KR20180020283A - 조직 배양 장치 및 방법 - Google Patents

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본 제이. 파이스트
리스 닐 우스터비크
미리암 캐더 심슨
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오클랜드 유니서비시즈 리미티드
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Abstract

세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치가 기술되며, 상기 장치는 하부 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 여기서 상기 하부의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 용기; 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 상부이되, 여기서 상부의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 탈착 가능한 상부; 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함한다. 상기 장치는 (a) 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되지 않은 제1 모드와 (b) 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드 사이에서 구성 가능하다.

Description

조직 배양 장치 및 방법
본 발명은 세포 또는 조직, 예를 들어 상피 세포 또는 상피 세포를 포함하는 조직, 예컨대 피부를 배양하기 위한 개선된 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 장치를 사용하거나 또는 본 발명의 방법에 의해서 생산된 조직, 예를 들어, 상피 세포를 포함하는 조직, 예컨대 전층 피부, 및 조직 손상을 치료하기 위한 이러한 조직의 용도에 관한 것이다.
시험관내에서 조작된 인간 및 비-인간 동물 세포 또는 조직은 다양한 치료적 응용 및 상업적 응용을 갖는다.
예를 들어, 상피 세포를 포함하는 조작된 조직, 예컨대 인간 피부는 화상 또는 만성 창상을 갖는 환자를 위한 자가 이식편 및 약제학, 화장품 또는 다른 국소 제품의 개발 및 시험을 위해서 사용될 수 있다.
조작된 세포 또는 조직은 상응하는 생체내 세포 또는 조직과 유사하거나, 실질적으로 동일한 구조 및/또는 기능을 갖는 것이 매우 바람직하다. 그러나, 세포의 성장 및 분화 및 복잡한 조직의 발생이 생체내에서 일어나는 매우 특이적이고 정밀하게 조절되는 조건을 복제하는 것은 매우 도전적이다.
많은 세포 및 조직의 경우, 공기-액체 계면에서의 배양은 세포 증식 및 다-층 세포 또는 조직 성장을 촉진시키는 고 산소 환경을 제공한다. 일부 세포 또는 조직은 성장 또는 분화하기 위해서 공기-액체 계면을 접촉해야 한다. 예를 들어, 피부 내의 케라티노사이트(keratinocyte)는 분화를 자극하고, 표피 층화(stratification)를 유도하기 위해서 공기-액체 계면과 접촉하는 것이 요구된다. 이러한 분화 및 성장은 전층 인간 피부의 조작에 중요하다.
고 산소 조건 및/또는 생체내에 존재하는 것을 모방하는 조건 하에서 시험관내에서 인간 및 비인간 동물 세포 또는 조직의 배양 및/또는 조작을 가능하게 하는 방법 및/또는 장치에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 목적은 이러한 요구를 충족시키는 방법 및/또는 장치를 제공하거나, 또는 유용한 선택을 대중에서 적어도 제공하는 것이다.
일 양상에서 본 발명은 세포 또는 조직을 배양하는 장치에 관한 것이며, 이 장치는
제1 단부벽(하부), 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기,
용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및
세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부) 중 적어도 하나의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 (a) 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되지 않은 제1 모드와 (b) 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드 사이에서 구성 가능하다.
예를 들어, 일 실시형태에서 본 발명은 세포 또는 조직을 배양하는 장치에 관한 것이며, 이 장치는
제1 단부벽(하부), 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기,
용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및
세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부) 중 2개 이상의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 제1 모드에서 기질은 기체 침투성 재료와 접촉하지 않고, 제2 모드에서 기질은 기체 침투성 재료와 접촉한다.
일 실시형태에서, 스캐폴드는 제1 위치로부터 제2 위치로 이동 가능하고, 여기서 제2 위치는 기체 침투성 재료에서 기질을 배치한다. 일례에서, 사용 시에 제1 위치에 존재하는 경우, 기질은 감겨있다.
일 실시형태에서, 제1 모드에서 스캐폴드 및/또는 기질은 제거 가능한, 기체 불침투성 표면에 의해서 기체 침투성 재료로부터 분리된다. 일 실시형태에서, 제거 가능한 기체 불침투성 표면은 용해에 의해서 제거된다. 일 실시형태에서, 제거 가능한 기체 불침투성 표면은 물리적으로 제거된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 배양하는 장치에 관한 것이며, 이 장치는
제1 단부벽(하부) 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기이되, 여기서 하부의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 용기;
용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)이되,
여기서 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분 또는 적어도 하나의 측벽의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 제2 단부벽(상부);
세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드이되, 여기서 스캐폴드는 (a) 스캐폴드의 실질적인 선형 이동을 챔버의 제1 단부벽(하부)과 제2 단부벽(상부) 사이에서 적어도 어느 정도 허용하고, 적어도 하나의 측벽에 수직인 축에 대한 스캐폴드의 회전 또는 반전을 제한하거나, 또는 (b) 적어도 하나의 측벽에 수직인 축에 대한 스캐폴드의 회전 이동을 허용하도록 적어도 하나의 측벽과 맞물린, 스캐폴드를 포함한다.
일 실시형태에서, 장치의 뒤집어짐은 스캐폴드의 실질적인 선형 이동을 챔버의 제1 단부벽(하부)과 제2 단부벽(상부) 사이에서 적어도 어느 정도 허용하여, 제2 단부벽(상부)에 존재하는 기체 침투성 재료에서 기질을 배치한다.
일 실시형태에서, 장치의 회전은 적어도 하나의 측벽에 수직인 축에 대한 스캐폴드의 실질적인 회전 이동을 허용하여 적어도 하나의 측벽에 존재하는 기체 침투성 재료에서 기질을 배치한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 배양하는 장치에 관한 것이며, 이 장치는
하부 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기이되, 여기서 하부의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 용기;
용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 상부이되, 여기서 상부의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 탈착 가능한 상부; 및
세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드이되, 여기서 스캐폴드는 (a) 스캐폴드의 실질적인 선형 이동을 챔버의 하부와 상부 사이에서 적어도 어느 정도 허용하고, (b) 적어도 하나의 측벽에 수직인 축에 대한 스캐폴드의 회전 또는 반전을 제한하도록 적어도 하나의 측벽과 맞물린, 스캐폴드를 포함한다.
일 실시형태에서, 사용 시에 그리고 기체 침투성 재료가 하부 및 상부 둘 모두에 존재하는 경우, 챔버는 환경으로부터 액체 밀봉 가능하지만, 환경과 기체 소통한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 기체 침투성 계면을 포함하는 배양 장치에서 세포 또는 조직을 배양하기 위한 스캐폴드에 관한 것이며, 이 스캐폴드는
내부 둘레 및 외부 둘레를 한정하는 프레임으로서, 상기 프레임은 실질적으로 평면인 상단 표면을 포함하는, 프레임,
프레임의 내부 둘레를 가로질러서 실질적으로 평면인 배열로 보유된 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 포함하고,
여기서 스캐폴드는 스캐폴드가 적어도 하나의 기체 침투성 계면을 포함하는 배양 장치에 배치되는 경우 기질 또는 기질 상에 존재하는 세포 또는 조직의 실질적인 전부를 기체 침투성 계면과 접촉시키도록 구성된다.
일 실시형태에서, 기질은 프레임의 평면 상단 표면 상에서 실질적으로 평면인 배열로 보유된다.
일 양상에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 배양하기 위한 스캐폴드에 관한 것이며, 여기서 스캐폴드는 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작되고, 스캐폴드는
내부 둘레 및 외부 둘레를 한정하는 제1 프레임으로서, 상기 제1 프레임은 실질적으로 평면인 상단 표면을 포함하는, 제1 프레임, 및
내부 둘레 및 외부 둘레를 한정하는 제2 프레임으로서, 상기 제2 프레임은 실질적으로 평면인 상단 표면을 포함하는, 제2 프레임을 포함하되,
여기서 제1 프레임 및 제2 프레임은 계면을 한정하여 기질을 수용 및 보유하도록 이의 둘레의 적어도 일부분 주위에서 탈착 가능하게 맞물리고,
여기서 보유되는 경우 기질은 제1 프레임의 내부 둘레를 가로지르는 실질적으로 평면인 배열로 보유되고,
맞물리는 경우, 제1 프레임의 상단 표면 및 제2 프레임의 상단 표면은 실질적으로 동일 평면에 존재한다.
일 실시형태에서, 제2 프레임의 내부 둘레의 이의 상단 표면에서의 치수는 제1 프레임의 이의 상단 표면에서의 외부 둘레의 치수보다 더 커서, 제2 프레임은 제1 프레임의 적어도 상단 표면에서 제1 프레임의 외부 둘레 주위에서 맞물린다.
일 실시형태에서, 기질은 제1 프레임의 상단 표면에서 스캐폴드의 내부 둘레를 가로질러서 실질적으로 평면인 배열로 보유되고, 이에 의해서 기질의 상단 표면과, 예를 들어 기체 침투성 계면의 직접적인 접촉이 허용된다.
다양한 실시형태에서, 기질은 제2 프레임에 대한 제1 프레임의 마찰 정합 맞물림(friction fit engagement)에 의해서 제1 프레임과 제2 프레임 사이에 보유된다. 예를 들어, 마찰 정합 맞물림은 그것이 기질을 단단히 클램핑시켜서 기질을 스캐폴드의 내부 둘레를 가로질러서 실질적으로 평면인 배열로 유지시키도록 한다. 예를 들어, 프레임은 예를 들어, 기질이 배양 배지와 접촉하는 경우, 기질의 수축, 신장 또는 변형을 예방하도록 맞물린다.
다양한 실시형태에서, 기질은 제1 프레임과 제2 프레임 사이에 연장된 하나 이상의 돌출부에 의해서 적어도 부분적으로 제1 프레임과 제2 프레임 사이에 보유된다. 일례에서, 상기 하나 이상의 돌출부 중 하나 이상은 맞물림 상에서 제1 프레임과 제2 프레임 사이에 형성된 계면 내의 지점에서 기질을 관통한다.
다양한 실시형태에서, 스캐폴드의 하단 표면은 스캐폴드의 외부 둘레 및 인접한 내부 둘레에 걸쳐있는 적어도 하나의 구획을 포함하고, 상기 구획은 스캐폴드의 상단 표면을 향해서 융기된 하단 표면을 갖되, 여기서 상기 구획은 스캐폴드가 평탄한 표면 상에 배치되는 경우 공극(void)를 한정한다. 일 실시형태에서, 구획은 스캐폴드가 잠긴 배양물 중에 존재하는 경우 공기 방울의 용이한 제거를 허용하기 위해서 제공된 리세스(554)를 한정한다.
일 실시형태에서 스캐폴드는 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 포함한다.
일 실시형태에서, 이의 상단 표면에서 스캐폴드의 내부 둘레의 치수는, 스캐폴드에 의해서 보유된 기질 또는 기질 상에 존재하는 세포 또는 조직과 접촉하는 기체 침투성 계면 중 하나 이상의 치수보다 더 커서, 기질 또는 기질 상에 존재하는 세포 또는 조직의 실질적으로 전부가 기체 침투성 계면을 접촉한다.
다양한 실시형태에서, 스캐폴드는 기질을 위한 지지를 제공하도록 내부 둘레에 걸쳐있는 하나 이상의 횡 부재를 포함한다. 일례에서, 스캐폴드는 2개 이상의 횡 부재를 포함한다. 일례에서, 스캐폴드는 예를 들어, 도 11에 도시된 바와 같은, 기질을 위한 지지를 제공하도록 내부 둘레에 걸쳐있는 횡 부재의 격자를 포함한다.
일 실시형태에서, 기체 침투성 재료는 기체 침투성 막이다.
일 실시형태에서, 기체 침투성 재료는 폴리다이메틸실록산이다.
일 실시형태에서 스캐폴드는 실질적으로 평면이다. 일 실시형태에서 스캐폴드는 하부, 또는 상부, 또는 하부와 상부 둘 모두와 실질적으로 평행하게 배향된다.
일 실시형태에서, 스캐폴드는 용기의 하부와 상부 사이에서 스캐폴드의 실질적인 선형 이동을 허용하도록 적어도 하나의 측벽과 맞물린다. 예를 들어, 스캐폴드는 적어도 하나의 측벽에 대한 스캐폴드의 병진 이동(translational movement)을 허용하지만 적어도 하나의 측벽에 대한 스캐폴드의 회전 이동 제한하도록 적어도 하나의 측벽에서 하나 이상의 상보적 홈과 맞물린 하나 이상의 러그(lug)를 갖는다.
일 실시형태에서 스캐폴드는 기질의 대향하는 평면 측면 상에 배양 표면을 제공하도록 기질을 수용한다.
일 실시형태에서 기질은 생체 적합성 재료, 예컨대 생체 적합성 막이다. 일 실시형태에서 기질은 생분해성 막이다. 다양한 실시형태에서, 기질은 공중합체이다.
일 실시형태에서, 기질은 기체 침투성이다. 대안적인 실시형태에서 기질은 기체-불침투성이다.
예를 들어, 기질은 폴리(락트 코-글리콜산)(PLGA)이거나 이를 포함한다. 일례에서, 기질은 전기방사된(electrospun) PLGA이거나 이를 포함한다.
일 실시형태에서, 기질은 세포 접착, 세포 이동 또는 조직 층화를 개선시키도록 처리된 표면을 포함한다.
일 실시형태에서, 기질은 세포 접착, 세포 이동 또는 조직 층화에 도움을 주기 위한 1종 이상의 분자를 포함한다. 예를 들어, 기질은 1종 이상의 단백질, 예컨대 1종 이상의 기저 막 단백질, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 또는 렉틴, 1종 이상의 탄수화물, 예컨대 1종 이상의 당류, 또는 이들의 둘 이상의 임의의 조합물을 포함한다.
다른 실시형태에서, 기질은 이식편 생존, 유지 또는 오랜 지속성에 도움을 주기 위해서 1종 이상의 다른 작용제를 포함한다. 1종 이상의 다른 작용제는 제조 시에, 배양 중에, 또는 기질 상에 존재하는 세포 또는 조직의 수술적 이식 전의 임의의 지점에서 또는 수술적 이식 동안 기질에 혼입될 수 있다. 예시적인 작용제는 1종 이상의 항생제(예컨대, 예를 들어, 콜로이드성 은 또는 콜로이드성 금, 또는 1종 이상의 화학적 항생제), 1종 이상의 면역조절제(예컨대 1종 이상의 항염증제), 1종 이상의 치유 또는 혈관신생 촉진제(예컨대, 예를 들어, VEGF) 등을 포함한다.
다양한 실시형태에서 기질은 콜라겐 I, 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 콜라겐 VII, 라미닌 5, 상기에 언급된 단백질 중 하나 또는 이들의 임의의 둘 이상의 조합물로부터 유래된 1종 이상의 접착 펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서 기질은 특정 세포 유형을 기질에 선택적으로 결합시키거나 끌어들이거나, 또는 기질에 대한 특정 세포 유형의 접착을 촉진시키거나 가능하게 하기 위해서 1종 이상의 분자를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 기질은 상피 세포, 예를 들어, 케라티노사이트에 선택적으로 결합하기 위한 1종 이상의 분자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서 기질은 섬유모세포에 선택적으로 결합하기 위해서 1종 이상의 분자를 포함한다.
다양한 실시형태에서 기질은 1종 이상의 세포 접착 분자, 예컨대 1종 이상의 면역글로불린 슈퍼패밀리 세포 접착 분자(IgSF CAM), 1종 이상의 인테그린, 1종 이상의 카데린 또는 1종 이상의 셀렉틴을 포함한다. 다양한 실시형태에서 기질은 1종 이상의 상피 카데린(E-카데린), 1종 이상의 태반 카데린(P-카데린), 1종 이상의 신경 카데린(N-카데린), 1종 이상의 레티날 카데린(R-카데린), 1종 이상의 뇌 카데린(B-카데린 또는 T-카데린), 또는 1종 이상의 근육 카데린(M-카데린), E-셀렉틴, L-셀렉틴, P-셀렉틴, 알파 1 인테그린(ITGA1), 알파 2 인테그린(ITGA2), 알파 2b 인테그린(ITGA2b), 알파 3 인테그린(ITGA3), 알파 4 인테그린(ITGA4), 알파 5 인테그린(ITGA5), 알파 6 인테그린(ITGA6), 알파 7 인테그린(ITGA7), 알파 8 인테그린(ITGA8), 알파 9 인테그린(ITGA9), 알파 10 인테그린(ITGA10), 알파 11 인테그린(ITGA11), 알파 D 인테그린(ITGAD), 알파 E 인테그린(ITGAE), 알파 L 인테그린(ITGAL), 알파 M 인테그린(ITGAM), 알파 V 인테그린(ITGAV), 알파 X 인테그린(ITGAX), 베타 1 인테그린(ITGB1), 베타 2 인테그린(ITGB2), 베타 3 인테그린(ITGB3), 베타 4 인테그린(ITGB4), 베타 5 인테그린(ITGB5), 베타 6 인테그린(ITGB6), 베타 7 인테그린(ITGB7), 베타 8 인테그린(ITGB8), 또는 이들의 임의의 둘 이상의 조합물을 포함한다.
일 실시형태에서, 기질은 상피 층화, 예를 들어, 표피 층화에 도움을 주기 위한 1종 이상의 분자를 포함한다.
일 실시형태에서 스캐폴드의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하고/포함하거나 기체 침투성 기질과 맞물리도록 개작되고, 기체 침투성 기질을 가로지르는 기체 교환을 허용하도록 천공된다.
다양한 실시형태에서, 용기 또는 탈착 가능한 상부는 적어도 하나의 유체적으로-밀봉 가능한 접근 포트를 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 측벽은 적어도 하나의 유체적으로-밀봉 가능한 접근 포트를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 장치는 예를 들어, 오토클레이빙(autoclaving) 또는 감마 조사를 비롯한 것에 의해서 멸균 가능하다.
일 실시형태에서, 장치가 제1 모드(예를 들어, 수직 배향)로 존재하는 경우, 스캐폴드 및 기질은 챔버 내에 배치되고, 기질은 잠긴다.
일 실시형태에서, 장치가 제2 모드(예를 들어, 역 또는 회전 배향)로 존재하는 경우, 기질은 기체 침투성 재료에 배치된다. 예를 들어, 제2 모드에서, 스캐폴드 및 기질은 기체 침투성 계면을 포함하도록 챔버의 하부를 한정한다.
일 실시형태에서, 사용 시에 장치는 장치가 제1 모드(예를 들어, 수직 배향)로 존재하는 경우 챔버가 기질을 잠기게 하기에 충분한 배양 배지의 부피를 보유하도록 구성된다.
일 실시형태에서, 사용 시에 장치는 기질이 기체 침투성 재료에 또는 그 근처에서 존재하는 제2 모드로 구성된다. 예를 들어, 일 실시형태에서 기질은 장치가 제2 모드(예를 들어, 역 또는 회전 배향)로 존재하는 경우 기체 침투성 계면을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포를 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 배양될 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기고, 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 세포 배양 장치를 기질이 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
e) 세포 배양 장치를 세포 융합(confluence), 세포 증식, 세포 분화, 조직 층화, 또는 조직 성장 중 하나 이상을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서 단계 b)에서 장치는 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제1 모드로 존재한다. 일 실시형태에서 단계 d)에서 장치는 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 존재한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포의 하나 이상의 융합층을 기질 상에서 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 배양될 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기지만, 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 존재하는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 세포 배양 장치를 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
e) 세포 배양 장치를 세포의 하나 이상의 융합층을 형성하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계이되, 여기서 세포의 상기 하나 이상의 융합층은 기질의 적어도 부분 상에 배치되는, 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서 단계 e)는 세포 배양 장치를 세포 분화 또는 세포 증식 중 하나 이상을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 장치는 본 발명의 장치이다.
일 실시형태에서, 세포 현탁물은 챔버에 존재하는 접근 포트, 예를 들어, 용기에 존재하는 접근 포트를 통해서 도입된다.
또 다른 실시형태에서, 세포 현탁물은 상부에 부착하기 전에 용기에 도입된다.
일 실시형태에서, 배양될 세포는 앵커리지(anchorage)-의존성 세포이다.
일 실시형태에서, 세포는 상피 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포는 케라티노사이트를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포는 섬유모세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포는 케라티노사이트 및 섬유모세포를 포함한다.
일 실시형태에서 세포 현탁물은 조직 소화물로부터 수득된 세포의 집단을 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 단계 d)와 단계 e) 사이에 하기 추가 단계를 포함한다:
f) 배양될 세포를 포함하는 제2 현탁물을, 예를 들어 접근 포트를 통해서 도입하는 단계; 및
g) 제2 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 제2 현탁물 중의 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계; 및 임의로
h) 기질 또는 세포를 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치하도록 세포 배양 장치를 개작하는 단계.
일 실시형태에서, 방법은 단계 f) 내지 단계 h)의 1회 이상의 반복을 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 현탁물은 제1 현탁물 중에 존재하는 것과 상이한 1종 이상의 세포 유형을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 제1 현탁물은 섬유모세포를 포함하고, 제2 현탁물은 케라티노사이트를 포함한다.
일 실시형태에서, 기질은 생체 적합성이다. 일 실시형태에서, 기질은 생분해성이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 조직, 예를 들어, 상피 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 상피 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 장치는 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하고, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기고, 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 존재하는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 상피 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 세포 배양 장치를 기질 및/또는 세포가 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
e) 세포 배양 장치를 세포 분화, 증식 또는 층화 또는 상피 조직 발생이 일어나는 것을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서 방법은 단계 b) 이후에 하기 단계 중 하나 이상을 포함한다:
f) 조직 배양 배지를 장치로부터 제거하는 단계;
g) 기질의 표면을 세척하여 미접착된 세포를 제거하는 단계; 및/또는
h) 새로운 조직 배양 배지를 장치에 첨가하는 단계.
일 실시형태에서, 상피 세포는 케라티노사이트이다.
일 실시형태에서 현탁물은 세포, 예를 들어, 섬유모세포의 제2 집단을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서 단계 b)에서 장치는 기질이 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제1 모드로 존재하고; 단계 d)에서 장치는 상피 세포가 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 존재한다. 예를 들어, 상피 세포는 기체 침투성 재료와 직접 접촉한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 중층 표피 조직(stratified epidermal tissue) 또는 전층 피부 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 케라티노사이트 및 섬유모세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 장치는 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하고, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 존재하지 않는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 케라티노사이트 및/또는 섬유모세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 세포 배양 장치를 기질 및/또는 세포가 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
e) 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나는 것을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 중층 상피 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은,
a) 세포를 포함하는 제1 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 제1 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작되고, 여기서 챔버는 주입 포트를 포함하는 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서, 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기고 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 제1 현탁물 중의 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 임의로 세포 배양 장치를 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되지 않은 제2 모드로 개작하는 단계;
e) 상피 세포를 포함하는 제2 현탁물을 주입 포트를 통해서 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
f) 제2 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 상피 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
g) 세포 배양 장치를 기질 및/또는 상피 세포가 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제1 모드로 개작하는 단계; 및
h) 세포 배양 장치를 상피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전층 피부 조직 또는 중층 표피 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은,
a) 섬유모세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작되고, 여기서 챔버는 주입 포트를 포함하는 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기고 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 섬유모세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 임의로 세포 배양 장치를 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되지 않은 제2 모드로 개작하는 단계;
e) 케라티노사이트를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 주입 포트를 통해서 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
f) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 케라티노사이트의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
g) 세포 배양 장치를 기질 및/또는 케라티노사이트가 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제1 모드로 개작하는 단계;
h) 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 단계 (d)에서 제2 모드로의 개작은 섬유모세포가 기체 침투성 재료에 고정된 곳의 반대편의 기질의 표면을 노출시킨다.
일 실시형태에서 방법은,
a) 섬유모세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작되고, 여기서 챔버는 주입 포트를 포함하는 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하는, 단계;
c) 여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠긴 제1 모드로 존재하는, 단계;
d) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 섬유모세포의 적어도 일부가 기질에 접착하고, 임의로 섬유모세포가 증식하는 것을 허용하여 하나 이상의 피층(dermal layer)을 형성하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
e) 케라티노사이트를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 주입 포트를 통해서 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
f) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 케라티노사이트의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
g) 세포 배양 장치를 케라티노사이트가 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
h) 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서 방법은
a) 섬유모세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작되고, 여기서 챔버는 주입 포트를 포함하는 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠긴 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 섬유모세포의 적어도 일부가 기질에 접착하고, 임의로 섬유모세포가 증식하여 1종 이상의 피층을 형성하는 것을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 세포 배양 장치를 섬유모세포 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계;
e) 케라티노사이트를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 주입 포트를 통해서 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
f) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 케라티노사이트의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
g) 세포 배양 장치를 케라티노사이트가 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제1 모드로 개작하는 단계; 및
h) 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 기질은 1종 이상의 세포에 대해서 불침투성이다.
또 다른 실시형태에서, 기질은 1종 이상의 세포에 대해서 침투성이다.
일 실시형태에서, 세포 배양 장치는 적어도 일부의 섬유모세포가 기질로 또는 기질을 통해서 이동하는 것을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다.
일 실시형태에서 세포 배양 장치는 섬유모세포의 적어도 일부의 증식을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다.
일 실시형태에서 세포 배양 장치는 섬유모세포가 두꺼워진 진피를 생성하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다. 또 다른 실시형태에서 세포 배양 장치는 세포외 기질 침착이 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다.
다양한 실시형태에서 세포 배양 장치는 적어도 1주, 예를 들어, 적어도 2주, 또는 적어도 3주의 기간 동안 인큐베이션된다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 장치는 적어도 약 1개월, 예를 들어, 적어도 약 2개월의 기간 동안 인큐베이션된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 중층 상피 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은,
a) 상피 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작되고, 여기서 챔버는 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하는 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하지 않는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 상피 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 세포 배양 장치를 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계;
e) 세포 배양 장치를 상피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 중층 표피 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 케라티노사이트를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작되고, 여기서 챔버는 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하는 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하지 않는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 케라티노사이트의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 세포 배양 장치를 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계;
e) 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 기질은 1종 이상의 세포에 대해서 불침투성이다.
또 다른 실시형태에서, 기질은 1종 이상의 세포에 대해서 침투성이다.
일 실시형태에서 섬유모세포의 하나 이상의 층은 기질의 적어도 일부분의 표면 상에 배치된다.
추가 양상에서, 본 발명은 중층 상피 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 기질의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 접착된 상피 세포 또는 상피 세포를 포함하는 조직을 제공하는 단계;
b) 접착된 상피 세포 또는 상피 세포를 포함하는 조직을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하고, 여기서 세포 배양 장치는 배양 배지를 함유하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질, 접착된 상피 세포 및/또는 상피 세포를 포함하는 조직이 배지 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 접착된 상피 세포 또는 상피 세포를 포함하는 조직 상피를 함유하는 세포 배양 장치를 상피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서 접착된 상피 세포는 케라티노사이트이고, 중층 상피 조직은 중층 표피 조직이다.
추가 양상에서, 본 발명은 전층 피부 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 기질의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 접착된 세포 또는 조직을 제공하는 단계;
b) 접착된 세포 또는 조직을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하고, 여기서 세포 배양 장치는 배양 배지를 함유하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질, 접착된 세포 및/또는 조직이 배지 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 접착된 세포 또는 조직을 함유하는 세포 배양 장치를 표피 층화 및/또는 전층 피부의 생성이 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서 접착된 세포 또는 조직은 세포의 하나 이상의 집단을 포함한다.
일 실시형태에서, 접착된 세포, 예를 들어, 케라티노사이트는 기질의 표면의 적어도 일부분에 접착된다.
일 실시형태에서 접착된 세포 또는 조직은 섬유모세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서 접착된 세포 또는 조직은 케라티노사이트를 포함한다. 추가 실시형태에서 접착된 세포 또는 조직은 섬유모세포 및 케라티노사이트를 포함한다.
일 실시형태에서 케라티노사이트는 미분화된다.
일 실시형태에서 기질은 챔버 내에 배치 가능한 스캐폴드와 맞물린다. 예를 들어, 챔버는 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함한다. 또 다른 예에서, 스캐폴드는 스캐폴드를 챔버에 도입하기 전에 기질을 수용한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 생체 적합성 기질 상에서 세포를 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 적어도 하나의 기체 침투성 표면을 갖는 챔버를 제공하는 단계로서, 여기서 챔버는 실질적으로 평면인 생체 적합성 기체 침투성 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고, 스캐폴드는 제1 위치로부터 기체 침투성 표면에 또는 그 근처에 존재하고 기체 침투성 표면과 기체 소통하는 제2 위치로의 실질적인 선형 이동이 가능한, 단계;
b) 스캐폴드가 챔버 내에서 액체 불침투성 부피를 한정하는 제1 위치에 존재하도록 챔버를 제1 모드로 제공하고, 그 부피에 배양될 세포를 포함하는 현탁물을 도입하는 단계;
c) 세포를 포함하는 제1 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
d) 챔버를 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
e) 스캐폴드가 챔버 내에서 액체 불침투성 부피를 한정하는 제2 위치에 존재하도록 챔버를 제2 모드로 제공하는 단계이되, 여기서 기질은 기체 침투성 표면과 기체 소통하는, 단계; 및
f) 임의로 세포를 포함하는 제2 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
g) 챔버를 세포의 하나 이상의 융합층의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계이되, 여기서 세포의 상기 하나 이상의 융합층은 기질의 적어도 부분 상에 배치된, 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 상피 세포, 표피 세포, 또는 상피 세포와 표피 세포 둘 모두를 배양하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 제1 현탁물은 섬유모세포 및 케라티노사이트를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 생체 적합성 기질 상에서 세포를 배양하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 적어도 2개의 기체 침투성 표면을 갖는 챔버를 제공하는 단계로서, 여기서 챔버는 실질적으로 평면인 생체 적합성 기체 침투성 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고, 스캐폴드는 제1 기체 침투성 표면에 또는 그 근처에 존재하고 제1 기체 침투성 표면과 기체 소통하는 제1 위치로부터, 제2 기체 침투성 표면에 또는 그 근처에 존재하고 제2 기체 침투성 표면과 기체 소통하는 제2 위치로의 실질적인 선형 이동이 가능한, 단계;
b) 스캐폴드가 챔버 내에서 액체 불침투성 부피를 한정하는 제1 위치에 존재하도록 챔버를 제1 모드로 제공하는 단계이되, 여기서 기질은 제1 기체 침투성 표면과 기체 소통하는, 단계;
c) 세포를 포함하는 제1 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
d) 챔버를 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
e) 스캐폴드가 챔버 내에서 액체 불침투성 부피를 한정하는 제2 위치에 존재하도록 챔버를 제2 모드로 제공하는 단계이되, 여기서 기질은 제2 기체 침투성 표면과 기체 소통하는, 단계; 및
f) 세포를 포함하는 제2 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
g) 챔버를 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하는 것을 허용하고, 세포의 하나 이상의 융합층의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계이되, 여기서 세포의 상기 하나 이상의 융합층은 기질의 적어도 부분 상에 배치된, 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 방법은 상피 세포, 표피 세포, 또는 상피 세포와 표피 세포 둘 모두를 배양하는 방법이다.
일 실시형태에서, 제1 세포 현탁물은 섬유모세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 제2 세포 현탁물은 케라티노사이트를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포의 하나 이상의 융합층의 형성은 하나 이상의 중층 표피 조직의 형성이다.
일 실시형태에서, 세포의 하나 이상의 융합층의 형성은 전층 피부의 형성이다.
일 실시형태에서, 스캐폴드의 이동은 제1 기체 침투성 표면에 또는 그 근처에 존재하고 제1 기체 침투성 표면과 기체 소통하는 제1 위치로부터, 제2 기체 침투성 표면에 또는 그 근처에 존재하고 제2 기체 침투성 표면과 기체 소통하는 제2 위치로의 실질적인 선형 이동이다. 일 실시형태에서, 상기 선형 이동은 선형 이동에 수직인 축에 대한 스캐폴드의 유의한 회전 또는 반전이 없다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 중층 표피 조직의 생산 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 기질을 제공하는 단계이되, 여기서 접착된 케라티노사이트는 기질의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된, 단계;
b) 적어도 하나의 기체 침투성 계면을 포함하는 세포 배양 장치를 제공하는 단계;
c) 케라티노사이트가 기체 침투성 계면과 접촉하도록 기질을 장치에 도입하는 단계;
d) 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나는 것을 허용하기에 충부한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서 방법은 기질을 제공하는 단계이되, 여기서 접착된 섬유모세포는 기질의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된, 단계를 포함한다. 일 실시형태에서 접착된 케라티노사이트 및 접착된 섬유모세포는 기질의 하나의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된다. 일 실시형태에서 접착된 케라티노사이트는 기질의 하나의 표면의 적어도 일부분 상에 배치되고, 접착된 섬유모세포는 대향하는 표면의 적어도 일부분 상에 배치된다.
일 실시형태에서 방법은 중층 표피 및 진피를 포함하는 조직의 생산 방법이다. 일 실시형태에서 방법은 전층 피부의 생산 방법이다.
일 실시형태에서, 생체 적합성 기질은 막이고, 스캐폴드는 장력 하에서 막을 보유하도록 개작된다.
다양한 실시형태에서, 기질은 무세포 탈상피 진피(알로덤(alloderm)); 진피; 콜라겐 겔을 포함하는 콜라겐 및 콜라겐을 포함하는 조직; 탯줄, 태반, 점막, 소화관으로부터의 조직 또는 세포를 비롯한, 표피 또는 상피 계열의 조직 또는 세포; 피브로넥틴/피브린; 혈소판 풍부 혈장; 마트리겔(Matrigel); 세포, 예컨대 섬유모세포에 의해서 분비된 세포외 기질을 비롯한 세포외 기질을 포함하는 성분 및 조직; 히알루론산; PLGA를 비롯한 전기방사된 생체 적합성 재료; 폴리아크릴산, 폴리 L 라이신, 콜라겐, 젤라틴, 나일론, 및 폴리에스터를 비롯한, 생체 적합성 중합체 또는 생체 적합성 중합체의 조합물, 특히 전기방사될 수 있는 것; 젤라틴; 펩타이드 하이드로겔; 폴리글락틴 스캐폴드; 더마그래프트(dermagraft); 엘라스틴; 키토산; 피브로인; 스파이더 실크(spider silk); 아가로스, 및 이들의 둘 이상의 임의의 조합물 중 1종 이상이거나 이를 포함한다.
상기에 언급된 세포 및 조직은 인간, 말, 돼지, 양, 뮤린(murine), 개, 고양이 및 소를 비롯한, 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 본 개시 내용을 읽으면, 1종 이상의 생물 유래 생성물을 포함하는 기질이 추가 변형 없이 본 발명의 특정 실시형태에서 표피 층화가 일어나기 위한 적절한 자극을 일반적으로 제공할 것이지만, 1종 이상의 합성 재료를 포함하는 기질은 표피 층화를 위한 자극을 제공하기 위해서 전형적으로 변형, 예컨대 코팅을 필요로 할 것이라는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 방법은 임의의 동물 세포의 배양에 적용된다는 것이 추가로 인지될 것이다. 특히 인간을 비롯한, 포유동물 세포가 고려된다.
본 발명의 방법은 상피, 예를 들어 케라티노사이트의 단일 세포-두께 층, 상피, 기저층(stratum basale), 유극층(stratum spinosum), 과립층(stratum granulosum), 투명층(stratum lucidum) 및 각질층(stratum corneum) 중 적어도 둘을 포함하는 중층 상피 및 피층 및 표피칭을 포함하는 전층 피부를 포함하는 조직을 제조하는 데 사용될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 기체 침투성 재료는 최적의 기체 교환 및/또는 세포 성장, 증식, 및/또는 층화를 위해서 선택된다.
일 실시형태에서, 기체 침투성 재료는 250㎛의 두께를 갖는 기체 침투성 막이다.
다양한 실시형태에서, 장치, 특히 단일 세포 현탁물이 세포 배양 장치에 도입되는 것은 적어도 10일, 예를 들어 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일 또는 적어도 17일 또는 더 긴 시간 동안 충분한 성장 배지를 함유하기에 충분한 부피를 갖는다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 의해서 또는 배양 장치에서 제조된 세포, 예를 들어, 상피 세포, 케라티노사이트, 섬유모세포 또는 케라티노사이트 및 섬유모세포를 제공한다.
일 실시형태에서 케라티노사이트는 분화된 케라티노사이트이다.
일 실시형태에서 세포는 기질에 접착된다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 의해서 또는 배양 장치에서 제조된 조직, 예를 들어, 상피 조직, 중층 상피 조직, 표피, 중층 표피, 중층 표피 및 진피, 또는 전층 피부를 제공한다.
또 다른 양상에서 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 의해서 또는 배양 장치에서 제조된, 섬유모세포를 포함하는 피층, 케라티노사이트를 포함하는 중층 표피층 및 생체 적합성 기질을 포함하는 조직을 제공한다.
일 실시형태에서, 생체 적합성 기질은 생분해성 기질이다. 일례에서, 생분해성 기질은 피층과 표피층 사이에 존재한다.
일 실시형태에서 조직은 기질 중에 적어도 부분적으로 내장되거나, 부착된 섬유모세포를 포함하는 피층, 및 표피층을 포함한다. 또 다른 실시형태에서 조직은 기질, 기질의 하나의 표면에 부착된 피층 및 기질의 대향하는 표면에 부착된 표피층을 포함한다. 또 다른 실시형태에서 조직은 상피층, 표피층의 하나의 표면 상에 부착된 기질 및 표피층의 대향하는 표면에 부착된 피층을 포함한다.
다양한 실시형태에서 피층, 표피층 또는 피층과 표피층은 기질 중에 내장되거나 부착된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 조직 손상의 치료를 필요로 하는 대상체에서 조직 손상의 치료에서의 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법으로 제조된, 조직, 예를 들어 표피, 중층 표피, 중층 표피 및 진피, 또는 전층 피부의 용도에 관한 것이다.
다양한 실시형태에서 치료는 상처, 화상, 수술 반흔을 비롯한 반흔에 대한 것이다.
추가 양상에서, 본 발명은 조직 손상의 치료를 필요로 하는 환자에서 조직 손상을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 본 발명의 장치를 제공하는 단계이되, 여기서 조직, 예컨대 상피 조직, 중층 상피 조직, 표피, 중층 표피, 중층 표피 및 진피, 또는 전층 피부는 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법으로 성장된, 단계;
b) 멸균 조건 하에서 조직을 장치로부터 회수하는 단계; 및
c) 조직을 대상체에 적용하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 조직을 대상체에 적용하는 것은 수술에 의해서 수행될 것이다. 일 실시형태에서, 멸균 조건 하에서의 회수는 예를 들어, 수술실에서 수술 중에 또는 직전에 수행된다.
일반적으로, 조직을 대상에 적용하는 것은 조직 손상의 부위에 또는 인접부에서 수행될 것이다.
다양한 실시형태에서, 조직 손상은 상처, 화상, 반흔, 수술 부위 등으로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서 상피 조직은 소화관, 피부기관, 생식기관, 기도, 감각기관, 또는 요로의 영역에 적용된다. 다양한 실시형태에서 상피 조직은 턱밑샘, 부착 치은, 설배, 경구개, 식도, 위, 대장, 소장, 직장, 항문, 담낭, 갑상샘 소포, 피부, 땀샘관, 체강의 중피, 난소, 난관, 자궁, 자궁 경부, 질, 대음순, 직세관, 정소망, 고환수출세관, 부고환, 정관, 사정관, 요도구샘, 정낭, 인두, 후두, 후두, 성대, 기관(trachea), 기관지, 각막, 코, 신장의 근위곡 요세관, 신장의 상행 가는 가지(ascending thin limb), 신장의 원위곡 요세관, 신장의 집합관, 신우, 요관, 방광, 전립선 요도, 막 요도, 음경 요도, 또는 외요도구에 적용되거나, 또는 이들을 형성한다.
추가 양상에서, 본 발명은 상피 조직을 포함하는 구조체를 조작하는 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 본 발명의 장치를 제공하는 단계이되, 여기서 조직, 예컨대 상피 조직, 중층 상피 조직, 표피, 또는 중층 표피는 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법으로 성장된, 단계;
b) 멸균 조건 하에서 조직을 장치로부터 회수하는 단계; 및
c) 회수된 조직을 처리하여 구조체를 형성하는 단계를 포함한다.
추가 양상에서 본 발명은 상피 조직을 포함하는 구조체를 조작하는 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 본 발명의 장치를 제공하는 단계이되, 여기서 조직, 예컨대 상피 조직, 중층 상피 조직, 표피, 또는 중층 표피는 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법으로 성장된, 단계;
b) 멸균 조건 하에서 조직을 장치로부터 회수하는 단계;
c) 조직을 대상체에 적용하는 단계; 및
d) 조직을 처리하여 구조체를 형성하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서 구조체는 소화관, 피부기관, 생식기관, 기도, 감각기관, 또는 요로의 구조체를 포함한다. 다양한 실시형태에서 구조체는 턱밑샘의 관, 부착 치은, 설배, 경구개, 식도, 위, 대장, 소장, 직장, 항문, 담낭, 갑상샘 소포, 피부, 땀샘관, 체강의 중피, 난소, 난관, 자궁, 자궁 경부, 질, 대음순, 직세관, 정소망, 고환수출세관, 부고환, 정관, 사정관, 요도구샘, 정낭, 인두, 후두, 후두, 성대, 기관, 기관지, 각막, 코, 신장의 근위곡 요세관, 신장의 상행 가는 가지, 신장의 원위곡 요세관, 신장의 집합관, 신우, 요관, 방광, 전립선 요도, 막 요도, 음경 요도, 또는 외요도구를 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 조직에 대한 화합물 또는 조성물의 독성을 시험하는 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 본 발명의 장치를 제공하는 단계이되, 여기서 조직, 예컨대 상피 조직, 중층 상피 조직, 표피, 중층 표피, 중층 표피 및 진피, 또는 전층 피부는 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법으로 성장된, 단계;
b) 화합물 또는 조성물을 조직에 적용하는 단계;
c) 조직 손상 또는 조직에 대한 세포 사멸이 일어나는지의 여부를 평가하는 단계를 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 화합물 또는 조성물의 조직 침투성, 예를 들어 경피 침투성을 시험하는 방법을 제공하며, 이 방법은,
a) 본 발명의 장치를 제공하는 단계이되, 여기서 조직, 예컨대 표피, 중층 표피, 중층 표피 또는 진피, 또는 전층 피부는 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법으로 성장된, 단계;
b) 화합물 또는 조성물을 조직에 적용하는 단계; 및
c) 화합물 또는 조성물의 조직을 통한 침투성을 평가하는 단계를 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 조직에서 변화를 달성하기 위한 화합물 또는 화장품, 치료 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 조성물의 효능을 시험하는 방법을 제공하며, 이 방법은,
a) 본 발명의 장치를 제공하는 단계이되, 여기서 조직, 예컨대 표피, 중층 표피, 중층 표피 및 진피, 또는 전층 피부는 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법으로 성장된, 단계;
b) 화합물 또는 조성물을 조직에 적용하는 단계; 및
c) 조직에서 변화를 달성하는 화합물 또는 조성물의 효능을 평가하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서 방법은 단계 a) 이후에 장치로부터 조직을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적인 실시형태에서 방법은 장치 내에서 동일계에서 화합물 또는 조성물을 조직에 적용하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 수치의 범위에 대한 언급(예를 들어, 1 내지 10)은 또한 그 범위 내의 모든 유리수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 및 또한 그 범위 내의 유리수의 임의의 범위(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)에 대한 언급을 포함하도록 의도된다.
본 발명이 관련된 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게, 구조에서의 다수의 변화 및 본 발명의 다양한 상이한 실시형태 및 적용은 그들 자체가 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않는 것을 제안할 것이다. 본 명세서에서 개시 내용 설명은 순수하게 설명이고, 어떤 의미에서도 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 또한 본 출원의 명세서에서 지칭되거나 언급된 부품, 요소 및 특징부로 개별적으로 또는 집합적으로 이루어진다고 넓게 기술될 수 있고, 상기 부품, 요소 또는 특징부 중 임의의 둘 이상의 임의의 또는 모든 조합(여기서 구체적인 정수는 본 명세서에 언급되어 있고, 이것은 본 명세서가 관련된 기술 분야에서 공지된 등가물을 가짐) 및 이러한 공지된 등가물은 개별적으로 언급된 바와 같이 본 명세서에 포함된다고 여겨진다.
본 명세서에서 특허 명세서 및 다른 문헌을 비롯한, 외부 정보 문헌이 참고되는 경우, 이것은 일반적으로 본 발명의 특징부를 논의하기 위한 내용을 제공하기 위한 목적을 위해서이다. 달리 언급되지 않는 한, 이러한 정보 문헌에 대한 언급은 임의의 관할에서 이러한 정보 문헌이 선행 기술이거나 또는 관련 기술 분야에서 공통적인 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 용인하는 것으로서 이해되어서는 안 된다.
본 발명은 이제 단지 예의 방식으로 하기 도면을 참고로 설명될 것이다.
도 1은 장치의 제1 실시형태의 2개의 분해 투시도;
도 2는 도 1에 도시된 장치의 분해 투시도;
도 3은 a) 제1 위치와 b) 제2 위치 사이에서의 스캐폴드의 이동을 나타내는 장치의 제2 실시형태의 투시도;
도 4는 a) 제1 시각 및 b) 제2 시각으로부터의 도면을 나타내는 장치의 제3 실시형태의 투시도;
도 5는 장치의 제4 실시형태의 분해 투시도;
도 6은 a) 제1 위치와 b) 제2 위치 사이에서의 스캐폴드의 이동을 나타내는 도 5에 도시된 장치의 투시도;
도 7은 뒷벽(513)의 평면에서 장치를 통해서 취한 단면을 갖는 장치의 제5 실시형태의 상단 전면 투시도;
도 8은 a) 제1 위치 및 b) 제2 위치에서 스캐폴드를 도시한 도 7에서 도시된 실시형태의 전면도;
도 9는 기질을 갖는 스캐폴드를 도시한 도 7의 실시형태의 스캐폴드의 상부 투시도;
도 10은 도 9의 실시형태의 좌측도;
도 11은 기질이 없는 도 9의 실시형태의 하부 투시도;
도 12는 (a) 평면 A-A를 통해서 취한 도 10의 실시형태의 단면의 좌측 분해도(기질 없음);(b) 기질을 갖는 스캐폴드를 도시한 평면 A-A를 통한 단면의 좌측도;
도 13은 도 9의 스캐폴드의 하단 부재의 대안의 실시형태의 상부 투시도;
도 14는 (a) 평면 B-B를 통해서 취한 도 13에 도시된 실시형태의 하단 스캐폴드 부재의 단면; 및 (b) 상단 스캐폴드 부재에 의해서 앵커링된 기질을 갖는 스캐폴드를 도시한 동일한 도면;
도 15는 도 9의 실시형태의 포획된 공기 방출 메커니즘을 강조한 도면;
도 16은 도 9의 스캐폴드의 하부면의 투시도;
도 17은 도 9의 스캐폴드의 우측도.
본 발명은 세포를 배양하는 장치 및 방법에 관한 것이다. 장치는 제1 단부벽 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 탈착 가능한 제2 단부벽을 포함하고, 여기서 2개 이상의 벽의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된다.
본 발명은 추가로 본 명세서에 기술된 방법에 의해서 또는 배양 장치에서 제조된 조직, 또는 조직 손상의 치료를 필요로 하는 대상체에서 조직 손상의 치료를 위한 이러한 조직의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에 기술된 장치 및 방법은 공기-액체 계면을 모방하는 조건 하에서, 세포 및 조직, 예를 들어, 상피 세포, 중층 상피 세포, 케라티노사이트, 섬유모세포 및/또는 상피 조직 예컨대 피부의 배양을 가능하게 한다. 조건은 다세포층 또는 다층 조직의 상피 세포 분화 및/또는 층화, 및/또는 성장을 촉진시키는 고 산소 환경을 제공한다. 본 발명의 장치 및 방법은 성장 세포 및 조직을 예를 들어, 기체 침투성 계면과, 예를 들어 기체 침투성 계면에서 기체 소통하게 배치한다.
본 발명의 방법 및 장치의 실시형태는 다수의 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 이점을 갖는다:
Figure pct00001
세포 및 조직의 실질적이고 효율적인 조작,
Figure pct00002
생체이물(xenobiotic) 물질, 예컨대 동물-유래 화합물 또는 물질을 사용하지 않은 완전 합성 조직의 생산,
Figure pct00003
배양된 조직 및 세포의 제조 비용 감소,
Figure pct00004
배양된 세포 및 조직의 배양 동안의 사용자 취급 감소,
Figure pct00005
배양된 조직 및 세포의 오염 감소, 또는
Figure pct00006
세포 또는 조직 배양 동안 세포 또는 조직 손실 감소 및/또는 수율 증가.
1. 정의
용어 "및/또는"은 "및" 또는 "또는"을 의미할 수 있다.
용어 "포함하는"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "적어도 부분적으로 이루어진"을 의미한다. 그 용어를 포함하여 본 명세서에서 서술을 설명하는 경우, 각각의 서술에서 그 용어 앞의 특징부는 모두 존재할 필요가 있지만, 다른 특징부가 또한 존재할 수 있다. 관련된 용어, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하였다"는 동일한 방식으로 설명된다.
용어 "기체-액체 계면" 또는 "공기-액체 계면"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 증식 또는 분화하는 세포 또는 조직이 공기 또는 기체 및 액체와 동시에 접촉하는 표면을 의미한다. 공기-액체 계면은 일부 세포 및 조직의 성장을 위해서 요구된다. 예를 들어, 공기-액체 계면은 전층 피부의 성장을 위해서 요구되고, 이에 의해서 성장하는 피부의 피층은 액체 세포 배양 배지와 접촉하고, 표피층은 표피 층화를 유도하기 위해서 공기와 접촉한다. 일부 세포 또는 조직 유형의 경우 공기-액체 계면 또는 기체-액체 계면에서 또는 그 근처에서 고 산소 배양 조건은 세포 성장, 분화 또는 층화, 및/또는 다세포층 또는 다층 조직의 형성을 촉진시킨다.
용어 "기체 침투성 계면"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 기체 환경과 기체 교환이 일어나는 것을 허용하지만 액체 밀봉된 폐쇄 환경 사이에 위치된 표면을 의미한다. 본 명세서에 기술된 장치에 존재하는 1종 이상의 기체 침투성 계면은 공기-액체 또는 기체-액체 계면과 유사한 방식으로 세포 또는 조직 증식, 분화 및/또는 층화를 촉진시키는 계면을 제공한다. 특히, 본 명세서에 기술된 장치에 존재하는 하나 이상의 기체 침투성 계면은 상피 세포, 예를 들어, 케라티노사이트 증식 및 분화 및/또는 상피 또는 표피 층화를 촉진시키는 계면을 제공한다.
용어 "기체 침투성 재료"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 기체 교환이 일어날 수 있는 재료를 의미한다. 기체 침투성 막은 특히 본 명세서에 기술된 장치에서의 사용이 고려된다.
본 발명의 장치의 스캐폴드와 기체 침투성 재료, 또는 기질, 기질 및 기체 침투성 재료 상에 배치된 세포 또는 조직 간의 상호작용과 관련하여 용어 "기체 소통하는"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 스캐폴드, 기질, 세포 또는 조직이 기질, 세포 또는 조직에 예를 들어 증가된 산소를 전달하기 위해서 환경과 기질 또는 세포(예를 들어, 스캐폴드 상에 배치된 기질 또는 세포) 간의 기체 교환이 일어나는 것을 허용하도록 기체 침투성 재료에 충분히 가깝게 존재하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서 스캐폴드, 기질 또는 세포는 기체 침투성 재료와 직접 접촉한다. 다른 실시형태에서 스캐폴드, 기질 또는 세포는 기체 침투성 재료와 직접 접촉하지 않는다. 예를 들어, 다양한 실시형태에서 스캐폴드, 기질 또는 세포는 약 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9 또는 약 10㎜ 미만의 거리에서 유지되고, 유용한 범위는 이들 값 중 임의의 것 사이, 예를 들어, 약 0 내지 약 10㎜, 약 0 내지 약 5㎜, 약 0 내지 약 2㎜, 약 0 내지 약 1㎜, 약 0 내지 약 0.5㎜, 약 0 내지 약 1㎜, 약 0.1 내지 약 10㎜, 약 0.1 내지 약 5㎜, 약 0.5 내지 약 5㎜, 또는 약 2 내지 약 5㎜로부터 선택될 수 있다.
명사 뒤의 용어 "(들)"은 단수 또는 복수 형태 또는 둘 모두를 고려한다.
용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭하도록 의도된다. 포유동물 대상체는 고양이, 개 및 말을 포함한다. 다른 포유동물 대상체는 말, 돼지, 양, 염소, 소, 사슴, 또는 가금을 비롯한 농업용 동물, 또는 원숭이, 래트, 마우스, 토끼 또는 기니피그를 비롯한 실험 동물을 포함한다.
용어 "치료하다" 및 이의 파생어는 이의 가장 넓은 가능한 내용으로 해석되어야 한다. 용어는 대상체가 완전 회복까지 치료되는 것을 의미하는 것으로 간주되어서는 안된다. 따라서, "치료하다"는 대상체의 질환 진행, 증상 또는 화상 또는 상처 치유의 실질적인 정적인 수준으로의 유지, 대상체의 회복 속도의 증가, 완화 및/또는 증상의 개시 또는 특정 병태, 화상, 상처 또는 다른 부상의 중증도의 예방, 또는 환자의 삶의 질의 개선을 포함한다. 용어 "치료하다"는 또한 민감성 개인을 위한 양호한 건강의 유지 및 질환, 감염, 또는 침입 예방을 위한 체력 보강을 광범위하게 포함한다.
2. 장치
본 발명의 장치는 세포 및/또는 조직의 성장, 분화 또는 층화를 자극 또는 촉진시키기 위해서 공기-액체 계면에 노출시키는 것이 필요하거나 또는 이것이 이로운 세포 및/또는 조직의 배양 및 조작을 가능하게 한다. 본 발명의 장치는 액체 중에 잠기고, 기체 침투성 표면와 기체 소통하는 세포 또는 조직의 배양을 가능하게 한다.
장치의 제1 실시형태가 도 1에 도시되어 있다. 장치(100)는 제1 단부벽(111) 및 적어도 하나의 측벽(112)에 의해서 형성된 용기(110), 및 탈착 가능한 제2 단부벽(120)을 포함한다.
용기(110)는 액체 밀봉을 형성하도록 제2 단부벽(120)과 밀봉식으로 맞물리도록 구성된다. 맞물리는 경우, 용기(110) 및 제2 단부벽(120)은 챔버(130)를 한정한다.
도 1에 도시된 바와 같은 본 발명의 일 실시형태에서, 플랜지(114)가 단부(113)에서 또는 그것을 향해서 용기(110)로부터 측면으로 연장되어 있다. 일 실시형태에서 플랜지(114)는 O-링(도시되지 않음), 예를 들어, 고무 O-링을 유지하도록 구성된 홈(115)을 한정한다. O-링은 용기가 제2 단부벽(120)과 맞물리는 경우 액체 밀봉을 형성한다.
일 실시형태에서 제2 단부벽(120)은 용기(110)에 고정된다. 예를 들어, 제2 단부벽(120)은 너트 및 볼트를 사용하여 용기(110)에 고정된다.
다양한 실시형태에서 제2 단부벽(120)은 마찰 정합, 나사산(threading) 배열 또는 하나 이상의 클램프에 의해서 용기(110)와 맞물리도록 구성된다.
일 실시형태에서 측벽(112) 또는 제2 단부벽(120)은 적어도 하나의 유체적으로-밀봉 가능한 접근 포트(117)를 포함한다. 일 실시형태에서 장치는 마개(bung), 예컨대 포트(117)과 맞물려서 액체 밀봉을 형성하는 마개, 또는 다른 부재를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 장치는 포트(117)와 맞물려서 액체 밀봉을 형성하는 고무 마개(도시되지 않음)를 포함하고, 여기서 바늘이 고무 마개를 통해서 삽입되어 세포 또는 배양 배지를 챔버에 주입할 수 있다. 바늘이 제거되는 경우, 액체 밀봉이 회복된다.
일 실시형태에서 용기(110) 및/또는 제2 단부벽(120)은 실질적으로 폴리카보네이트로 형성된다. 용기(110) 및/또는 제2 단부벽(120)을 형성하는 데 사용하기에 적합한 재료는 밀봉 가능한 재료, 예를 들어 오토클레이브 가능하거나 또는 조사될 수 있는 재료이다.
제2 단부벽(120), 단부벽(111) 및 적어도 하나의 측벽(112) 중 2개 이상의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료와 맞물리도록 구성된다. 예시적인 실시형태에서 제1 단부벽(111) 및 제2 단부벽(120)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 그것과 맞물리도록 구성된다.
일 실시형태에서 기체 침투성 재료는 단부벽 또는 측벽의 내부 표면 상에 위치된다. 일 실시형태에서 기체 침투성 재료는 접착제를 사용하여 부착된다.
기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 그것과 맞물린 제2 단부벽(120), 제1 단부벽(111) 및/또는 측벽(112)의 부분은 도 1에 도시된 바와 같이 기체 교환을 허용하도록 천공된다. 일 실시형태에서 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 그것과 맞물린 제2 단부벽, 제1 단부벽 및/또는 측벽의 부분은 복수의 천공(140)을 포함한다. 예시적인 실시형태에서 천공(140)은 직경이 약 3㎜이다. 일 실시형태에서 천공은 기체 침투성 재료와 실질적으로 동일한 면적으로 연장되어 있고, 이에 의해서 단부벽(120 및 111) 각각의 내부 표면 상에 기체 침투성 계면을 형성한다.
일 실시형태에서, 플랜지는 제1 단부벽(111) 및/또는 제2 단부벽(120)으로부터 연장되어 있고, 플랜지는 장치(100)가 외부 표면 상에 놓이는 경우, 제1 단부벽(111) 및/또는 제2 단부벽(120)의 외부 면이 외부 표면과 접촉하지 않도록 구성된다. 장치에서 하나 이상의 플랜지의 존재는 외부 환경과 장치의 챔버 간의 천공(140) 및 기체 침투성 재료를 통한 기체 교환을 향상시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 장치(100)가 사용되고, 기체 침투성 재료가 존재하고, 천공(140)을 전체적으로 피복하도록 연장된 경우, 챔버(130)는 액체 밀봉 가능하지만 환경과 기체 소통한다.
일 실시형태에서 기체 침투성 재료는 기체 침투성 막이다.
다양한 실시형태에서 기체 침투성 재료는 약 50, 75, 100, 120, 125, 140, 145, 150, 155, 160, 170, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450 미만 또는 약 500㎛ 미만, 예를 들어, 약 50 내지 약 500㎛, 약 100 내지 약 200㎛, 또는 약 125 내지 약 175㎛의 두께를 갖는다.
일 실시형태에서 기체 침투성 재료는 폴리다이메틸실록산, 실리콘, 플루오로에틸렌폴리프로필렌, 폴리올레핀, 또는 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체이다.
기체 침투성, 수증기 전파, 세포와의 생체적합성 및 물리적 강도 또는 온전성 정도를 비롯한 특성은 장치에서 사용하기에 적합한 기체 침투성 재료의 선택에 중요한 고려 사항이라는 것이 인지될 것이다.
장치(100)는 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 챔버(130) 내에 위치된 스캐폴드(150)를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서 스캐폴드(150)는 장치로부터 탈착 가능하다.
일 실시형태에서 스캐폴드(150)는 제1 단부벽(111) 및/또는 제2 단부벽(120)과 실질적으로 평행하게 배향된다.
일 실시형태에서 스캐폴드(150)는 실질적으로 평면이고, 기질을 보유하도록 개작된 프레임의 형태로 존재할 수 있다. 일 실시형태에서 스캐폴드는 장력 하에서 스캐폴드 내에 또는 그 상에 기질을 보유하는 클램프 또는 클립을 포함한다.
일 실시형태에서 기질은 스캐폴드(150)에 직접 결합 또는 적용된다.
일 실시형태에서 장치는 복수의 스캐폴드를 포함하고, 여기서 각각의 스캐폴드는 별개의 기질을 포함한다. 일 실시형태에서 각각의 스캐폴드는 상이한 기질을 포함한다. 일 실시형태에서 각각의 스캐폴드는 동일한 기질을 포함한다.
또 다른 실시형태에서 스캐폴드는 복수의 분리된 기질을 포함한다. 일 실시형태에서 분리된 기질은 동일한 기질이다. 또 다른 실시형태에서 분리된 기질은 상이한 기질이다.
대안적인 실시형태에서 기질을 포함하는 부재는 예를 들어, 접착제, 클램핑 또는 마찰 정합에 의해서 스캐폴드(150)에 정합된다.
스캐폴드(150)는 제1 단부벽(111)에 존재하거나 또는 그것을 향하는 제1 위치와 제2 단부벽(120)에 존재하거나 또는 그것을 향하는 제2 위치 사이에서 또는 사용 시에 장치(100)가 뒤집어진 경우에는 그 반대의 스캐폴드(150)의 실질적인 선형 이동을 허용하도록 하나 이상의 측벽(112)과 맞물리도록 구성된다. 제1 위치 또는 제2 위치, 또는 제1 위치와 제2 위치 둘 모두에서, 기질은 기체 침투성 재료와 기체 소통한다. 일 실시형태에서 기질은 기체 침투성 재료와 접촉한다.
예를 들어, 사용 시에, 장치(100)가 제1 단부벽(111)이 하부에 존재하고, 제2 단부벽(120)이 장치의 상부에 존재하도록 하는 제1 모드로 배향되는 경우, 스캐폴드(150)는 제1 단부벽(111)에 존재하거나 또는 그것을 향하는 제1 위치에 위치된다. 장치(100)는, 제2 모드에서, 제1 단부벽(111)이 상부에 존재하도록 뒤집어지고, 스캐폴드(150)는 중력에 의해서 제2 단부벽(120)에 존재하거나 또는 그것을 향하는 제2 위치로 선형으로 이동한다.
스캐폴드(150)는 적어도 하나의 측벽(112)에 수직인 축에 대한 스캐폴드의 회전 또는 반전이 제한되도록 하나 이상의 측벽(112)과 맞물리도록 구성된다.
일 실시형태에서, 스캐폴드(150)는 적어도 하나의 측벽(112) 내의 하나 이상의 상보적 홈과 맞물리는 하나 이상의 러그를 가져서 스캐폴드(150)의 병진 이동을 허용하지만, 회전 이동을 제한한다. 대안적인 실시형태에서 적어도 하나의 측벽(112)은 스캐폴드(150) 내의 하나 이상의 상보적 홈과 맞물리는 하나 이상의 러그를 갖는다.
일 실시형태에서 스캐폴드(150)는 스테인리스강으로부터 형성된다. 다른 적합한 재료는 챔버(130)가 액체의 부피로 충전되고 장치가 뒤집어지는 경우, 스캐폴드(150)가 액체를 통해서 제1 위치로부터 제2 위치로 이동하기에 충분한 밀도의 재료를 포함한다는 것이 인지될 것이다. 스캐폴드를 형성하기에 적합한 재료는 생체 적합성이고, 조직 배양 배지에 의해서 유발되는 산화 또는 분해에 내성인 재료를 포함한다.
일 실시형태에서 스캐폴드(150)는 챔버(130) 내에서 액체의 이동을 허용하고, 장치(100)가 뒤집어지는 경우 포획된 공기를 방출시키기 위해서 하나 이상의 개구부를 포함한다.
병진 이동을 안내하지만, 스캐폴드(150)의 회전 이동을 제한하기 위한 다른 시스템이 사용될 수 있음이 인지될 것이다.
대안적인 실시형태에서 용기(110)는 도 2에 도시된 바와 같은 원통형이다. 이러한 실시형태에서 제1 단부벽(111), 제2 단부벽(120), 플랜지(114) 및/또는 스캐폴드(150) 또한 원형 형상일 수 있다.
병진 이동을 안내하지만 스캐폴드의 회전 이동을 제한하기 위한 대안적인 시스템을 포함하는 장치의 제2 실시형태가 도 3에 도시되어 있다.
장치(200)는 제1 위치와 제2 위치 사이에서 실질적으로 선형 이동을 달성하기 위해서 이중 암 레버(double arm lever)에 의해서 작동되는 스캐폴드(250)를 포함한다.
이러한 실시형태에서 스캐폴드(250)는 스캐폴드(250)의 대향 측면으로부터 측벽(212)을 향해서 연장된 핀(251)에 고정식으로 부착되거나, 또는 이것과 통합된 프레임의 형태이다. 힌지드 레버(hinged lever)(253)는 핀(251)과 이동 가능하게 맞물려 있고, 측벽(212)을 통해서 연장된 핀(254)과 고정식으로 맞물리도록 대향하는 배향으로 연장되어 있다.
일 실시형태에서 장치(200)는 핀(254)을 보유한 측벽(212) 내의 개구부와 밀봉식으로 맞물린 하나 이상의 마개(255)를 포함한다.
장치(200)는 대향하는 측벽(212)의 외부 상에 위치되고, 핀(254)과 고정식으로 맞물린 하나 이상의 대향하는 핸들(256)을 추가로 포함한다. 하나를 초과하는 핸들을 포함하는 실시형태에서, 편리하게는 핸들(256)은 대향하는 방향으로 연장되어 있다.
도 3의 부분 A에 도시된 제1 위치로부터의 스캐폴드(250)의 병진, 선형 이동은 핸들(256) 중 하나 또는 둘 모두를 측벽(212)에 수직인 축에 대해서 회전시켜서 힌지드 레버(253)를 움직여서 달성되어 스캐폴드(250)를 도 3의 부분 B에 도시된 제2 위치로 개방 및 상승시킨다.
병진 이동을 안내하지만 스캐폴드의 회전 이동을 제한하기 위한 추가의 대안적인 시스템을 포함하는 장치의 제3 실시형태가 도 4에 도시되어 있다.
이러한 실시형태에서 스캐폴드(350)는 스캐폴드(350)의 대향하는 측면으로부터 측벽(312)을 향해서 연장된 레버 암(353)과 이동 가능하게 맞물려 있다. 레버 암(353)은 스캐폴드(350)의 대향하는 모서리에 존재하거나 또는 그것을 향해서 스캐폴드(350)와 맞물려있다.
레버 암(353)은 측벽(312)을 통해서 연장된 핀(354)과 고정식으로 맞물리도록 대향 배향으로 연장된다.
장치(300)는 대향하는 측벽(312)의 외부 상에 위치되고, 핀(354)과 고정식으로 맞물린 하나 이상의 대향하는 핸들(356)을 포함한다. 하나를 초과하는 핸들을 포함하는 실시형태에서, 편리하게는 핸들(356)은 대향하는 방향으로 연장된다.
제1 위치로부터의 제2 위치로의 스캐폴드(350)의 병진, 선형 이동은 핸들(356) 중 하나 또는 둘 모두를 측벽(312)에 수직인 축에 대해서 회전시켜서 레버 암(352)을 구동시켜서 달성되어 하단 스캐폴드(350)를 개방 및 상승시킨다.
장치의 제4 실시양태가 도 5에 도시되어 있다.
장치(400)는 제1 단부벽(411) 및 측벽(412)에 의해서 형성된 용기(410), 및 제2 단부벽(420)을 포함한다.
용기(410)는 액체 밀봉을 형성하고 챔버(430)를 한정하도록 제2 단부벽(420)과 밀봉식으로 맞물리도록 구성된다. 장치(400)는 플랜지(414) 및 장치(100)에 대해서 상기에 기술된 바와 같은 밀봉 배열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서 적어도 하나의 측벽(412)은 적어도 하나의 유체적으로-밀봉 가능한 접근 포트를 포함한다. 일 실시형태에서 장치는 마개(418) 또는 액체 밀봉을 형성하도록 포트와 맞물린 다른 부재를 추가로 포함한다.
제2 단부벽(420)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 이것과 맞물리도록 구성된다. 일 실시형태에서 제2 단부벽(420)의 2개 이상의 분리된 영역은 도 4에 도시된 바와 같은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 이것과 맞물리도록 구성된다.
기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 이것과 맞물린 제2 단부벽(420)의 하나 이상의 영역은 장치(100)에 대해서 기술된 바와 같이 기체 교환을 허용하기 위해서 천공되어 있다. 일 실시형태에서 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 이것과 맞물린 제2 단부벽의 하나 이상의 영역은 복수의 천공(440)을 포함한다.
일 실시형태에서, 장치(400)가 사용되고 기체 침투성 재료가 존재하고 천공(440)을 포함하는 두 영역 모두를 완전히 피복하도록 연장된 경우, 챔버(430)는 환경으로부터 액체 밀봉 가능하지만 환경과 기체 소통한다.
장치(400)는 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 챔버(430) 내에 위치된 스캐폴드(450)를 추가로 포함한다. 기질은 장치(400)에 대해서 상기에 기술된 바와 같이 스캐폴드(450)에 적용 또는 정합될 수 있다.
일 실시형태에서 스캐폴드(450)는 탈착 가능하다. 또 다른 실시형태에서 스캐폴드(450)는 장치(400)에 고정된다.
스캐폴드(450)는 측벽(412) 중 하나 또는 둘 모두에 수직인 축에 대한 스캐폴드(450)의 실질적인 회전 이동을 허용하도록 측벽(412) 중 하나 또는 둘 모두와 맞물리도록 구성된다.
스캐폴드(450)의 이동은 도 6에 도시되어 있다.
일 실시형태에서 스캐폴드(450)는 측벽(412) 사이에서 챔버(430)의 폭을 가로질러서 연장된 핀(451)과 맞물려 있다.
일 실시형태에서 스캐폴드(450)는 핀(451)에 고정식으로 부착된다. 핀(451)은 측벽(412) 중 하나 또는 둘 모두에 수직인 축에 대해서 자유롭게 회전한다. 이러한 실시형태에서 장치는 용기(410)의 외부 상에 위치되고 핀(451)의 단부에 고정식으로 부착된 핸들(452)을 포함한다. 일 실시형태에서 장치는 핀(451)의 대향하는 단부로부터 연장된 제2 핸들을 포함한다.
스캐폴드(450)는 도 6의 부분 A에 도시된 제1 위치와 도 6의 부분 B에 도시된 제2 위치 사이에서 이동한다. 제1 위치에서 스캐폴드(450)의 측면은 단부벽(420)의 제1 영역과 접촉한다. 단부벽(420)의 제1 영역이 기체 침투성 재료를 포함하는 실시형태에서, 기질은 제1 위치에서 기체 침투성 재료와 기체 소통하거나 또는 그것과 직접 접촉한다.
사용자는 핀(451)에 대해서 핸들(452)을 회전시켜서 스캐폴드(450)를 제2 위치로 이동시킴으로써 스캐폴드(450)의 대향하는 평면 표면이 단부벽(420)의 제2 영역과 접촉하도록 스캐폴드(450)를 이동시킨다. 단부벽(420)의 제2 영역이 기체 침투성 재료를 포함하는 실시형태에서, 기질은 제2 위치에서 기체 침투성 재료와 기체 소통하거나 또는 그것과 직접 접촉한다.
스캐폴드(450)의 회전 이동을 안내하기 위한 다른 시스템이 사용될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
일 실시형태에서 장치(400)는 제1 단부벽(411)의 내부 표면으로부터 제2 단부벽(420)을 향해서 연장되고, 측벽(412) 사이에서 연장되어 챔버(430)를 2등분하여 2개의 하위 챔버를 형성하는 파티션(partition)(도시되지 않음)을 포함한다. 파티션은 스캐폴드(450)의 회전 이동을 방해하지 않도록 구성된다. 일 실시형태에서 핀(451)은 파티션 내에 보유될 수 있다.
배양 배지는 하위 챔버 중 하나 또는 둘 모두에 첨가될 수 있다. 배양 배지의 하나의 하위 챔버에 대한 첨가는 하위 챔버에 위치된 세포 또는 조직의 성장 또는 분화를 위한 적절한 부피의 배지를 제공하고, 따라서 챔버 내에 배지와 기체 사이의 계면에서의 기체 교환을 최대화시킨다.
일 실시형태에서 용기의 측벽 중 하나 이상은 변형 가능하다. 이러한 실시형태에서 변형 가능한 측벽의 수동 조작을 사용하여 용기의 제1 단부벽과 제2 단부벽 사이에서 적어도 어느 정도 스캐폴드의 병진 이동을 달성 또는 허용한다.
일 실시형태에서 장치는 기체 침투성 재료를 적어도 부분적으로 피복하는 제거 가능하거나 또는 용해 가능한 커버를 포함한다. 커버는 배지, 세포, 조직 또는 기질이 기체 침투성 재료와 접촉하는 것을 허용하도록 사용자에 의해서 제거될 수 있다.
일 실시형태에서 제거 가능한 커버는 용해 가능한 재료를 포함한다. 커버는 액체가 장치의 챔버에 첨가되는 경우 용해된다.
장치의 제5 실시형태가 도 7에 도시되어 있다.
장치(500)는 측벽(512), 뒷벽(513), 앞벽(도시되지 않음), 및 대향하는 탈착 가능한 단부벽(520 및 521)에 의해서 형성된 본체(510)를 포함한다.
일 실시형태에서 본체(510)는 액체 밀봉을 형성하기 위해서 단부벽(520 및 521)과 밀봉식으로 맞물리도록 구성된다. 일 실시형태에서 액체 밀봉은 단부벽(520 및 521)이 스크류를 사용하여 본체(510)에 고정되는 경우 형성된다. 사용될 수 있는 다른 적합한 고정 수단은 상기에 논의된 것을 비롯하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
맞물리는 경우, 본체(510) 및 단부벽(520 및 521)이 챔버를 한정한다.
일 실시형태에서 본체(510)의 임의의 벽은 적어도 하나의 유체적으로-밀봉 가능한 접근 포트(517)를 포함한다. 일 실시형태에서 상기에 기술된 바와 같이 액체 밀봉을 형성하기 위해서 접근 포트(517)와 맞물린 마개 또는 다른 부재를 사용한다.
단부벽(520 및 521)은 챔버와 환경 간의 기체 교환을 허용하도록 도 7에 도시된 바와 같은 복수의 천공(540)을 포함한다. 단부벽(520 및 521)의 적어도 일부분은 천공(540)을 완전히 피복하도록 연장된 기체 침투성 재료(도시되지 않음)와 맞물리도록 구성되어, 장치(500)가 사용되는 경우, 챔버는 환경으로부터 액체 밀봉되지만, 환경과 기체 소통한다. 기체 침투성 계면(GPI)이 이에 의해서 단부벽(520 및 521) 각각의 내부 표면 상에 형성된다.
사용 시에, GPI는 장치 내의 배지 내로의 기체 확산을 가능하게 하여, 기질 상에 시딩된 세포가 GPI와 직접 접촉할 때 세포 또는 조직 증식, 분화 및/또는 층화를 촉진시킨다.
장치(500)는 기질(551)을 수용하도록 개작된 챔버 내에 위치된 스캐폴드(550)를 포함한다.
도 8에 도시된 바와 같이, 스캐폴드(550)는 단부벽(520)에 존재하거나 또는 그것을 향하는 제1 위치(A)와 단부벽(521)에 존재하거나 또는 그것을 향하는 제2 위치(B) 사이에서 스캐폴드(550)의 실질적인 선형 병진 이동을 허용하기 위해서 하나 이상의 측벽(512)과 맞물리도록 구성된다. 사용 시에, 스캐폴드(550)는 장치(500)가 뒤집어지는 경우 제1 위치와 제2 위치 사이에서 이동한다.
일 실시형태에서 장치(500) 및 스캐폴드(550)의 치수는 스캐폴드가 장치의 깊이보다 한 치수(폭 또는 길이)에서 더 크도록 하는 정도이다. 이러한 치수는 장치 내에서 스캐폴드(550)의 버클링(buckling) 또는 재밍(jamming)을 회피하도록 회전 이동을 제한하면서 제1 위치와 제2 위치 사이에서 스캐폴드(550)의 매끄러운 선형 이동을 보장한다.
상기에 기술된 시스템을 비롯한, 스캐폴드의 병진 이동을 안내하지만 회전 이동을 제한하기 위한 다른 시스템이 사용될 수 있음이 인지될 것이다.
사용 시에, 스캐폴드(500)가 도 8a에 도시된 제1 위치에 존재하는 경우, 기질(551)의 상단 표면은 단부벽(520)의 내부 표면 상의 GPI와 접촉한다.
사용 시에, 스캐폴드(550)가 도 8b에 도시된 제2 위치에 존재하는 경우, 기질(551)의 하단 표면은 단부벽(521)의 내부 표면 상의 GPI와 직접 접촉하지 않고 근접한다.
사용 시에서, 예컨대 케라티노사이트를 증식, 분화 또는 층화시키기 위해서 GPI와 접촉할 필요가 있는 세포 또는 조직은 기질(551)의 상단 표면 상에 시딩되어야 한다. 즉, 그러한 세포 또는 조직은 스캐폴드(550)가 도 8b에 도시된 제2 위치에 존재할 때 장치에 첨가되어야 한다.
대안적인 실시형태(도시되지 않음)에서, 단부벽(521)의 일부분은 상승되어 기체 침투성 재료와 맞물린 플랫폼을 형성한다. 이러한 실시형태에서, 플랫폼은 사용 시에, 스캐폴드(550)가 제2 위치에 존재할 때 기질(551)의 하단 표면이 단부벽(521)에서 GPI와 접촉하도록 구성된다. 이러한 실시형태에서, 장치(500)는 사용 시에 기질(551)의 상단 표면이 제1 위치에서 GPI와 접촉하고, 하단 표면이 제2 위치에서 GPI와 접촉하도록 조작될 수 있다.
사용 시에, 챔버에 첨가된 세포는 기질(551)에 접착한다. 세포는 기질(551)의 상단 표면, 기질(551)의 하단 표면 또는 기질(551)의 상단 표면과 하단 표면 둘 모두에 접착할 수 있다.
일 실시형태에서 스캐폴드(550)는 도 9에 도시된 바와 같이 프레임의 형태이다. 스캐폴드(550)는 장력 하에서 기질(551)을 보유하도록 구성된다. 바람직한 실시형태에서 기질(551)은 스캐폴드(550)의 상부 에지의 실질적으로 전부를 피복한다.
일 실시형태에서 스캐폴드는 도 10에 도시된 바와 같이 하단 부재(552) 및 상단 부재(553)를 포함한다.
일 실시형태에서 하단 부재(552)는 장치가 사용 시에 뒤집어지는 경우 기질을 지지하고 액체 및 공기가 스캐폴드를 통해서 통과하는 것을 허용하는 도 11에 도시된 바와 같은 격자를 형성한다.
도 12에 도시된 바와 같이, 하단 부재(552) 및 상단 부재(553)는 스캐폴드 상에 기질을 보유하도록 구성된다. 실질적으로 평면인 기질(551)이 하단 부재(552)의 상부 표면을 가로질러서 배치된다. 하단 부재(552)는 장력 하에서 기질(551)을 보유하는 마찰 정합을 형성하기 위해서 상단 부재(553)와 맞물리도록 이의 둘레 주위에서 형상화된다. 일 실시형태에서 하단 부재(552) 및 상단 부재(553)는 스캐폴드(550)의 전체 둘레 주위에서 기질을 보유한다.
일 실시형태에서 스캐폴드(550)는 하단 부재(552) 및 상단 부재(553)와 고정식으로 맞물리도록 하나 이상의 클립 또는 클램핑 부재를 포함한다.
하단 부재(552)의 대안적인 실시형태가 도 13에 도시되어 있다. 이러한 실시형태에서 하단 부재(552)는 이의 상부 표면 상에 하나 이상의 돌출부(5521)를 포함한다. 사용 시에, 상단 부재(553)는 하단 부재(552) 내의 기질 상에 정합되고, 돌출부(5521)는 도 14에 도시된 바와 같이 기질을 관통한다. 이러한 방식으로 스캐폴드에 기질을 정합시키는 것은 사용 시에 기질의 수축 및 변위를 방지할 수 있다.
일 실시형태에서 스캐폴드(550)는 기질 아래에 포획된 공기가 스캐폴드를 통해서 통과하는 것을 허용하는 도 15에 도시된 바와 같은 하나 이상의 개구부(554)를 포함한다. 예시적인 일 실시형태에서 개구부(554)는 스캐폴드(550)의 둘 이상의 모서리에 위치된다.
일 실시형태에서 스캐폴드(555)는 도 16 및 17에 도시된 바와 같이 스캐폴드 프레임의 측면의 길이를 따르는 위치에 위치된 하나 이상의 리세스(555)를 포함한다. 사용 시에, 하단 부재(552) 및 상단 부재(553)를 분리하여 스캐폴드로부터 기질을 해방시키도록 툴(tool)이 리세스(555)에 삽입될 수 있다.
3. 방법
일부 세포 및 조직의 배양 또는 조직은 산소-풍부 환경으로부터 이익을 얻거나 이것이 필요하다. 이는 공기-액체 계면에서 성장 세포 또는 조직을 배치하는 배양 기술을 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 기술은 전형적으로 조직 배양 기구의 챔버 내에 존재하는 기체에 근접한 액체 조직 배양 배지의 표면에서 세포 또는 조직을 위치시키는 것을 포함한다. 이러한 기술은 특히, 큰 면적을 갖는 조직을 성장시키기 위해서, 정밀하게 실행하는 것은 매우 어렵다. 긴 주에 걸쳐서 이들 배양물을 유지시키는 것은, 조직의 모든 부분 상에 배지의 일정한 깊이를 유지시키는 것의 실제적인 어려움으로 인해서, 불가피하게 세포 성장을 대해서 최적에 못미치는 조건을 유발한다. 배양 배지의 다수의 변화가 전형적으로 요구되는데, 이는 세포 또는 조직의 오염의 위험이 있다.
본 발명은 공기 액체 계면에 노출될 필요가 있거나 또는 고 산소 환경에서의 배양이 이로운 세포 또는 조직을 배양 또는 조작하는 효율적이고 정밀한 방법을 제공한다.
본 명세서에 기술된 방법 및 장치는 세포로부터 복잡한 조직을 배양 또는 조작하는 데 사용될 수 있다. 이 방법 및 장치는 세포의 증식 및 분화를 촉진시켜서 복잡한 조직 구조체를 형성하는 환경을 제공한다.
다양한 실시형태에서 방법은 상피 세포, 예를 들어, 표피 세포 예컨대 케라티노사이트를 배양하는 방법이다.
다양한 실시형태에서 방법은 상피 세포 증식 또는 분화를 자극 또는 유지시키는 방법이다.
다양한 실시형태에서 방법은 기질 상에서 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법이며, 여기서 상기 하나 이상의 융합층은 기질의 적어도 부분 상에 배치된다. 일 실시형태에서 방법은 세포를 다세포층으로 배양하는 방법이다.
일 실시형태에서 방법은 조직을 배양하는 방법이다. 다양한 실시형태에서 방법은 상피 조직(상피), 중층 상피 조직, 표피 조직(표피), 중층 표피 조직, 또는 중층 표피 조직 및 진피 조직(진피)을 포함하는 조직을 배양하는 방법이다.
일 실시형태에서 방법은 상피의 배양 방법이다. 다양한 실시형태에서 방법은 케라티노사이트의 단일 세포-두께 층, 또는 기저층, 유극층, 과립층, 투명층 및 각질층 중 적어도 2개를 포함하는 중층 상피를 배양하는 방법이다.
특히 고려되는 실시형태에서 방법은 피부 또는 피부 조직을 배양하는 방법이다. 특히 바람직한 실시형태에서 방법은 피층 및 표피층을 포함하는 피부 또는 전층 피부를 배양하는 방법이다.
다양한 실시형태에서, 세포, 조직, 상피 또는 피부는 인간 또는 비-인간 동물로부터 유래된다. 일 실시형태에서 세포, 조직, 상피 또는 피부는 포유동물이다. 다양한 실시형태에서 세포, 조직, 상피 또는 피부는 인간, 원숭이, 토끼, 말, 돼지, 양, 뮤린, 개, 고양이, 소, 염소, 또는 조류이다.
다양한 실시형태에서 상피 조직(상피)은 단지 하나의 세포 두께인 단층 상피, 2층 이상 두께인 중층 상피, 원주 상피, 편평 상피, 입방 상피, 이행 상피 또는 다열 상피를 포함한다. 다양한 실시형태에서 상피는 케라틴화되거나 또는 비-케라틴화된다. 일 실시형태에서 상피는 섬모화된다. 일 실시형태에서 상피는 미세융모를 포함한다. 다양한 실시형태에서 상피는 단층 원주 상피, 중층 편평 상피, 단층 입방 상피 또는 다열 원주 상피이다. 다양한 실시형태에서 상피는 폐포 상피, 내피, 중피, 생식 상피, 호흡 상피, 각막 상피, 후각 상피, 또는 요로상피이다.
일 양상에서, 본 발명은 세포 배양 방법을 제공하며, 이 방법은
a) 배양될 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
b) 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질이 현탁물 중에 잠기고, 임의로는 기체 침투성 재료와 접촉하는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
d) 세포 배양 장치를 기질이 기체 침투성 재료에 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
e) 세포 배양 장치를
i. 세포 융합이 일어나거나,
ii. 세포 분화가 일어나거나,
iii. 세포 증식이 일어나거나,
iv. 세포의 하나 이상의 융합층, 예를 들어 기질의 적어도 부분 상에 배치된 세포의 하나 이상의 융합층을 형성하거나,
v. 중층 조직, 예를 들어, 중층 표피 조직의 형성이 일어나거나,
vi. 조직 성장이 일어나거나,
vii. 적어도 일부 세포, 예를 들어, 섬유모세포가 기질 내로 또는 그것을 통해서 이동하는 것을 허용하거나,
viii. i) 내지 v) 중 임의의 둘 이상의 조합이 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서 현탁물은 균질한 세포 집단을 포함한다. 일 실시형태에서 현탁물은 불균질 세포 집단을 포함한다.
일 실시형태에서 현탁물은 조직 소화물 또는 부분적으로 정제된 조직 소화물로부터 수득된 세포를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 현탁물은 피부 소화물로부터 수득된 세포를 포함한다.
다양한 실시형태에서 세포는 앵커리지-의존성 세포 또는 접착성 세포이다. 일 실시형태에서 세포는 케라티노사이트, 섬유모세포 또는 케라티노사이트 및 섬유모세포를 포함한다.
다양한 실시형태에서 세포는 색소-생산 세포, 혈관 세포, 다능성 줄기세포 또는 면역 세포를 포함한다. 일 실시형태에서 세포는 멜라닌세포, 내피 세포, 평활근 세포, 단핵구, 마크로파지, T 림프구, 혈소판, 비만 세포, 지방 세포, 또는 간엽 세포를 포함한다.
일 실시형태에서 조직 배양 배지는 그린 배지(Green's medium)이다. 다양한 실시형태에서 조직 배양 배지는 염, 성장 인자, 호르몬 및/또는 항생제를 포함한다. 상이한 조직 배양 배지가 다른 세포 또는 조직 유형의 성장에 적절할 수 있고/있거나 상이한 배지 첨가제가 사용될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
다양한 실시형태에서, 장치는 본 발명의 장치이다.
일 실시형태에서 세포 현탁물은 챔버 내에 존재하는 접근 포트, 예를 들어 용기 내에 존재하는 접근 포트를 통해서 도입된다. 또 다른 실시형태에서, 세포 현탁물은 제2 단부벽(상부)을 부착하기 전에 용기에 도입된다.
일 실시형태에서, 기질은 생체 적합성이다. 일 실시형태에서, 기질은 생분해성이다. 일 실시형태에서, 기질은 세포에 대해서 불침투성이다. 또 다른 실시형태에서, 기질은 세포에 대해서 침투성이다. 일 실시형태에서 기질은 기체 침투성이다. 또 다른 실시형태에서 기질은 기체 불침투성이다.
다양한 실시형태에서, 기질은 무세포 탈상피 진피(알로덤); 진피; 콜라겐 겔을 포함하는 콜라겐 및 콜라겐을 포함하는 조직; 탯줄, 태반, 점막, 소화관으로부터의 조직 또는 세포를 비롯한, 표피 또는 상피 계열의 조직 또는 세포; 피브로넥틴/피브린; 혈소판 풍부 혈장; 마트리겔; 세포, 예컨대 섬유모세포에 의해서 분비된 세포외 기질을 비롯한 세포외 기질을 포함하는 성분 및 조직; 히알루론산; PLGA를 비롯한 전기방사된 생체 적합성 재료; 폴리아크릴산, 폴리 L 라이신, 콜라겐, 젤라틴, 나일론, 및 폴리에스터를 비롯한, 생체 적합성 중합체 또는 생체 적합성 중합체의 조합물, 특히 전기방사될 수 있는 것; 젤라틴; 펩타이드 하이드로겔; 폴리글락틴 스캐폴드; 더마그래프트; 엘라스틴; 키토산; 피브로인; 스파이더 실크; 아가로스, 및 이들의 둘 이상의 임의의 조합 중 1종 이상이거나 이를 포함한다.
예시적인 실시형태에서 기질은 폴리(락트 코-글리콜산)(PLGA)이거나 이를 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서 기질은 전기방사된 PLGA이거나 이를 포함한다.
상기에 언급된 세포 및 조직은 인간, 말, 돼지, 양, 뮤린, 개, 고양이 및 소를 비롯한, 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 본 개시 내용을 읽으면, 1종 이상의 생물 유래 생성물을 포함하는 기질이 추가 변형 없이 본 발명의 특정 실시형태에서 표피 층화가 일어나기 위한 적절한 자극을 일반적으로 제공할 것이지만, 1종 이상의 합성 재료를 포함하는 기질은 표피 층화를 위한 자극을 제공하기 위해서 전형적으로 변형, 예컨대 코팅을 필요로 할 것이라는 것을 인식할 것이다.
일 실시형태에서, 기질은 세포 접착 또는 이동, 분화, 증식 및/또는 층화를 돕기 위한 1종 이상의 분자를 포함한다. 예를 들어, 기질은 1종 이상의 단백질, 예컨대 1종 이상의 기저 막 단백질, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 또는 렉틴, 1종 이상의 탄수화물, 예컨대 1종 이상의 당류, 또는 이들의 둘 이상의 임의의 조합물을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 기체 침투성 재료는 상기에 논의되어 있다. 다양한 실시형태에서 기체 침투성 재료는 최적의 기체 교환, 세포 성장, 세포 또는 조직 증식, 조직 층화 및/또는 기질, 세포 또는 조직과의 생체적합성을 위해서 선택된다.
일 실시형태에서 기질은 제1 모드로 기체 침투성 재료에 배치된다. 일 실시형태에서 기질은 제1 모드 및 제2 모드로 기체 침투성 재료에 배치된다.
일 실시형태에서 방법은 단계 d)와 단계 e) 사이에 하기 추가 단계를 포함한다:
f) 배양될 세포를 포함하는 제2 현탁물을, 예를 들어 접근 포트를 통해서 도입하는 단계; 및
g) 제2 현탁물을 함유하는 세포 배양 장치를 제2 현탁물 중의 세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계; 및 임의로
h) 기질 또는 세포를 기체 침투성 재료에 배치하도록 세포 배양 장치를 개작하는 단계.
세포 또는 조직 배양을 위해서 관련 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 인큐베이션 조건이 사용될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에서 장치는 5% 이산화탄소를 포함하는 습식 분위기에서 약 37℃의 온도에서 인큐베이션된다.
피층(진피) 및 표피층(표피)을 포함하는 전층 피부는 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 섬유모세포가 장치에 첨가되고 배양되어 진피를 형성한다.
장치에 첨가되고 배양되는 케라티노사이트는 분화 및 증식하여 중층 표피를 형성한다. 본 출원인은 기질에 부착된 케라티노사이트는 최적의 표피 층화가 발생하기 위해서 기체 침투성 계면을 직접 접촉해야 한다는 것을 발견하였다.
일 실시형태에서 섬유모세포 및 케라티노사이트는 장치에 동시에 도입된다.
또 다른 실시형태에서 섬유모세포 및 케라티노사이트는 순차적으로 장치에 도입된다. 예를 들어, 방법은 제1 섬유모세포를 포함하는 현탁물을 도입하는 단계, 장치를 섬유모세포가 부착 또는 증식하기에 충분한 시간 동안, 또는 필요한 두께의 진피를 형성하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계, 이어서 제2 케라티노사이트를 포함하는 현탁물을 도입하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태는 더 두꺼운 진피의 발생을 허용할 수 있다.
일 실시형태에서 섬유모세포 및 케라티노사이트는 기질의 하나의 표면 상에 시딩된다. 또 다른 실시형태에서 섬유모세포는 기질의 하나의 표면 상에 시딩되고, 케라티노사이트는 기질의 대향하는 표면 상에 시딩된다.
일 실시형태에서 조작된 조직은 기질을 포함한다. 예를 들어, 섬유모세포는 기질로 이동하여 전층 피부의 피층을 형성할 수 있다.
본 발명의 방법의 예시적인 실시형태는 하기 단계를 포함한다.
케라티노사이트 및 섬유모세포의 불균질 집단을 포함하는 현탁물을 제공한다. 세포를 적어도 약 14일의 기간 동안 세포의 성장을 지지하기에 충분한 적합한 조직 배양 배지, 예를 들어, 그린 배지의 부피 중에 제공한다.
콜라겐 IV로 코팅된 전기방사된 PLGA를 포함하는 스캐폴드를 포함하는 장치를 제공한다. 기체 침투성 재료를 포함하고, 천공을 갖는 제1 벽이 상부에 위치되어 기체 침투성 계면을 형성하도록 하는 배향으로 장치를 제공한다. 장치는 또한 천공된 대향하는 제2(하부) 벽 상에 위치된 기체 침투성 재료를 임의로 포함한다.
스캐폴드를 기질 측면이 하부 벽을 향하도록 장치에 삽입한다. 장치, 예컨대 상기에 기술된 제5 실시형태의 것이 사용되는 경우, 기질(551)의 상부 표면이 제1(상부) 벽을 향하도록 스캐폴드를 장치에 삽입한다.
세포 현탁물을 장치에 삽입하고, 장치를 밀봉한다. 장치를 기질의 표면의 적어도 부분에 대한 세포 접착이 일어나는 것을 허용하기 위해서 약 48시간의 기간 동안 인큐베이션시킨다.
장치를 뒤집어서 스캐폴드를 장치의 대향하는 단부(제1 벽)로 이동시킨다. 접착된 세포는 이제 장치의 상부 벽에서 기체 침투성 계면과 접촉한다. 장치를 약 14일의 기간 동안 인큐베이션시켜서 중층 상피의 생산을 유도한다. 장치의 추가 조작은 필요하지 않다.
14일 후 스캐폴드는 전층 피부를 포함한다. 피부를 스캘펄 또는 다른 툴을 사용하여 스캐폴드로부터 제거할 수 있다.
제2 예시적인 실시형태에서 섬유모세포 및 케라티노사이트를 별개로 첨가하고, 장치를 2회 뒤집는다.
제1 예시적인 실시형태를 위해서 상기에 기술된 바와 같은 장치를 사용한다. 장치를 기질이 기체 침투성 재료와 접촉하도록 하는 제1 모드로 제공한다. 섬유모세포의 균질한 집단을 포함하는 제1 세포 현탁물을 장치에 첨가한다. 장치를 밀봉하고, 48시간 동안 인큐베이션시킨다.
48시간 후에 장치를 뒤집어서 스캐폴드를 장치의 대향하는 단부로 이동시킨다.
케라티노사이트의 균질한 집단을 포함하는 제2 세포 집단을 예를 들어, 장치의 측벽 상의 접근 포트를 사용하여 첨가한다. 장치를 케라티노사이트 접착을 달성하기에 충분한 기간, 예를 들어 약 48시간 동안 인큐베이션시킨다.
장치를 두번째로 뒤집어서 스캐폴드를 장치의 대향하는 단부로 이동시키고, 케라틴 세포를 기체 침투성 재료와 접촉시킨다. 장치를 약 14일의 기간 동안 인큐베이션시켜서 중층 상피의 생산을 유도한다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 본 개시 내용을 읽으면, 상기에 언급된 방법의 특정 실시형태가 장치에서 세포의 시딩 후에 배양 배지를 변화시킬 필요성을 제거하거나, 또는 발생 조직을 배양 기구들 사이에서 제거 및 전달하는 것을 비롯한, 이점을 제공한다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 전층 피부를 생산하는 데 필요한 간섭의 수를 감소시키는 것은, 세포 또는 조직의 오염 위험을 감소시키고, 임상적 실시에 대한 유의한 장벽인 생산 비용을 감소시킨다.
본 발명의 다른 방법이 다른 이점을 달성한다는 것이 인지될 것이다. 전층 피부를 조작하는 선행 기술 방법은 공기-액체 계면(ALI)의 사용을 필요로 한다. 이러한 방법의 단점은 성장 및 표피 층화를 달성하기 위한 최적의 ALI에서 성장 조직을 유지시키기 위해서 배지 수준을 가까이에서 모니터링하는 것이 필요하다는 것이다. 본 발명의 장치 및 방법은 장치 내의 배양물 수준 및 부피에 좌우되지 않는 기체 침투성 계면(GPI)을 사용하여 세포 또는 조직을 성장, 분화 및/또는 조작하는 것이 가능하고, 이것은 배양 동안 주의깊은 모니터링 필요성을 제거한다.
예를 들어, 본 발명의 추가 방법은 중층 표피 조직, 또는 전층 피부 조직을 배양하는 방법을 제공하고, 이 방법은
a) 기질의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 접착된 세포 또는 조직을 제공하는 단계;
b) 접착된 세포 또는 조직을 세포 배양 장치에 도입하는 단계이되, 여기서 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하고,
여기서 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
여기서 장치는 기질, 접착된 세포 또는 조직이 현탁물 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 단계;
c) 접착된 세포 또는 조직을 함유하는 세포 배양 장치를 표피 층화, 또는 전층 피부의 생성이 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
예를 들어, 접착된 세포 또는 조직은 배양 기구에서 탈상피 진피(DED) 상에서 케라티노사이트, 또는 섬유모세포 및 케라티노사이트를 배양함으로써 제조될 수 있다. 세포가 접착된 후, 기질 상에 배치된 세포를 배양 기구로부터 제거하고, 장치로 옮긴다.
본 발명의 장치 및 방법은 상피 세포 또는 조직을 포함하는 다양한 상피 또는 조직의 배양 및/또는 조작에 적합하다.
본 발명의 장치 및 방법은 전형적으로 산소-풍부 환경이 필요한 다세포층 또는 다층 조직의 배양에 특히 적합하다.
특히, 본 발명의 방법 및 장치는 단층 편평 상피, 단층 입방 상피 및 단층 원주 상피를 비롯한, 단층 상피를 포함하는 조직 또는 구조체의 조작에 적합하다. 단층 상피는 상피 세포의 단일층을 포함한다. 중층 상피는 상피 세포의 2개 이상의 층을 포함한다. 중층 상피는 케라틴화 또는 비-케라틴화될 수 있거나, 또는 이행 상피일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 장치는 피부(표피)의 외부층을 비롯한 상피, 각막, 입, 식도 및 직장을 비롯한 위장관의 구조체의 내부 라이닝, 비뇨기 또는 생식기관, 예컨대 질 또는 요관의 구조체의 라이닝, 폐의 라이닝 점막, 또는 심막, 흉막 또는 복막의 벽을 형성하는 상피를 제조하기에 적합하다.
특히, 본 발명의 장치 및 방법은 섬유모세포, 케라티노사이트의 배양 및 중층 표피 및/또는 전층 피부의 생산에 적합하다.
전층 피부는 표피층 및 피층을 포함한다. 표피는 케라티노사이트를 포함하는 중층 상피이다. 진피는 섬유모세포를 포함하는 표피 및 콜라겐을 포함하는 기질 성분 아래의 층이다.
시험관내에서 전층 피부를 조작하는 도전적인 양상은 중층 표피 조직의 생산이다. 표피의 층화는 피부 기능에 결정적이고, 피부의 장벽 기능을 제공하는 조직층인, 각질층의 형성을 위해서 필요하다.
전층 피부를 생산하는 데 사용되는 기존의 방법은 탈상피 진피 상의 링틀(rings set)에서 케라티노사이트 및 섬유모세포룰 배양하는 단계를 포함한다. 조직 배지를 1일에 교환해야 하고, 2일에 링을 제거하고, 공기 액체 계면으로 전달해야 한다. 규칙적인 배지 교환이 요구되며, 이는 배양의 오염 가능성을 증가시킨다.
본 발명의 장치 및 방법은 진피 및 중층 표피 조직을 포함하는 전층 피부를 조작하는 것을 가능하게 한다. 본 발명은, 성장 표피와 접촉 또는 근접한 기체 침투성 계면을 제공하여 케라틴 세포의 분화 및 표피의 층화에 필요한 기체 교환을 허용하면서, 적합한 기질 상에서 전층 피부의 성장을 가능하게 한다. 성장 조직을 임의의 시기에 또 다른 배양 기구로 전달할 필요가 없고, 배지 교환 또는 사용자 간섭이 거의 요구되지 않는다.
다양한 실시형태에서 본 발명의 장치 및 방법은 이식 후에 본 발명의 방법에 의해서 생산된 전층 피부의 기능을 개선시키기 위해서 추가적인 세포 및 조직을 포함하는 전층 피부를 추가로 제공한다.
일 실시형태에서 본 발명의 방법 또는 장치를 사용하여 생산된 분화된 또는 중층 상피를 포함하는 조직을 추가로 처리하여 구조체를 형성한다. 상피 표면 또는 라이닝을 포함하는 임의의 구조체가 형성될 수 있다고 예상된다. 예를 들어, 조직을 감거나 또는 접어서 관형 구조체, 예컨대 혈관, 요도 또는 식도를 형성한다. 이러한 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Green et al., 2010. Tissue Engineering Vol 16, No 3, pages 1052-1064]; [Bhargava et al., 2004. BJU International, Vol 93: pages 807-811]; 및 [Bhargava et al., 2008. European Urology, Vol 53: pages 1263-1271]에 기술된 방법이고, 이들은 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 방법 또는 장치를 사용하여 생산된 조직을 포함하는 구조체는 이식을 필요로 하는 대상체에게 이식하기에 적합할 수 있다.
대안적인 실시형태에서 본 발명의 방법에 의해서 또는 장치를 사용하여 생산된 상피 조직은 장치로부터 회수되어, 수술 이식 절차 동안 동일계에서 구조체로 형성된다. 예를 들어, 일 실시형태에서 본 발명의 방법에 의해서 또는 장치를 사용하여 생산된 조직은 요도성형술 절차 동안 동일계에서 요도로 형성된다.
오염 가능성을 감소시키기 위해서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 본 발명의 장치를 사용하여 생산된 조직은 실험실로부터 수술실로 장치 내에서 이송된다.
조직 손상의 치료
본 발명은 조직 손상의 치료를 필요로 하는 대상체에서 조직 손상을 치료하기 위한, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 제조된, 조직, 예컨대 상피, 표피, 중층 상피, 중층 표피 및 진피, 부분층 피부 또는 전층 피부의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 조직 손상의 치료를 필요로 하는 대상체에서 조직 손상을 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은
a) 본 발명의 장치를 제공하는 단계이되, 여기서 조직, 예컨대 상피, 중층 상피, 표피, 중층 표피, 중층 표피 및 진피, 부분층 피부 또는 전층 피부가 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법으로 성장된, 단계;
b) 멸균 조건 하에서 장치로부터 조직을 회수하는 단계; 및
c) 조직을 환자에게 적용하는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서 조직 손상은 상처, 만성 창상, 수술 상처, 궤양, 비-치유 상처, 반흔, 수술 반흔, 열탕화상(scald) 또는 화상이다. 다양한 실시형태에서 화상은 1도 화상, 2도 화상, 3도 화상, 심도 진피 화상 또는 전층 화상이다.
다양한 실시형태에서 조직 손상은 점막 표면 상에 위치된 상피이다. 다양한 실시형태에서 상피는 피부, 폐, 위장관(예를 들어, 식도 또는 입), 생식기관, 또는 요로(예를 들어, 요도) 상에 또는 그 내에 위치된다.
바람직한 실시형태에서 조직은 대상체에 대해서 자가 유래된 세포를 사용하여 제조된다. 예를 들어, 다양한 실시형태에서 조직은 대상체에 대해서 자가 유래된 섬유모세포, 케라티노사이트, 또는 섬유모세포 및 케라티노사이트를 사용하여 제조된다. 대안적인 실시형태에서 조직은 대상체에 대해서 이종 유래된 세포를 사용하여 제조된다. 추가 실시형태에서 조직은 대상체에 대해서 자가 유래된 세포 및 대상체에 대해서 이종 유래된 세포를 사용하여 제조된다.
대상체에 대해서 자가 유래된 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 단리될 수 있다고 인지될 것이다. 예를 들어, 자가 유래된 세포는 샘플 조직을 소화시키고, 소화된 조직으로부터 섬유모세포 및/또는 케라티노사이트를 분리함으로써 대상체로부터 취한 피부 샘플 또는 피부 생검물로부터 단리될 수 있다.
일 실시형태에서 조직은 자가 이식편, 예를 들어 피부 자가 이식편이다. 다양한 실시형태에서 조직은 표피 자가 이식편, 부분층 피부 자가 이식편 또는 전층 피부 자가 이식편이다. 또 다른 실시형태에서 조직은 동종이계 이식편이다.
환자에 대한 자가 유래된 세포를 사용하여 제조된 조직, 예컨대 자가 이식편을 적용하는 것이 조직의 면역 거부를 감소시키거나 예방하고, 진행 중인 면역요법 또는 또 다른 보조적인 치료를 위한 요건을 감소시키는 데 매우 바람직하다는 것이 인지될 것이다.
일 실시형태에서 조직은 기질을 포함하고, 조직은 기질을 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서 조직은 환자에게 적용하기 전에 기질로부터 분리된다.
일반적으로, 환자에 대한 조직의 적용은 수술에 의해서일 것이다. 일 실시형태에서, 멸균 조건 하에서의 회수는 예를 들어, 수술실에서 수술 동안 또는 수술 직전에 일어난다.
일반적으로, 환자에 대한 조직의 적용은 조직 손상 부위에서 또는 그 근처에서 일어날 것이다. 다양한 실시형태에서 조직을 적용하여 조직 손상 부위를 적어도 부분적으로 피복하거나 또는 조직 손상 부위를 완전히 피복한다.
일 실시형태에서 조직을 적용하여 조직 손상 부위를 일시적으로 피복한다. 대안적인 실시형태에서 조직을 적용하여 조직 손상 부위를 영구적으로 피복한다.
시험관내 시험
국소 도포된 약제학, 뉴트라슈티컬 또는 화장품 제품의 효능 및 안전성을 전형적으로 동물 피부 또는 살아있는 동물, 인간 시체 피부 또는 합성 인간 피부 모델을 사용하여 시험한다.
동물 피부와 인간 피부 간의 형태학적 차이는, 제품의 시험을 위해서 절제된 동물 피부 또는 살아있는 동물이 최적이 아님을 의미한다. 추가로, 일부 국가에서의 이러한 시험에 대한 금지를 비롯하여, 화장품 제품을 시험하기 위해서 살아있는 동물 또는 동물 피부를 사용하는 것에 대한 상당한 윤리적인 문제가 존재한다. 이러한 이유로 인해서, 이러한 제품의 시험을 위한 동물 모델에 대한 대안을 식별하기 위한 강한 욕구가 존재한다.
인간 시체 피부를 제품 시험을 위해서 사용하는 경우에는 일관되지 않고 매우 가변적인 결과가 관찰되었다.
본 명세서에 기술된 장치 또는 방법을 사용하여 제조된 세포 또는 조직은 약제학, 뉴트라슈티컬 또는 화장품 제품의 시험관내 시험에 유용하다.
다양한 실시형태에서 본 명세서에 기술된 장치 또는 방법을 사용하여 제조된 세포 또는 조직은 화합물의 경피 관통을 시험하거나, 표피, 진피 또는 기저 막을 가로지르는 화합물의 침투를 시험하거나, 병태, 예를 들어 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위한 활성 성분의 효능을 시험하거나, 또는 화합물의 독성을 시험하기 위해서 사용된다.
다양한 실시형태에서 세포 또는 조직은, 관심 화합물이 피부 자극성인지를 결정하기 위해서, 예를 들어 관심 화합물이 피부 발진, 염증, 또는 접촉 피부염을 유도하는지를 결정하기 위해서 사용된다.
다양한 실시형태에서 세포는 섬유모세포, 케라티노사이트 또는 면역 세포, 또는 이들의 임의의 둘 이상의 조합물을 포함한다. 일 실시형태에서 세포는 섬유모세포 및 케라티노사이트를 포함한다. 다양한 실시형태에서 조직은 표피, 중층 표피 및 진피, 중층 표피 및 진피, 부분층 피부 또는 전층 피부를 포함하는 군으로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서 화합물은 약제학적 화합물, 화장품 화합물 또는 뉴트라슈티컬 화합물이다.
다양한 실시형태에서 시험용 화합물을 단독으로 또는 약제학적으로 또는 화장품용으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합하여 조직에 적용한다.
다양한 실시형태에서 시험용 화합물을 멸균 크림, 겔, 푸어-온(pour-on) 또는 스팟-온(spot-on) 제형, 현탁물, 로션, 연고, 더스팅 분말, 드렌치(drench), 스프레이, 약물-혼입 드레싱, 샴푸, 칼라(collar) 또는 피부 패치의 형태로 조직에 국소 도포한다.
본 발명은 상기의 것으로 이루어지고, 또한 하기의 것은 단지 예를 제공하고 이의 범주를 어떤 방식으로도 제한하지 않는 구조가 예상된다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 전층 피부를 제조한 연구를 요약한다.
1. 방법
멸균된 기질(전기방사된 PLGA 또는 피부 세포 성장과 상용성인 임의의 다른 피부 대체제)을 스테인리스강 스캐폴드에 부착한다. 기질을 임의로 콜라겐 IV(콜라겐 IV 시그마-알드리치 C5533, 10㎍/㎠로 사용)로 2시간 동안 코팅하고, 이어서 인산염 완충 염수(PBS)로 3회 세척한다.
기질이 부착된 스캐폴드를, 콜라겐 IV-코팅된 측면이 개구부를 향하도록 기체 침투성 계면(GPI) 장치에 놓는다.
250㎖의 그린 배지(DMEM:햄스(Hams) F12(라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 31765-035) 3:1, 10% FCS, 10ng/㎖ EGF(시그마-알드리치 E9644), 0.4㎍/㎖ 하이드로코르티손(시그마-알드리치 H0396), 0.1nM 콜레라독소(시그마-알드리치 C8052), 180μM 아데닌(시그마-알드리치 A2786), 5㎍/㎖ 인슐린(시그마-알드리치 I9278), 5㎍/㎖ 아포트랜스페린(시그마-알드리치 T2036), 2nM 3,3,5,-트라이-아이오도티로닌(시그마-알드리치 T2752), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 0.625㎍/㎖ 암포테신 B(시그마-알드리치 A2942))를 장치에 첨가한다.
섬유모세포 및 케라티노사이트를 배양 접시로부터 탈착시키고, 계수한다. ㎠당 300,000개의 케라티노사이트 및 100,000개의 섬유모세포를 GPI 장치에 첨가한다. 뚜껑을 덮어 GPI 장치를 밀봉한다. 장치를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시킨다.
GPI 장치를 뒤집어서, 스캐폴드가 장치의 대향하는 단부로 이동하여, 기질이 기체 침투성 막과 직접 접촉하는 것을 보장한다. 장치를 37℃, 5% CO2에서 14일 동안 인큐베이션시킨다.
GPI 장치를 개방하고, 모든 액체를 버리고, 스캐폴드를 제거한다. 에지 주위에서의 스캘펄 절단을 사용하여 스캐폴드로부터 피부를 방출한다.
2. 결과
본 방법은 환자에게 이식하기에 적합한 진피 및 중층 표피를 포함하는 전층 피부를 생산할 것이다.
실시예 2
본 실시예는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 전층 피부를 제조한 연구를 요약한다.
1. 방법
멸균된 기질을 실시예 1에 기술된 바와 같이 스테인리스강 스캐폴드에 부착한다. 기질을 임의로 콜라겐 IV(콜라겐 IV 시그마-알드리치 C5533, 10㎍/㎠로 사용)로 2시간 동안 코팅하고, 이어서 인산염 완충 염수(PBS)로 3회 세척한다.
기질이 부착된 스캐폴드를, 콜라겐 IV 코팅된 측면이 개구부로부터 멀리 향하도록 기체 침투성 계면(GPI) 장치에 놓는다.
250㎖의 그린 배지를 실시예 1에 기술된 바와 같이 첨가한다.
㎠당 100,000개의 섬유모세포를 GPI 장치에 첨가한다. 뚜껑을 덮어 GPI 장치를 밀봉한다. 장치를 37℃, 5% CO2에서 적어도 48시간 동안 인큐베이션시킨다.
GPI 장치를 뒤집어서, 스캐폴드가 장치의 대향하는 단부로 이동하는 것을 보장한다.
㎠당 300,000개의 케라티노사이트를, 케라티노사이트가 기질의 시딩되지 않은 측면 상에 정착하도록, 주입 포트를 통해서 GPI 장치에 첨가한다. 장치를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시킨다.
GPI 장치를 두 번째로 뒤집어서, 스캐폴드가 장치의 대향하는 단부로 이동하여, 기질이 기체 침투성 막과 직접 접촉하는 것을 보장한다. 장치를 37℃, 5% CO2에서 14일 동안 인큐베이션시킨다.
GPI 장치를 개방하고, 모든 액체를 버리고, 스캐폴드를 제거한다. 에지 주위에서의 스캘펄 절단을 사용하여 스캐폴드로부터 피부를 방출한다.
2. 결과
본 방법은 환자에게 이식하기에 적합한 진피 및 중층 표피를 포함하는 전층 피부를 생산할 것이다.
실시예 3
본 실시예는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 중층 표피를 제조한 연구를 요약한다.
1. 방법
멸균된 기질을 실시예 1에 기술된 바와 같이 스테인리스강 스캐폴드에 부착한다. 기질을 임의로 콜라겐 IV(콜라겐 IV 시그마-알드리치 C5533, 10㎍/㎠로 사용)로 2시간 동안 코팅하고, 이어서 인산염 완충 염수(PBS)로 3회 세척한다.
기질이 부착된 스캐폴드를, 콜라겐 IV 코팅된 측면이 개구부를 향하도록 기체 침투성 계면(GPI) 장치에 놓는다.
250㎖의 그린 배지를 실시예 1에 기술된 바와 같이 첨가한다.
㎠당 300,000개의 케라티노사이트를, 케라티노사이트가 기질의 시딩되지 않은 측면 상에 정착하도록, GPI 장치에 첨가한다. 뚜겅을 GPI 장치 상에 덮고, 밀봉한다. 장치를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시킨다.
GPI 장치를 뒤집어서, 스캐폴드가 장치의 대향하는 단부로 이동하여, 기질이 기체 침투성 막과 직접 접촉하는 것을 보장한다. 장치를 37℃, 5% CO2에서 14일 동안 인큐베이션시킨다.
GPI 장치를 개방하고, 모든 액체를 버리고, 스캐폴드를 제거한다. 에지 주위에서의 스캘펄 절단을 사용하여 스캐폴드로부터 중층 표피를 방출한다.
2. 결과
본 방법은 환자에게 이식하기에 적합한 중층 표피를 생산할 것이다.
실시예 4
본 실시예는 기체 침투성 계면(GPI)을 사용한 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 피부를 공기-액체 계면(ALI)을 사용한 선행 기술 방법을 사용하여 제조된 피부와 비교한다.
1. 전층 피부의 제조
접착된 세포의 제조
탈상피 무세포 진피(DED)를 폴리스타이렌 조직 배양 접시에 넣었다. 10㎜ 직경 개구부 및 10㎜ 깊이를 갖는 스테인리스강 고리를 DED 상에 설치하고, 그린 배지를 충전시켰다. 300,000개의 케라티노사이트 및 100,000개의 섬유모세포를 고리의 중심에 첨가하였다. 배지를 24시간 내에 2회 교환하였다.
공기-액체 계면(ALI)을 사용한 전층 피부의 제조
하기와 같이 공기-액체 계면을 사용하는 선행 기술 방법을 사용하여 전층 피부를 제조하였다.
48시간 후 고리를 DED로부터 제거하고, 접착된 섬유모세포 및 케라티노사이트를 포함하는 DED를 그린 배지를 포함하는 조직 배양 접시 내의 스테인리스강 랙 상에 전달하였다. 랙은 배양 접시의 기저부로부터 7㎜ 융기된 구멍의 격자로 이루어졌는데, 이것을 통해서 배지가 DED와 접촉할 수 있다. 금속 랙 상에서 유지된, DED의 기저부가 배지와 접촉하도록 배양 접시에서 배지의 수준을 유지시켰고, 케라티노사이트 및 섬유모세포가 시딩되었을 때 DED의 상부 표면이 공기에 노출되어 공기-액체 계면을 생성하였다.
2 내지 3일마다 완전 배지를 변화시키면서 세포를 공기-액체 계면에서 14일 동안 배양하였다.
기체 침투성 계면을 사용한 전층 피부의 제조
하기와 같이 기체 침투성 계면(GPI)을 사용하여 전층 피부를 제조하였다.
48시간 후, 고리를 DED로부터 제거하고, DED를 기체 침투성 막을 포함하는 장치로 전달하였다. 접착된 섬유모세포 및 케라티노사이트가 장치의 하부에 위치된 기체 침투성 막과 접촉하도록 DED를 장치에 놓는다.
세포를 14일 동안 기체 침투성 계면에서 배양하였다.
14일 후 조직을 분석을 위해서 수확하여 공기-액체 계면과 접촉시켜 형성된 피부 또는 기체 침투성 막과 접촉시켜 형성된 피부의 품질을 평가하였다.
2. 전층 피부의 비교
GPI를 사용하여 생산된 피부는 ALI를 사용하여 생산된 피부와 유사한 두께 및 외관을 가졌다.
각각의 피부 샘플을 케라티노사이트 줄기 세포의 마커인 사이토케라틴 19; 사이토케라틴 14; 기저 케라티노사이트 마커; 및 사이토케라틴 10, 초기저 케라티노사이트 마커에 대한 항체로 염색하였고, 형광 현미경법에 의해서 관찰하였다. 각각의 동결된 피부 샘플의 5㎛ 두께의 단면을 아세톤으로 고정시키고, 0.25% 카제인 용액으로 차단시켰다. 1% 우태아 혈청(FBS)을 함유하는 트리스 완충 염수(TBS) 용액 중의 사이토케라틴 10, 사이토케라틴 14, 또는 사이토케라틴 19에 대한 1차 항체로 샘플 구획을 피복하였다. 샘플을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 TBS로 1회 세척하고, 이어서 로킹(rocking)으로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 핵 염색제 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유하는 1% FBS를 갖는 TBS 중의, 알렉사(Alexa) 488 염료가 접합된 각각의 1차 항체에 대해서 특이적인 2차 항체로 샘플 구획을 피복하였다. 샘플을 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 TBS로 1회 세척하고, 이어서 로킹으로 각각 15분 동안 2회 세척하였다. 샘플을 프로롱 골드(Prolong Gold) 적재 용액으로 피복하고, 상부 상에 커버슬립을 놓았다. 형광 현미경을 사용하여 DAPI 염색제 및 각각의 알렉사 488 염색제의 모든 샘플에 대해서 영상을 수득하였다.
공기-액체 계면(ALI)에서 성장된 피부 및 기체 침투성 계면(GPI)에서 성장된 피부는 중층 표피의 형성을 나타내었다.
케라티노사이트의 다수의 층이 두 샘플 유형 모두 중에 존재하였다. 기저 영역에서 둥근 것으로부터, 상단 영역에서 평탄한 것까지의, 표피에서 케라티노사이트의 핵의 형상 변화는, 중층 표피가 ALI 및 GPI 둘 모두에서 성장된 피부에서 형성되었음을 나타내었다.
ALI에서 성장된 피부 또는 GPI에서 성장된 피부는 표피의 상부층에서 초기저 케라티노사이트 마커인 사이토케라틴 10의 발현을 나타내었으며, 이는 각질층 층이 성공적으로 형성되었음을 나타내는데, 이는 결국 케라티노사이트 분화 및 표피 층화 과정이 성공적으로 완결되었음을 나타내었다.
ALI에서 성장된 피부 또는 GPI에서 성장된 피부는, 각질층 아래의 케라티노사이트의 층에서 기저 케라티노사이트 마커인 사이토케라틴 14의 발현을 나타내었는데, 이는 이들 케라티노사이트가 중층 표피의 형성을 위해서 요구되는 증식 상태로 존재하였음을 나타내었다. ALI에서 성장된 피부 및 GPI에서 성장된 피부는 케라티노사이트 줄기 세포 마커인 사이토케라틴 19에 대해서 양성으로 염색된 케라티노사이트를 함유하였다. 케라티노사이트 줄기 세포의 존재는, 표피의 연속적인 개선을 위해서 요구되는 케라티노사이트 세포 유형 모두가 존재하였음을 나타낸다.
ALI에서 생산된 피부와 GPI에서 성장된 피부의 비교는, GPI가 표피에 존재하는 더 많은 수의 케라티노사이트 줄기 세포를 생성하여, 잠재적으로 더 양호한 중층 표피를 생산할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 실시예는, 본 발명의 방법이 중층 표피를 갖는 전층 피부의 제조를 가능하게 하고, 선행 기술 방법을 사용하여 생산된 피부와 유사한 특징을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 5
본 실시예는 본 발명의 방법 및 장치를 사용한 피부 조직의 제조를 나타낸다.
(1) 본 명세서에 기술된 장치를 사용하여 제조된 피부 조직 및 (2) 선행 기술 장치를 사용하여 제조된 피부 조직(둘 모두 GPI를 사용함)을 (3) ALI를 사용한 선행 기술 방법을 사용하여 제조된 피부 조직과 비교하였다.
1. 방법
전기방사된 PLGA를 콜라겐 IV 용액(10㎍/㎠)으로 2시간 동안 37℃에서 코팅하여 기질을 형성하였다. 코팅된 PLGA를 인산염 완충 염수(PBS)로 3회 세척하고, 그 후 코팅된 표면 상에 섬유모세포 및 케라티노사이트를 시딩하였다. 방법 (1)의 경우 100㎠의 기질을 사용하고, 방법 (2)의 경우 6㎠의 기질을 사용하였고 방법 (3)의 경우 1㎠의 기질을 사용하였다.
방법 (1): 본 명세서에 기술된 GPI 장치를 사용한 피부의 제조
콜라겐-코팅된 전기방사된 PLGA를, 코팅된 측면이 스캐폴드의 상부 표면과 플러싱하도록, 본 발명의 GPI 장치의 스캐폴드 내에 클램핑하였다.
스캐폴드를 전기방사된 PLGA의 코팅된 측면이 위로 향하도록 GPI 장치의 하부에 놓았다.
GPI 장치에 그린 배지 300㎖를 충전하였다. 그린 배지의 조성은 실시예 1에 기술되어 있다.
케라티노사이트 및 섬유모세포가 코팅된 전기방사된 PLGA에 부착될 수 있도록 13,000,000개의 케라티노사이트 및 2,500,000개의 섬유모세포를 GPI 장치에 첨가하였다.
뚜껑(GPI를 포함함)을 GPI 장치 상에 놓고, GPI 장치를 밀봉하였다.
48시간 후, GPI 장치를 뒤집어서 스캐폴드를 장치의 대향하는 단부(뚜껑)으로 이동시켰다. 이 위치에서, 접착된 섬유모세포 및 케라티노사이트는 뚜껑 내의 GPI와 직접 접촉하였다.
세포를 14일 동안 배양하였고, 그 시간 기간 동안 배지를 교체할 필요가 없었다.
14일 후, 피부 조직을 분석을 위해서 수확하였다.
방법 (2): 선행 기술 GPI 장치를 사용한 피부의 제조
25㎜ 직경의 개구부 및 10㎜ 깊이를 갖는 스테인리스강 고리를 5㎝ 직경의 배양 접시 내의 코팅된 전기방사된 PLGA 상에 설치하고, 그린 배지를 충전하였다. 750,000개의 케라티노사이트 및 200,000개의 섬유모세포를 고리의 중심에 첨가하였다. 배지를 24시간 이내에 2회 교환하였다.
48시간 후, 고리를 코팅된 전기방사된 PLGA로부터 제거하고, 코팅된 전기방사된 PLGA를 배양 접시로부터 20㎖의 그린 배지를 갖는 G-Rex10 장치(윌슨 울프(Wilson Wolf))로 전달하여, 접착된 섬유모세포 및 케라티노사이트를 G-Rex10의 하부 표면에 위치된 GPI와 접촉시켰다.
세포를 14일 동안 배양하였고, 그 시간 기간 동안 배지 변화가 필요하지 않았다.
14일 후, 피부 조직을 분석을 위해서 수집하였다.
방법 (3): ALI를 사용한 피부의 제조
10㎜ 직경 개구부 및 10㎜ 깊이를 갖는 스테인리스강 고리를 6웰 배양 플레이트 내부의 코팅된 전기방사된 PLGA 상에 설치하고, 그린 배지를 충전하였다.
130,000개의 케라티노사이트 및 34,000개의 섬유모세포를 고리의 중심에 첨가하였다. 배지를 24시간 이내에 2회 교환하였다.
48시간 후, 고리를 코팅된 전기방사된 PLGA로부터 제거하고, 접착된 섬유모세포 및 케라티노사이트를 포함하는 코팅된 전기방사된 PLGA를 그린 배지를 포함하는 조직 배양 접시 내의 스테인리스강 랙 상에 전달하였다. 랙은 배양 접시의 기저부로부터 7㎜ 융기된 구멍의 격자로 이루어졌는데, 이것을 통해서 배지가 코팅된 전기방사된 PLGA와 접촉할 수 있다. 금속 랙 상에서 유지된, 코팅된 전기방사된 PLGA의 기저부가 배지과 접촉하도록 배양 접시에서 배지의 수준을 유지시켰고, 케라티노사이트 및 섬유모세포가 시딩되었을 때 코팅된 전기방사된 PLGA의 상부 표면이 공기에 노출되어 공기-액체 계면을 생성하였다.
2 내지 3일마다 완전 배지를 변화시키면서 세포를 ALI에서 14일 동안 배양하였다.
14일 후에 피부 조직을 분석을 위해서 수확하였다.
분석
각각의 피부의 샘플을 모든 케라티노사이트 세포의 마커인 판-사이토케라틴에 대한 항체로 염색하여 표피 품질을 평가하였고, 섬유모세포의 마커인 비멘틴에 대한 항체로 염색하여 피부 품질을 평가하였고, 형광 현미경법에 의해서 관찰하였다.
각각의 동결된 피부 샘플의 5㎛ 두께의 단면을 아세톤으로 고정시키고, 0.25% 카제인 용액으로 차단시켰다. 1% 우태아 혈청(FBS)을 함유하는 트리스 완충 염수(TBS) 용액 중의 판-사이토케라틴, 또는 비멘틴에 대한 1차 항체로 샘플 구획을 피복하였다. 샘플을 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 TBS로 1회 세척하고, 이어서 로킹으로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 핵 염색제 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유하는 1% FBS를 갖는 TBS 중의, 알렉사 488 염료가 접합된 각각의 1차 항체에 대해서 특이적인 2차 항체로 샘플 구획을 피복하였다. 샘플을 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 TBS로 1회 세척하고, 이어서 로킹으로 각각 15분 동안 2회 세척하였다. 샘플을 프로롱 골드 적재 용액으로 피복하고, 상부 상에 커버슬립을 놓았다. 형광 현미경을 사용하여 DAPI 염색제 및 각각의 알렉사 488 염색제의 모든 샘플에 대해서 영상을 수득하였다.
2. 결과
방법 (1), (2) 및 (3) 모두는 피층의 상부 상에 중층 표피를 갖는 피층을 포함하는 전층 피부를 생산하였다. 섬유모세포 마커 비멘틴에 대한 양성 염색에 의해서 증명되는 바와 같이, 피층은 생산된 피부의 하부층이었다. 피층은 3개의 방법 모두에 의해서 생산된 피부 조직에 대해서 단일 세포 두께였다.
3개의 방법 모두에 의해서 생산된 피부 조직의 경우 피층 상부에 중충 표피층이 형성되었다. 표피는 케라티노사이트 마커 판-사이토케라틴에 대한 양성 염색에 의해서 증명되는 바와 같이, 케라티노사이트의 다수의 층을 포함하였다. 사이토케라틴의 층형성으로부터의 피부 샘플의 판-사이토케라틴 염색에서 표피의 층화가 관찰되었다. 기저층 내의 케라티노사이트는 원형이었고, 각질층이 상부층을 형성할 때까지 중간층에서 평탄해졌다.
표피의 층화는 또한 표피의 층 내에서, DAPI 염색에 의해서 보이는, 케라티노사이트 세포 핵의 모폴로지에 의해서 예증되었다. 표피의 기저층에서, 케라티노사이트 세포 핵은 원형이었고, 이는 증식이 가능한 건강한 기저 케라티노사이트를 나타낸다. 표피층을 통해서 상향으로, 케라티노사이트 세포 핵은 평탄하였는데, 이는 이들이 분화를 달성하는 데 필요한 분화 과정을 겪었다는 것을 나타낸다. 케라티노사이트 세포가 이의 분화 과정을 완결한 상부층에서, 세포 핵은 매우 얇거나 또는 완전히 사라져서, 죽은 케라티노사이트 세포로 이루어진 각질층 층을 생성하였다.
본 발명의 장치 및 방법은 피부 이식 및 약제학적 제품 및 화장품 제품의 시험을 비롯한, 광범위한 치료적, 약제학적, 화장품, 뉴트라슈티컬 및 다른 실험실 응용을 갖는 다수의 세포 및 조직의 조작을 위한 유용성을 갖는다.

Claims (65)

  1. 세포 또는 조직을 배양하는 장치로서,
    제1 단부벽(하부), 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기,
    상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및
    세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하되,
    상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부) 중 적어도 하나의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 (a) 상기 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되지 않은 제1 모드와, (b) 상기 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드 사이에서 구성 가능한, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  2. 세포 또는 조직을 배양하는 장치로서,
    제1 단부벽(하부) 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기로서, 상기 하부의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 상기 용기;
    상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)으로서, 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분 또는 상기 적어도 하나의 측벽의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 상기 탈착 가능한 제2 단부벽; 및
    세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드로서, (a) 상기 스캐폴드의 실질적인 선형 이동을 상기 챔버의 상기 제1 단부벽(하부)과 상기 제2 단부벽(상부) 사이에서 적어도 어느 정도 허용하고, 상기 적어도 하나의 측벽에 수직인 축에 대한 상기 스캐폴드의 회전 또는 반전을 제한하거나, 또는 (b) 상기 적어도 하나의 측벽에 수직인 축에 대한 상기 스캐폴드의 회전 이동을 허용하도록 상기 적어도 하나의 측벽과 맞물린, 상기 스캐폴드를 포함하는, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  3. 세포 또는 조직을 배양하는 장치로서,
    하부 및 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기로서, 상기 하부의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 상기 용기;
    상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 상부로서, 상기 상기의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공된, 상기 탈착 가능한 상부; 및
    세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드로서, (a) 상기 스캐폴드의 실질적인 선형 이동을 상기 챔버의 상기 하부와 상기 상부 사이에서 적어도 어느 정도 허용하고, (b) 상기 적어도 하나의 측벽에 수직인 축에 대한 상기 스캐폴드의 회전 또는 반전을 제한하도록 상기 적어도 하나의 측벽과 맞물린, 상기 스캐폴드를 포함하는, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  4. 제1 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사용 시에, 그리고 기체 침투성 재료가 상기 하부 및 상기 상부 둘 모두에 존재하는 경우, 상기 챔버는 환경으로부터 액체 밀봉 가능하지만, 환경과 기체 소통하는, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기체 침투성 재료는 기체 침투성 막인, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 기체 침투성 재료는 폴리다이메틸실록산인, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 상기 기질의 대향하는 평면 측면 상에 배양 표면을 제공하도록 상기 기질을 수용하는, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 생체 적합성 재료, 예컨대 생체 적합성 막인, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 기체 침투성인, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 기체-불침투성인, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 폴리(락트 코-글리콜산)(PLGA)이거나 이를 포함하는, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 기질은 전기방사된(electrospun) PLGA이거나 이를 포함하는, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 세포 접착, 세포 이동, 또는 조직 층화(stratification)를 개선시키기 위해서 처리된 표면을 포함하는, 세포 또는 조직을 배양하는 장치.
  14. 하기 단계들을 포함하는, 세포를 배양하는 방법:
    a) 배양될 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
    b) 상기 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하되,
    적어도 상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 상기 기질이 상기 현탁물 중에 잠기고, 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상기 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    d) 상기 세포 배양 장치를 상기 기질이 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
    e) 상기 세포 배양 장치를 세포 융합, 조직 층화, 또는 조직 성장 중 하나 이상을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
  15. 하기 단계들을 포함하는, 기질 상에서 세포의 하나 이상의 융합층(confluent layer)을 배양하는 방법:
    a) 배양될 상기 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
    b) 상기 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
    상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고, 그리고
    상기 장치는 상기 기질이 상기 현탁물 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하지 않는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상기 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    d) 상기 세포 배양 장치를 상기 기질이 상기 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
    e) 상기 세포 배양 장치를 세포의 하나 이상의 융합층을 형성하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계로서, 세포의 상기 하나 이상의 융합층은 상기 기질의 적어도 부분 상에 배치된, 상기 인큐베이션시키는 단계.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 장치는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 장치인, 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 현탁물은 상기 챔버 내에 존재하는 접근 포트를 통해서 도입되는, 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 상피 세포, 예를 들어, 케라티노사이트(keratinocyte)를 포함하는, 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법.
  19. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 섬유모세포, 또는 케라티노사이트 및 섬유모세포를 포함하는, 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)와 단계 e) 사이에 하기 추가 단계를 포함하는, 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법:
    f) 배양될 세포를 포함하는 제2 현탁물을 예를 들어 접근 포트를 통해서 도입하는 단계; 및
    g) 상기 제2 현탁물을 포함하는 상기 세포 배양 장치를 상기 제2 현탁물 중의 상기 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계; 및 임의로
    h) 상기 기질 또는 상기 세포를 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치하도록 상기 세포 배양 장치를 개작하는 단계.
  21. 제20항에 있어서, 단계 f) 내지 단계 h)의 1회 이상의 반복을 포함하는, 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 제2 현탁물은 상기 제1 현탁물 중에 존재하는 것과 상이한 1종 이상의 세포 유형을 포함하는, 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 현탁물은 섬유모세포를 포함하고, 상기 제2 현탁물은 케라티노사이트를 포함하는, 세포의 하나 이상의 융합층을 배양하는 방법.
  24. 하기 단계들을 포함하는, 조직을 배양하는 방법:
    a) 상피 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
    b) 상기 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 상기 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하고, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
    상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 상기 기질이 상기 현탁물 중에 잠기고, 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상기 상피 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    d) 상기 세포 배양 장치를 상기 기질 및/또는 상기 세포가 상기 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
    e) 상기 세포 배양 장치를 세포 분화 또는 층화 또는 상피 조직 발생이 일어나는 것을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
  25. 제24항에 있어서, 단계 b) 이후에 하기 추가 단계 중 하나 이상을 더 포함하는, 조직을 배양하는 방법:
    f) 상기 장치로부터 상기 조직 배양 배지를 제거하는 단계;
    g) 상기 기질의 상기 표면을 세척하여 미접착된 세포를 제거하는 단계; 및/또는
    h) 새로운 조직 배양 배지를 상기 장치에 첨가하는 단계.
  26. 하기 단계들을 포함하는, 중층 상피 조직(stratified epithelial tissue)을 배양하는 방법:
    a) 세포를 포함하는 제1 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
    b) 상기 제1 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하되, 상기 챔버는 주입 포트, 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
    상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 상기 기질이 현탁물 중에 잠기고 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상기 제1 현탁물 중의 상기 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    d) 임의로 상기 세포 배양 장치를 상기 기질이 상기 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되지 않은 제2 모드로 개작하는 단계;
    e) 상피 세포를 포함하는 제2 현탁물을 상기 주입 포트를 통해서 상기 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
    f) 상기 제2 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상기 상피 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    g) 상기 세포 배양 장치를 상기 기질 및/또는 상기 상피 세포가 상기 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 상기 제1 모드로 개작하는 단계; 및
    h) 상기 세포 배양 장치를 상피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
  27. 하기 단계들을 포함하는, 중층 표피 조직(stratified epidermal tissue) 또는 전층 피부 조직을 배양하는 방법:
    a) 케라티노사이트 및 섬유모세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
    b) 상기 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 상기 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하되, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부), 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
    상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 상기 기질이 상기 현탁물 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 존재하지 않는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상기 케라티노사이트 및/또는 섬유모세포의 적어도 일부가 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    d) 상기 세포 배양 장치를 상기 기질 및/또는 상기 세포가 상기 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계; 및
    e) 상기 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나는 것을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
  28. 하기 단계들을 포함하는, 전층 피부 조직 또는 중층 표피 조직을 배양하는 방법:
    a) 섬유모세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
    b) 상기 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하되, 상기 챔버는 주입 포트, 및 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
    상기 1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 상기 기질이 상기 현탁물 중에 잠기고 임의로 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 섬유모세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    d) 임의로 상기 세포 배양 장치를 상기 기질이 상기 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되지 않은 제2 모드로 개작하는 단계;
    e) 케라티노사이트를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 상기 주입 포트를 통해서 상기 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
    f) 상기 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상기 케라티노사이트의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    g) 상기 세포 배양 장치를 상기 기질 및/또는 상기 케라티노사이트가 상기 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 상기 제1 모드로 개작하는 단계;
    h) 상기 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
  29. 하기 단계들을 포함하는, 중층 상피 조직을 배양하는 방법.
    a) 상피 세포를 포함하는 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 제공하는 단계;
    b) 상기 현탁물을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하되, 상기 챔버는 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하고,
    상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 상기 기질이 상기 현탁물 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하지 않는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 현탁물을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상피 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    d) 상기 세포 배양 장치를 상기 기질이 기체 침투성 재료와 기체 소통하게 배치되는 제2 모드로 개작하는 단계;
    e) 상기 세포 배양 장치를 상피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
  30. 하기 단계들을 포함하는, 중층 상피 조직을 배양하는 방법:
    a) 기질의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 접착된 상피 세포 또는 상피 세포를 포함하는 조직을 제공하는 단계;
    b) 상기 접착된 상피 세포 또는 상피 세포를 포함하는 조직을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하되, 상기 세포 배양 장치는 배양 배지를 함유하고,
    상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 상기 기질, 접착된 상피 세포 및/또는 상피 세포를 포함하는 조직이 상기 배지 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 접착된 상피 세포 또는 상피 세포를 포함는 조직을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 상피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
  31. 제30항에 있어서, 상기 접착된 상피 세포는 케라티노사이트이고, 상기 중층 상피 조직은 중층 표피 조직인, 중층 상피 조직을 배양하는 방법.
  32. 하기 단계들을 포함하는, 전층 피부 조직을 배양하는 방법:
    a) 기질의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 접착된 세포 또는 조직을 제공하는 단계;
    b) 상기 접착된 세포 또는 조직을 세포 배양 장치에 도입하는 단계로서, 상기 장치는 제1 단부벽(하부), 적어도 하나의 측벽을 포함하는 용기, 및 상기 용기와 맞물려서 챔버를 한정하도록 개작된 탈착 가능한 제2 단부벽(상부)을 포함하되, 상기 세포 배양 장치는 배양 배지를 함유하고;
    상기 제1 단부벽(하부), 상기 적어도 하나의 측벽, 또는 상기 제2 단부벽(상부)의 적어도 일부분은 기체 침투성 재료를 포함하거나 또는 기체 침투성 재료와 맞물리도록 개작되고, 기체 교환을 허용하도록 천공되고,
    상기 장치는 상기 기질, 접착된 세포 및/또는 조직이 상기 배지 중에 잠기고, 기체 침투성 재료와 기체 소통하는 제1 모드로 존재하는, 상기 도입하는 단계;
    c) 상기 접착된 세포 또는 조직을 함유하는 상기 세포 배양 장치를 표피 층화 및/또는 전층 피부의 생성이 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
  33. 제32항에 있어서, 상기 접착된 세포는 기질의 상기 표면의 적어도 일부분에 부착되는, 전층 피부 조직을 배양하는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 접착된 세포 또는 조직은 섬유모세포, 케라티노사이트, 또는 섬유모세포 및 케라티노사이트를 포함하는, 전층 피부 조직을 배양하는 방법.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 장치인, 방법.
  36. 하기 단계들을 포함하는, 생체 적합성 기질 상에서 세포를 배양하는 방법:
    a) 적어도 하나의 기체 침투성 표면을 갖는 챔버를 제공하는 단계로서, 상기 챔버는 실질적으로 평면인 생체 적합성 기체 침투성 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하되, 상기 스캐폴드는 제1 위치로부터 상기 기체 침투성 표면에 또는 그 근처에 존재하고 상기 기체 침투성 표면과 기체 소통하는 제2 위치로의 실질적인 선형 이동이 가능한, 상기 제공하는 단계;
    b) 상기 스캐폴드가 상기 챔버 내에서 액체 불침투성 부피를 한정하는 제1 위치에 존재하도록 챔버를 제1 모드로 제공하고, 상기 부피에 배양될 세포를 포함하는 현탁물을 도입하는 단계;
    c) 세포를 포함하는 제1 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 상기 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
    d) 상기 챔버를 상기 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    e) 상기 스캐폴드가 상기 챔버 내에서 액체 불침투성 부피를 한정하는 상기 제2 위치에 존재하도록 상기 챔버를 제2 모드로 제공하는 단계로서, 상기 기질은 상기 기체 침투성 표면과 기체 소통하는, 상기 제공하는 단계; 및
    f) 임의로 세포를 포함하는 제2 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 상기 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
    g) 상기 챔버를 세포의 하나 이상의 융합층의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계로서, 세포의 상기 하나 이상의 융합층은 상기 기질의 적어도 부분 상에 배치된, 상기 인큐베이션시키는 단계.
  37. 제36항에 있어서, 상기 방법은 상피 세포, 표피 세포를 배양하는 방법 또는 상피 세포 및 표피 세포 둘 모두를 배양하는 방법인, 생체 적합성 기질 상에서 세포를 배양하는 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 제1 현탁물은 섬유모세포 및 케라티노사이트를 포함하는, 생체 적합성 기질 상에서 세포를 배양하는 방법.
  39. 하기 단계들을 포함하는, 생체 적합성 기질 상에서 세포를 배양하는 방법:
    a) 적어도 2개의 기체 침투성 표면을 갖는 챔버를 제공하는 단계로서, 상기 챔버는 실질적으로 평면인 생체 적합성 기체 침투성 기질을 수용하도록 개작된 스캐폴드를 포함하되, 상기 스캐폴드는 제1 기체 침투성 표면에 또는 그 근처에 존재하고 제1 기체 침투성 표면과 기체 소통하는 제1 위치로부터, 제2 기체 침투성 표면에 또는 그 근처에 존재하고 제2 기체 침투성 표면과 기체 소통하는 제2 위치로의 실질적인 선형 이동이 가능한, 상기 챔버를 제공하는 단계;
    b) 상기 스캐폴드가 상기 챔버 내에서 액체 불침투성 부피를 한정하는 상기 제1 위치에 존재하도록 상기 챔버를 제1 모드로 제공하는 단계로서, 상기 기질은 상기 제1 기체 침투성 표면과 기체 소통하는, 상기 제1 모드로 제공하는 단계, 세포를 포함하는 제1 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 상기 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
    c) 상기 챔버를 상기 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하는 것을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계;
    d) 상기 스캐폴드가 상기 챔버 내에서 액체 불침투성 부피를 한정하는 상기 제2 위치에 존재하도록 상기 챔버를 제2 모드로 제공하는 단계로서, 상기 기질은 상기 제2 기체 침투성 표면과 기체 소통하는, 상기 제2 모드로 제공하는 단계; 및
    e) 세포를 포함하는 제2 현탁물을 세포 성장을 지지하기에 충분한 조직 배양 배지의 양으로 상기 세포 배양 장치에 도입하는 단계;
    f) 상기 챔버를 상기 세포의 적어도 일부가 상기 기질에 접착하는 것을 허용하고, 세포의 하나 이상의 융합층의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계로서, 세포의 상기 하나 이상의 융합층은 상기 기질의 적어도 부분 상에 배치된, 단계.
  40. 제14항 내지 제25항 또는 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조되거나 또는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 배양 장치에서 제조된 세포.
  41. 제14항 내지 제25항 또는 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조되거나 또는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 배양 장치에서 제조된 조직.
  42. 제41항에 있어서, 상기 조직은 상피 조직, 중층 상피 조직, 표피, 중층 표피, 중층 표피 및 진피, 또는 전층 피부인 조직.
  43. 제41항에 있어서, 섬유모세포를 포함하는 피층(dermal layer), 케라티노사이트를 포함하는 중층 표피층 및 생체 적합성 기질을 포함하는 조직.
  44. 조직 손상의 치료를 필요로 하는 대상체에서 조직 손상을 치료하는 데 있어서의 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 조직의 용도.
  45. 제44항에 있어서, 상기 치료는 상처, 화상, 반흔 또는 수술 반흔에 대한 것인, 조직의 용도.
  46. 하기 단계들을 포함하는, 조직 손상의 치료를 필요로 하는 환자에서 조직 손상을 치료하는 방법:
    a) 조직이 성장된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 장치를 제공하는 단계 또는 조직이 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 성장된 장치를 제공하는 단계;
    b) 멸균 조건 하에서 상기 조직을 상기 장치로부터 회수하는 단계; 및
    c) 상기 조직을 대상체에 적용하는 단계.
  47. 하기 단계들을 포함하는, 상피 조직을 포함하는 구조체를 조작하는 방법:
    a) 조직이 제24항 내지 항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 성장된 장치를 제공하는 단계;
    b) 멸균 조건 하에서 상기 조직을 상기 장치로부터 회수하는 단계; 및
    c) 상기 회수된 조직을 처리하여 상기 구조체를 형성하는 단계.
  48. 하기 단계들을 포함하는, 상피 조직을 포함하는 구조체를 조작하는 방법:
    a) 조직이 성장된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 장치를 제공하는 단계 또는 조직이 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 성장된 장치를 제공하는 단계;
    b) 멸균 조건 하에서 상기 조직을 상기 장치로부터 회수하는 단계;
    c) 상기 조직을 대상체에 적용하는 단계; 및
    d) 상기 조직을 처리하여 구조체를 형성하는 단계.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 조직은 상피 조직, 중층 상피 조직, 표피, 또는 중층 표피인, 상피 조직을 포함하는 구조체를 조작하는 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조체는 턱밑샘의 관, 부착 치은, 설배, 경구개, 식도, 위, 대장, 소장, 직장, 항문, 담낭, 갑상샘 소포, 피부, 땀샘관, 체강의 중피, 난소, 난관, 자궁, 자궁 경부, 질, 대음순, 직세관, 정소망, 고환수출세관, 부고환, 정관, 사정관, 요도구샘, 정낭, 인두, 후두, 후두, 성대, 기관(trachea), 기관지, 각막, 코, 신장의 근위곡 요세관, 신장의 상행 가는 가지(ascending thin limb), 신장의 원위곡 요세관, 신장의 집합관, 신우, 요관, 방광, 전립선 요도, 막 요도, 음경 요도, 또는 외요도구를 포함하는, 상피 조직을 포함하는 구조체를 조작하는 방법.
  51. 하기 단계들을 포함하는, 조직에 대한 화합물 또는 조성물의 독성을 시험하는 방법:
    a) 조직이 성장된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 장치를 제공하는 단계 또는 조직이 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 성장된 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 화합물 또는 상기 조성물을 상기 조직에 적용하는 단계; 및
    c) 조직 손상 또는 상기 조직에 대한 세포 사멸이 일어나는지의 여부를 평가하는 단계.
  52. 하기 단계들을 포함하는, 화합물 또는 조성물의 조직 침투성, 예를 들어 경피 침투성을 시험하는 방법:
    a) 조직이 성장된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 장치를 제공하는 단계 또는 조직이 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 성장된 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 화합물 또는 상기 조성물을 상기 조직에 적용하는 단계; 및
    c) 상기 화합물 또는 상기 조성물의 상기 조직을 통한 상기 침투성을 평가하는 단계.
  53. 하기 단계들을 포함하는, 조직에서 변화를 달성하기 위한 화합물 또는 화장품, 치료 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 조성물의 효능을 시험하는 방법:
    a) 조직이 성장된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 장치를 제공하는 단계, 또는 조직이 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 성장된 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 화합물 또는 상기 조성물을 상기 조직에 적용하는 단계; 및
    c) 상기 조직에서 변화를 달성하는 상기 화합물 또는 상기 조성물의 효능을 평가하는 단계.
  54. 적어도 하나의 기체 침투성 계면을 포함하는 배양 장치에서 세포 또는 조직을 배양하기 위한 스캐폴드로서,
    내부 둘레 및 외부 둘레를 한정하는 프레임으로서, 실질적으로 평면인 상단 표면을 포함하는, 상기 프레임,
    상기 프레임의 상기 내부 둘레를 가로질러서 실질적으로 평면인 배열로 보유된 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 포함하되,
    상기 스캐폴드는 상기 스캐폴드가 적어도 하나의 기체 침투성 계면을 포함하는 배양 장치에 배치되는 경우 상기 기질 또는 상기 기질 상에 존재하는 상기 세포 또는 상기 조직의 실질적인 전부를 기체 침투성 계면과 접촉시키도록 구성된, 스캐폴드.
  55. 세포 또는 조직을 배양하기 위한 스캐폴드로서, 세포가 상부에 놓이기 위한 기질을 수용하도록 개작되고, 상기 스캐폴드는,
    내부 둘레 및 외부 둘레를 한정하는 제1 프레임으로서, 실질적으로 평면인 상단 표면을 포함하는, 상기 제1 프레임, 및
    내부 둘레 및 외부 둘레를 한정하는 제2 프레임으로서, 실질적으로 평면인 상단 표면을 포함하는, 상기 제2 프레임을 포함하되,
    상기 제1 프레임 및 상기 제2 프레임은 계면을 한정하여 상기 기질을 수용 및 보유하도록 이의 둘레의 적어도 일부분 주위에서 탈착 가능하게 맞물리고,
    보유되는 경우 상기 기질은 상기 제1 프레임의 상기 내부 둘레를 가로지르는 실질적으로 평면인 배열로 보유되고,
    맞물리는 경우, 상기 제1 프레임의 상기 상단 표면 및 상기 제2 프레임의 상기 상단 표면은 실질적으로 동일 평면에 존재하는, 스캐폴드.
  56. 제55항에 있어서, 상기 제2 프레임의 이의 상단 표면에서의 상기 내부 둘레의 상기 치수는 상기 제1 프레임의 이의 상단 표면에서의 상기 외부 둘레의 상기 치수보다 더 커서, 상기 제2 프레임은 상기 제1 프레임의 적어도 상기 상단 표면에서 상기 제1 프레임의 상기 외부 둘레 주위에서 맞물린, 스캐폴드.
  57. 제55항에 있어서, 상기 기질은 상기 제1 프레임의 상기 상단 표면에서 상기 스캐폴드의 상기 내부 둘레를 가로질러서 실질적으로 평면인 배열로 보유되고, 이에 의해서 상기 기질의 상기 상단 표면과, 예를 들어 기체 침투성 계면의 직접적인 접촉이 허용되는, 스캐폴드.
  58. 제55항에 있어서, 상기 기질은 상기 제2 프레임에 대한 상기 제1 프레임의 마찰 정합 맞물림(friction fit engagement)에 의해서 상기 제1 프레임과 상기 제2 프레임 사이에 보유되는, 스캐폴드.
  59. 제59항에 있어서, 상기 마찰 정합 맞물림은 그것이 상기 기질을 단단히 클램핑시켜서 상기 기질을 상기 스캐폴드의 상기 내부 둘레를 가로질러서 실질적으로 평면인 배열로 유지시키도록 하는, 스캐폴드.
  60. 제55항에 있어서, 상기 기질은 상기 제1 프레임과 상기 제2 프레임 사이에 연장된 하나 이상의 돌출부에 의해서 적어도 부분적으로 상기 제1 프레임과 상기 제2 프레임 사이에 보유되는, 스캐폴드.
  61. 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 스캐폴드의 상기 하단 표면은 상기 스캐폴드의 상기 외부 둘레 및 상기 인접한 내부 둘레에 걸쳐있는 적어도 하나의 구획을 포함하고, 상기 구획은 상기 스캐폴드의 상기 상단 표면을 향해서 융기된 하단 표면을 갖되, 상기 구획은 상기 스캐폴드가 평탄한 표면 상에 배치되는 경우 공극(void)를 한정하는, 스캐폴드.
  62. 제61항에 있어서, 상기 구획은 상기 스캐폴드가 잠긴 배양물 중에 존재하는 경우 공기 방울의 용이한 제거를 허용하기 위해서 제공된 리세스(554)를 한정하는, 스캐폴드.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드의 상기 내부 둘레의 상기 치수는 이의 상단 표면에서 상기 스캐폴드에 의해서 보유된 상기 기질 또는 상기 기질 상에 존재하는 상기 세포 또는 조직과 접촉하는 상기 기체 침투성 계면 중 하나 이상의 상기 치수보다 더 커서, 상기 기질 또는 상기 기질 상에 존재하는 상기 세포 또는 조직의 실질적으로 전부가 상기 기체 침투성 계면과 접촉할 수 있는, 스캐폴드.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 상기 기질을 위한 지지를 제공하도록 상기 내부 둘레에 걸쳐있는 하나 이상의 횡 부재를 포함하는, 스캐폴드.
  65. 하기 단계들을 포함하는, 중층 표피 조직을 생산하는 방법:
    a) 기질을 제공하는 단계로서, 접착된 케라티노사이트가 상기 기질의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된, 상기 기질을 제공하는 단계;
    b) 적어도 하나의 기체 침투성 계면을 포함하는 세포 배양 장치를 제공하는 단계;
    c) 상기 케라티노사이트가 상기 기체 침투성 계면과 접촉하도록 상기 기질을 상기 장치에 도입하는 단계;
    d) 상기 세포 배양 장치를 표피 층화가 일어나기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시키는 단계.
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