或更多个所述零件、元件或特征中的任何或所有组合，并且当具有本发明所涉及的领域中的已知等效物的特定的整数在此被提到时，此类已知等效物被认为如单独地进行阐述一般并入本文中。

在其中已经对包含专利说明书和其它文献的信息的外部来源进行参考的本说明书中，这总体上是出于提供论述本发明特征的上下文的目的。除非另外说明，否则对于此类信息源的参考不能以任何司法权解释为，承认此类信息源是现有技术或者形成所属领域中的公知常识的部分。

附图说明

现将仅借助于实例并且参考附图来描述本发明，在附图中：

图1是设备的第一实施例的两个分解透视图；

图2是图1中示出的设备的分解透视图；

图3是设备的第二实施例的透视图，示出支架在A)第一位置和B)第二位置之间移动；

图4是设备的第三实施例的透视图，示出从A)第一视角和B)第二视角的视图；

图5是设备的第四实施例的分解透视图；

图6是图5中所示的设备的透视图，示出支架在A)第一位置和B)第二位置之间的移动；

图7示出设备的第五实施例的前上方透视图，具有在后壁平面513中通过设备所取的横截面；

图8示出图7中所示的实施例的前视图，示出A)第一位置和B)第二位置中的支架；

图9示出图7的实施例的支架的顶部透视图，示出支架接合基质；

图10示出图9的实施例的左视图；

图11示出图9的实施例的无基质的底部透视图；

图12示出A)通过平面A-A所取的图10的实施例的横截面的左分解视图(没有基质)；以及(B)通过平面A-A示出支架接合基质的横截面的左视图；

图13示出图9的支架的下部部件的替代实施例的顶部透视图；

图14示出A)通过平面B-B所取的图13中所示出的实施例的下部支架部件的横截面；以及(B)示出支架接合由上部支架部件锚着的基质的同一视图；

图15示出突出显示图9的实施例的截留空气释放机构的视图；

图16示出图9的支架的下侧的透视图；以及

图17示出图9的支架的右视图。

具体实施方式

本发明涉及一种用于培养细胞的设备和方法。所述设备包括：容器，包括第一端壁和至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁，其中两个或更多个壁的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换。

本发明另外涉及通过本文中描述的方法或在本文中描述的培养设备中制备的组织，或涉及使用此类组织治疗有需要的患者的组织损伤。

本文中描述的设备和方法提供用于在模拟空气-液体界面的条件下培养细胞和组织(例如，上皮细胞、复层上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞和/或上皮组织，例如皮肤)。所述条件提供促进上皮细胞分化和/或分层和/或多细胞层或多层组织生长的高氧环境。本发明的设备和方法将生长中的细胞和组织安置成与气体可渗透界面气体连通，例如，安置在气体可渗透界面处。

本发明的方法和设备的实施例具有多个优点，包含但不限于

·细胞和组织工程化是切实可行且高效的，

·生产全合成组织无需使用异生素物质，例如动物来源的化合物或物质，

·减少培养的组织和细胞的制造成本，

·减少在培养的细胞和组织的培养期间的用户处置，

·减少对培养的组织和细胞的污染，或

·在细胞或组织培养期间，减少细胞或组织损失和/或增加产出。

1.定义

术语“和/或”可指“和”或“或”。

如本说明书中所使用的术语“包括”意指“至少部分由…组成”。当解释本说明书中包括所述术语的语句时，在每一语句中由所述术语引出的特征都需要存在，但是其它特征也可存在。如“包括”和“包括着”等相关术语应以相同方式解释。

如本说明书中所使用的术语“气体-液体界面”或“空气-液体界面”意指增殖或分化中的细胞或组织同时与空气或气体和液体接触所处的表面。一些细胞和组织的生长需要空气-液体界面。举例来说，全厚皮片的生长需要空气-液体界面，其中生长中的皮肤的真皮层与液体细胞培养基接触，且表皮层与空气接触以便引发表皮分层。对于一些细胞或组织类型，空气-液体界面或气体-液体界面处或邻近的高氧培养条件促进细胞生长、分化或分层，以及/或多细胞层或多层组织的形成。

如本说明书中所使用的术语“气体可渗透界面”意指定位于气体环境与允许发生气体交换但是液体密封的封闭环境之间的表面。存在于本文中描述的设备中的一个或多个气体可渗透界面提供以与空气-液体或气体-液体界面类似的方式促进细胞或组织增殖、分化和/或分层的界面。特定来说，存在于本文中描述的设备中的一个或多个气体可渗透界面提供促进上皮细胞(例如角质细胞)增殖和分化和/或上皮或表皮分层的界面。

如本说明书中所使用的术语“气体可渗透材料”意指发生气体交换可通过的材料。气体可渗透膜特别预期供在本文中描述的设备中使用。

如本说明书中所使用的关于本发明的设备的支架和气体可渗透材料或基质、安置于基质上的细胞或组织和气体可渗透材料之间的相互作用的术语“气体连通”意指支架、基质、细胞或组织足够接近于气体可渗透材料以允许发生环境和基质或细胞(例如，基质或安置于支架上的细胞)之间的气体交换，以便递送例如增加的氧气到基质、细胞或组织。在一些实施例中，支架、基质或细胞与气体可渗透材料直接接触。在其它实施例中，支架、基质或细胞不与气体可渗透材料直接接触。举例来说，在各种实施例中，支架、基质或细胞维持在小于约0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9或约10mm的距离处，且有用范围可选自任何这些值之间，例如从约0到约10mm，约0到约5mm，约0到约2mm，约0到约1mm，约0到约0.5mm，约0到约1mm，约0.1到约10mm，约0.1到约5mm，约0.5到约5mm，或从约2到约5mm。

跟在名词之后的术语“(s)”预期单数或复数形式，或这两个。

术语“受治疗者”用于指动物，优选地哺乳动物，更优选地人类。哺乳动物受治疗者包含猫、狗和马。其它哺乳动物受治疗者包含农业动物，包含马、猪、绵羊、山羊、母牛、鹿或飞禽，或实验动物，包含猴、大鼠、小鼠、兔或豚鼠。

术语“治疗”和其派生词应以其最广泛的可能上下文来解释。所述术语不应用以暗示受治疗者得以治疗直至完全康复。因此，“治疗”广泛地包含以基本上静止的水平维持受治疗者的疾病进展、症状或烧伤或伤口愈合，增加受治疗者的康复率，改善和/或预防症状发作或特定病症、烧伤、伤口或其它损伤的严重程度，或延展患者的生活品质。术语“治疗”还广泛地包含对过敏个体维持良好健康状况以及建立对疾病、传染或感染预防的耐力。

2.设备

本发明的设备提供用于培养或工程化需要或受益于暴露于空气-液体界面以刺激或促进其生长、分化或分层的细胞和/或组织。本发明的设备提供用于培养浸没于液体中并且与气体可渗透表面气体连通的的细胞或组织。

在图1中示出的设备的第一实施例。设备100包括：容器110，由第一端壁111和至少一个侧壁112形成；以及可拆卸第二端壁120。

容器110被配置成与第二端壁120密封地接合以形成液体密封。当接合时，容器110和第二端壁120限定室130。

在如图1中所示的本发明的一个实施例中，边缘114从容器110在端部113处或朝向端部113侧向延伸。在一个实施例中，边缘114限定凹槽115，所述凹槽被配置成保持O型环(未示出)，例如橡胶O型环。当容器与第二端壁120接合时，O型环形成液体密封。

在一个实施例中，第二端壁120紧固到容器110。举例来说，第二端壁120使用螺母和螺栓紧固到容器110。

在各种实施例中，第二端壁120被配置成通过摩擦配合、螺纹布置或一个或多个夹具与容器110接合。

在一个实施例中，侧壁112或第二端壁120包括至少一个可流体密封进出口117。在一个实施例中，所述设备另外包括塞子，例如塞子或与口117接合以形成液体密封的其它部件。举例来说，在一个实施例中，所述设备包括与港口117接合以形成液体密封的橡胶塞(未示出)，其中可通过橡胶塞插入针以将细胞或培养基注入到室中。当去除针时，恢复液体密封。

在一个实施例中，容器110和/或第二端壁基本上由塑料合金形成。用于形成容器110和/或第二端壁120的适合材料是可灭菌的材料，例如可高压灭菌或可辐射的材料。

第二端壁120、端壁111和至少一个侧壁112中的两个或更多个的至少一部分包括气体可渗透材料或被配置成与气体可渗透材料接合。在示范性实施例中，第一端壁111和第二端壁120的至少一部分包括气体可渗透材料或经配置以与气体可渗透材料接合。

在一个实施例中，气体可渗透材料位于端壁或侧壁的内表面上。在一个实施例中，使用粘附剂附接气体可渗透材料。

如图1中所示，包括气体可渗透材料或与气体可渗透材料接合的第二端壁120、第一端壁111和/或侧壁112的部分是多孔的以允许气体交换。在一个实施例中，包括气体可渗透材料或与气体可渗透材料接合的第二端壁、第一端壁和/或侧壁的部分包括多个孔眼140。在示范性实施例中，孔眼140直径约3mm。在一个实施例中，孔眼延伸到与气体可渗透材料基本上相同的区，进而在端壁120和111中的每一个的内表面上形成气体可渗透界面。

在一个实施例中，边缘从第一端壁111和/或第二端壁120延伸，所述边缘被配置成使得当设备100放置在外表面上时，第一端壁111和/或第二端壁120的外面不接触所述外表面。在所述设备中存在一个或多个法兰可增强外部环境和设备的室之间通过孔眼140和气体可渗透材料的气体交换。

在一个实施例中，当设备100处于使用中且气体可渗透材料存在并延伸以完全覆盖孔眼140时，室130可与环境液体密封但与所述环境气体连通。

在一个实施例中，气体可渗透材料是气体可渗透膜。

在各种实施例中，气体可渗透材料具有小于约50、75、100、120、125、140、145、150、155、160、170、175、200、225、250、300、350、400、450或小于约500pm的厚度，且有用范围可选自任何这些值之间，例如从约50到约500pm，从约100到约200pm，或从约125到约175pm。

在一个实施例中，气体可渗透材料是聚二甲基硅氧烷、硅酮、氟乙烯聚丙烯、聚烯烃、或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。

应了解，包含气体渗透性程度、湿汽穿透率、与细胞的生物相容性以及物理强度或完整性的性质对于选择适合的气体可渗透材料供所述设备使用来说是重要的考虑因素。

设备100另外包括位于室130中的支架150，所述支架适于接纳上面驻留细胞的基质。在一个实施例中，支架150可从所述设备拆卸。

在一个实施例中，支架150取向成与第一端壁111和/或第二端壁120基本上平行。

在一个实施例中，支架150是大体上平面的且可呈适于保持基质的框架的形式。在一个实施例中，支架包括将基质保持在处于拉伸下的支架中或上的夹具或夹片。

在一个实施例中，基质直接结合或施加到支架150。

在一个实施例中，所述设备包括多个支架，其中每个支架包括离散基质。在一个实施例中，每个支架包括不同基质。在一个实施例中，每个支架包括相同基质。

在另一实施例中，支架包括多个分开的基质。在一个实施例中，分开的基质是相同基质。在另一实施例中，分开的基质是不同基质。

在替代实施例中，包括所述基质的部件例如通过粘附剂、夹持或摩擦配合装配到支架150。

支架150被配置成与一个或多个侧壁112接合以允许支架150在第一端壁111处或朝向第一端壁111的第一位置与第二端壁120处或朝向第二端壁120的第二位置之间大体上线性地移动，或反过来也如此，当在使用中时，设备100倒置。在第一位置或第二位置，或第一位置和第二位置中，基质与气体可渗透材料气体连通。在一个实施例中，基质与气体可渗透材料接触。

举例来说，在使用中时，当设备100在第一模式中取向使得第一端壁111处于设备的底部且第二端壁120处于顶部时，支架150位于第一端壁111处或朝向第一端壁111的第一位置中。当设备100在第二模式中倒置使得第一端壁111处于顶部时，支架150通过重力线性地移动到第二端壁120处或朝向第二端壁120的第二位置。

支架150被配置成与一个或多个侧壁112接合，以便限制支架绕垂直于至少一个侧壁112的轴线的旋转或倒转。

在一个实施例中，支架150具有与至少一个侧壁112中的一个或多个互补凹槽接合的一个或多个凸耳，以允许支架150的平移移动但限制旋转移动。在替代实施例中，至少一个侧壁112具有与支架150中的一个或多个互补凹槽接合的一个或多个凸耳。

在一个实施例中，支架150由不锈钢形成。应了解，其它适合材料包含具有足够密度的材料以使得当室130填充有大量液体且设备倒置时，支架150通过液体从第一位置移动到第二位置。形成支架的适合材料包含生物相容性且对组织培养基引起的氧化或降解具抗性的材料。

在一个实施例中，支架150包括一个或多个孔隙以允许室130中的液体移动并且当设备100倒置时，释放截留的空气。

应了解，可使用导引支架150的平移移动但限制旋转移动的其它系统。

在替代实施例中，如图2中所示，容器110是圆柱形的。在此实施例中，第一端壁111、第二端壁120、边缘114和/或支架150也可具有圆形形状。

在图3中示出设备的第二实施例，包括导引支架的平移移动但限制旋转移动的替代系统。

设备200包括支架250，所述支架由双臂杆操作以达成在第一和第二位置之间的大体上线性的移动。

在此实施例中，支架250呈通过从支架250的相对侧朝向侧壁212延展的插脚251固定地附接或与所述插脚成整体的框架形式。抛移(flinged)杆253可与插脚251移动接合并且在相反朝向上延伸以与延伸通过侧壁212的插脚254固定地接合。

在一个实施例中，设备200包括以密封方式与侧壁212中的容纳插脚254的孔隙接合的一个或多个塞子255。

设备200另外包括位于相对侧壁212的外部上并且与插脚254固定地接合的一个或多个相对柄256。在实施例中，包括大于一个柄的柄256宜在相反方向上延伸。

通过使一个或两个柄256绕垂直于侧壁212的轴线旋转来达成支架250从图3的部分A中所示出的第一位置的平移、线性移动，以驱动铰接杆253打开支架250并将其升高到图3的部分B中所示出的第二位置。

在图4中示出设备的第三实施例，包括导引支架的平移移动但限制旋转移动的另一替代系统。

在此实施例中，支架350可与从支架350的相对侧朝向侧壁312延伸的杆臂353移动接合。杆臂353在支架350的相对拐角处或朝向所述拐角与支架350接合。

杆臂353在相对朝向上延伸以与延伸通过侧壁312的插脚354固定地接合。

设备300包括位于相对侧壁312的外部上并与与插脚354固定地接合的一个或多个相对柄356。在实施例中，包括大于一个柄的柄356宜在相反方向上延伸。

通过使一个或两个柄356绕垂直于侧壁312的轴线旋转来达成支架350从第一位置到第二位置的平移、线性移动，以迫使杆臂352打开并且升高或降低支架350。

在图5中示出设备的第四实施例。

设备400包括由第一端壁411和侧壁412形成的容器410，以及第二端壁420。

容器410被配置成与第二端壁420密封地接合以形成液体密封并且限定室430。设备400可包括边缘414以及如上文针对设备100所描述的密封布置。

在一个实施例中，至少一个侧壁412包括至少一个可流体密封的进出口。在一个实施例中，设备另外包括与所述口接合以形成液体密封的塞子418或其它部件。

第二端壁420的至少一部分包括气体可渗透材料或被配置成与气体可渗透材料接合。在一个实施例中，如图4中所示，第二端壁420的两个或更多个分开的区域包括气体可渗透材料或被配置成与气体可渗透材料接合。

第二端壁420的包括气体可渗透材料或与气体可渗透材料接合的一个或多个区域是多孔的，以允许如针对设备100所描述的气体交换。在一个实施例中，第二端壁的包括气体可渗透材料或与气体可渗透材料接合的一个或多个区域包括多个孔眼440。

在一个实施例中，当设备400在使用中且气体可渗透材料存在并延伸以完全覆盖包括孔眼440的两个区域时，室430可与环境气体液体密封但与所述环境气体连通。

设备400另外包括位于室430中的支架450，所述支架适于接纳上面驻留细胞的基质。基质可如上文针对设备400所描述地施加或装配到支架450。

在一个实施例中，支架450是可拆卸的。在另一实施例中，支架450固定到设备400。

支架450被配置成与一个或两个侧壁412接合，以允许支架450绕垂直于一个或两个侧壁412的轴线大体上旋转移动。

在图6中示出支架450的移动。

在一个实施例中，支架450与跨越室430的宽度在侧壁412之间延伸的接脚451接合。

在一个实施例中，支架450固定地附接到接脚451。接脚451绕垂直于一个或两个侧壁412的轴线自由旋转。在此实施例中，设备包括位于容器410的外部上并且固定地附接到接脚451的端部的柄452。在一个实施例中，设备包括从接脚451的相对端延伸的第二柄。

支架450在图6的部分A中所示出的第一位置与图6的部分B中所示出的第二位置之间移动。在第一位置中，支架450的侧接触端壁420的第一区域。在其中端壁420的第一区域包括气体可渗透材料的实施例中，基质在第一位置中与气体可渗透材料气体连通或直接接触所述气体可渗透材料。

用户通过绕接脚451旋转柄452来移动支架450，以将支架450移动到第二位置使得支架450的相对平面表面接触端壁420的第二区域。在其中端壁420的第二区域包括气体可渗透材料的实施例中，基质在第二位置中与气体可渗透材料气体连通或接触所述气体可渗透材料。

应了解，可使用导引支架450的旋转移动的其它系统。

在一个实施例中，设备400包括从第一端壁411的内表面朝向第二端壁420延伸并且在侧壁412之间延伸的分区(未示出)，以将室430二等分并形成两个子室。所述分区被配置成不妨碍支架450的旋转移动。在一个实施例中，接脚451可容纳于所述分区内。

可将培养基添加到一个或两个子室。将培养基添加到一个子室提供用于位于所述子室中的细胞或组织的生长和分化的足够体积的培养基，同时提供大气体容积的室，因此最大化室中的培养基与气体之间的界面处的气体交换。

在一个实施例中，容器的侧壁中的一个或多个是可变形的。在此实施例中，手动处理可变形侧壁用以实现或允许支架至少部分地在容器的第一和第二端壁之间的平移移动。

在一个实施例中，设备包括至少部分地覆盖气体可渗透材料的可去除式或可溶性罩盖。用户可去除所述罩盖，以允许培养基、细胞、组织或基质与气体可渗透材料接触。

在一个实施例中，可去除式罩盖包括可溶性材料。当液体添加到设备的室时，所述罩盖溶解。

在图7中示出设备的第五实施例。

设备500包括由侧壁512、后壁513、前壁(未示出)形成的主体510，以及相对的可拆卸端壁520和521。

在一个实施例中，主体510被配置成与端壁520和521密封地接合以形成液体密封。在一个实施例中，当使用螺钉将端壁520和521紧固到主体510时，形成液体密封。所属领域的技术人员将明白可使用其它适合的紧固构件，包含上文所论述的那些紧固构件。

当接合时，主体510以及端壁520和521限定一室。

在一个实施例中，主体510的任一壁包括至少一个可流体密封的进出口517。在一个实施例中，与进出口517接合的塞子或其它部件用以形成如上文所描述的液体密封。

端壁520和521包括如图7中所示的多个孔眼540，以允许室环境之间的气体交换。端壁520和521的至少一部分被配置成与延伸以完全覆盖孔眼540的气体可渗透材料(未示出)接合，使得当设备500在使用中时，室与环境液体密封但与所述环境气体连通。气体可渗透界面(gas permeable interface，GPI)进而形成于端壁520和521中的每个的内表面上。

在使用中时，GPI提供气体扩散到设备内的培养基中，并且当接种于基质上的细胞与GPI直接接触时，促进细胞或组织增殖、分化和/或分层

设备500包括位于室中适于接纳基质551的支架550。

如图8中所示，支架550被配置成与一个或多个侧壁512接合以允许支架550在端壁520处或朝向所述端壁的第一位置(A)和端壁521处或朝向所述端壁的第二位置(B)之间大体上线性的平移移动。在使用中时，当设备500倒置时，支架550在第一和第二位置之间移动。

在一个实施例中，设备500和支架550的尺寸使得支架在一个尺寸(宽度或长度)上比设备的深度大。这些尺寸在限制旋转移动以避免支架550在设备中屈曲或卡住的同时，确保支架550在第一和第二位置之间光滑线性移行移动。

应了解，可使用导引支架的移行移动但限制旋转移动的其它系统，包含上文所描述的系统。

在使用中时，当支架500处于图8A中所示出的第一位置时，基质551的上表面与端壁520的内表面上的GPI接触。

在使用中时，当支架550处于图8B中所示出的第二位置时，基质551的下表面非常接近端壁521的内表面上的GPI，但不与其直接接触。

在使用中时，需要与GPI接触以便激增、分化或分层的细胞或组织(例如角质细胞)应接种于基质551的上表面上。换句话说，当支架550处于图8B中所示出的第二位置时，细胞或组织应添加到设备。

在替代实施例中(未示出)，端壁521的部分凸起以形成接合气体可渗透材料的平台。在此实施例中，所述平台被配置成使得在使用中时，当支架550处于第二位置时，基质551的下表面在端壁521处接触GPI。在此实施例中，可在使用中时处理设备500使得基质551的上表面在第一位置中接触GPI，且下表面在第二位置中接触GPI。

在使用中时，添加到室的细胞粘附到基质551。细胞可粘附到基质551的上表面、基质551的下表面，或基质551的上表面和下表面。

在一个实施例中，支架550呈如图9中所示的框架形式。支架550被配置成将基质551保持在拉伸下。在优选实施例中，基质551覆盖支架550的基本上全部顶边缘。

在一个实施例中，如图10中所示，支架包括下部部件552和上部部件553。

在一个实施例中，下部部件552形成如图11中所示的网格，所述网格支撑基质并且当设备在使用中倒置时，允许液体和空气通过支架。

如图12中所示，在使用中时，下部部件552和上部部件553被配置成将基质保持在支架上。大体上平面基板551跨越下部部件552的顶部表面放置。下部部件552围绕其周边塑形以接合上部部件553，从而形成将基质551保持在拉伸下的摩擦配合。在一个实施例中，下部部件552和上部部件553绕支架550的整个周边保持基质。

在一个实施例中，支架550包括固定地接合下部部件552和上部部件553的一个或多个夹片或夹持部件。

在图13中示出下部部件552的替代实施例。在此实施例中，下部部件552在其顶部表面上包括一个或多个突起部5521。如图14中所示，在使用中时，母上部部件553在基质上方装配到下部部件552中，突起部5521刺穿基质。将基质固定到支架的此方式可防止基质在使用中收缩或位移。

在一个实施例中，支架550包括如图15中所示的一个或多个孔隙554，以允许截留在基质下方的空气通过支架。在一个示范性实施例中，孔隙554位于支架550的两个或更多个拐角处。

在一个实施例中，如图16和17中所示，支架555包括位于沿着支架框架的侧长度的位置处的一个或多个凹部555。在使用中时，工具可插入于凹部中555以撬开下部部件552和上部部件553，从而从支架释放基质。

3.方法

一些细胞和组织的培养或工程化受益于或需要富氧环境。这可通过使用将生长中的细胞或组织安置在空气-液体界面处的培养技术来达成。这些技术通常涉及将细胞或组织定位于液体组织培养基的表面处接近于组织培养容器的室中存在的气体。此类技术尤其是对于生长具有大面积的组织，非常难以精确地实施。维持这些培养基多个周必然造成次优的细胞生长条件，这归因于在组织的所有部分上方维持一致深度的媒体实践起来有困难。通常需要多次改变培养基，这带来污染细胞或组织的风险。

本发明提供培养或工程化需要暴露于空气液体界面或受益于高氧环境中的培养的细胞或组织的高效且精确方法。

本文中描述的方法和设备可用以培养或工程化来自细胞的复杂组织。所述方法和设备提供促进细胞增殖和分化以形成复杂组织结构的环境。

在各种实施例中，所述方法是培养上皮细胞(例如表皮细胞，例如角质细胞)的方法。

在各种实施例中，所述方法是刺激或维持上皮细胞增殖或分化的方法。

在各种实施例中，所述方法是在基质上培养一个或多个汇合细胞层的方法，其中所述一个或多个汇合层安置于基质的至少一部分上方。在一个实施例中，所述方法是培养多细胞层中的细胞的方法。

在一个实施例中，所述方法是培养组织的方法。在各种实施例中，所述方法是培养包括上皮组织(上皮)、复层上皮组织、表皮组织(表皮)、分层表皮组织或分层表皮组织和皮肤组织(真皮)的组织的方法。

在一个实施例中，所述方法是培养上皮的方法。在各种实施例中，所述方法是培养单个细胞厚的角质细胞层或复层上皮(包括基底层、棘层、粒层、透明层和角质层中的至少两个)的方法。

在特别预期的实施例中，所述方法是培养皮肤或皮肤组织的方法。在特别优选的实施例中，所述方法是培养包括真皮和表皮层或全厚皮片的皮肤的方法。

在各种实施例中，细胞、组织、上皮或皮肤来源于人类或非人类动物。在一个实施例中，细胞、组织、上皮或皮肤是哺乳动物的。在各种实施例中，细胞、组织、上皮或皮肤是人类、猴、兔、马、猪、绵羊、鼠、犬、猫、牛、山羊或鸟的。

在各种实施例中，上皮组织(上皮)包括仅一个细胞厚的单层上皮、两个或更多个层厚的复层上皮、柱状上皮、鳞状上皮、立方上皮、移行上皮或假复层上皮。在各种实施例中，上皮是角质化或非角质化的。在一个实施例中，上皮是纤毛的。在一个实施例中，上皮包括微绒毛。在各种实施例中，上皮是单层柱状上皮、复层鳞状上皮、单层立方上皮或假复层柱状上皮。在各种实施例中，上皮是泡腔上皮、内皮、间皮、生殖上皮、呼吸上皮、角膜上皮、嗅上皮或泌尿道上皮。

在一个方面中，本发明提供培养细胞的方法，所述方法包括

b)将悬浮液引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括：容器，包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁；以及可拆卸第二端壁(顶部)，适于与所述容器接合以限定室；以及支架，适于接纳上面驻留细胞的基质，其中至少第一端壁(底部)、至少一个侧壁或第二端壁(顶部)的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述设备处于基质浸没于悬浮液中并且任选地与气体可渗透材料接触的第一模式中，

c)培育容纳悬浮液的细胞培养设备达足以让细胞中的至少一些粘附到基质的时间，

d)将细胞培养设备调整到第二模式，其中基质安置于气体可渗透材料处，以及

e)培育细胞培养设备达对于以下是足够的时间

i.发生细胞汇合，

ii.发生细胞分化，

iii.发生细胞增殖，

iv.形成一个或多个汇合细胞层，例如安置于基质的至少一部分上方的一个或多个汇合细胞层，

v.形成分层组织，例如发生分层表皮组织，

vi.发生组织生长，

vii.允许至少一些细胞(例如成纤维细胞)迁移到基质中或通过基质，或

viii.i)到V)中的任何两个或更多个的组合发生。

在一个实施例中，悬浮液包括均相细胞群。在一个实施例中，悬浮液包括非均相细胞群。

在一个实施例中，悬浮液包括获得细胞的组织消化物或部分纯化的组织消化物。举例来说，在一个实施例中，悬浮液包括从皮肤消化物获得的细胞。

在各种实施例中，细胞是锚着依赖性细胞或粘附细胞。在一个实施例中，细胞包括角质细胞、成纤维细胞，或角质细胞和成纤维细胞。

在各种实施例中，细胞包括色素生成细胞、血管细胞、多能干细胞或免疫细胞。在一个实施例中，细胞包括黑色素细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、血小板、肥大细胞、脂肪细胞或间充质细胞。

在一个实施例中，组织培养基是Green's培养基。在各种实施例中，组织培养基包括盐类、生长因子、激素和/或抗生素。应了解，不同组织培养基可适合于其它细胞或组织类型的生长，且/或可使用不同培养基添加物。

在各种实施例中，所述设备是本发明的设备。

在一个实施例中，经由室中存在的进出口(例如，容器中存在的进出口)引入细胞悬浮液。在另一实施例中，细胞悬浮液在附着第二端壁(顶部)之前引入到容器中。

在一个实施例中，基质是生物相容性的。在一个实施例中，基质是生物可降解的。在一个实施例中，基质是细胞不可渗透的。在另一实施例中，基质是细胞可渗透的。在一个实施例中，基质是气体可渗透的。在另一实施例中，基质是气体不可渗透的。

在各种实施例中，基质是或包括以下中的一个或多个：无细胞去上皮真皮(人造真皮)；真皮；包含胶原蛋白凝胶的胶原蛋白和包括胶原蛋白的组织；表皮或上皮系的组织或细胞，包含来自脐带、胎盘、粘膜、消化道的组织或细胞；纤维结合蛋白/纤维蛋白；富含血小板的血浆；基质胶；包括细胞外基质(包含由例如成纤维细胞的细胞分泌的细胞外基质)的成分和组织；透明质酸；静电纺丝生物相容性材料，包含PLGA；生物相容性聚合物或生物相容性聚合物的组合，尤其是能够静电纺丝的生物相容性聚合物，包含聚丙烯酸、聚L赖氨酸、胶原蛋白、明胶、尼龙和聚酯；明胶；肽水凝胶；聚乳酸羟基乙酸(polyglactin)支架；人工真皮(dermagraft)；弹性蛋白；壳聚糖；蚕丝蛋白；蜘蛛丝；琼脂糖，和其中任两种或更多种的组合。

在示范性实施例中，基质是或包括聚(乳酸共-乙醇酸)(PLGA)。在特别优选的实施例中，基质是或包括静电纺丝PLGA。

在一个实施例中，基质包括辅助细胞粘附或迁移、分化、增殖和/或分层的一个或多个分子。举例来说，基质包括一种或多种蛋白质(例如一种或多种基膜蛋白质、胶原蛋白、纤维结合蛋白、层粘连蛋白或凝集素)、一种或多种碳水化合物(例如一种或多种醣类)，或其中的任两种或更多种的组合。

上文论述供在本发明的方法中使用的适合的气体可渗透材料。在各种实施例中，选择气体可渗透材料以用于最佳气体交换、细胞生长、细胞或组织增殖、组织分层和/或与基质、细胞或组织的生物相容性。

在一个实施例中，基质在第一模式中安置于气体可渗透材料处。在一个实施例中，基质在第一模式和第二模式中安置于气体可渗透材料处。

h)调整细胞培养设备以将基质或细胞安置在气体可渗透材料处。

应了解，可使用所属领域中细胞或组织培养常用的培育条件。举例来说，在一个实施例中，在约37℃的温度下在包括5％二氧化碳的潮湿气氛中培育所述设备。

可使用本文中所描述的方法形成包括真皮层(真皮)和表皮层(表皮)的全厚皮片。成纤维细胞添加到设备并且进行培养以形成真皮。

角质细胞添加到设备并且培养分化和增殖以形成分层表皮。本申请人已经观察到的，粘附到基质的角质细胞必须直接接触气体可渗透界面以发生最佳表皮分层。

在一个实施例中，将成纤维细胞和角质细胞同时引入到设备中。

在另一实施例中，将成纤维细胞和角质细胞依序引入到设备中。举例来说，所述方法包括引入包括成纤维细胞的第一悬浮液，培育所述设备达足以粘附或增殖成纤维细胞或形成所需厚度的真皮的时间，接着引入包括角质细胞的第二悬浮液。此实施例可允许发育较厚真皮。

在一个实施例中，成纤维细胞和角质细胞接种于基质的一个表面上。在另一实施例中，成纤维细胞接种于基质的一个表面上，且角质细胞接种于基质的相对表面上。

在一个实施例中，工程化的组织包括基质。举例来说，成纤维细胞可迁移到基质中，以形成全厚皮片真皮层。

本发明的方法的示范性实施例包括以下步骤。

提供包括非均相角质细胞和成纤维细胞群的悬浮液。将所述细胞提供于足以支持细胞生长达至少约14天的时间段的量的适合组织培养基(例如，Green's培养基)中。

提供包括支架的设备，所述支架包括涂覆有胶原蛋白IV的静电纺丝PLGA。所述设备提供于使得包括气体可渗透材料并且具有孔眼的第一壁位于顶部以形成气体可渗透界面的定向中。所述设备任选地包括位于相对第二(底部)壁并且也是多孔的气体可渗透材料上。

支架插入到所述设备中使得基质侧面底壁。当使用例如上文所描述的第五实施例的设备的设备时，支架插入于所述设备中使得基质551的顶部表面面向第一(顶部)壁。

将细胞悬浮液添加到所述设备并且密封所述设备。培育所述设备达允许细胞粘附到基质的表面的至少一部分的约48小时的时间段。

使所述设备倒置使得支架移动到设备的相对端(第一壁)。胶粘的细胞现在与装置的顶壁处的气体可渗透界面接触。培育所述设备达约14天的时间段以引起产生复层上皮。不需要对装置另外处理。

在14天之后，支架包括全厚皮片。可使用刮刀或其它工具从支架中移出皮肤。

在第二示范性实施例中，分别添加成纤维细胞和角质细胞，并且使所述设备倒置两次。

使用如上文针对第一示范性实施例所描述的设备。将所述设备提供于使得基质与气体可渗透材料接触的第一模式中。将包括均相成纤维细胞群的第一细胞悬浮液添加到所述设备。密封所述设备并且培育48小时。

在48小时之后，使所述设备倒置以使得支架移动到装置的相对端。

举例来说，使用所述设备的侧壁上的进出口添加包括均相角质细胞群的第二细胞群。培育所述设备达足以达成角质细胞粘附的时间段，例如约48小时。

第二次使所述设备倒置以使得支架移动到设备的相对端，并且角质细胞与气体可渗透材料接触。培育所述设备达约14天的时间段，以引起产生复层上皮。

所属领域的技术人员在阅读本说明书时应了解，上述方法的特定实施例提供包含消除在将细胞接种于所述设备中之后对改变培养基的需要或去除和转移培养容器之间的发育组织的优点。减少产生例如全厚皮片所需的干预的数目会减小污染细胞或组织的风险，并且减小明显阻碍临床实施的生产成本。

应了解，本发明的其它方法达成其它优点。工程化全厚皮片的现有技术方法需要使用空气-液体界面(air-liquid interface，ALI)。此类方法的缺点是需要密切监测培养基含量以将生长中的组织保持在最佳ALI处，以达成生长和表皮分层。本发明的设备和方法提供使用不依赖于设备中的培养物含量和体积的气体可渗透界面(gas permeableinterface，GPI)的细胞或组织的生长、分化和/或工程化，这消除对在培养期间进行仔细监测的需要。

举例来说，本发明的另一方法提供用于培养分层表皮组织或全厚皮片组织的方法，包括以下步骤：

b)将粘附细胞或组织引入到细胞培养设备中，其中所述设备包括容器和可拆卸第二端壁(顶部)，所述容器包括第一端壁(底部)、至少一个侧壁，所述可拆卸第二端壁适于与所述容器接合以限定室，

其中第一端壁(底部)、至少一个侧壁或第二端壁(顶部)的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述设备处于其中基质、粘附细胞或组织浸没于悬浮液中并且与气体可渗透材料气体连通的第一模式中，

c)培育容纳粘附细胞或组织的细胞培养设备达足以发生表皮分层或生成全厚皮片的时间。

举例来说，可通过在培养容器中在去表皮真皮(de-epidermised dermis，DED)上培养角质细胞、或成纤维细胞和角质细胞来制备粘附细胞或组织。一旦细胞粘附，便从培养容器中移出安置于基质上的细胞并且将其转移到所述设备。

本发明的设备和方法适用于包括上皮细胞或组织的一系列上皮或组织的培养和/或工程化。

本发明的设备和方法特别适用于通常需要富氧环境的多细胞层或多层组织的培养。

特定来说，本发明的方法和设备适用于包括单层上皮、复层上皮的组织或结构的工程化，所述单层上皮包含单层鳞状上皮、单层立方上皮和单层柱状上皮，所述复层上皮包含复层鳞状上皮、复层立方上皮和复层柱状上皮。单层上皮包括单层的上皮细胞。复层上皮包括两层或多于两层的上皮细胞。复层上皮可为角质化或非角质化的，或是移行上皮。举例来说，本发明的方法和设备适用于制备包含以下的上皮：皮肤的外层(表皮层)，角膜，包含嘴、食管和直肠的胃肠道的结构的内层，阴道或输尿管等泌尿或生殖道的结构的内层，肺的内层粘膜，或形成心包膜、胸膜或腹膜的壁的上皮。

特定来说，本发明的设备和方法适用于成纤维细胞、角质细胞的培养和分层表皮层和/或全厚皮片的生产。

全厚皮片包括表皮和真皮层。表皮层是包括角质细胞的复层上皮。真皮是包括成纤维细胞的表皮层和包含胶原蛋白的基质成分下方的层。

活体外工程化全厚皮片的具有挑战性的方面是产生分层表皮组织。表皮层分层对于皮肤功能是至关重要的，并且为形成角质层(提供皮肤的屏障功能的组织层)所需要。

用以产生全厚皮片的当前方法涉及在设置于去表皮真皮上的环中培养角质细胞和成纤维细胞。必须在第1天改变组织培养基，并且在第2天去除环并将其转移到空气液体界面。需要规律的培养基改变，这增加污染培养物的机率。

本发明的设备和方法提供包括真皮和分层表皮组织的全厚皮片的工程化。本发明提供在适合基质上生长全厚皮片，同时提供与生长中的表皮层接触或非常接近的气体可渗透界面以允许角质细胞分化和表皮层分层所需的气体交换。在任何时间都不必将生长中的组织转移到另一培养容器，且需要极少培养基改变或用户干预。

在各种实施例中，本发明的设备和方法另外提供包括额外细胞和组织以在移植之后改进通过本发明的方法产生的全厚皮片的功能的全厚皮片。

在一个实施例中，使用本发明的方法或设备产生的包括分化或分层的上皮的组织被另外处理以形成结构。设想可形成包括上皮表面或内层的任何结构。举例来说，可包裹或包拢组织以形成管状结构，例如血管、尿道或食管。此类方法在所属领域中是已知的，例如在以下中所描述的方法：Green等人的2010年《组织工程学(Tissue Engineering)》第16卷，第3号，第1052-1064页；Bhargava等人的2004年《英国国际泌尿学杂志(BJUInternational)》第93卷，第807-811页；以及Bhargava等人的2008年《欧洲泌尿学(European Urology)》第53卷，第1263-1271页，所述文献由此以引用的方式并入。

包括使用本发明的方法或设备产生的组织的结构可适用于移植到有需要的受治疗者中。

在替代实施例中，在手术移植过程期间，通过本发明的方法或使用本发明的的设备产生的上皮组织从所述设备回收并且当场成形为所述结构。举例来说，在一个实施例中，在尿道成形术期间，通过本发明的方法或使用本发明的设备产生的组织当场形成为尿道。

为了减小污染的机率，可将使用本发明的设备根据本文中所描述的方法产生的组织在所述设备中从实验室运送到手术室。

组织损伤的治疗

本发明提供使用本文中所描述的方法制备的组织(例如上皮、表皮、复层上皮、分层表皮和真皮、断层皮片或全厚皮片)治疗有需要的受治疗者的组织损伤。

本发明另外涉及治疗有需要的受治疗者的组织损伤的方法，包括以下步骤

a)提供本发明的设备，在所述设备中，已用例如本文中所描述的方法生长例如上皮、复层上皮、表皮、分层表皮、分层表皮和真皮、断层皮片或全厚皮片的组织，

b)在无菌条件下从所述设备回收所述组织，以及

c)将所述组织应用于患者。

在各种实施例中，组织损伤是伤口、慢性伤口、手术伤口、溃疡、疤痕、手术疤痕、烫伤或烧伤。在各种实施例中，烧伤分一度烧伤、二度烧伤、三度烧伤、深度真皮烧伤或全厚度烧伤。

在各种实施例中，组织损伤是位于粘膜表面上的上皮。在各种实施例中，上皮位于皮肤、肺、胃肠道(例如，食管或嘴)、生殖道或泌尿道(例如，尿道)上或中。

在优选实施例中，使用受治疗者的自体细胞制备所述组织。举例来说，在各种实施例中，使用受治疗者的自体成纤维细胞、角质细胞、或成纤维细胞和角质细胞制备所述组织。在替代实施例中，使用与受治疗者异源的细胞制备所述组织。在另一实施例中，使用受治疗者的自体细胞和与受治疗者异源的细胞制备所述组织。

应了解，可使用所属领域中已知的任何方法分离受治疗者的自体细胞。举例来说，可通过浸煮样本组织并且从消化的组织分离成纤维细胞和/或角质细胞，以从从受治疗者取得的皮肤样本或皮肤活检体分离自体细胞。

在一个实施例中，组织是自体移植物，例如皮肤自体移植物。在各种实施例中，组织是表皮自体移植物、断层皮片自体移植物或全厚皮片自体移植物。在另一实施例中，组织是同种异基因的移植物。

应了解，使用受治疗者的自体细胞(例如自体移植物)制备的组织的应用对于减少或防止组织的免疫排斥以及减少对进行中的免疫治疗或另一辅助治疗的要求来说是非常理想的。

在一个实施例中，所述组织包括另外包括基质的组织。在另一实施例中，所述组织在应用于受治疗者之前与基质分离。

一般来说，组织应用于受治疗者将在组织损伤的部位处或邻近。在各种实施例中，应用组织以至少部分地覆盖组织损伤的部位或完全覆盖组织损伤的部位。

在一个实施例中，应用组织以暂时覆盖组织损伤的部位。在替代实施例中，应用组织以永久覆盖组织损伤的部位。

活体外测试

通常使用动物皮肤或活体动物、人类尸体皮肤或合成人类皮肤模型测试局部应用的药品、营养药剂或美容产品的效力和安全性。

动物和人类皮肤之间的形态差异是指用于产品测试的离体动物皮肤或活体动物不是最佳的。此外，关于使用活体动物或动物皮肤测试美容产品存在引起了相当大的道德关注，包含在一些国家禁止此类测试。出于这些原因，非常希望识别用于测试此类产品的动物模型的替代方案。

当使用人类尸体皮肤进行产品测试时，观察到不一致且高度可变性结果。

使用本文中所描述的设备或方法制备的细胞或组织适用于药品、营养药剂或美容产品的活体外测试。

在各种实施例中，使用本文中所描述的设备或方法制备的细胞或组织用以测试化合物的经皮渗透性，测试化合物跨越表皮、真皮或基膜的渗透性，测试用于治疗或预防病症(例如，皮肤病症)的活性成分的效力，或测试化合物的毒性。

在各种实施例中，细胞或组织用以确定所关注的化合物是否刺激皮肤，例如确定所关注的化合物引发皮肤疹、发炎或接触性皮炎。

在各种实施例中，细胞包括成纤维细胞、角质细胞或免疫细胞，或其任何两种或更多种的组合。在一个实施例中，细胞包括成纤维细胞和角质细胞。在各种实施例中，组织选自包括表皮、分层表皮和真皮、分层表皮和真皮、断层皮片或全厚皮片的组。

在各种实施例中，化合物是药物化合物、美容化合物或营养药剂化合物。

在各种实施例中，用于测试的化合物单独应用于组织或与药学或美容可接受的载剂、赋形剂或稀释剂掺合。

在各种实施例中，用于测试的化合物以无菌霜剂、凝胶、浇泼剂或喷滴剂制剂、悬浮液、乳液、软膏、扑粉、浸液、喷雾剂、含药敷料、洗发剂、脖套或皮肤贴剂的形式局部应用于组织。

本发明包括前文并且还设想以下仅给出实例且决不限制其范围的构造。

实例

实例1

此实例概述使用本发明的设备和方法制备全厚皮片的研究。

1.方法

将灭菌基质(静电纺丝PLGA或与皮肤细胞生长相容的任何其它真皮替代品)附接到不锈钢支架。任选地用胶原蛋白IV(胶原蛋白IV Sigma-Aldrich C5533，以10ug/cm²使用)涂覆基质2小时，接着用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)清洗三次。

将支架和附接的基质放置到气体可渗透界面(GPI)设备中，使涂覆有胶原蛋白IV的侧面朝向开口。

将250ml的Greens培养基(DMEM:Hams F12(Life Technologies 31765-035)3:1，10％FCS，10ng/ml EGF(Sigma-Aldrich E9644)，0.4pg/ml氢化可的松(Sigma-AldrichFI0396)，0.1nM霍乱毒素(Sigma-Aldrich C8052)，180pM腺嘌呤(Sigma-Aldrich A2786)，5ug/ml胰岛素(Sigma-Aldrich 19278)，5pg/ml脱铁运铁蛋白(Sigma-Aldrich T2036)，2nM3,3,5,-三-碘甲状腺原氨酸(Sigma-Aldrich T2752)，1x青霉素/链霉素，0.625pg/ml两性霉素B(Sigma-Aldrich A2942))添加到设备。

从培养盘剥离成纤维细胞和角质细胞并进行计数。将每cm²的300000角质细胞和100000成纤维细胞添加到GPI设备中。放置封盖以密封GPI设备。在37℃、5％CO2下培育设备48小时。

使GPI设备倒置，确保支架移动到设备的相对端，并且基质与气体可渗透膜直接接触。在37℃、5％CO2下培育设备14天。

打开GPI设备，弃置所有液体，并且去除支架。使用刮刀围绕边缘切割，以从支架释放皮肤。

2.结果

所述方法将产生适用于移植到患者的包括真皮和分层表皮的全厚皮片。

实例2

此实例概述使用本发明的设备和方法制备全厚皮片的研究。

1.方法

如针对实例1所描述，将灭菌基质附接到不锈钢支架。任选地用胶原蛋白IV(胶原蛋白IV Sigma-Aldrich C5533，以10ug/cm²使用)涂覆基质2小时，接着用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗三次。

将支架和附接的基质放置到气体可渗透界面(GPI)设备中，使涂覆有胶原蛋白IV的侧面背对开口。

如针对实例1所描述，添加250ml的Greens培养基。

将每cm²的100000成纤维细胞添加到GPI设备中。将封盖放置在GPI设备上并密封。在37℃、5％CO₂下培育设备至少48小时。

使GPI设备倒置，确保支架移动到设备的相对端。

通过注射口将每cm²的300000角质细胞添加到GPI设备中，使得角质细胞停留在基质的未接种侧上。在37℃、5％CO₂下培育设备48小时。

第二次使GPI设备倒置，确保支架移动到设备的相对端，并且基质与气体可渗透膜直接接触。在37℃、5％CO₂下培育设备14天。

2.结果

实例3

此实例概述使用本发明的设备和方法制备分层表皮的研究。

1.方法

如针对实例1所描述，添加250ml的Greens培养基。

将每cm²的300000角质细胞添加到GPI设备中，使得角质细胞停留在基质的未接种侧上。将封盖放置在GPI设备上并密封。在37℃、5％CO₂下培育设备48小时。

使GPI设备倒置，确保支架移动到设备的相对端，并且基质与气体可渗透膜直接接触。在37℃、5％CO₂下培育设备14天。

打开GPI设备，弃置所有液体，并且去除支架。使用刮刀围绕边缘切割，以从支架释放分层表皮。

2.结果

所述方法将产生适用于移植到患者的分层表皮。

实例4

此实例比较使用本发明方法利用气体可渗透界面(GPI)制备的皮肤与使用现有技术方法利用空气-液体界面(ALI)制备的皮肤。

1.制备全厚皮片

制备粘附细胞

将去表皮无细胞真皮(de-epidermised acellular dermis，DED)放置于聚苯乙烯组织培养盘中将具有10mm直径孔隙和10mm深度的不锈钢环设置于DED上并填充Green's培养基。将300000角质细胞和100000成纤维细胞添加到环的中心。在24小时内两次改变培养基。

使用空气-液体界面(ALI)制备全厚皮片

如下使用现有技术方法利用空气-液体界面制备全厚皮片。

在48小时之后，从DED去除环，并且将包括粘附成纤维细胞和角质细胞的DED转移到包括Greens培养基的组织培养盘中的不锈钢托架上。托架由孔网格组成，从培养盘的基底凸起7mm，培养基可通过所述孔网格接触DED。维持培养盘中的培养基的含量使得DED的搁置于金属托架上的基底与培养基接触，且DED的上面接种角质细胞和成纤维细胞的顶部表面暴露于空气，从而产生空气-液体界面。

在空气-液体界面处培养细胞14天，其中每两到三天进行一次完全培养基改变。

使用气体可渗透界面制备全厚皮片

如下使用气体可渗透界面(GPI)制备全厚皮片。

在48小时之后，从DED去除环，并且将DED转移到包括气体可渗透膜的设备中。将DED放置于装置中使得粘附成纤维细胞和角质细胞与位于设备底部的气体可渗透膜接触。

在气体可渗透界面处培养细胞14天。

在14天之后，采集组织进行分析，以评估与空气-液体界面接触或与气体可渗透膜接触形成的皮肤的质量。

1.全厚皮片的比较

使用GPI产生的皮肤具有与使用ALI产生的皮肤类似的厚度和外观。

用针对以下的抗体染色每个皮肤的样本：细胞角蛋白19，角质细胞干细胞的标记；细胞角蛋白14；基底角质细胞标记；以及细胞角蛋白10，基底上角质细胞标记；并且用荧光显微镜进行检测。用丙酮固定并且用0.25％酪蛋白溶液封闭每个冷冻皮肤样本的5pm厚横向区段。用含有1％胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)的三乙醇胺缓冲盐水(Trisbuffered saline，TBS)溶液中抵抗细胞角蛋白10、细胞角蛋白14或细胞角蛋白19的一级抗体覆盖样本区段。在室温下培育样本一个小时。用TBS清洗样本一次，接着摇动三次，每次五分钟。在含有核染色剂4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的具有1％FBS的TBS中，与Alexa 488染料缀合且对每个一级抗体具特异性的二级抗体覆盖样本区段。在室温下培育样本30分钟。用TBS清洗样本一次，接着摇动两次，每次15分钟。用Prolong Gold封固溶液和置于顶部的盖玻片覆盖样本。使用荧光显微镜获得所有DAPI染色剂和每个Alexa 488染色剂样本的图像。

在空气-液体界面(ALI)处生长的皮肤和在气体可渗透界面(GPI)处生长的皮肤展示形成分层表皮。

两个样本类型中均存在多层角质细胞。表皮中角质细胞的核从在基底区域中为圆形到在上部区域中为扁平的形状改变指示，分层表皮已形成于在ALI和GPI处生长的皮肤中。

在ALI或GPI处生长的皮肤展示细胞角蛋白10(其为基底上角质细胞标记)在表皮的顶层中的表达，这指示已成功地形成角质层，这又指示已成功地完成角质细胞分化和表皮分层过程。

在ALI或GPI处生长的皮肤展示细胞角蛋白14(其为基底角质细胞标记)在角质层下方角质细胞层中的表达，这指示这些角质细胞处于形成分层表皮所需的增殖状态中。在ALI和GPI处生长的皮肤含有对于细胞角蛋白19(其为角质细胞干细胞标记)呈阳性染色的角质细胞。角质细胞干细胞的存在指示存在继续表皮更新所需的所有角质细胞细胞类型。

在ALI处产生的皮肤与在GPI处生长的皮肤的比较指示，GPI可产生存在于表皮中的较大数目的角质细胞干细胞，这可能产生更好的分层表皮。

此实例展示本发明的方法提供具有分层表皮和与使用现有技术方法产生的皮肤类似的特征的全厚皮片的制备。

实例5

此实例展示使用本发明的方法和设备的皮肤组织的制备。

使用(1)本文中所描述的设备和(2)现有技术设备都利用GPI制备的皮肤组织与使用(3)现有技术方法利用ALI制备的皮肤组织进行比较。

1.方法

在37℃下用胶原蛋白IV溶液(10ug/cm²)涂覆静电纺丝PLGA达2小时以形成基质。在将成纤维细胞和角质细胞接种到被涂覆的表面上之前，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗涂覆的PLGA三次。100cm²基质用于方法(1)，6cm²用于方法(2)且1cm²用于方法(3)。

方法(1)：使用本文中所描述的GPI设备制备皮肤

涂覆胶原蛋白的静电纺丝PLGA夹持到本发明的GPI设备的支架中，使得被涂覆的侧与支架的顶部表面齐平。

支架放置于GPI设备的底部中，使得静电纺丝PLGA的被涂覆侧面朝上。

用300ml的Green's培养基填充GPI设备。在实例1中描述Green's培养基的组合物。

13000000角质细胞和2500000成纤维细胞添加到GPI设备，使得角质细胞和成纤维细胞可附接到被涂覆的静电纺丝PLGA。

封盖(包括GPI)置于GPI设备上并且密封GPI设备。

在48小时之后，倒置GPI设备以将支架移动到设备的相对端(封盖)。在此位置中，粘附成纤维细胞和角质细胞与封盖中的GPI直接接触。

培养细胞14天，且在此时间段中不需要培养基改变。

在14天之后，采集皮肤组织进行分析。

方法(2)：使用现有技术GPI设备制备皮肤

将具有25mm直径孔隙和10mm深度的不锈钢环设置于5cm直径培养盘内部的被涂覆的静电纺丝PLGA上并填充Green's培养基。将750000角质细胞和200000成纤维细胞添加到环的中心。在24小时内两次改变培养基。

在48小时之后，从被涂覆的静电纺丝PLGA去除环，并且将被涂覆的静电纺丝PLGA从培养盘转移到具有20mL Green's培养基的G-Rex10设备(Wilson Wolf)中，使得粘附成纤维细胞和角质细胞与位于G-RexlO的底部表面的GPI接触。

培养细胞14天，且在此时间段中不需要培养基改变。

在14天之后，采集皮肤组织进行分析。

方法(3)：使用ALI制备皮肤

将具有10mm直径孔隙和10mm深度的不锈钢环设置于六孔培养板内部的被涂覆的静电纺丝PLGA上并填充Green's培养基。

将130000角质细胞和34000成纤维细胞添加到环的中心。在24小时内两次改变培养基。

在48小时之后，从被涂覆的静电纺丝PLGA去除环，并且将包括粘附成纤维细胞和角质细胞的被涂覆的静电纺丝PLGA转移到包括Green's培养基的组织培养盘中的不锈钢托架上。托架由孔网格组成，从培养盘的基底凸起7mm，培养基可通过所述孔网格接触被涂覆的静电纺丝PLGA。维持培养盘中的培养基的含量使得被涂覆的静电纺丝PLGA的搁置于金属托架上的基底与培养基接触，且被涂覆的静电纺丝PLGA的上面接种角质细胞和成纤维细胞的顶部表面暴露于空气，从而产生空气-液体界面。

在ALI处培养细胞14天，其中每两到三天进行一次完全培养基改变。

在14天之后，采集皮肤组织进行分析。

分析

用针对以下的抗体染色每个皮肤的样本：全细胞角蛋白，评估表皮质量的所有角质细胞的标记，以及波形蛋白，评估真皮质量的成纤维细胞的标记，并且用荧光显微镜进行检测。

用丙酮固定并且用0.25％酪蛋白溶液封闭每个冷冻皮肤样本的5pm厚横向区段。用含有1％胎牛血清(FBS)的三乙醇胺缓冲盐水(TBS)溶液中抵抗全细胞角蛋白或波形蛋白的一级抗体覆盖样本区段。在室温下培育样本一个小时。用TBS清洗样本一次，接着摇动三次，每次五分钟。在含有核染色剂4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的具有1％FBS的TBS中，与Alexa 488染料缀合且对每个一级抗体具特异性的二级抗体覆盖样本区段。在室温下培育样本30分钟。用TBS清洗样本一次，接着摇动两次，每次15分钟。用Prolong Gold封固溶液和置于顶部的盖玻片覆盖样本。使用荧光显微镜获得所有DAPI染色剂和每个Alexa 488染色剂样本的图像。

2.结果

方法(1)、(2)和(3)全部都产生包括真皮层与真皮层顶部上的分层表皮的全厚皮片。如通过针对成纤维细胞标记波形蛋白的阳性染色所证明，真皮层为所产生的皮肤的底部层。真皮层为所有三种方法产生的皮肤组织的单个细胞厚。

分层表皮层形成于所有三种方法产生的皮肤组织的真皮层上方。如针对角质细胞标记全细胞角蛋白的阳性染色所证明，表皮包括多层角质细胞。在皮肤样本的全细胞角蛋白染色时，从细胞角蛋白的分层观察到表皮的分层。基底层中的角质细胞为圆形，在介入层中变平，直到角质层形成顶层。

还通过在表皮的层中由DAPI染色展示的角质细胞细胞核的形态展示表皮的分层。在表皮的基底层中，角质细胞细胞核为圆形，指示能够增殖的健康基底角质细胞。向上移动穿过表皮层，角质细胞细胞核展平，这指示其已经历达成分层所需的分化过程。在角质细胞已完成其分化过程的顶层中，细胞核非常薄或已完全消失，产生由死角质细胞组成的角质层。

工业应用

本发明的设备和方法对具有广泛范围的治疗性、药物性、药妆品、营养药剂和其它实验室应用(包含皮肤移植以及药物和美容产品测试)的多种细胞和组织的工程化有用。

Claims

1.一种用于培养细胞或组织的设备，所述设备包括

容器，包括在所述容器的底部的第一端壁、至少一个侧壁、在所述容器的顶部的第二端壁以及适于接纳上面驻留细胞的基质的可移动支架，

其中所述第一端壁、所述至少一个侧壁和所述第二端壁中的至少一个可拆卸地与所述容器接合以限定室，

并且其中所述第一端壁的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述设备能够在(a)其中所述室内的所述可移动支架不安置成与气体可渗透材料气体连通的第一模式与(b)其中移动所述室内的所述可移动支架以处于或邻近气体可渗透材料和/或安置成与所述气体可渗透材料气体连通、尤其与所述气体可渗透材料接触的第二模式之间配置。

2.根据权利要求1所述的用于培养细胞或组织的设备，

其中所述第二端壁的至少一部分或所述至少一个侧壁的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述支架与所述至少一个侧壁接合以(a)允许所述支架至少部分地在所述室的所述第一端壁与所述第二端壁之间大体上线性地移动，并且限制所述支架围绕垂直于所述至少一个侧壁的轴线的旋转或倒转，或(b)允许所述支架围绕垂直于所述至少一个侧壁的轴线的旋转移动。

3.根据权利要求1所述的用于培养细胞或组织的设备，

其中所述第二端壁的至少一部分包括气体可渗透材料或适于与气体可渗透材料接合并且是多孔的以允许气体交换；以及

其中所述支架与所述至少一个侧壁接合以(a)允许所述支架至少部分地在所述室的所述第一端壁与所述第二端壁之间大体上线性地移动，并且(b)限制所述支架围绕垂直于所述至少一个侧壁的轴线的旋转或倒转。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中当在使用中且所述第一端壁和所述第二端壁均存在气体可渗透材料时，所述室能与环境液体密封但与所述环境气体连通。

5.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述气体可渗透材料是气体可渗透膜。

6.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中气体可渗透材料是聚二甲基硅氧烷。

7.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述支架接纳所述基质以在所述基质的相对平面侧上呈现培养表面。

8.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述基质是生物相容性材料，例如生物相容性膜。

9.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述基质是气体可渗透的。

10.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述基质是气体不可渗透的。

11.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述基质是或包括聚(乳酸共-乙醇酸)(PLGA)。

12.根据权利要求11所述的设备，其中所述基质是或包括静电纺丝PLGA。

13.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述基质包括被处理以改进细胞粘附、细胞迁移或组织分层的表面。

14.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述支架包括

基质，上面驻留细胞，所述基质保持在跨越所述框架的所述内周界的大体上平面的布置中，

其中所述支架被配置成当所述支架放置于包括至少一个气体可渗透材料的所述设备中时，使所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织基本上全部与气体可渗透材料接触。

15.根据权利要求1到3中任一项所述的设备，其中所述支架包括

16.根据权利要求15所述的设备，其中所述第二框架的所述内周界在其上表面处的尺寸大于所述第一框架的所述外周界在其上表面处的尺寸，使得所述第二框架在所述第一框架的至少所述上表面处围绕所述第一框架的所述外周界接合。

17.根据权利要求15所述的设备，其中所述基质保持于在所述第一框架的所述上表面处跨越所述支架的所述内周界的大体上平面的布置中，由此允许所述基质的上表面与例如气体可渗透材料直接接触。

18.根据权利要求15所述的设备，其中所述基质通过所述第一框架与所述第二框架的摩擦配合接合而保持在所述第一框架与所述第二框架之间。

19.根据权利要求18所述的设备，其中所述摩擦配合接合使得其稳固地夹持所述基质以将所述基质维持于跨越所述支架的所述内周界的大体上平面的布置中。

20.根据权利要求15所述的设备，其中所述基质至少部分地通过在所述第一框架与所述第二框架之间延伸的一个或多个突起部而保持在所述第一框架与所述第二框架之间。

21.根据权利要求14所述的设备，其中所述支架的下表面包括跨越所述支架的外周界和邻近内周界的至少一个区段，所述区段具有朝向所述支架的上表面凸起的下表面，其中当所述支架放置在平坦表面上时，所述区段限定一空隙。

22.根据权利要求21所述的设备，其中所述区段限定凹部，提供所述凹部以允许当所述支架处于浸没培养物中时，容易去除气泡。

23.根据权利要求16到22中任一项所述的设备，其中所述支架的所述内周界在其上表面处的尺寸大于由所述支架保持的所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织将要接触的所述气体可渗透材料中的一个或多个的尺寸，使得所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织基本上全部能够接触所述气体可渗透材料。

24.根据权利要求16到22中任一项所述的设备，其中所述支架包括跨越所述内周界以提供对所述基质的支撑的一个或多个横向部件。

25.一种产生分层表皮组织的方法，所述方法包括

b)提供根据权利要求1至24中任一项所述的设备；

c)放置所述基质，使得所述角质细胞与所述气体可渗透材料接触，以及

d)培育所述细胞培养设备达足以允许发生表皮分层的时间。

26.根据权利要求25所述的方法，所述方法包括

提供包括待在足以支持细胞生长的量的组织培养基中培养的细胞的悬浮液；

将所述悬浮液引入到所述设备中，

培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间，

将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中所述基质与气体可渗透材料接触，以及

培育所述细胞培养设备达足以允许细胞汇合、组织分层或组织生长中的一个或多个的时间。

27.一种用于培养分层表皮组织或全厚皮片组织的方法，所述方法包括以下步骤：

b)将所述悬浮液引入到根据权利要求1至24中任一项所述的设备中，

c)培育容纳所述悬浮液的所述细胞培养设备达足以让所述角质细胞和/或成纤维细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间，

e)培育所述细胞培养设备达足以允许发生表皮分层的时间。

28.根据权利要求26或27所述的方法，包括在将所述细胞培养设备调整到第二模式，其中所述基质和/或所述细胞与气体可渗透材料接触的步骤和培育所述细胞培养设备达足以允许细胞汇合、组织分层、或组织生长、或发生表皮分层中的一个或多个的时间的步骤之间的以下额外步骤：

例如经由进出口引入包括待培养的细胞的第二悬浮液，以及

培育容纳所述第二悬浮液的细胞培养设备达足以让所述第二悬浮液中的细胞中的至少一些粘附到所述基质的时间。

29.一种通过根据权利要求25到28中任一项所述的方法制备的组织。

30.根据权利要求29所述的组织，包括：包括成纤维细胞的真皮层、包括角质细胞的分层表皮层以及生物相容性基质。

31.一种在根据权利要求25到28中任一项所述的方法中制备的组织的用途，用在用于治疗有需要的受治疗者的组织损伤的药用物的制造中。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述治疗是针对伤口、烧伤、或疤痕。

33.根据权利要求32所述的用途，其中所述疤痕是手术疤痕。

34.一种对包括上皮组织的组织结构进行工程化的方法，所述方法包括以下步骤

a)提供根据权利要求1到24中任一项所述的设备，其中在所述设备中已生长组织，或提供其中已根据权利要求25到27中任一项所述的方法生长组织的设备，

b)在无菌条件下从所述设备回收所述组织，以及

c)处理所述组织以形成所述组织结构，其中所述组织结构适用于应用至有需要的受试者。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述组织是上皮组织、或表皮。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述上皮组织是复层上皮组织，或其中所述表皮是分层表皮。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述组织结构选自颌下腺管、附着牙龈、舌背、硬腭、食管、胃、大肠、小肠、直肠、肛门、胆囊、甲状腺滤泡、皮肤、汗腺管、体腔间皮、卵巢、输卵管、子宫、子宫颈、阴道、大阴唇、肾直小管、睾丸网、输出小管、附睾、输精管、射精管、尿道球腺、精囊、口咽、喉、声带、气管、呼吸细支气管、角膜、鼻、肾脏近曲小管、肾脏升支细段、肾脏远曲小管、肾脏集合管、肾盂、输尿管、膀胱、前列腺尿道、膜部尿道、阴茎尿道、或外尿道口。

38.根据权利要求14所述的设备，其中所述支架的所述内周界在其上表面处的尺寸大于由所述支架保持的所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织将要接触的所述气体可渗透材料中的一个或多个的尺寸，使得所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织基本上全部能够接触所述气体可渗透材料。

39.根据权利要求15所述的设备，其中所述支架的所述内周界在其上表面处的尺寸大于由所述支架保持的所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织将要接触的所述气体可渗透材料中的一个或多个的尺寸，使得所述基质或所述基质上存在的所述细胞或组织基本上全部能够接触所述气体可渗透材料。

40.根据权利要求14所述的设备，其中所述支架包括跨越所述内周界以提供对所述基质的支撑的一个或多个横向部件。

41.根据权利要求15所述的设备，其中所述支架包括跨越所述内周界以提供对所述基质的支撑的一个或多个横向部件。