PT91676A - Three-dimensional cell and tissue culture system - Google Patents

Description

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-2- MEMORIA descritiva

J 0 presente invento é uma continuação parcial do pedido de patente copendente n9. de séria 07/242096 depositado em 8 de Setembro de 1988; que é uma continuação parcial do nS. de série 038 110 depositado em 14 de Abril de 1987» que é uma continuação parcial do nS. de série 036 154 depositado em 3 de Abril de 1987, que deu origem à Patente dos E.U.A. n2. 4 721 086 em 26 de Oanei-ro de 1988; que é uma continuação parcial do nQ. de série 853 569 depositado em 18 de Abril de 1986, abandonado; cada um dos quais é aqui incorporado como referência na sua integridade.

1. INTRODUÇÃO 0 presente invento é dirigido a um sistema tridimensional de cultura de células e de tecidos. Este sistema- de cultura pode ser usado para a proliferação, por períodos prolongados de células e de tecidos _in vitro num ambiente que mais de perto se aproxima ao que se encontra _in vivo. 0 sistema de cultura que aqui se descreve permite que a proliferação e maturação apropriada de células formem estruturas análogas aos tecidos corresponderi tes jln vivo.

As culturas resultantes têm uma variedade de aplicaçães desde a transplantação ou implantação jln vivo até à determinação dos compostos e dos compostos farmacêuticos citotoxicos _in vitro t e na produção de moléculas biologicamente activas em reactores biológicos. 0 presente invento é demonstrado por exemplos que descrevem a cultura tridimensional de medúla óssea, pele, fígado, epitélio de mucosa, pâncreas e adenocarcinoma e por outros exemplos que mostram a utilização de sistemas de cultura tridimensionais em ensaios de citotoxicidade, num sistema., modelo da barreira sangue-cérebro e em transplantes de pele.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A maior parte das culturas de células de vertebrados in vitro crescem em mono-camadas num substrato artificial banhado num meio nutriente. A natureza do substrato onde as mono-camadas

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-3- se desenvolvem pode ser sólida, por exemplo -de plástico» ou semi--sólida, por exemplo de geles» tais como o colagénio ou o agar.

Os plásticos descartáveis têm-se tornado os substratos preferidos usados nas modernas culturas da células ou de tecidos.

Alguns investigadores têm explorado o uso de substratos naturais relacionados com componentes de membrana de base, As membranas de base compreendem uma mistura de glicoproteinas e de proteoglicanos que rodeam a maior parte das células jin vivo. Por exemplo» Reid e Rojkund (1979» em» Methods in Enzymology, l/ol. 57, Cell Culture, Oakoby & Pasten» eds.» New York, Acad. Press, págs. 263-278); l/lodavsky et al.» (1980, Cell 19:607-617), Yang et al, , (1979, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:3401) têm usado colagénio pa, ra cultivar hepatocitos, células epiteliais e tecido endotelial. 0 crescimento de células em colagénio flutuante (Michalopoulos e Pitot, 1975, Fed. Proc. 34:826) em em membranas de nitrato de celulose (Savage e Bonney, 1978, Exp. Cell Res. 114:307-315) tem sji do usado em tentativas para promover a diferenciação terminal. Contudo, a regeneração celular prolongada e a cultura destes teci. dos nestes sistemas não foi até agora conseguida.

Têm-se usado culturas de fibroblastos de embrião de ratinho para melhorar o crescimento de células, particularmente para baixas densidades. Pensa-se que este efeito seja devido, parcia_l mente, à suplementação do meio, mas pode também ser devido ao coj] dicionamento do substrato pelos produtos celulares. Nestes sistemas ,as camadas alimentadoras ds fibroblastos são cultivadas co mo mono-camadas confluentes que tornam a superfície adequada para a ligação de outras células. Por exemplo, foi descrito (Lindsay, 1979, Nature 228:80), o crescimento de glioma em camadas alimenta doras confluentes de intestino fetal normal.

Enquanto que o crescimento de células em duas dimensBes é um método conveniente para a preparação, observação e estudo das células em cultura, permitindo uma velocidade de proliferação das células elevada, carece das interacçBes célula-célula e célula-ma triz caracterlsticas dos tecidos inteiros in vivo. Por forma a e_s tudar estas interacçBes funcionais e morfológicas, alguns investi -4- 69 900 6261-031-118 ί* gadores têm explorado o uso de substratos tridimensionais tais como, gel de colagénio (Douglas et al., 1980, In Vitro 16:306-312 Yang et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. 76:3401; Yang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. 77:2088-2092; Yang et al., 1981, Câncer Res. 41:1021-1027); esponja de celulose sozinha (Leighton et al. , 1951, 0. Natl. Câncer Inst. 12:545-561) ou revestida a co lagénio (Leighton et al., 1968, Câncer Res. 28:286-296); e numa esponja de gelatina, Gelfoam (Sorour et al., 1975, 0. Neurosurg. 43:742-749).

Geralmente, estes substratos tridimensionais sSo inoculados com as células a serem cultivadas. Tem-se descrito que muitos dos tipos de células penetram a matriz e estabelecem uma histologia do tipo da dos tecidos. Por exemplo, têm-se utilizado gj3 les de colagénio tri-dimensionais para cultivar células de epité-lio de peito (Yang et al., 1981, Câncer Res. 41:1021-1027) e neu-rónios simpáticos (Ebendal, 1976, Exp. Cell Res. 98:159-169). Adicionalmente, têm sido feitas várias tentativas para regenar a arquitectura idêntica à dos tecidos a partir de culturas de mono--camadas dispersas. Kruse e Miedema (1965, 0. Cell Biol. 27:273) descrevem que mono-camadas cobertas podiam crescer em mais do que dez células de profundidade e que se podiam desenvolver estruturas organóides em culturas de multicamadas se estas fossem mantidas com meio apropriado (ver também Schneider et al., 1963, Exp. Cell Res. 30:449-459 e Bell et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:1274-1279); Green (1978, Science 200:1385-1388) descreve que queratinocitos de epiderme humana podem formar dematoglifos (arestas de fricção) se mantidas durante várias semanas sem trans ferência; Folkman e Haudenschild (1980, Nature 288:551-556) descrevem a formação de túbulos capilares em culturas de células en-doteliais vasculares cultivadas na presença de factor de crescimento endotelial e de meio condicionado por células de tumor; e Sirica et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:283-287; 1980, Câncer Res. 40:3259-3267) mantiveram hepatocitos em cultura primária durante cerca de 10-13 dias em redes de "nylon" revestidas com uma camada fina de colagénio. Porém ainda não se conseguiu nestes sistemas a cultura e a proliferação de células durar» 69 900 6261-031-118

-5-te um período prolongado.

De facto, tem sido tentado o estabelecimento de cultura de tecidos de medúla óssea por períodos de tempo prolongados. Os resultados globais foram desapontantes pelo facto de, se bem que se tenha formado rapidamente uma camada de células de estroma contendo diferentes tipos de células, não se conseguiu manter uma hematopoiese significativa durante qualquer período de tempo real. (Ver, por exemplo, Dexter et al., em Long Term Bone Marrom Culture, 1984, Alan R. Liss, Inc., págs. 57-96).

3. SUMARIO DA INVENÇÃO 0 presente invento refere-se a um sistema tri-dimensional de cultura de células que pode ser usado para cultivar uma variedade de células e de tecidos diferentes _in vitro por períodos de tempo prolongados. De acordo com o presente invento inoculam-se células obtidas a partir de um tecido desejado e cultivam-se numa matriz suporte de estroma pré-estabelecida. A matriz suporte de estroma compreende células de estroma, tais como fibroblastos crescendo activamente numa matriz tri-dimensional. As células de estroma podem também incluir outras células que se encontram em vários tecidos conjuntivos tais como células endoteliais, macrofa gos/monocitos, adipocitos, pericitos, células reticulares que se encontram no estroma da medula óssea, etc.. A matriz de estroma fornece o suporte, os factores de crescimento e os factores reguladores necessários para manter a proliferação activa, a longo prazo, das células em cultura. Quando cultivadas neste sistema tri-dimensional, as células proliferantes amadurecem e segregam--se adequadamente para formar componentes de tecidos adultos análogos aos tecidos correspondentes encontrados in vivo. 0 presente invento é baseado, em parte, no facto de se ter verificado que o crescimento de células de estroma a três dimensões mantinha a proliferação activa de células em cultura por períodos de tempo mais prolongados do que em sistemas de mono-camada. Isto pode ser devido, em parte, à maior área superficiel da matriz tri-dimensional que resulta num período prolongado da 3 3

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-6- proliferação activ/a das células de estroma. . Estas células de estroma proliferantes elaboram proteínas» factores de crescimento, e factores reguladores necessários para suportar a proliferação por períodos prolongados das células de estroma e das células específicas de tecido inoculadas na matriz de estroma. Adicionalmente, o espaço a três dimensões da matriz permita uma distribuição espacial que mais de perto se aproxima das condições _in vivo, permitindo assim a formação de micro-ambientes conducentes à matu Λ

ração e a migração celular. 0 crescimento de células na presença deste suporte pode ainda ser melhorado pela adição de proteínas, glicoproteinas, glicosaminoglicanos, de uma matriz celular e de outros materiais ao próprio suporte ou revestindo o suporte com estes materiais. 0 uso de um suporte tri-dimensional permite que as células cresçam em múltiplas camadas, criando-se assim o sistema de cultura de células tri-dimensional do presente invento. Neste sistema de cultura tri-dimensional podem cultivar-se muitos tipos de células e de tecidos.

Em concretizações específicas do presente invento podem cultivar-se, no sistema de cultura tri-dimensional, medula óssea, tecidos de pele, fígado, pâncreas, epitélio de mucosa, adenocarci, noma e melanoma.

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Adicionalmente, podem usar-se as culturas resultantes como sistemas modelo para o estudo de condições fisiológicas e patológicas. Por exemplo, numa concretização específica da invenção, pode usar-se um sistema de cultura tri-dimensional como modelo para a barreira sangue-cérebro. Numa concretização específj-ca adicional e não como limitação, pode usar-se uma cultura tri--dimensional de epitélio de mucosa coma sistema modelo para o estudo de infecção por herpesvírus ou papiloma vírus. As culturas resultantes têm uma variedade de aplicações, desde a transplantação ou implantação, in vivo, de células desenvolvidas em culturas, testes de citotoxicidade e análise de compostos _in vitro. até ao projecto de reactorBs biológicos para a produção de materiais bio lógicos in vitro. -7-

69 900 6261-031-118 3.1 DEFINIÇÕES E ABREVIATURAS

Os termos seguintes aqui utilizados deverão ter os significados que se indicam:

Camada aderente: células ligadas directamente à matriz tri-dimensional ou ligadas indirectaroente por ligação a células que estão elas próprias ligadas directamente à matriz. Células de estroma: fibroblastos com ou sem outras células e/ou elementos que se encontram em vários tecidos conjuntivos, incluindo, mas não limitados a, células endoteliais, pericitos, macrofagos, monocitos, células de plasma, mastocitos, adipocitos, etc.. Células especificas de tecido ou parênquimatosas: as célu las que formam o tecido essencial e distinto de um órgão tal como se distingue da sua cadeia suportante.

Matriz tri-dimensional: uma matriz tri-dimensional de qualquer material e/ou forma que (a) permite que as células se li guem a ele (ou que pode ser modificado por forma a permitir que as células se liguem a ele); e (b) permite que as células cresçam em mais do que uma camada. Este suporte é inoculado com célu las de estroma para formar a matriz de estroma tri-dimensional.

Matriz de estroma tri-dimensional: uma matriz tri-dimeri sional que foi inoculada com células de estroma. Quer confluentes, quer subconfluentes, as células de estroma de acordo com a invenção continuam a crescer e a multiplicar-se. A matriz de estroma suportará o crescimento das últimas células específicas de tecido inoculadas para formar a cultura de células tri-dimensio-nal.

Cultura de células tri-dimensional: uma matriz de estroma tri-dimensional que foi inoculada com células específicas de tecido cuja cultura se iniciou. Em geral, as células específicas de tecido usadas para inocular a matriz de estroma tri-dimensional deverão incluir as células de "raiz” (ou células de "reserva") para esse tecido; i.e. as células que geram novas células que amadurecerão transformando-se nas células especializadas que 69 900 6261-031-118

-8-formam o parenquima do tecido.

As abreviaturas seguintes terão os significados que se in dicam: BFU-E = unidades formando eclosões-eritroide CFU-C = cultura de unidades formando colónias CFll-GEMM - unidades formando colónias granuloides eritroides, mo-nocitos, megacariocitos EDTA = ácido etilenodiaminotetra-acético FBS = soro fetal de bovino HBSS = solução salina equilibrada de Hank HS « soro de cavalo LTBMC » cultura de medúla óssea de larga duração MEM = meio essencial mínimo PBL a leucócitos de sangue periférico ΡΒΞ = solução salina tamponizada com fosfata RPMI 1640 = meio do Rosuiell Park Memorial Institute número 1640 (GIBC0, Inc.» Grand Island, NY, E.U.A.) SEM = microscopia electrónica de varrimento

4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 é uma micrografia electrónica de varrimento ilus trando a ligação dos fibroblastes à matriz tri-dimensional e a ex tensão dos processos celulares através da abertura da rede. 0s fibroblastos estão segregando activamente proteínas de matriz e estão no estado apropriado de subconfluência que deverá ser obtido antes da inoculação com células especificas de tecido. A Figura 2 é uma micrografia electrónica de varrimento da LTBMC tri-dimensional demonstrando a área de rede de 210^[/,m para a expressão de colónias eritroides» mieloides e outras. As células de suporte cresceram linearmente ao longo de e envolveram a matriz tri-dimensional. A Figura 3 é um gráfico que representa o total de contagem de células das camadas aderentes e não aderentes de LTBMC tri -dimensionais durante várias semanas de cultura. As contagens to tais de células e as preparaçães de citospina da zona não aderente -9- 69 900 6261-031-118 foram efectuadas usando o meio consumido, removido quando se alimentaram as culturas de cinco em cinco dias. As contagens de células da zona aderente foram efectuadas em diferentes intervalos da LTBMC tratando a cultura de células tri-dimensional com colagjj nase e tripsina para remover as células aderentes. A proliferação celular atingiu uma condição de estado estacionário após várias semanas em cultura, 5 A Figura 4 ê Um gráfico representando o CFU-C por 10 células obtido da zona aderente da LTBMC tri-dimensional durante vá rias semanas em cultura. A Figura 5 é uma representação em diagrama do modelo de pele tri-dimensional. Está presente uma junção dérmica/epidermi-ca acima da qual se situam os melanocitos pigmentados e várias ca madas de queratinocitos contendo pigmento. As células de estroma ligam-se à matriz e formam o componente dérmico. A Figura 6 é uma micrografia electrónica de varrimento do estroma tri-dimensional três dias após a inoculação com melanocitos. Os melanocitos crescem normalmente no sistema tri-dimensional pois exibem formação de dendrite, permanecem pigmentos e retêm a capacidade para transferir pigmento para os queratinocitos. A Figura 7 é uma fotomicrografia de uma secção transversal da cultura de pele tri-dimensional corada com hematoxilina-* -eosina. E óbvia a normal morfologia e orientação das células de epiderme (E). Os componentes epidérmico e dérmico (D) rodeiam completamente a fibra da rede (M) e está presente uma junção dér-mica/epidérmica distinta. A Figura 8 é uma fotomicrografia mostrando uma área da epiderme da cultura de pele tri-dimensional corada com toluidina. Os queratinocitos (K) manifestam uma morfologia normal e contêm grânulos de pigmento (P). Observa-se uma maturação das células, com evidência de stratum corenum (SC). A Figura 9 é uma fotomicrografia do modelo de pele tri-di. mensional enxertado em ratazanas, sete dias, após o transplante. E evidente uma junção dérmica e epidérmica distinta. As células 69 900

6261-031-118 -10- mastram uma ligação firme à rede sem quaisquer sinais de rejeição. A Figura 10 é uma fotomicrografia do modelo de pele tri--dimensional enxertado em ratazanas sete dias após o transplante. Estão representados os feixes de colagénio (c) e todos os tipos de células, incluindo queratinocitos (k), fibroblastos (f), adip_o eitos (a), e células de músculo liso (s), arranjadas numa configu ração natural à volta da fibra da rede da "nylon” (m). A Figura 11 é uma fotomicrografia de culturas de fígado adulto, cultivadas pelo método de cultura tri-dimensional, formaji do um tecida de múltiplas camadas tri-dimensional em células de estroma hepáticas. A Figura 12 é uma fotomicrografia de hepatocitos dividindo-se activamente durante os primeiros dez a doze dias após a ino culaçao em culturas tri-dimensionais parecendo hepatoblastos ou células de fígado em regeneração. A Figura 13 é uma fotomicrografia de uma secção transversal de uma cultura de tecido tri-dimensional de epitélio de mucosa. A Figura 14 é uma fotomicrografia de uma secção transversal de uma cultura de tecido tri-dimensional de pâncreas. Uma se. ta aponta grânulos de zimogénio numa célula acinar. Um asterisco indica uma célula de estroma. A Figura 15 é uma fotomicrografia de uma secção transversal de um sistema modelo de cultura de tecido tri-dimensional da barreira sangue-cérebro. Uma seta fechada aponta para uma pequena célula endotelial da vaso sanguíneo pequeno. Uma seta aberta aponta para uma célula neurónica. Um asterisco indica um astroci to. A Figura 16 é uma fotomicrografia de uma secção transversal de uma cultura de tecido tri-dimensional de adenocarcinoma. A Figura 17 é um gráfico onde se compara a resposta de Fi broblastos crescendo em mono-camada com medúla de estroma e a toda a espessura crescendo no sistema da rede tri-dimensional da -11- 69 900 6261-031-118 % invenção. Os substratos mostram uma resposta a adriamicina relacionada com a dose, utilizando o ensaio de neutro-vermelho para determinar a viabilidade das células. A Figura 18 é um gráfico que representa os resultados do ensaio de neutro-vermelho mostrando uma resposta, relacionada com a dose à cis-platina por cultura tri-dimensional de estroma e de medula éssea. A Figura 19 é uma fotografia que mostra a condição da superfície de uma ferida a toda a espessura 10 dias após a implantja ção de uma neoderme humana na cobaia. l\lotou-se uma contracção mi nima sem quaisquer sinais de rejeição ou desidratação. A Figura 20 é uma fotomicrografia apresentando a avaliação histológica de uma neoderme mostrando uma secção transversal de fibras de rede, conjuntamente com fibroblastos activos e com cola génio segregado naturalmente. A Figura 21 é uma fotografia comparando feridas tratadas quer com neoderme (à esquerda) quer com rede biodegradável sozi-nha (à direita). E de notar a diminuição da contracção e o aumen to da pigmentação e do crescimento do cabelo na ferida na qual se implantou a neoderme. A Figura 22 ê uma microfotografia mostrando a avaliação histológica de uma biopsia tomada num local tratado com rede im- * pregnada em lisado de fibroblasto dérmico humano. E de notar o aumento da migração de células epiteliais a volta das fibras de rede individuais. A Figura 23 é uma fotomicrografia mostrando a avaliação histológica de um equivalente dérmico 21 dias após a implantação. As células epiteliais migraram para a superfície dérmica, ligaram -se equilibradamente, e exibem uma diferenciação e um crescimento normal. 0 crescimento de pinos de rede profundos é característi-co de pele transplantada. A resolução dos pinos de rede é observada em três a quatro meses. A Figura 24 é uma fotografia de uma ferida a toda a espes^ sura 21 dias após o tratamento com neoderme. Metade da neoderme 69 900 6261-031-118 -12- recebeu um enxerto de epitêlio cultiv/ado, autólogo. 0 enxerto epitelial sarou uniformemente, evitando uma contracção adicional e ligou-se firmemente ao equivalente dérmico da camada inferior. A Figura 25 é uma fotomicrografia mostrando a avaliação * histológica do local epidérmico/dérmico ilustrado na Figura N. E de notar o crescimento uniforme e a ligação dos queratinocitos ao equivalente dérmico. As fibras de rede são ainda evidentes 21 dias após o transplante e os fibroblastos permanecem activos entre as fibras de colagénio segregadas naturalmente.

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5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVEMÇffO: 0 SISTEMA OE CULTURA DE CÉLULAS TRI-DIMENSIONAL

0 presente invento envolve uma matriz tri-dimensional e a sua utilização como cadeia para um sistema de cultura de células tri-dimensional de multi-camadas. Em sistemas de cultura de tecidos anteriormente conhecidas as células eram cultivadas numa mono-camada. De acordo com o presente invento, as células cultivadas num suporte de estroma tri-dimensional crescem em múltiplas camadas formando uma matriz celular. Este sistema de matriz aproxima-se das condições fisiológicas que se encontram iri vivo, num maior grau do que nos sistemas de cultura de tecido de mono--camada anteriormente descritos. 0 sistema de cultura de células tri-dimensional é aplicável à proliferação de diferentes tipos de células e à formação de um número de diferentes tecidos, incluindo mas não limitados a, medula óssea, tecido de pele, fiqa do, pâncreas, rim, adrenal e neurológico, isto para referir apenas alguns. 0 sistema de cultura tem uma variedade de aplicações. Por exemplo, para tecidos tais como pele, glândulas, etc., a cultura tri-dimensional pode ela própria ser transplantada ou implantada num organismo vivo. Alternativamente, para tecidos d_i fusos tais como a medula óssea, as células proliferantes podem ser isoladas do sistema de cultura para transplantação. As culturas tri-dimensionais podem também ser usadas .in vitro para testes de citotoxicidade e análise de compostos. Ainda numa outra aplicação, pode usar-se o sistema de cultura tri-dimensional como um reactor biológico para produzir produtos celulares em quan-

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-13-tidade.

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De acordo com a invenção inoculam-se as células obtidas a partir de um tecido desejado (aqui designadas por células específicas de tecido ou células parenquimatosas) e cultivam-se numa ma triz de estroma tri-dimensional pré-estabelecida. A matriz de es. troma compreende células de estroma cultivadas numa matriz ou numa cadeia tri-dimensional. As células de estroma compreendem fi-broblastos com ou sem células e/ou elementos adicionais que aqui se descrevem mais em pormenor. Os fibroblastos e outras células e/ou elementos que compreendem o estroma podem ser de origem fetal ou adulta e podem ser obtidas de fontes convenientes tais como pele, fígado, pâncreas, etc.. Estes tecidos e/ou órgãos podem ser obtidos por biopsia apropriada ou por autópsia. De facto, p_g dem usar-se órgãos de cadáveres que constituem um abastecimento generoso de células e de elementos de estroma. i

Os fibroblastos fetais suportarão o crescimento de muitas células e tecidos diferentes no sistema de cultura tri-dimensional e, deste modo, podem ser inoculados na matriz para formar uma matriz suporte de estroma '"genérica” para cultivar qualquer um de uma variedade de células e tecidos. Contudo, em certos casos, p.o de ser preferível usar uma matriz suporte de estroma "específica" em vez da "genérica", caso este em que as células e/ou os elementos de estroma podem ser obtidos de um tecido, órgão ou indivíduo, particular. Por exemplo, quando se pretende usar a cultura tri--dimensional para propósitos de transplantação ou implante i_n vivo. pode ser preferível obter as células e/ou os elementos de estroma do indivíduo que vai receber o transplante ou o implante. Esta aproximação pode ser especialmente vantajosa quando é provável a rejeição imunológica do transplante e/ou do enxerto versus doença do hospedeiro. Além disso, os fibroblastos e outras células e/ou elementos de estroma podem ser obtidos do mesmo tipo de tecido a ser cultivado no sistema tri-dimensional. Isto pode ser vantajoso quando se cultivam tecidos nos quais as células de estroma especializadas podem desempenhar papeis estruturais/funcio-nais particulares; e.q. células gliais, do tecido neurológico, cê 69 900 6261-031-118

-14-lulas de Kupffer do fígado, etc..

Uma uez inoculadas na matriz tri-dimensional, as células de estroma proliferarão na matriz e suportarão o crescimento de células específicas de tecido inoculadas no .sistema de cultura tri-dimensional da invenção. De facto, quando inoculada com célu las específicas de tecido, a matriz suporte de estroma tri-dimen-sional mantém a proliferação activa da cultura por períodos de tempo prolongados. Podem adicionar-se à cultura factores de cres cimento e reguladores, mas não são necessários pois são elaborados pela matriz suporte de estroma.

Em virtude de, de acordo com a invenção, ser importante recrear em cultura o micro-ambiente celular que se encontra .in vivo para um tecido particular, o grau até ao qual se cultivam as células de estroma, antes da inoculação das células parenquimato-sas pode variar dependendo do tipo de tecido a ser cultivado na cultura de tecido tri-dimensional. Por exemplo, em culturas tri--dimensionais de medula óssea é preferival inocular células hema-topoieticas na matriz de estroma que é subconfluente. Porém, em culturas tri-dimensionais de tecido de pele, prefere-se, de acordo com a invenção, deixar que as células de estroma atinjam a coj-j fluência antes da inoculação com queratinocitos e/ou melanocitos, por forma a recriar a estrutura do componente dérmico da pele. 0 que é muito importante é que, em virtude das aberturas na rede permitirem a saída das células de estroma em cultura, as culturas de estroma confluentes não exibem inibição de contacto e as células de estroma continuam a crescer e a dividir-se, permanecendo funcionalmente activas. 0 presente invento é baseado, em parte, no facto de se ter verificado que o crescimento das células de estroma em três dimensões mantêm a proliferação activa das células de estroma e das células específicas de tecido em cultura por períodos de tempo muito maiores do que em sistemas de mono-camada. Além disso, o sistema tri-dimensional suporta a maturação, diferenciação e segragação de células em cultura jln vitro formando-se componentes de tecidos adultos análogos aos tecidos correspondentes que se en -15- 69 900 6261-031-118 contram jLn vivo.

Se bem que os aplicantes não tenham qualquer dever ou obrigação de explicar o mecanismo pelo qual o presente invento funciona, um certo número de factores inerentes ao sistema de cul tura tri-dimensional pode contribuir para o seu sucesso: (a) a matriz tri-dimensional oferece uma área superficial maior para a ligação de proteínas e, consequentemente, para a aderência de células de estroma. (b) Em virtude do espaço a três dimensães da matriz, as células de estroma continuam a crescer activamente, em contraste com as células em culturas de mono-cama da que crescem até a confluência, exibem inibição de contacto e param de crescer e de se dividir. A elaboração de factores de crescimento e reguladores por células de estroma em replicação pode ser parcialmejn te responsável pelo estimulo da proliferação e pelo regulamento da diferenciação de células em cultura. (c) A matriz tri-dimensional permite uma distribuição es. pacial dos elementos celulares que é mais análoga à que se verifica no tecido correspondente jLn vivo. (d) 0 aumento no volume potencial para o crescimento de células no sistema tri-dimensional pode permitir o estabelecimento de micro-ambientes localizados condju centes à maturação celular. (e) A matriz tri-dimensional maximiza as interacçães célula-célula permitindo um maior potencial para o movimento de células migratórias, tais como macrofagos, monocitos e, possivelmente, linfocitos na camada ade. rente. (f) Foi reconhecido que a manutenção de um fenotipo celij lar diferenciado requer não apenas factores de crescimento/ diferenciação mas também as interacçães celu lares apropriadas. 0 presente invento recria efecti vamente o micro-ambiente do tecido. -16- 69 900 6261-031-118- 0 suporte da estroma tri-dimensional, o próprio processo de cultura e a sua manutenção, bem como os vários usos das culturas tri-dimensionais, são descritos com maior pormenor nas sub--secçães seguintes.

5.1 ESTABELECIMENTO Dft MATRIZ DE ESTROMA TRI-DIMENSIONAL 0 suporte tri-dimensional pode ser de qualquer material e/ou forma tal que: (a) permite que as células se liguem a ele (ou que possa ser modificado por forma a permitir que as células se liguem a ele); e (b) permite que as células cresçam em mais do que uma camada. Para formar a matriz pode usar-se um grande número de materiais diferentes incluindo, mas não limitadas a: "nylon" (poliamidas), "dacron" (poliesteres), poliestireno, poli-propileno, poliacrilatos, compostos de polivinilo (p.e., cloreto de polivinilo), policarbonato, politetrafluoretileno (PTFE; "te-flon"), "termanox" (TPX), nitrocelulose, algodão, ácido poliglicó lico (PGA), fio "catgut", celulose, gelatina, dextrano, etc.. Qualquer destes materiais pode ser transformado numa rede, por exemplo, para formar a matriz tri-dimensional. Certos materiais, tais como o "nylon" e o poliestireno, etc., são substratos pobres para a ligação celular. Quando se usam estes materiais cg mo matriz suporte tri-dimensional é aconselhável pré-tratar a matriz antes da inoculação das células de estroma por forna a melhorar a ligação das células de estroma à matriz. Por exemplo, antes da inoculação com células de estroma, às matrizes de "nylon" podem ser tratadas com ácido acético 0,1 M e incubadas em poli-li sina, FBS, e/ou colagênio para revestir o "nylon". De um modo sj. milar pode tratar-se o poliestireno usando ácido sulfúrico.

Quando se pretende implantar a própria cultura tri-dimen-sional jLn vivo, pode ser preferível usar matrizes biodegradáveis tais como ácido poliglicólico, material de sutura de "catgut" ou gelatina, por exemplo* Quando se pretende manter as culturas por períodos de tempo longos ou crio-conservar-se, podem preferir-se materiais não degradáveis tais como "nylon", "dacron", poliestire no, poliacrilatos, polivinilos, "teflons", algodão, etc.. Uma re de "nylon" conveniente que pode ser usada de acordo com a inven-

-17- ção é o Nitex, uma rede de filtração de "nyl-on" com uma dimensão média de poro de 210 ^.m e com um diâmetro médio de fibra de "nylon" de 90 m (#3-210/36, Tetko, Inc., N.Y., E.U.A.).

Inoculam-se na matriz células de estroma compreendendo fibroblastos com ou sem outras células e elementos que a seguir se descrevem. Estes fibroblastos podem ser obtidos a partir de órgãos, tais como pele, fígado, pâncreas, etc., que podem ser obtidos por biopsia (quando apropriado) ou por autópsia. De facto, os fibroblastos podem ser obtidos em quantidades, muito conve, nientemente, a partir de qualquer órgão de cadáver apropriado.

Tal como anteriormente se explicou, podem usar-se fibroblastos fe tais para formar uma matriz de estroma tri-dimensional "genérica" que suportará o crescimento de uma variedade de células e/ou teci dos diferentes. Contudo, pode preparar-se uma matriz de estroma "específica" inoculando a matriz tri-dimensional com fibroblastos obtidos a partir do mesmo tipo de tecido a ser cultivado e/ou a partir de um indivíduo particular que vai depois receber as células e/ou os tecidos cultivadas numa cultura de acordo com siste-ina tri-dimensional da invenção.

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Os fibroblastos podem ser facilmente isolados desagregando um órgão ou um tecido apropriado que vai servir como fonte dos fi broblastos. Isto pode ser facilmente conseguido usando técnicas conhecidos dos peritos na arte. Por exemplo, o tecido ou o órgão podem ambos ser desagregados mecanicamente e/ou tratados com enzi. mas digestivas e/ou com agentes quelantes que enfraquecem as liga ç8es entre células vizinhas tornando possível dispersar o tecido numa suspensão de células individuais sem ruptura apreciável das células. A dissociação enzimâtica pode ser conseguida moendo o tecido e tratandD o tecido moído com qualquer uma de um certo número de enzimas digestivas quer sozinhas quer em combinação. Estas incluem, mas não estão limitadas a, tripsina, quimotripsina, colagenase, alastase, e/ou hialuronidase DNasa, pronase, dispase, etc.. A ruptura mecânica pode também realizar-se por um certo nú mero de métodos incluindo, mas não limitados ao uso de moinhos, misturadores, peneiros, homogeneizadores, células de pressão, ou -18-. 69 900 6261-031-118 insonadores, isto para referir apenas alguns. Para uma revisão das técnicas de desagregação de tecidos, ver Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of 8asic Technique, 2§. Ed., A.R. Liss, Inc., Neiu York, 1987, Ch. 9, pág. 107-126.

Uma vez reduzido o tecido a uma suspensão de células indjL viduais, a suspensão pode ser fraccionada em subpopulaçBes a partir das quais se podem obter os fibroblastos e/ou outras células e/ou elementos de estroma. Isto pode também ser conseguido usando técnicas convencionais para a separação de células incluindo, mas não limitadas a, clonação e selecção de tipos de células espes clficas, destruição selectiva das células não desejadas (selecção negativa), separação baseada na aglutinabilidade diferencial das células na população mista, procedimentos de eongelamento-descon-gelamento, propriedades de aderência diferencial das células na p.o pulação mista, filtração, centrifugação convencional e zonal, elti triação centrífuga (centrifugação em contra-corrente), separação por gravidade unitária, distribuição em contra-corrente, electro-forese e classificação de células activada por fluorescência. P.a ra uma revisão das técnicas de selecção clonal e de separação de células, ver Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques 2§. Ed., A.R. Liss, Inc., Nem York, 1987, Ch, 11 e 12, págs. 137-168. 0 isolamento dos fibroblastos pode por exemplo, ser reali zado como se segue: lavam-se exaustivamente amostras de tecido fresco e moem-se em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) por forma a remover o soro. Incuba-se o tecido moído por um período de 1-12 horas numa solução recentemente preparada de uma enzima de dissociação, tal como a tripsina. Após esta incubação, suspeji dem-se as células dissociadas, sedimentam-se por centrifugação e colocam-se em placas de cultura. Todos os fibroblastos se ligarão antes das outras células e deste modo podem isolar-se e culti var-se selectivamente as células de estroma apropriadas. Os fibroblastos isolados podem depois ser cultivados até à confluência, retirados da cultura confluente e inoculados na matriz tri-dimen-sional (ver, Naughton et al., 1987, 3. Med. 18(3&4)*219-250). A inoculação da matriz tri-dimensional com uma concentração elevada -19- -19- ψ 69 900 6261-031-118 6 7 de células de estrema, p.e. de aproximadamente 10 a 5 x 10 célu las/ml, resultará no estabelecimento do suporte de estroma tri-djl mensional em períodos de tempo mais curtos.

Para além dos fibroblastos, podem adicionar-se outras células, para formar a matriz de estroma tri-dimensional requeridas para suportar o crescimento em cultura por períodos prolongados. Por exemplo, podem inocular-se no suporte tri-dimensional, conjun taroente com os fibroblastos, outras células que se encontram em vários tecidos conjuntivos. Estas células incluem, mas não estão limitadas a, células endoteliais, pericitos, macrofagos, monoci-tos, células de plasma, mastocitos, adipocitos, etc.. Estas célu. las de estroma podem ser facilmente obtidas a partir de órgãos apropriados tais como, pele, fígado, etc., usando métodos conhecj. dos na arte tais como os quz anteriormente se discutem. Numa con cretização do presente invento, podem adicionar-se ao estroma de fibroblasto, células de estroma que são especializadas para d tecido particular a ser cultivado. Por exemplo podem usar-se células de estroma de tecido hematopoiético, incluindo mas não limita das a fibroblastos, células endoteliais, macrofagos/monocitos, adipocitos e células reticulares, para formar o estroma subconflu ente, tri-dimensional para a cultura, por períodos prolongados de medula óssea _±_n vitro. As células de estroma hematopoiéticas podem ser facilmente obtidas a partir da "camada de coágulo" que se forma nas suspensões de medula óssea por centrifugação com forças pequenas p.e., de 3000 x g. As células de estroma de fígado podem incluir fibroblastos, células de Kupffer e células endoteliais de dueto vascular e bilial. Similarmente, podem usar-se célu. las gliais como estroma para suportar a proliferação de células e de tecidos neurológicos; as células gliais para este propósito podem ser obtidas por tripsinização ou digestão com colagenase de cérebro embrionário ou adulto (Pontem e Westermark, 1980, in Federof, S. Hertz, L., eds, "Advances in Cellular Neurobiology", Vol. 1, Nem York, Academic Press, pág. 209-227).

De novo, quando se pretendem usar as células cultivadas para transplantação ou implantação .in vivo é preferível obter as -20- 69 900 6261-031-118 células de estroma a partir dos próprios tecidos do paciente. 0 crescimento das células na presença da matriz suporte de estroma tri-dimensional pode ser ainda melhorado, adicionando à matriz, ou revestindo a matriz suporte com proteínas (p.e., colagénios, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteínas, glicosami noglicanos (p.e., sulfato de heparano, 4-sulfato de condroitina, 6-sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de quera-tano, etc.), uma matriz celular e/ou outros materiais.

Após a inoculação das células de estroma, a matriz tri-di. mensional deverá ser incubada num meio nutriente apropriado. Podem ser adequados muitos meios comercialmente disponíveis tais como o meio RPMI 1640, o meio de Fisher, o meio de Iscove, o meio de McCoy e similares. E importante que a matriz de estroma tri--dimensional esteja suspensa ou flutuante no meio durante o perlo do de incubação por forma a maximizar a actividade proliferativa. Adicionalmente, a cultura deverá ser "alimentada" periodicamente para remover o meio consumido, remover a população de células libertadas e adicionar meio fresco.

Durante o período de incubação, as células de estroma crescerão livremente ao longo da, e envolverão a matriz tri-dimeri sional antes de começarem a crescer para as aberturas da matriz. * E importante cultivar as células até um grau apropriado que re-flicta a quantidade de células de estroma presentes no tecido in vivo. antes da inoculação da matriz de estroma com as células especificas de tecido.

As aberturas da matriz deverão ter uma dimensão apropriada por forma a permitir que as células de estroma se desenvolvam através das aberturas. A manutenção das células de estroma crescendo activamente que se desenvolvem através da matriz, aumenta a produção de factores de crescimento que são elaborados pelas células de estroma e assim suportarão culturas por períodos prolongados. Por exemplo, se as aberturas são muito pequenas, as células de estroma podem atingir rapidamente a confluência mas serem incapazes de sair facilmente da redeí as células aprisionadas po, dem exibir inibição de contacto e cessar a produção dos factores -21- 69 900 6261-031-118 apropriados necessários para suportar a proliferação e manter as culturas por períodos prolongados. Se as aberturas são muito grandes, as células de estroma podem ser incapazes de se desenvol. ver através da abertura; este facto diminui também a produção pe, las células de estroma dos factores apropriados, necessários para suportar a proliferação e manter as culturas por períodos prolongados. Quando se usa uma matriz tipo rede, tal como é aqui exemplificado, verifica-se que aberturas compreendidas entre cerca de 15yum e cerca de 220y*m funcionarão satisfatoriamente. Porém, dj3 pendendo da estrutura tri-dimensional e da complexidade da matriz, outras dimensães podem funcionar igualmente bem. De facto, qualquer forma ou estrutura que permita que as células de estroma se desenvolvam e continuem a replicar e a crescer por períodos de tempo prolongados, funcionarão de acordo com a invenção.

Diferentes proporçães dos vários tipos de colagênio depositados na matriz podem afectar o crescimento das células específicas de tecido depois inoculadas. Por exemplo, para o crescimeri to óptimo de células hematopoiéticas, a matriz deverá conter, pre ferivelmente, colagênio dos tipos III, IV e I, numa proporção aproximada de 6:3:1 na matriz inicial. Para sistemas de cultura de pele tri-dimensionais depositam-se preferivelmente na matriz inicial colagénios dos tipos I e III. As proporçães dos tipos de colagênio depositados podem ser manipuladas ou melhoradas selecci onando fibroblastos que elaboram o tipo de colagênio apropriado. Isto pode ser conseguido usando anticorpos monoclonais de um iso-tipo ou subclasse apropriada que são capazes de activar o complemento, e que definem tipos particulares de colagênio. Estes anti corpos e complemento podem ser usados para seleccionar negativamente os fibroblastos que exprimem o tipo de colagênio desejado. Alternativamente, o estroma usado para inocular a matriz pode ser uma mistura de células que sintetizam os tipos de colagênio apropriados desejados. Na Tabela I mostram-se a distribuição e as origens dos cinco tipos de colagênio. -22- 69 900 6261-031-118

TA BELA I DISTRIBUIÇÕES E ORIGENS DOS CINCO TIPOS DE COLAGÉNIO

Tipo de colagénio

Principal distribuição de tecido Células de origem

I

Tecido conjuntivo vulgar vário e denso» fibras dê colagénio F ibrocartilagem

II

III

Osso Dentina Hialina e cartilagem elástica; corpo vitreo do olho Tecido conjuntivo vário» fibras reticulares Camada papilar da derme» vasos sanguíneos II/

Membranas de base Cápsula de lente do olho Membranas fetais; placenta membranas de base Osso Músculo liso

Fibroblastos e células reticu lares» células de músculo liso Osteoblasto Odontoblasto Condrocitos células de re tina Fibroblastos e células reticu lares Células de mús culo liso; cé lulas endoteli. ais Células epite-liais e endote liais Fibras de lente Fibroblastos Células de mús. culo liso

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Assim, dependendo da tecido a ser cultivado -e dos tipos de colagé, nio desejados, podem seleocionar-se as células de estroma apropri adas para inocular na matriz tri-dimensional.

Durante a incubação do suporte de estroma tri-dimensional, podem libertar-se células proliferantes da matriz. ^stas células libertadas podem aderir às paredes do vaso de cultura onde podem continuar a proliferar e formam uma camada confluente. Isto devje rá ser evitado ou minimizado, por exemplo, por remoção das células desprendidas durante a alimentação ou transferindo a matriz de estroma tri-dimensional para um novo vaso de cultura. A presença de uma mono-camada confluente no vaso iria paralisar o crescimento de células na matriz e/ou cultura tri-dimensional. A remoção da mono-camada confluente ou a transferência da matriz para meio de cultura fresco num vaso novo vai restaurar a actividade proli-ferativa do .sistema.de cultura tri-dimensional. Estas remoçães ou transferências deverão ser efectuadas em qualquer vaso de cultura que tenha uma mono-camada de estroma que exceda 25fó de confluência. Alternativamente, pode agitar-se o sistema de cultura para evitar que as células desprendidas adiram às paredes do recipiente, ou em vez de alimentar periodicamente as culturas, o sistema, de cultura pode ser instalado de modo a que meio fresco flua continuamente através do .sistema. 0 caudal deverá ser ajustado para maximizar a proliferação na cultura tri-dimensional e para remover por lavagem as células desprendidas da matriz, por forma a evitar a sua aderência às paredes do recipiente e o seu crescimento até à confluência. Em qualquer dos casos as células de estroma desprendidas podem ser recolhidas e crio-conservadas para futura utilização.

5.2 INOCULAÇÃO DE CÉLULAS ESPECIFICAS DE TECIDO NA MATRIZ DE ESTROMA TRI-DIMENSIONAL E MANUTENÇÃO DAS CULTURAS

Assim que a matriz de estroma tri-dimensional atinge o grau de crescimento apropriado, inoculam-se na matriz de estroma as células especificas de tecido (células parenquimatosas que se pretendem cultivar. Uma concentração de células elevada no inócu lo resultará vantajosamente na maior proliferação na cultura mui- -24- 69 900 6261-031-118 to mais cedo do que com concentraçães baixas. As células escolhi das para a inoculação dependerão do tecido a ser cultivado que po de incluir, mas que não está limitado a, medula óssea, tecido de pele, de fígado, de pâncreas, de rim, neurológico e da glândula adrenal, isto para referir apenas alguns.

Por exemplo, e não como limitação, pode cultivar-se uma variedade de células epiteliais no suporte de estroma, vivo, tri--dimensional. Exemplos destas células epiteliais incluem, mas não estão limitadas a, células de mucosa oral e do tracto gastro--intestinal (G.I.). Estas células epiteliais podem ser isoladas por tratamento enzimático do tecido de acordo com métodos conheci, dos na arte, seguido da expansão destas células em cultura e apli cação das células epiteliais à matriz de células suporte de estro ma tri-dimensional (neo-submucosa). A presença da submucosa fornece os factores de crescimento e outras proteínas que promovem a vivisão e a diferenciação normais das células de mucosa oral e de células de revestimento do tracto G.I.. Usando esta metodologia podem cultivar-se com sucesso outras células epiteliais, incluindo, epitélio nasal, epitélio do tracto respiratório, epitélio vaginal e epitélio de córnea.

No suporte de estroma vivo tri-dimensional podem cultivajç -se uma variedade de tumores. Exemplos destes tumores incluem, mas não estão limitados a, o adenocarcinoma e o melanoma maligno que podem ser obtidos em locais primários ou metaestáticos. Estas culturas podem ser estabelecidas de um modo similar a outras culturas de epitélio tri-dimensionais. Resumidamente, estabele-cem-se na rede células de estroma obtidas, quer a partir de tecido normal ou de tumor de paciente, quer a partir de uma fonte alo geneica. Após atingir um estado próximo da confluência as células de estroma são inoculadas com células de tumor. As células de tumor continuarão a dividir-se rapidamente e formam um tumor sólido tri-dimensional. As células de tumor cultivadas neste suporte tri-dimensional exibem uma morfologia similar ao estado in vivo e exprimem e difundem antigénios de superfície de um modo si milar ao dos tumores sólidos; as células malignas cultivadas em mono-camadas não exibem a mesmo grau de semelhança em relação ao

69 900 6261-031-118 -25- tecido de tumor _in vivo. Este crescimento fisiológico de células de tumor permite aplicações no estudo e desenvolvimento de novos agentes quemoterapêuticos, regimes de quemoterapia individualizados e mecanismos de metastase. Adicionalmente, estas culturas de tumor podem ser úteis em imunoterapia individualizada. Com res- 51 peito a isto, experiências com estudos de libertação de CR ind.i caram que as células Lak evocam uma resposta muito mais potente contra células de tumor cultivadas em três dimensões quando camp.a rada com a de células cultivadas em mono-camada. As células imuno lógicas podem ser obtidas de pacientes por técnicas de perese tra dicional e sensibilizadas nas células do próprio tumor do paciente, desenvolvidas na cultura tri-dimensional.

Em geral, este inóculo deverá incluir a célula de "raiz" (também designada por célula de "reserva") para esse tecido; i.e., as células que gerarão novas células que amadurecerão transformai) do-se nas células especializadas que formam os vários componentes do tecido.

As células parenquimatosas ou células especificas de teci. do usadas no inóculo podem ser obtidas de suspensões de células preparadas desagregando o tecido desejado usando técnicas convencionais anteriormente descritas para a obtenção de células de es-troma na secção 5.1 anterior. A suspensão celular inteira pode ela própria ser usada para inocular a matriz suporte de estroma tri-dimensional. Como resultado, as células regeneradoras contidas no homogeneizado proliferam, amadurecem e diferenciam-se adequadamente na matriz, enquanto que as células não regenerativas não. Alternativamente, os tipos de células particulares podem ser isolados a partir das fracções apropriadas da suspensão celular usando as técnicas convencionais que se descrevem na Secção 5.1, anterior, para o fraccionamento das células de estruma. Quando se puderem isolar facilmente as células de "raiz" ou de "reserva", estas podem ser usadas, preferencialmente, para inocular o suporte de estroma tri-dimensional. Por exemplo, quando se cultiva me dula óssea, o estroma tri-dimensional pode ser inoculado com célu las de medula óssea, quer frescas quer obtidas a partir de uma amostra crio-conservada. Quando se cultiva pele, o estroma tri- 69 900 6261-031-118

-26- -dimensional pode ser inoculado com melanoci-tos e com queratinoci tos. Quando se cultiva fígado, o estroma tri-dimensional poda ser inoculado com hepatocitos. Quando se cultiva pâncreas, o estroma tri-dimensional pode ser inoculado com células endocrinas pancreáticas. Para uma revisão dos métodos qua podem ser usados para obter células parenquimatosas de vários tecidos, ver Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2§. Ed., A.R. Liss, Inc., Nem York, 19B7, Ch. 20. págs. 257-288.

Duranta a incubação, o sistema de cultura de células tri--dimensional deverá estar em suspensão ou flutuando no meio nutri ente. As culturas deverão ser alimentadas periodicamente com meio fresco. De novo, dever-se-á tomar cuidado para evitar que as célu las desprendidas da cultura adiram às paredes do vaso onde podem proliferar e formar uma mono-camada confluente. 0 desprendimento de células da cultura tri-dimensional parece ocorrer mais facilmente quando se cultivam tecidos difusos do que quando se cultivam tecidos estruturados. Por exemplo, a cultura tri-dimensional de pele do presente invento é histologicamente e morfologicamente normal» as camadas dérmica e epidérmica não libertam células para o meio circundante. Por contraste, as culturas tri-dimensionais de medula óssea tri-dimensionais da invenção libertam células maduras, não aderentes para o meio de um modo muito semelhante ao modo como células são libertadas na medula _in vivo. Como anteri-ormente se explicou, assim que as células desprendidas aderem ao vaso de cultura e formam uma mono-camada confluente, a proliferação da cultura tri-dimensional será "extinguida". Isto pode ser evitado por remoção das células desprendidas durante a alimentação, por transferência da cultura tri-dimensional para um novo va so, por agitação da cultura para evitar a adesão das células desprendidas à parede do recipiente, ou por alimentação continua de meio fresco a uma velocidade suficiente para substituir os nutrientes no meio de cultura e para remover as células desprendidas.

Em qualquer dos casos, as células maduras desprendidas podem ser recolhidas e crio-conservadas para uso futuro.

Os factores de crescimento e os factores reguladores não necessitam de ser adicionados ao meio pois estes tipos de facto-

69 900 6261-031-110 res são elaborados pelas células de estroma ·tri-dimensional. Contudo, pode utilizar-se a adição destes factores ou a inoculação de outras células especializadas, para aumentar, alterar ou modular a proliferação e a maturação das células nas culturas. 0 cres cimento e a actividade das células em cultura podem ser afectados por uma v/ariedade de factores de crescimento tais como a insulina, a hormona de crescimento, somatomedinas, factores estimulantes de colónias, eritropoietina, factor de crescimento epidérmico, factor eritropoiético hepático (hepatopoietina) e factor de crescimento de células de fígado. Outros factores que regulam a proliferação e/ou diferenciação incluem, prostaglandinas, interleucinas e caló nios naturais.

5.3 APLICAÇÕES DO SISTEMA DE CULTURA TRI-DIKENSIONAL 0 sistema de cultura tri-dimensional da invenção pode ser usado numa variedade de aplicaçães. Estas incluem, mas não estão limitadas a, transplantação ou implantação, quer das células cultivadas obtidas a partir da matriz, quer da própria matriz cultivada, in vivo, análise de compostos citotóxicos, alérgenos, factores de crescimento/reguladores, compostos farmacêuticos, etc., in vitro; elucidação do mecanismo de certas doenças; estudo do mecanismo pelo qual as drogas e/ou os factores de crescimento ope, ram; diagnóstica e seguimento do cancro num paciente; terapia de gene; e a produção de produtos biologicamente activos, isto para referir apenas algumas.

Para transplantação ou implantação _in vivo podem implantar-se, quer as células obtidas a partir da cultura, quer toda a cultura tri-dimensional, dependendo do tipo de tecido envolvido. Por exemplo, as culturas tri-dimensionais da medula óssea podem ser mantidas in vitro por períodos largos; podem usar-se as células isoladas a partir destas culturas na transplantação, ou pode implantar-se toda a cultura. Contrariamente, nas culturas de pele, pode enxutar-se toda a cultura tri-dimensional jLrj vivo para o tratamento de vitimas de queimaduras, úlceras de pele, feridas, etc.·

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Os implantes da cultura de tacido tri-dimensional podem ser usados, de acordo com a invenção, para substituir ou aumentar o tecido existente, para introduzir tecido novo ou alterado, para modificar próteses artificiais ou para unir tecidos ou estruturas biológicas. Por exemplo, mas n3o como limitação, concretizaçães especificas da invenção incluem (i) implantes de cultura tri-dimensional de medula óssea para substituir medula óssea destruida durante o tratamento quemoterapêutico; (ii) implantes de tecido de fígado tri-dimensionais usados para aumentar a função hepática em pacientes com cirrose; (iii) células geneticamente alteradas cultivadas em cultura tri-dimensional (tais como culturas tri-dimensionais de fibroblastos que exprimem um gene recombinante que codifica a insulina); (iv) próteses do ilíaco revestidas com cul turas tri-dimensionais de cartilagem; (v) próteses dentais ligadas a uma cultura tri-dimensional de mucosa oral.

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As culturas tri-dimensionais podem ser usadas in vitro p.a ra analisar uma grande variedade de compostos, tais como, compostos citotóxicos, factores de crescimento/reguladores, agentes fax macêuticos, etc.. Para este propósito, as culturas são mantidas in vitro e expostas ao composto a ser testado. A actividade de um composto citotóxico pode ser medida pela sua capacidade em danificar ou matar células em cultura. Isto pode ser facilmente de. terminado por técnicas de coloração vital. 0 efeito dos factores de crescimento/reguladores pode ser determinado analisando o conteúdo celular da matriz, eo., por contagem total das células e por contagem diferencial das células. Isto pode ser conseguido usando técnicas citológicas e/ou histológicas convencionais, incluindo o uso de técnicas imunocitoquimicas utilizando anticorpos que definem antigénios celulares específicos de certos tipos. Pode ser determinado o efeito de várias drogas em células normais cultivadas no sistema tri-dimensional. Por exemplo podem ser testadas, nas culturas tri-dimensionais de medula óssea, drogas que a.u mentam a formação de glóbulos vermelhos. No sistema tri-dimen-sional de fígado podem testar-se drogas que afectam o metabolismo do colesterol, p.e. que diminuem a produção de colesterol. Podem usar-se culturas tri-dimensionais de células de tumor como siste-

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-29- mas modelo para testar, por exemplo, a eficácia de agentes anti--tumor.

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As culturas tri-dimensionais da invenção podem ser usadas como sistemas modelo para o estudo de condiçSes fisiológicas ou patológicas. Por exemplo, numa concretização especifica da inve.n çSo, pode usar-se um sistema de cultura tri-dimensional como modelo para a barreira sangue-cárebro; este sistema modelo pode ser usado para estudar a penetração de substâncias através da barreira sangue-cérebro. Numa concretização especifica adicional, e não como limitação, pode usar-se uma cultura tri-dimensional de epitélio de mucosa como sistema modelo para estudar a infecção por herpes virus ou papiloma vírus; este sistema pode ser usado para testar a eficácia de medicaçães anti-virais.

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Podem também usar-se as culturas tri-dimensionais de medu, la óssea como auxiliares de diagnóstico e tratamento de malignid.a des e de doenças. Por exemplo, pode tornar-se uma biopsia de quaJL quer tecido (p.e., medula óssea, pele, fígado, etc.) do paciente que se suspeita ter uma doença maligna. Se se cultivam as células da biopsia no sistema tri-dimensional da invenção, as células malignas expandir-se-ão clonalmente durante a proliferação da cultui ra. Este facto aumentará as hipóteses de detectar uma doença maligna e, deste modo, a precisão do diagnóstico. Isto pode ser es. pecialmente útil em doenças, tal como a SIDA, onde a população de células infectadas está em pequeno número _iri vivo. · Além disso, pode usar-se a cultura do paciente in vitro para avaliar compostos citotóxicos e/ou farmacêuticos por forma a identificar os que são mais eficazes? i.e. os que matam as células malignas ou doentes, mas que poupam no entanto as células normais. Estes agentes podem depois ser usados para tratar terapeuticamente o paciente.

De acordo com o presente invento, pode remover-se um voljj me de medula óssea relativamente pequeno de um paciente doente e pode destruir-se a medula óssea do paciente por quemoterapia ou radiação. Pode depois expurgar-se a amostra de medula óssea de células doentes usando um agente quemoterapêutico adequado, expa_n de-se in vitro e depois readministra-se ao paciente. Para além

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J de permitir uma purga mais efectiva, pelo tratamento de menores volumes de medula doente, a que se segue a expansão _in vitro, o sistema de cultura tri-dimensional pode ser utilizado em maiores volumes de medula expurgada. Um efeito colateral da maior parte dos agentes de purga consiste na destruição e ruptura das células de pele hematopoiéticas normais, o que resulta num tempo prolonga do até à implantação e, muitas vezes, na morte do paciente devido a uma infecção secundária. Um agente de purga eficaz utilizado com a leucemia não linfocítica aguda é o 4-hidroperoxioiolofosfa-mida (4HC) que provoca uma morte de dois log das células malignas. No tratamento tradicional, tratam-se 500 ml a 1000 ml de medula doente por incubação da medula _ex vivo com 6-100 ng de 4HC/ml. A medula é depois crio-conservada e re-infundida no paciente após 2-3 semanas de quemoterapia clinica. De acordo com o presente invento, pode colher-se um volume comparável de medula óssea, pur ga-se com 4HC e depois expande-se jln vitro na cultura tri-dimensional, permitindo deste modo um tempo de implantação mais rápido e uma diminuição na taxa de mortalidade dos pacientes.

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As metodologias .in vitro têm sido úteis na redução da rejeição de células usadas para a transplantação tanto em animais (transplantação da medula óssea em ratinhos) como em humanos (enxertos epidérmicos alogeneicos). A cultura de medula óssea tri--dimensional pode ainda ser usada para promover a tolerância das células a antigénios estranhos. Para isto, podem cultivar-se células hematopoiéticas do dador em células de estroma tri-dimensig nal do receptor. Estas culturas podem ser desenvolvidas na presença de culturas térmicas tri-dimensionais que fornecem os facto res de crescimento e os factores de diferenciação adicionais que induzirão a maturação de linfocitos no sistema da medula óssea. A medida que as células hematopoiéticas se multiplicam e amadurecem serão educadas para ver os antigénios das células do receptor como "seus", tornando-se deste modo tolerantes a estas células "estranhas" .

Dependendo do uso pretendido para as células e tecidos pro liferados, podem adicionar-se várias células especializadas à cultura tri-dimensional. Por exemplo, o crescimento, por períodos 69 900 6261-031-118

-31- prolongados, de células de medula óssea em culturas tri-dimensio-nais, pode ser melhorado pela adição de certas populações de célu las mononucleares às culturas» pela adição de factores de crescimento ao meio de cultura, ou pelo uso de células de estroma manipuladas por forma a produzirem um factor ou os factores de cresci, mento desejados. As células recolhidas destas culturas podem ser usadas para transfusão, transplantação e armazenamento. A adição de linfocitos, obtidos a partir de um paciente, a culturas de pele tri-dimensionais, pode auxiliar a avaliação e o diagnóstico de desordens imunológicas, tais como certas doenças auto-imunes. Si^ milarmente, a adição de linfocitos e de mastocitos, obtidos a pax tir de um parente, a culturas de pele tri-dimensionais, pode auxi. liar na avaliação da resposta alérgica do paciente a vários aler-genos sem expor o paciente aos alergenos. Nesta altura, exp3e-se a cultura tri-dimensional de pele contendo os linfocitos e os ma.s tocitos de paciente a vários alergenos. A ligação de IgE, gerada por linfocitos, aos mastocitos residentes, quando "ligadas" ao alergeno ao qual o paciente é sensível, resultará na libertação de mediadores vasoactivos, tais como a histamina. A libertação destes mediadores em cultura, em resposta à exposição da cultura tri-dimensional a um alergeno pode ser medida e utilizada como uma indicação da resposta alérgica do paciente. Isto permitiria a realização de testes de alergia, sem a exposição do indivíduo a alergenos perigosos e potencialmente prejudiciais. Este sistema pode ser usado, similarmente, para o teste de cosméticos .in vitro. Q sistema de cultura tri-dimensional da invenção pode cons. tituir um veículo para a introdução de genes e de produtos genéti cos in vivo para uso em terapias com genes. Por exemplo, usando técnicas de ADN recombinante pode colocar-se um gene, no qual um paciente é deficiente, sob o controlo de um promotor específico de vírus ou de tecido. Pode usar-se a construção de ADN recombinante contendo o gene, para transformar ou transfectar uma célula hospedeira que é clonada e depois expandida clonalmente no sistema. de cultura tri-dimensional. A cultura tri-dimensional que exprime o produto do gene activo pode ser implantada num indivíduo que é deficiente para esse produto. 69 900 6261-031-11Θ -32-

0 uso da cultura tri-dimensional em-terapia de gene tem um certo número de vantagens. Em primeiro lugar, uma vez que a cultura compreende células eucariéticas, o produto genético será adequadamente expresso e processado em cultura para formar um pro duto activo. Em segundo lugar, as técnicas de terapia de gene são úteis apenas se o número de células transfectadas puder ser substancialmente aumentada para ter valor clínico, relevância e utilidade; as culturas tri-dimensionais da invenção permitem a expansão do número de células transfectadas e a ampliação (por divisão celular) das células transfectadas.

Preferivelmente, os elementos de controlo da expressão utilizados deverão permitir a expressão reoulada do gene de forma que o produto seja apenas sintetizado quando necessário _in vivo. 0 promotor escolhido dependerá, em parte, do tipo de tecidos e de células cultivadas. Preferem-se as células e os tecidos capazes de segregar proteínas (p.e., as caracterizadas por um retículo ejn doplasmático grosseiro e complexos de golgi, abundantes). Para este propésito podem seleccionar-se o fígado e outros tecidos glandulares. Quando se usam células de fígado, podem usar-se pro motores virais específicos do fígado, tais como elementos do vírus da hepatite B, para introduzir genes estranhos nas células de fígado e regular a expressão destes genes. Estas células podem então ser cultivadas no sistema tri-dimensional da invenção. Altejr nativamente pode usar-se um promotor especifico do fígado tal como o promotor da albumina.

Exemplos de regiães de controlo de transcrição, que exibem especificidade de tecidos, que são conhecidas e que se podem usar, incluem, mas não estão limitados a: região de controlo do gene da elastase I que é activa em células acinares pancreáticas (Su/ift et al., 1984, Cell 38:639-646,* Ornitz et al. , 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:42S-51S); região de controlo do gene da insulina que é activa em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); região de controlo do gene da imunoglobulina que é activa em células linfoides (Grosschedl . et al., 1984, Cell 38: :647-658; Adams et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et

69 900 6261-031-118 -33- al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)» região de controlo do gsne da albumina que é activa em células de fígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. 1:268-276); região de controlo do ge. ne da fetoprotelna alfa que é activa no fígado (Krumlauf et al., 198$, Mol. Cell. 8iol. 5:1639-1648); Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); região de controlo do gene da alfa-l-antitripsina que é activa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1: :161-17l); região de controlo do gene da beta-globina que é acti va em células mieloides (Magram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al. , 1986, Cell 46:89-94); região de controlo do gene da proteína básica da mielina que é activa em células oligodendró citas no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); região de controlo do gene da cadeia leve da miosina-2 que é activo no músculo esquelético (Shani, 1985, Nature 314:283-286); e região de controlo do gene da hormona de libertação gonadotrópica que é activo no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Numa outra concretização da invenção podem usar-se culturas tri-dimensionais para facilitar a transdução dos genes. Por exemplo, e não como limitação, podem usar-se culturas tri-dimen-sionais de estroma de fibroblasto compreendendo um vector de expressão de vírus recombinante para transferir o vírus recombinan-te para células postas em contacto com a matriz de estroma, simulando-se deste modo a transmissão virai in vivo. 0 sistema de cultura tri-dimensional é um processo mais eficiente de conseguir a transdução do gene do que as técnicas correntes para a transfecção de ADN.

Ainda numa outra concretização da invenção pode usar-se o sistema de cultura tri-dimensional _in vitro para produzir produtos biológicos com um elevado rendimento. Por exempla, pode expandir-se clonalmente _in vitro, usando o sistema de cultura tri--dimensional, uma célula que produz naturalmente grandes quant-ida des de um produto biológico particular (p.e. , um factor de cresci mento, um factor regulador, uma hormona de peptldeo, um anticorpo, etc.), ou uma célula hospedeira, transformada por engenharia gené tica, para produzir um produto de um gene estranho. Se a célula transformada excreta o produto genético para o meio nutriente, p0 69 900

6261-031-118 de isalar-se facilmente o produto a partir do meio consumido ou condicionado, usando técnicas de separação convencionais (p.e., HPLC, cromatografia, electroforese, isto para referir apenas algu, mas). Pode-se assim conceber um reactor biológico que teria a vantagem do método do fluxo contínuo para a alimentação das cult^j ras tri-dimensionais _in vitro. Essencialmente, a medida que se faz passar meio fresco, através da cultura tri-dimensional, o pro duto do gene é removido da cultura, por lavagem, conjuntamente com as células libertadas da cultura. Q produto do gene pode ser isolado (p.e. por HPLC, cromatografia em coluna, electroforese, etc.) da corrente de saída de meio consumido ou condicionado.

Nas secções seguintes descrevem-se várias concretizações da invenção. Apenas com propósitos de auxiliar a descrição e não como limitação, o sistema de cultura tri-dimensional da invenção é descrito com base nos tipos de tecidos e de células usadas em vários sistemas.. Estas descrições incluem, especificamente, mas não estão limitadas a, medula óssea, pele, fígado e pâncreas mas está expressamente pressuposto que se pode usar o sistema de cu^L tura tri-dimensional com outros tipos de células e tecidos, A iri venção é também ilustrada com exemplos que mostram resultados ca-racteristicos obtidos com cada sistema descrito.

ó. SISTEMA DE CULTURA DE MEDULA QS5EA TRI-DIMENSIONAL 0 sistema' de cultura tri-dimensional da invenção permite a aplicação de células de medula óssea in vitro. num sistema com- * - parável às condições fisiológicas. E importante notar que, as cé lulas de medula óssea replicadas neste sistema incluem todas as células presentes na medula óssea normal, assumindo que no inócu-lo de medula óssea original usado para iniciar as culturas estavam presentes todos os tipos de células.

Se bem que as células de medula tenham um crescimento limitado quando cultivadas sozinhas, o crescimento destas culturas por períodos prolongados é apenas possível se estiverem presentes células de estroma ou os seus produtos de secreção. \ler, Long--Term Bane Marrou Culture, D.G. Wright & 3.S. Greenberger, eds., A.R. Liss, Neuj York, (1984) págs. 141-156.

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Da acordo com a invenção, cultivam-se as células de medula óssea num suporte tri-dimensional em co-cultura com células de estroma compreendendo fibroblastos (quer de origem fetal quer obtidos a partir de medula óssea) ou uma mistura de tipos de célu las que compreendem os componentes de estroma da medula normal, incluindo fibroblastos, macrofagos, células reticulares e adipo-citos. Podem adicionar-se facultativamente à cultura factores obtidos a partir de meios de cultura de macrofagos esplénicos e/ /ou hepáticos (fígado) ou de subconjuntos de células de estroma. 0 sistema de cultura tri-dimensional da invenção parece maximizar a proliferação de células de raiz hematopoiéticas, multipotenci-ais, que têm a capacidade de repovoar a medula óssea quando esta é destruída por uma doença, mediada pelo ambiente ou intrinsecamente, ou pelo tratamento desta doença por quemoterapia e/ou radiação.

Usando técnicas de cultura de células em mono-camadas convencionais, não se observa que as células de raiz, que têm actividade de repovoamento da medula (MRA), subsistam e se repliquem em culturas de medula óssea murina por períodos prolongados. Nestes sistemas porém, a expressão das células hematopoiéticas maduras é limitada, principalmente, às linhagens mieloides e mono. citoides. As culturas de mono-camada de células de medula óssea de primata não humano e humano, exibem um declínio constante, para além do tempo normal, em progenitores testáveis (CFU-GM, CFU--GEMM, BFU-E, etc.). A célula madura mais importante que se exprime nestas culturas de mono-camada, tal como no sistema murina, é o granulocita. Por contrasts, os progenitores hematopoiético e os precursores hematopoiéticos de todas as linhagens de células de sangue parecem replicar-se e proliferar no sistema de estroma tri-dimensional do presente invento. Além disso, a diferenciação parede decorrer de um modo fisiológico. Por exemplo, as colónias eritroides, mieloides, linfoides, macrofágicas e megacariocíticas podem ser continuamente criadas na mesma cultura usando os sistemas , tal comD se apresentam no presente invento e a seguir se descrevem. A replicação de células de raiz neste processo pode ser inferida da proliferação constante dos progenitores envolvidos.

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6.1 OBTENÇÃO DftS CÉLULAS DE MEDULA 0S5EA

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As células de medula óssea usadas no inóculo podem ser obtidas directamente a partir do dador ou recuperadas a partir de uma quantidade crio-conservada. Primeiro, separam-se as células do seu retículo por meio físicos. Deste modo, pode aspirar--se uma pequena quantidade (10-15 cc de medula óssea/suspensão de sangue periférico) da cristã ilíaca de um dador. Com propósitos de transplantação, os resultados do processo são óptimos se: (a) o indivíduo tiver menos do que 40 anos de idade na altura em que a sua medula for tomada para cultura e/ou crio-conservação; e (b) se o paciente não tiver doenças, contudo a invenção não está limitada a estes critérios. São bem conhecidos na arte métodos de aspiração de medula óssea de um dador. Nas Patentes dos E.U.A. nSs. 4 481 946 e 4 486 188 encontram-se exemplos de dispositivos e de processos para aspirar medula óssea de um dador.

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Se se vai cultivar medula óssea para tratar certos pacieri tes com doenças metaestáticas ou com malignidades hematológicas, a medula obtida a partir dos pacientes deverá ser "expurgada" de células malignas, por meio de métodos físicos ou quemoterapêuti-cos, antes da cultura. Presentemente, os métodos de purga físicos e quemoterapêuticos requerem uma amostra de grande dimensão pois estes métodos matam, não selectivamente, tanto células malj. gnas como células normais. Contudo, estão actualmente a ser desenvolvidos métodos selectivos para a purga. Por exemplo, estão--se a testar anticorpos específicos para as células malignas numa tentativa para alcançar os agentes tóxicos e matar especificamen-te as células malignas. Estes métodos de purga selectiua serão eficazes mesmo quando a dimensão da amostra é pequena. D sistema' de cultura tri-dimensional da invenção torna isto possível pois pode expurgar-se eficazmente uma pequena amostra e podem expandir -se as células saudáveis restantes. A medula óssea removida de um dador pode ser replicada ou conservada, para replicação numa data posterior. Se se pretende conservar a medula óssea, esta pçi de ser incrementalmente congelada usando equipamento criotecnoló-gico computadorizado. Por exemplo, pode dividir-se uma suspensão de medula óssea/sangue em volumes iguais para tubos Nunc esteri -37- 69 900 6261-031-118 lizados e colocam-se os tubos num copo com gelo esmagado até se ter na câmara de crio-conservação uma temperatura similar (4^C). Imediatamente antes da inserção do espécime na câmara, adiciona--se uma solução a cada tubo Mune usando uma técnica asséptica de modo a que os crioprotectores, dimetilsulfóxido e glicerol, estejam presentes em concentrações finais de cerca de 7% e 5%, respeç. tivamente. 0 programa de congelamento é iniciado imediatamente apds a introdução dos espécime. No controlador CryoMed modelo nú. mero 1010 usa-se o programa de congelamento número 1.

Usando esta técnica a viabilidade celular após congelação e degelo rápido num banho de água a 80SC, excede os 90%t tal como é determinado pelo método de exclusão de azul de tripano. Adicio nalmente, após o congelamento, podem recuperar-se mais do que 80% da cultura de unidades formando colónias (CFU-C) original. Nas Pa tentes dos E.U.A* n^s. 4 107 937 e 4 117 881 descrevem-se exemplos de sistemas para congelamento de medula óssea e de substâncias biológicas de acordo com uma temperatura pré-calculada e com uma curva de tempos. Preferivelmente, as células de medula óssea são armazenadas na fase liquida, do azoto líquido, a uma temperatura de -196SC, temperatura esta para a qual cessa toda a actividade metabólica celular.

6.2 ESTABELECIMENTO DA MATRIZ DE ESTRQMA TRI-DIMENSIONAL

As células de estroma obtidas a partir de suspensões de me dula deverão ser separadas dos outros componentes da medula. Isto pode ser realizado usando qualquer método adequado conhecido na arte. Por exemplo, podem centrifugar-se suspensões de medula a baixas forças, p.e.« 3000 x g durante 20 minutos por forma a obter-se uma base branca de células (i.e. a "camada de coágulo") contendo macrofagos, fibroblastos, adipocitos, células sanguíneas mononucleares, células reticulares e células endoteliais. As células da camada de coágulo podem ser suspensas em qualquer meio adequado, tal como meio RPMI 1640 que pode ser suplementado com FBS, HS, hemisuccinato de hidrocortisona, e antibióticos apropria dos.

As células são então colocadas na matriz tri-dimensional.

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Se se usam elevadas concentraçães de células de estroma no inóculo, a matriz suporte de estroma atingirá o grau de subconfluência apropriado em períodos de tempo mais curtos. Por exemplo» podem 6 7 colocar-se aproximadamente 10 a 10 células de estroma por ml, numa matriz tri-dimensional, tal como rede de "nylon" esterilizada (Tetko Corp. of Nem York, Neu» York, E.U.A.) contida numa caixa de petri ou noutro recipiente adequado (p.a. , recipientes Titer--Tek).

Coloca-se depois a rede inoculada num balão de cultura contendo um colume apropriado de meio nutriente. As culturas tri -dimensionais flutuam, parcialmente submersas sob a superfície do meio. Podem incubar-se as culturas a cerca de 35SC a 372C, em cejr ca de 5$ de CQ^, em ar ambiente, com uma humidade relativa, em ex, cesso, de cerca de 90$. As células de estroma, que são predominantemente fibroblastos, crescem primeiro ao longo de, e depois rodeiam completamente todas as fibras de "nylon" antes de começarem a crescer através das aberturas da rede. Dependendo da concentração de células usada no inóculo, este processo pode levar, aproximadamente, 5 a 18 dias. 0 grau de subconfluência das células de estroma deverá ser consistente com o que se observa na Fig. 1, antes da inoculação das células hematopoiéticas.

As células da estroma em suspensão que se desenvolvem na matriz tri-dimensional podem ser crio-conservadas usando a mesma técnica que anteriormente se descreveu para as células de medula óssea. Para crio-conservação das células subconfluentes na rede, pode emolar-se a rede de "nylon" e inserir-se num tubo Nunc contendo meio adequado tal como RPMI 1640 suplementado com crio-pro-tectores, tais como dimetilsulfóxido e glicerol, em concentraçães finais de cerca de 5$ e 15$, respectivamente. A congelação das células de estroma na rede pode realizar-se a velocidades iniciais de arrefecimento de -l^c/minuto, desde +1SC até -402C. Uma velocidade de arrefecimento de -2 a -32C/minuto é óptima até se conseguir um estado final de temperatura de -84SC. Durante este processo podem desprender-se da rede de "nylon" aproximadamente 20-25$ das células de estroma. -39- 69 900 6261-031-118

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6.2.1 AUMENTO DO CRESCIMENTO PftS CELULA5 DE ESTROMA DE MEDULA 0 factor limitante principal da velocidade no crescimento de células de estroma de medula é o Índice mitdtico relativa-mente baixo dos fibroblastos incluídos entre as células de estroma de medula. 0 crescimento destas células e a sua deposição de componentes de matriz extracelulares pode ser melhorado pela adição de hemissuccinato de hidrocortisona e/ou factores de crescimento auto-regulantes obtidos a partir do meio de fibroblastos fetais humanos cultivados que têm uma velocidade elevada de divisão celular. A ligação e o crescimento dos fibroblastos na rede podem também ser melhorados por: pré-revestimento da rede com colagé-nio solubilizado, dos tipos I a 11/; ou usando uma rede que está revestida ou embebida em colagénio segregado por fibroblastos humanos fetais ou por fibroblastos adultos (aqui depois designados por "fibroblastos melhoradores do crescimento") que foram selec-cionados pela sua capacidade em sintetizar certos tipos de colagénio. Para isto, os fibroblastos melhoradores do crescimento são retirados da rede, por tripsinização moderada, apés terem atingido a confluência (5 a 7 dias para fibroblastos humanos fetais e 14 a 18 dias para fibroblastos de adultos respectivamente) e podem ser, quer inoculados conjuntamente com as células de medju la de estroma, tal como anteriormente se descreveu, quer crio-cojn servadas para uso futuro.

Numa concretização da invenção, cultivam-se os fibroblastos melhoradores do crescimento, que estão sintetizando colagénio e outros componentes de matriz extracelular, na rede até atingirem a subconfluência. Inocula-se então uma mistura de células de medula óssea hematopoiáticas e de estroma, na sede de fibroblastos, melhoradores do crescimento, subconfluentes.

Os métodos de crescimento, selecção e crio-conservação de fibroblastos melhoradores do crescimento são os seguintes: -40- ; 69 900 6261-031-118 (a) Cultura de fibroblastos melhoradores de crescimento

Para cultivar os fibroblastos melhoradores do crescimento pode usar-se qualquer método adequado. Por exemplo, podem cul tivar-se os fibroblastos num meio adequado, tal como RPMI 1640 suplementado com 2-10% de FBS ou 2-10% de HS, ao qual se adiciona ram l^g/ml de hemissuccinato de hidrocortisona e antibióticos, tais como, 2 ^g/ml de gentamicina, penicilina, estreptomicina e fungizona. As culturas podem ser desenvolvidas com cerca de 5% de CO2 em ar ambiente, a 35SC - 373C, com uma humidade relativa, em excesso, de cerca de 50%, (b) Seleccão de fibroblastos melhoradores de crescimento

Para seleccionar os fibroblastos melhoradores de crescimento, podem usar-se vários métodos. Por exemplo, podem colocar- 6 -se cerca de 5,0 x 10 fibroblastos obtidos a partir de camada de coágulo de uma suspensão de medula óssea, fibroblastos de derme, ou fibroblastos obtidos a partir de fígados de cadáveres, em cavi dades de microtítulo (l mm ) e cultivam-se até à confluência. Es. tas células podem ser retiradas das cavidades de cultura por lav.a gens repetidas, usualmente quatro a cinco vezes com solução sali- 2+ 2+ na equilibrada de Hank sem Ca ou Mg . Pode examinar-se a matriz restante nas placas de microtítulo por imuno fluorescência indirecta, utilizando anticorpos monoclonais em relação aos vários componentes da matriz, visualizada por marcadores directos ou indirectos. Por exemplo, a ligação de anticorpos monoclonais IgC murinos, não marcados, específicos de um componente de matriz pa_r ticular, pode ser visualizada usando imunoglobulina G de coelho anti-ratinho, marcada com enzima ou marcada com isotiocianato de fluoresceína, para avaliar os tipos de colagénio presentes. Pode depois realizar-se uma selecção negativa por um certo número de técnicas. Por exemplo, podem tratar-se as células em suspensão com um anticorpo monoclonal de um isotipo que é capaz de activar o complemento (p.e., IgG, IgM, etc.) e que define um componente de matriz particular (p.e., tipos de colagénio de I a 11/, elasti-na, tropoelastina ou fibronectina) para isolar sub-populaçães de células capazes de sintetizarem cada produto. Se se tratarem da- 6261-031-118 // -41- í/ pois as células com complemento de cobaia, as células às quais o anticorpo monoclonal se ligou ficarão danificadas ou destruídas. As células viáveis que restam da amostra podem então ser colocadas de novo em cavidades de microtitulo, tal como anteriormente se descreveu, cultivam-se até à confluência e recolhem-se. Pode verificar-se a eficiência da técnica de isolamento examinando a matriz, segregada pelas células sobreviventes, com anticorpos mo-noclonais apropriados visualizados por técnicas de marcação direç, ta ou indirecta.

Para o crescimento óptimo das células hematopoiéticas, a matriz inicial deverá conter os tipos de colagénio III, V e I, nu ma proporção de cerca de 6:3:1. (c) Crio-conservacão dos fibroblastos melhoradores de crescimento

Podem crio-conservar-se os fibroblastos melhoradores de crescimento usando as mesmas técnicas que anteriormente se descrjí veram para as células de estroma. Tal como as células de estroma alguns dos fibroblastos melhoradores do crescimento podem também separar-se da rede durante o congelamento. Esta matriz, porém, contribui ainda para a ligação das células de estroma de medula e deste modo, diminui o tempo necessário para o estabelecimento de uma matriz que conduz ao crescimento de células hematopoiéticas.

6.3 INOCULAÇÃO COM CÉLULAS HEMATOPOIÉTICAS

Suspendem-se as células de medula óssea num meio nutriente apropriado (p.e., pode usar-se RPMl/1640 suplementado com FBS, HS, hidrocortisona, e antibióticos apropriados) e inoculam-se no suporte de estroma tri-dimensional. Estas células podem ser quer frescos, quer obtidos a partir de uma amostra anteriormente crio--conservada que é rapidamente descongelada, por exemplo, num banho de água quente a 802C. Nas redes com células de estroma sub- confluentes inoculam-se as células numa concentração adequada. 6 7

Por exemplo, podem inocular-se 10 a 10 células em matrizes de estroma tri-dimensional em vasos de cultura de plástico de 25 mm e cultivam-se a uma temperatura de cerca de 332C a 34^C e em 5% 2 -42- 69 900 6261-031-118 de CO^ em ar ambiente. A humidade relativa destas culturas deverá ser em excesso, de cerca de 90$. Após 3 dias deverá aumentar--se a temperatura da cultura até uma temperatura de cerca de 35SC a 37SC.

Em geral, as células hematopoiéticas crescerão nas bolsas naturais formadas pelas células de estroma subconfluentes e pelas células progenitoras que permanecem na camada aderente de células. A camada aderente é constituída pelas células ligadas directamen-te à rede ou pelas células ligadas indirectamente, por ligação a células que estão, elas próprias, ligadas directamente à rede. Ainda que a colonização hematopoiética ocorra rapidamente, a sementeira de estroma parece ser o passo limitativo da velocidade, para a hematopoiáse, uma vez que as células hematopoiéticas do inóculo ficam semeadas principalmente nas áreas onde está presente uma matriz suporte de estroma. A colonização ocorre nos inte-restícios formados pelas camadas de estroma parcialmente desenvol. vidas e pode ser também observada na superfície mais exterior da matriz. As colónias de superfície são um pouco mais pequenas do que as que se formam na matriz e parecem, por vezes, fazer parte da zona não aderente. De facto, estão fracamente ligadas e perma necem após a alimentação. Estas células, que também se contram consistentemente na monocamada do tipo LTBMC, têm sido designadas por camada "pseudo-aderente" (Coulombel et al., 1983, Blood 62: :291-297).

Após 4 a 5 dias, os granulocitos maduros, as células mono nucleares e os eritrocitos aparecem na camada não aderente tal co mo são observados pela preparação de citospina. Após 7 a 10 dias, podem ser observadas nos interestícios da rede, numerosas colónias hematopoiéticas, e são morfologicamente consistentes com o CFU-C, com colónias mistas e com colónias linfoides. 0 crescimento mega. cariocítico é limitado mas pode também ser observado nesta matriz. Uma cultura média de 3,6 cm produzirá 450 a 950 CFU-C por semana.

As culturas que consistem de células de estroma e de célu las hematopoiéticas, obtidas a partir do mesmo indivíduo (autolo-gas) deverão ser alimentadas duas vezes por semana. As culturas 69 900 6261-031-118 Ί!

-43- que consistem de uma medula óssea de paciente que foi^inoculada numa rede de células de estroma obtidas a partir de outro(s) in-divíduo(s) (alogeneicas) deverão ser alimentadas três vezes por semana para assegurar o despovoamento adequado de células imuno competentes maduras da camada não aderente.

6.4 CRESCIMENTO POR PERÍODOS PROLONGADOS DE CULTURAS DE ICDULA Óssea tri-dimensionais

Facultativamente, as culturas de medula óssea tri-dimen-sionais podem ser inoculadas com células mono-nucleares para melhorar o crescimento por períodos prolongados. Podem preparar--se células mono-nucleares de sangue periférico a partir de uma suspensão heparinizada usando "Ficcoll-hypaque" ou Percoll. Preferivelmente, as células de sangue periférico e as células hema-topoiéticas de medula óssea deverão ser obtidas a partir do mesmo indivíduo (autólogas). Estas podem ser obtidas por venipunctura e crio-conservadas na altura em que se colhe o espécime de medula óssea. Se necessário durante o processo de cultura podem obter--se células de sangue periférico adicionais, a partir do paciente doente. Contudo, se se suspeita de uma doença metaestática, a amostra deve primeiro ser sujeita a uma purga tal como anterior-mente se referiu. Podem inocular-se as células mononucleares na cultura tri-dimensional logo após a inoculação das células de medula óssea. Podem inocular-se nas redes, por exemplo, 5 x 10^ a 10^ células mononucleares (neste passo, para a camada de células mononucleares, o tipo de células preferido é o constituído pela subpopulação de monocitos), 4 a 5 dias após a inoculação inicial com células hematopoiéticas de medula óssea e depois, de três em três semanas. Este procedimento pode melhorar a hematopoiese em 10 a 13$ tal como é observado numa base semanal.

De acordo com a experiência dos aplicantes, as culturas de células de estroma confluentes não suportarão ou na melhor das hipóteses, suportarão apenas muito deficientemente, a hematopoiese. E possível o crescimento indefinido de progenitores hemato-poiéticos humanos, se lhes forem fornecidos os factores de cres-cimento/reguladores, derivados de estroma, necessários. 0 proces-

69 900 6261-031-118 -44- so de cultura tri-dimensional do presente invento permite que as células de estroma mantenham um estado subconfluente e produzam assim os factores necessários para a hematopoiese por períodos de tempo prolongados. Porém, o período de tampo pode ser prolongado por outras manipulações do s-lstemá de cultura tri-dimensional.

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Por exemplo, pode dividir-se a amostra de medula artificial num certo número de aliquotos, contendo cada um aproximada-mente 10 células hematopoiéticas. Inocula-se cada uma destas fracções na rede de células de estroma subconfluentes. Pode acojn panhar-se o desenvolvimento das culturas por observação directa, com um microscópio de fase inversa, e por contagens diferenciais das células não aderentes, tal como se pode observar na preparação de citospina do meio consumido, após cada alimentação. Antes de atingir a confluência, as culturas são tratadas com colagenase e ultra-sonicadas ligeiramente durante cerca de 6-10 minutos. As células hematopoiéticas e as células de estroma dissociadas da cultura podem ser fraccionadas, por exemplo, por métodos de grad_i ente de densidade. As células hematopoiéticas podem ser contadas usando um hemacitometro e podem crio-conservar-se aproximadamente 50$ usando os métodos que anteriormente se descreveram. 0s restantes 50$ das células hematopoiéticas podem ser divididos em al_í quotas consistindo de aproximadamente 10^ células cada, e podem ser inoculados em culturas de células de estroma subconfluentes que foram escalonadas e cultivadas em paralelo. Quando estas começam a atingir a confluência, pode repetir-se o mesmo procedimen to. Esta técnica: (a) perpetua o crescimento de células hematopoiéticas fornecendo um micro-ambiente que produz os factores de crescimento requeridos e (b) forma um banco continuo onde se podem depositar os progenitores hematopoiéticos até se terem números adequados para um enxerto.

6.5 MODULAÇÃO DA HEMATOPOIESE EM CULTURA DE MEDULA ÓSSEA TRI--DIMENSIOMAL POR PERÍODOS PROLONGADOS

Podem subcultivar-se os vários componentes celulares da medula humana, no sistema tri-dimensional, como culturas separadas. Podem cultivar-se separadamente, macrofagos, células reticulares,

-45- J 69 900 6261-031-118

7ϋ adipocitos e fibroblastos e poda modificar-se a sua actividade secretora por tratamento com vários agentes. Já anteriormente se descreveu a modulação da actividade dos fibroblastos.

Pode também modular-se a hematopoiese em cultura de medula humana por períodos prolongados na rede tri-dimensional, por secreçBes de macrofagos extra-medulares (células de Kupffer), quando cultivadas em cultura do seguinte modo. As células de Kupffer podem ser separadas do seu estroma de órgão, por exemplo, por digestão de pronase. Resumidamente, podem incubar-se espécimes de tecido, durante 1 hora, em solução de pronase /~0,2$ de pronase (Calbiochem) e solução salina equilibrada de Geys (BSS)J7 com uma ligeira agitação. 0 pH da solução deverá ser mantido entre 7,3 e 7,5 usando, por exemplo, NaOH IN, Adiciona-se desoxir-ribonuclease (0,5 mg; Calbiochem) em intervalos de 30 minutos, durante o procedimento anterior e filtra-se a suspensão de células resultante e centrifuga-se a 350 x g durante 10 minutos. Pode ressuspender-se o sedimento em BSS de Geys e podem separar-se as células litorais (macrofagos e células endoteliais) dos restos celulares e das células de sangue maduras usando um gradiente de Percoll (Pharmacia). A fracção de células resultante deverá ser lavada três vezes, durante três minutos cada vez usando, por exem pio, um meio de Dulbecco modificado, enriquecido com 10$ de soro fetal de bovino, e colocada em placas de cultura de plástico com g um volume contendo 3 a 4 x 10 células.

Após incubação durante 1 dia, removem-se as células não aderentes, por lavagem com o meio de cultura e as células aderentes podem ser mantidas a 332C numa mistura gasosa consistindo de cerca de 6$ de C02 em ar ambiente, com uma humidade relativa, em excesso, de cerca de 80$. 0 crescimento e/ou a actividade secretora destas células podem ser estimuladas: (a) variando a propor, ção C02:02, (b) tratando as culturas com esferas de látex, (c) tratando as culturas com silica, (d) adicionando prostaglandina E2, ou F2^ ao meio, e, (f) suplementando 0 meio com interleuci na 1 ou interleucina 2. Os produtos da secreção de macrofagos p_o dem ser modificadas por estes procedimentos/agentes. 69 900 6261-031-118 j». β &

-46-

Pode usar-se o meio condicionado com os produtos de secre ção destes macrofagos para modular a razão eritropoiêtica/granulo poiético da cultura de medula óssea por períodos prolongados.

6.6 USOS DO SISTEMA. · DE CULTURA DE MEDULA OSSEfl TRI-DIMENSIONAL

6.6.1 TRANSPLANTAÇÃO

Podem usar-se as culturas de medula óssea tri-dimensionais, do presente invento, para o tratamento de doenças ou de condiçães que destroem as células de medula óssea saudáveis ou que diminuem a sua capacidade funcional. 0 processo é eficaz especialmente no tratamento de malignidades hematológicas e de outras neoplasias que se disseminam por metastase na medula óssea. Este aspecto da invenção é também eficaz no tratamento de pacientes cuja medula óssea foi adversamente afectada por factores ambientais (p.e. . ra diaçães, toxinas, etc.), quemoterapia e/ou terapia de radiação ne cessitadas por uma doença que não afecte directamente a medula os. sea. Nestes casos, por exemplo, podem remover-se células de medu, la óssea de um paciente saudável, conservam-se e depois replicam--se e reinfundem-se, caso o paciente desenvolva uma doença que destrua a medula óssea, quer directamente quer uma doença cujo tratamento afecte adversamente a medula. D sistema de cultura tri-dimensional da presente invento tem várias vantagens para um paciente que necessite de um transplante de medula óssea. Se o paciente for receber as suas próprias células isto é designado por um transplante autólogo; este transplante tem uma pouca probabilidade derejeição. Os transplar» tes autólogos eliminam uma causa importante de rejeição de transplantes de medula óssea, isto é, o enxerto versus reacção do hospedeiro. Se a medula contém células malignas ou doentes, podem purgar-se mais eficazmente pequenas amostras quando se usa o sistema- de cultura tri-dimensional da invenção. Tal como anterior-mente se explicou, os métodos selectivos para a purga de células malignas ou doentes funcionarão melhor em pequenos volumes de células de medula óssea. 0 sistema de cultura tri-dimensional que aqui se descreve torna isto possível. Deste modo, pode purgar-se 69 900 6261-031-118

-47-mais eficazmsnte uma pequena amostra obtida .a partir do paciente usando um método selectivo que mate as células malignas e que po_u pe, no entanto, as células saudáveis. Podem depois expandir-se consideravelmente as células saudáveis restantes usando o sistema de cultura tri-dimensional da invenção. Adicionalmente, o processo do presente inv/ento permite o tratamento mais agressivo de desordens neoplásticas com agentes quemoterapêuticos e com radiação. Presentemente a extensão destes tratamento é muitas vezes limitada pela toxicidade da medula óssea.

6.6.2. ACOMPANHAMENTO DA EVQLUCflQ DA CONDIÇÃO DE UM PACIENTE

Num paciente com cancro ou com outras doenças é, por vezes, eficaz acompanhar a evolução da condição do paciente, aspirando uma porção da medula óssea do paciente e examinando a amostra. Deste modo pode detectar-se uma metastase ou uma recorrência antes desta ser clinicamente óbvia. Podem também acompanhar--se deste modo pacientes com outras condiçães que são detectáveis pelo exame da medula óssea.

Usando o sistema tri-dimensional do presente inv/ento, o *· crescimento por períodos prolongados de células obtidas a partir de um espécime de medula óssea aspirado que não foi purgado aume.n ta a probabilidade da detecção de células clonais mestastáticas e hematopoiéticas com anormalidades cromossómicas. Estas células deverão ser expandidas clonalmente no sistema de cultura tri-dimensional da invenção e, assim, serão mais facilmente detectadas. Estas células podem escapae à detecção numa amostra convencional de medula óssea recentemente aspirada (não cultivada).

6.6.3. ANALISE DE COMPOSTOS

Pode testar-se a citotoxicidade, em relação à medula óssea, de produtos farmacêuticos, agentes anti-neoplásticos, carcji nogénios, aditivos de alimentares e de outras substâncias, utilizando o sistema de replicaçãu de medula óssea jln vitro, do preserv te invento.

Em primeiro lugar, estabelecem-se culturas de células de medula óssea (incluindo, tanto células de estroma como células he 69 900 6261-031-11Β

-48-matopoiéticas). Depois, expõem-se as culturas a concentrações ua riáveis do agente a testar. Após incubação com os agentes a testar, examinam-se as culturas por microscopia de fase para determi nar a dose mais elevada tolerada (HTD) - a concentração de agente a testar para a qual aparecem as primeiras anormalidades morfológicas. Os testes de citotoxicidade podem ser realizadas usando uma variedade de corantes supravitais para determinar a viabilidji de das células neste sistema tri-dimensional, usando técnicas bem conhecidas dos peritos na arte. A determinação do HTD fornece uma gama de concentrações para testes adicionais.

Uma vez estabelecida uma gama de teste, podem examinar-se concentrações variáveis do agente a testar para determinar o seu efeito na viabilidade, crescimento e/ou morfologia dos diferentes tipos de células que constituem a cultura de medula óssea, por mé todos bem conhecidos dos peritos na arte.

Similarmente podem determinar-se os efeitos benéficos de drogas usando o sistema de cultura tri-dimensional in vitro; por exemplo, podem testar-se factores de crescimento, hormonas, drogas que aumentam a formação de glóbulos vermelhos, etc.. Neste caso, podem expòr-se ao agente a testar, culturas em crescimento estáveis. Após a incubação, podem examinar-se as culturas para determinar a viabilidade, o crescimento, a morfologia, o tipo de células, etc., como indicação da eficiência da substância teste. Podem testar-se concentrações variáveis da droga para obter uma curva de dose-resposta.

Para uso nos testes de citotoxicidade e na determinação de drogas, podem adoptar-se outros sistemas de cultura de células tri-dimensionais, tal como se descrevem no presente invento. Na Secção 18, infra, apresenta-se um exemplo do uso de cultura de me dula tri-dimensional nos ensaios de citotoxicidade.

7. SISTEMA DE CULTURA DE PELE TRI-DIMENSIONAL 0 sistema.de cultura tri-dimensional do presente invento permite a replicação dos elementos epidérmicos e dérmicos ijn vitro , num sistema comparável às condições fisiológicas. Um aspec. 69 900 6261-031-118

aase^·

-49-to importante é o de as células que se replicam neste processo se gregarem-se adequadamente para formar os componentes epidérmicos e dérmicos morfologicamente e histologicamente normais. 0 uso de um sistema co-cultiv/ado tri-dimensional para o crescimento de células epidérmicas e dérmicas tem muitas vantagens em relação aos sistemas de monocamada normalmente usados. Este modelo permite as interacções normais célula-célula e a secreção de factores de crescimento naturais e o estabelecimento de > uma cadeia de tecido conjuntivo virtualmente idêntica a que se ejn contra i_n vivo; em particular, as células de estroma elaboram co. lagénio específico dos tipos e especifico das espécies. A rede resultante, completamente removível, pode ser transplantada, crio -conservada, ou usada como tecido em estudos de citotoxicidade e do mecanismo de drogas. Adicionalmente, este modelo permite o crescimento de fibroblastos sozinhos para formar um equivalente da derme, ou de fibroblastos conjuntamente com queratinocitos eme lanocitos para formar um equivalente da pele a toda a espessura. Todas as células neste sistema tri-dimensional permanecem metabo-licamente activas e sofrem um processo de mitose, uma vantagem im portante em relação a muitos outros modelos. A cultura de pele tri-dimensional da invenção tem uma variedade de aplicações, desde o seu uso como substrato para a análise de compostos, transplantação e enxertos de pele, até ao estudo de doenças de pele e tratamentos. Por exemplo, a necessidade de testes exaustivos a produtos químicos de natureza potencia_l mente tóxica é geralmente reconhecida, e é evidente a necessidade de desenvolver ensaios in vitro rápidos, sensíveis e reproduzíveis, para a avaliação de drogas, cosméticos, aditivos alimentares e pesticidas. 0 modelo de pele tri-dimensional que aqui se descreve permite o uso de um equivalente de tecido como substrato para o ensaio e oferece as vantagens das interacções normais entre as células num sistema que se, parece muito ao estado .in vivo. t E também evidente a necessidade de uma substituição de p.e le, para pacientes queimados, l/ários centros nos Estados Unidos 69 900 6261-031-118

-50- e na Europa têm utilizado aloenxertos e autõenxartos de queratino eitos humanos cultivados para cobrir permanentemente as feridas de queimaduras e de úlceras crónicas (Eisinger et al., 1980, Sur-gery 88:287-293; Green et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:5665-5668; Cuono et al., 1987, Plast. Reconstr. Surg. 80:626--635). Estes métodos são muitas vezes mal sucedidos e estudos re centes têm indicado que o empolamento e/ou a fragilidade da pele nos enxertos sarados podem existir devido a uma anormalidade num ou em mais componentes de tecido conjuntivo que se formam sob a camada de epiderme transplantada (Woodley et al. , 1988, 3AMA 6: :2566-2571). 0 sistema de cultura de pele tri-dimensional do presente invento constitui um equivalente de pele tanto da epide_r me como da derme e deverá ultrapassar os problemas característi-cos dos enxertos de queratinocitos cultivados, normalmente usados. Para além da citotoxicidade e da substituição da pele, as culturas de pele tri-dimensionais têm aplicação em muitos campos da in dústria incluindo a utilização como modelo para o estudo de doenças de pele e desenvolvimento de drogas novas e modalidades de tratamento, e como fonte de agentes farmacológicos segregados naturalmente.

7.1. ESTABELECIMENTO DO SUPORTE DE ESTRQMA TRI-DIMENSIONAL E FORMAÇÃO DO EQUIVALENTE DE DERME A inoculação de fibroblastos na matriz tri-dimensional e o seu crescimento até à subconfluência conduz à formação de um equivalente de derme. Numa concretização preferida da invenção, deixam-se os fibroblastos continuar a proliferar até todo o substrato de crescimento estar coberto; deverá ser de notar que mesmo após os fibroblastos terem atingido a confluência, os fibroblas. tos continuam a dividir-se porque a cultura tri-dimensional permi te a saída de células, evitando deste modo a inibição de contacto. Ainda que se possam usar no inóculo quaisquer fibroblastos, ê van tajoso usar fibroblastos de pela, na medida em que estes depositja rão os tipos apropriados de colagénio e elaboram outros componentes da derme. Os fibroblastos podem ser alogeneicos ou autologos. Podem obter-se facilmente fibroblastos de pele a partir de suspeji -51- 69 900 6261-031-118 sões de células preparadas por desagregação mecânica e/ou enzimá-tica de tecido dérmico. Quando se coloca a suspensão celular obtida em placa, os fibroblastos aderirão mais rapidamente do que as outras células e assim podem ser cultivados até à confluência, recolhidos por tratamento enzimático moderado e inoculados na ma triz tri-dimensional, tal como anteriormente se descreveu.

Logo que inoculados na matriz tri-dimensional, observa-se rapidamente (p.e. em algumas horas) a aderência dos fibroblastos e os fibroblastos começam a crescer através das aberturas da matriz após alguns dias. Estes fibroblastos são metabolicamente a£ tivos, segregam matriz extra-celular e formam rapidamente um equi valente dérmico compreendendo fibroblastos activos e colagénio. Requere-se aproximadamente 60% de confluência dos fibroblastos na matriz tri-dimensional para suportar o crescimento de células de epiderme que são depois inoculadas.

Enquanto que o uso dos fibroblastos sozinhos é suficiente para formar uma matriz de estroma tri-dimensional que funciona c£ mo um equivalente da derme, podem usar-se tipos adicionais de células de estroma para inocular a matriz tri-dimensional. Estes incluem, mas não estão limitados a, células endoteliais, perici-tos, macrofagos, monocitos, linfocitos, células de plasma, adipo-citos, etc..

7.2. INOCULAÇÃO DQ EQUIVALENTE DÉRMICO COM CÉLULAS DE EPIDERME

Por forma a cultivar pele a toda a espessura, i,b.« compreendendo ambas as camadas epidérmicas e dérmica, deverão inocular-se as células de epiderme do equivalente dérmico. Para este fim, podem inocular-se melanocitos e queratinocitos simultaneameri te ou preferivelmente, em sequência. Por exemplo, podem inocula^ -se queratinocitos em melanocitos subconfluentes que foram previa mente inoculados na matriz de estroma.

Os melanocitos e os queratinocitos podem ser alogeneicos ou autologos na sua relação com as células de estroma de fibroblastos e podem ser isolados a partir da pele usando procedimentos conhecidos que envolvem a incubação da pele numa enzima diges. 69 900 6261-031-118

./D

-52-tiva, tal como a tripsina, por forma a separar as camadas dérmica e epidérmica.

Por exemplo, e não como limitação, podem isolar-se os que ratinocitos e os melanocitos como se segue. Pode aparar-se uma amostra de tecido, p.e. de prepúcio, por forma a que toda a súper, ficie possa ser facilmente exposta a antibióticos* Pode lavar-se primeiro o tecido numa solução concentrada de antibióticos, duraji te 20 minutos, seguindo-se duas lavagens subsequentes de dez minu tos cada. Pode depois cortar-se a parte exterior do tecido em pjs quenos bocados e depois colocam-se numa solução de tripsina a 0,15$ (em PBS sem cálcio ou magnésio), removem-se rapidamente, cjg locam-se num recipiente fresco contendo a mesma solução de tripsi, na (por forma a que todo o tecido fique coberto pela solução) e refrigera-se de um dia para o outro a cerca de 2-83C. No dia seguinte, podem remover-se os bocados de tecido da solução de trips.i na e separa-se a epiderme da derme usando fórceps curvas. Pode colocar-se a epiderme num tubo cónico, e pode usar-se cerca de 0,15$ de tripsina em PBS (sem cálcio ou magnésio) para digerir o tecido numa suspensão de células simples; para facilitar este processo pode aspirar-se repetidamente a amostra, para dentro e para fora, de uma pipeta de Pasteam. Quando a amostra parece ser uma suspensão de células simples, pode ser centrifugada a 1400 g, durante cerca de 7 minutos e depois resuspende-se quer em meio de crescimento, quer em meio de crescimento contendo 0,01 mg/ml de PMA, que selecciona os melanocitos. Deste modo, podem produzir--se culturas de queratinocitos ou melanocitos. Podem suspender--se as células de epiderme e usam-se para inocular o equivalente de derme. Alternativamente, pode colocar-se a suspensão de células de epiderme em placa e separam-se os melanocitos e os querati nocitos com base nas suas qualidades de ligação diferenciais. Os melanocitos isolados podem primeiro ser inoculados no equivalente de derme e deixam-se desenvolver durante alguns dias antes da ino culação dos queratinocitos. Este "tecido" cresce rapidamente e pode ser mantido em meio nutriente sem factores de crescimento exógenos.

Uma desvantagem de todas as substituiçães de pele envolve

i a ausência de foliculos de cabelo e de glândulas sudoríferas e se, báceas na área transplantada. Esta deficiência resulta na incapa, cidade do paciente em regular a temperatura normalmente e faz com que o paciente tenha uma pele extremamente seca e ofegue descon-troladamente. Para ajudar a aliviar este problema podem remover--se biopsias das áreas não afectadas de pele e podem implantar--se no equivalente de derme. Localizando estrategicamente estas biopsias, podem introduzir-se no local de transplante foliculos e as glânculas associadas. As biopsias podem estar compreendidas, em dimensão, preferivelmente, entre cerca de 4 cm e 8 cm e podem ser removidas por uma punção de Baker convencional. Podem então remover-se biopsias de tamanho equivalente do transplante dérmico e substituem-se com implantes contendo folículo, criando deste mo do um local transplantado que é histologicamente normal e funcionalmente similar à pele normal.

Como exemplo, e não como limitação, pode preparar-se um sistema de cultura de pele tri-dimensional como se segue: i (a) deixam-se os fibroblastos ligarem-se a uma rede e cultivam-se durante cerca de 7-9 dias para atingir a confluência e depositarem os tipos de colagénio I e III, tal como anteriormente se descreveu em relação ao crescimento de fibroblastos melhoradores, usados no sistema de replicação de medula óssea yitro; (b) colocam-se os melanocitos na rede de estroma e dei-xam-se cultivar até à subconfluência durante cerca de 5 dias > (c) inoculam-se os queratinocitos nos melanocitos sub-confluentes.

Numa concretização preferida da invenção, pode preparar--se um sistema de cultura de pele tri-dimensional como se segue: (a) deixam-se os fibroblastos ligarem-se à rede cultivam -se durante cerca de 14 dias até atingirem a confluêji cia e depositarem os tipos de colagénio I e III; (b) colocam-se os melanocitos na rede de estroma e dei- 69 900

6261-031-118 -54- xam-se cultivar até a subconfluância durante cerca de 5 dias; e (c) inoculam-se os queratinocitos nos melanocitos sub-confluentes.

Em concretizações particulares da invenção, por exemplo e não como limitação, em pacientes queimados pode ser vantajosa tejr -se uma cobertura para a ferida logo após a lesão; nesta situação pode aplicar-se sobre a ferida uma cultura de células tri-di-mensional de acordo com a invenção consistindo essencialmente de

X M fibroblastos e correspondente a derme (e até agora designada por neoderme) e podem aplicar-se subsequentemente os melanocitos e os queratinocitos. A neoderme pode compreender células autalogas ou alogeneicas em relação ao paciente. As células epidérmicas podem ser alogeneicas ou, preferivelmente, autologas em relação ao pac_i ente. D presente invento inclui a implantação de uma neoderme vi va em desenvolvimento, a qual se podem adicionar células de epiderme jín vivo ou iri vitro; alternativamente, podem deixar-se as próprias células do paciente povoar a neoderme transplantada.

7.3. CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA Dfl CULTURA DE PELE TRI-DIl*i£N510-NAL A caracterização morfológica do estroma tri-dimensional indica que os fibroblastos inoculados na matriz se desenvolvem através das aberturas, exibem deposição de matriz e migram através dos interestlcios da rede. A Fig. 1 ilustra a capacidade dos fibroblastos em arranjarem-se, ele próprios, em camadas paralelas entre os feixes de colagénio segregados naturalmente. Estes fibroblastos exibem uma velocidade rápida de divisão celular e de secreção de proteínas. Os melanocitos crescerão normalmente no sistema tri-dimensional pois exibem formação de dendrite, permane cem pigmentados e retêm a capacidade de transferirem pigmento (ver Figs. 6 a 8).

Pode cultivar-se pele, a toda a espessura, de uma varied_a de de maneiras permitindo uma interface de ar. A exposição dos queratinocitos ao ar promove uma diferenciação mais rápida dos 6261-031-118

.....00 ,Α' .

-55- queratinocitos e uma secreção mais extensiva das camadas de quera tina, o que pode ser muito importante em estudos de penetração na pele.

Uma grande vantagem deste sistema de cultura de células em relação a outros normalmente utilizados em pesquisa dermatológica e em estudos de implantação, reside no facto de os fibroblas. tos na matriz tri-dimensional, quer subconfluentes quer confluentes, tal como se descreve supra, permanecerem metabolicamente ac-tivos e segregarem factores de crescimento naturais e os tipos de colagénio naturais I e III. A actividade metabólica normal destas células torna este sistema particularmente vantajoso para uso em ensaios de citotoxicidade bem como no estudo de desordens que afectam directamente a secreção de colagénio ou nas quais uma in-teractuação entre as células de derme e de epiderme resulta em a_l teraçães patológicas consistentes com a doença.

7.4. TRANSPLANTAÇÃO IN UIUQ

Para transplantação ou enxerto I preferível usar matrizes tri-dimensionais construídas de materiais biodegradáveis, p.e. fio "catgut", gelatina, etc.. Estes permitem todas as vantagens de um sistema tri-dimensional e possibilitam que um "tecido" transplantado permaneça intacto enquanto a rede é degradada e absorvida naturalmente pelo organismo sendo substituída por células normais que migram para essa área.

Para formar a matri2 de estroma tri-dimensional será preferível usar fibroblastos de pela obtidos a partir do paciente que vai receber o enxerto. Alternativamente, podam usar-se fibra, blastos fetais ou uma mistura de fibroblastos fetais e de fibroblastos de paciente. Contudo, de acordo com a invenção podem usajr -se fibroblastos de fonte autologa, aloganeica ou xenogeneica; o Exemplo da Secção 19 ilustra uma concretização específica da invenção na qual se cultivam fibroblastos humanos de acordo com a invenção, implantam-se e enxertam-se com sucesso no porco. 0 que é mais importante, porém, é que as últimas células de epiderme inoculadas podem ser vantajosamente obtidas a partir do paciente por forma a minimizar o risco de rejeição do enxerto. -56- 69 900 6261-031-118

Numa concretização alternativa deste aspecto da invenção, a matriz suporte de estroma tri-dimensional que forma a neoderme pode ela própria ser enxertada na ferida do paciente. Neste caso, as próprias células de epiderme do paciente na área ferida invadj. rão a matriz de estroma e proliferarão na matriz de estroma jln vivo para formar pele a toda a espessura, i.e., com ambas as camadas de epiderme e de derme. Alternativamente podem semear-se as células de epiderme na neoderme» ou podBm aplicar-se folhas de cê lulas de epiderme. Quando se pretendem cobrir grandes áreas feri. das, pode preferir-se enxertar a cultura de pele tri-dimensional completa, ou usar combinações de ambas as culturas de neoderme e de pele a toda a espessura. Por exemplo, podem enxertar-se neoderme nas extremidades da ferida e cultura a toda a espessura nas áreas centrais da ferida para melhorar o crescimento e a cura da ferida e minimizar a formação de cicatrizes.

7.5. APLICAÇÕES IN l/ITRO DA CULTURA DE PELE TRI-DIMENSIONAL

As culturas de pele tri-dimensionais podem ser mantidas in vitro e podem ser usadas para uma variedade de propósitos, incluindo o teste de toxicidade de compostos, o estudo do mecanis mo de acção de drogas, o estudo de desordens e doenças de pele, etc..

Pode usar-se a cultura de pele tri-dimensional, como subs trato para testar a citotoxicidade de compostos e de outras substâncias. Por exemplo, para uso em ensaios de citotoxicidade, podem cultivar-se células humanas em redes que podem ser cortadas em discos de 6 mm, colocam-se os discos em placas de microteste de cultura de tecido de fundo plano de 96 cavidades, e alimentam--se com meio apropriado. Pode depois adicionar-se a substância a testar a cada amostra. Pode aplicar-se vantajosamente a substância a testar por técnica de diluição limitante, o que permita que neste caso se possa testar uma gama de concentrações da substância tóxica. Cada tipo de tecido pode ser representado por três linhas de redes por forma a obterem-se resultados em triplicado. Pode realizar-se um ensaio adequadamente controlado como se segue: rede sozinha; rede inoculada com fibroblastos$ rede inoculada

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69 900 6261-031-118 -57- com Fibroblastos e queratinocitos; rede inoculada com Fibroblas-tos e melanocitos; θ rede inoculada com Fibroblastos, melanoci-tos e queratinocitos. Podem adicionar-se agentes químicos a cada um destes substratos e incubam-se, p.e. durante 24 horas. 0 efei. to citotóxico destas substâncias pode ser avaliado de um certo nú mero de maneiras. Por exemplo, pode adaptar-se um método conveni ente, o bem conhecido ensaio de vermelho-neutro, para uso neste sistema. Nesta altura, após a remoção do meio, pode lavar-se cada cavidade antes da adição de uma solução de reserva aquosa de 0,4/o de corante vermelho neutro. Após vários intervalos de tempo remove-se o corante 1 lavam-se rapidamente com 4,0;$ de formaldel-do, 1,0% CaC^. Após cerca de 20 minutos, pode medir-se a quant_i dade de corante presente em cada amostra de tecido, lendo a abso_r vância com um leitor de micro-placas Dynatech equipado com um fil_ tro de 540 nm. A quantidade de corante vital absorvida é directa mente proporcional ao número de células viáveis presentes em cada cavidade. As leituras podem ser ponderadas e podem exprimir-se os resultados como a absorvSncia observada em relação aos níveis das linhas de base as culturas de controlo.

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Estudos recentes têm mostrado que a pele á um elemento integrante e activo do sistema, imunolóoico (Copper et al., 1987, "The mechanobullous diseases". _In: Dermatology in General fedici-ne, 3§. Ed. , McGratu Hill, NY, pág. 610-626). U ma das células mais importantes da pele, que é responsável por várias imuno-activida-des, é a célula de Langerhans. Podem preparar-se estas células, a partir de amostras de pele Frescas e adicionam-se à cultura de pele tri-dimensional para produzir um sistema de tecido imunolo-gicamente completo. 0 crescimento destas células na cultura, por períodos de tempo prolongados, por técnicas de cultura de tecido convencionais, é difícil. A capacidade de cultivar estas células no sistema tri-dimensional será da maior importância em todos os aspectos do estudo incluindo enxerto, citotoxicidade e mecanismos de doença. Este tipo de sistema de cultura de pele terá o maior impacto na pesquisa envolvendo desordens auto-imunes que têm envolvimento cutâneo directo ou indirecto (lupus, eritematose, pen-figoide bulhosa, etc.).

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Tal coma anteriormente sa explicou, -pode também usar-se a cultura de pele tridimensional para testar a sensibilidade a ale_r genos. Para testes de alergia podem inocular-se as culturas de pele com linfocitos (ou células de plasma) e com mastocitos obtidos a partir de um paciente. A exposição da cultura a um alerge-no que "liga" os anticorpos IgE (produzidos por linfocitos) ligados a mastocitos residentes, resultaria na libertação pelos masto, eitos de mediadores vasoactivos tais como histamina. A libertação da histamina na cultura pode ser medida e pode correlacionar--se com a resposta alérgica da pessoa ao alergeno a testar.

8. SISTEMA DE CULTURA TRI-DIMENSIONAL DE TECIDO DE FÍGADO

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Os hepatocitos podem ser isolados por métodos convencionais (Berry e Friend, 1969, 3. Cell Biol. 43:506-520) que podem ser adaptadas para material de biopsia ou de autópsia de fígado humano. Resumidamente, introduz-se uma cânula na veia porta cu num ramo da porta e perfunde-se o fígado com tampão sem cálcio ou magnésio até que o tecido pareça pálido. Perfunde-se depois ο όχ gão com uma enzima proteolitica, tal como uma solução de colagena se, com um caudal adequado. Isto deverá digerir a cadeia de teci do conjuntivo. Lava-se depois o fígado em tampão e dispersam-se as células. Pode filtrar-se a suspensão de células através de uma rede de "nylon" de 70^{η para remover os restas celulares. Podem seleccionar-se os hepatocitos a partir da suspensão de célu las, por duas ou trâs centrifugaçães diferenciais.

Para a perfusão dos lóbulos individuais de fígado humano excisado pode usar-se tampão HEPES. A perfusão de colagenase em tampão HEPES pode realizar-se a uma velocidade de cerca de 30 ml/ /minuto. Obtém-se uma suspensão de células simples por incubação adicional com colagenase durante 15-20 minutos a 37SC (Guguen--Guillouzo e Guillouzo, eds, 1986, "Isolated and Culture Hepatoc^ tes" Paris, INSERM, e London, Oohn Libbey Eurotext, pág. 1-12; 1982, Cell Biol. Int. Rep. 6:625-628).

Podem depois usar-se os hepatocitos isolados para inocular o estroma tri-dimensional. 0 estroma inoculado pode ser cul tivado tal como se descreve para a medula óssea e para a pele, por

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69 900 6261-031-118 -59- tema comparável luma expressão forma a replicar os hepatocitos jLn vitro, num sis às condições fisiológicas. Isto deverá resultar i funcional aumentada pelos hepatocitos.

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As culturas de fígado mantidas deste modo podem ser utili zadas para uma variedade de propósitos incluindo testes de citoto xicidade, análise de drogas» etc. Numa concretização, podem usajr -se culturas de fígado tri-dimensionais para testar carcinogénios e mutagénios in vitro. Mais particularmente, é bem conhecido que um certo número de compostos falha na acção como mutagénios em ojç ganismos teste tais como bactérias ou fungos, causando no entanto tumores em animais experimentais tais como ratinhos. Isto é dev_i do à activação metabólica; i. e. , alguns químicos são metabolica-mente alterados por enzimas no fígado (o sistema da oxidase P450 e os sistemas de hidroxilação) ou noutros tecidos, criando compo_s tos novos que são mutagénicos e carcinogénicos. De modo a identi. ficar estes carcinogénios, Ames e os seus colaboradores conceberam um ensaio para testes que envolve a incubação do composto quí mico com extractos de fígado antes da exposição do organismo teste ao produto metabólico (Ames et al., 1975, Mut. Res. 31:347-364). Ainda que seja uma aproximação mais sofisticada ao ensaio de Ames, falta-lhe ainda sensibilidade. Por contraste, as culturas de fígado tri-dimensionais podem ser utilizadas tanto como conversores metabólicos como"organismo teste" para determinar a mutagenicida-de ou a carcinogenicidade da substância que está a ser testada.

9. SISTEMA MODELO TRI-DIMENSIONAL PARA A BARREIRA SANGUE-CEREBRO

De acordo com a invenção pode produzir-se um sistema modelo de cultura de tecido tri-dimensional para a barreira sangue--cérebro. Resumidamente, esta cultura tri-dimensional recria a barreira de células endoteliais que separa o sistema nervoso cen trai da corrente sanguínea, cultivando primeiro células endoteliais, obtidas a partir de pequenos vasos sanguíneos do cérebro, até a confluência numa rede tri-dimensional. Aplicam-se, primeiro os astrocitos e depois os neurónios, à matriz de estroma confluente formada por células endoteliais, de modo que as células endoteliais formam uma barreira entre uma superfície da cultura,

acima, e os neurónios em baixo. Uma substância aplicada à superfície de células endoteliais tem de penetrar através da camada de células endoteliais para atingir os neurónios que se encontram sob ela.

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Por exemplo, e não como limitação, podem isolar-se as células endoteliais a partir de pequenos vasos sanguíneos do cérebro de acordo com o método de Larson et al. (1987, Microvasc. Res. J54:184) e os seus números podem ser expandidos por cultura in vi-tro usando métodos convencionais. Estas células endoteliais de pequenos vasos podem depois ser inoculadas numa rede adequada (p. e. a rede de filtração de "nylon'* fabricada pela Tetko, Inc.,^,3--210/36) e depois cultivadas até à confluência completa; pode usar-se a coloração com prata, para determinar a presença de complexos de junção forte, específicos do endotélio de pequenos vasos e associados com a função de barreira do endotélio.

Os neurónios e os astrocitos podem depois ser obtidos a partir de ratazanas embrionárias ou perinatais e depois separados uns dos outros por técnicas convencionais (Hattan et al., 1988, 3. Cell Biol. 106: . Por exemplo, os neurónios podem ser se

J parados dos astrocitos por aderência doferencial a um substrato, os astrocitos aderindo a placas pré-revestidas com 100^g/ml de poli-D-lisina e os neurónios aderindo a placas pré-revestidas com 500 ^ig/ml de poli-D-lisina. Os astrocitos podem depois ser inoculados em matrizes de estroma tri-dimensional de células endo. teliais confluentes, cultivam-se durante um período de cerca de 5 dias e depois inoculam-se com células de neurónio. 0 sistema de cultura de tecido tri-dimensional de camadas múltiplas compreende uma camada de células endoteliais de vasos sanguíneos pequenos e outras de astrocitos e neurónios e recria a estrutura da barreira sangue-cérebro que se encontra in vivo» onde as substâncias no sangue têm de penetrar o endotélio de pequenos vasos sanguíneos para atingirem o tecido de neurónios do cérebro. 0 sistema pode ser usado para testar a capacidade das substâncias em atravessar a barreira sangue-cérebro. Em virtude de muitas substâncias serem incapazes de atravessar esta bajç 69 900 6261-031-118 -61-

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reira, existe uma grande necessidade premente de um sistema in vitro para testar rapidamente as capacidades de penetração dos agentes teste. Por exemplo, muitos antibióticos são incapazes de atravessar a barreira sangue-cérebro. Seria útil poder-se testar rapidamente antibióticos recentemente desenvolvidos para determinar a sua capacidade de penetração; os relativamente poucos anti bióticos que podem ser usados para tratar infecções do sistema nervoso central, muitos dos quais são relacionados com a penicilj. na e, deste modo, estão associados ao risco de reacção alérgica, criam uma necessidade urgente para o desenvolvimento de novos age_n tes CNS-activos.

10. SISTEMA DE CULTURA DE TECIDO DE PANCREA5 TRI-DIMENSIONAL

As suspensães de células acinares pancreáticas pod8m ser preparadas por adaptação de técnicas descritas por outros (Ruoff e Hay, 1979, Cell Tissue Res. 204:243-252; e Hay, 1979, in. "Methodological Surveys in Biochemistry. l/ol. 8, Cell Populations" London, Ellis Horniuood, Itd., págs. 143-160). Resumidamente, o tecido á moído e lavado em tampão sem cálcio nem magnésio. Incubam-se os fragmentos de tecido moído numa solução de tripsina e colagenase. As células dissociadas podem ser filtradas usando uma rede de "nylon" de 20 m, ressuspendem-se num tampão adequado, tal como solução salina equilibrada de Hanks, e sedimentam-se por centrifugação. 0 sedimento de células resultante pode ser de novo suspenso em quantidades mínimas de meio apropriado e inocula -se no estroma tri-dimensional preparado tal como anteriormente se descreveu. As células acinares podem ser identificadas com ba_ se nas inclusães de gotículas de zimogénio. A cultura de células acinares pancreáticas no sistema de estroma tri-dimensional dev_e rá prolongar a sobrevivência das células na cultura.

11. EXEMPLO: SISTEMA DE CULTURA TRI-DIMENSIONAL DE MEDULA Q5SEA

As sub-secções seguintes demonstram que o sistema de cultura tri-dimensional pode ser usado para o estabelecimento de cultura de medula óssea por períodos prolongados para humanos, primatas não humanos (macaco) e ratazanas. As culturas tri-dimeri -62- sionais foram avaliadas por microscopia electrónica de varrimento e o conteúdo celular foi avaliado por um certo número ds métodos. 0 conteúdo do progenitor foi avaliado por CFU-C e BFU-E e o conteúdo celular por contagens diferenciais e análise citofluorográ-fica usando anticorpos monoclonais marcados específicos de diferentes linhagens de células hematopoiéticas.

Os resultados indicam que o sistema de cultura tri-dime_n sional suporta a expressão de várias linhagens hematológicas tal como é evidenciado pelas contagens diferenciais das zonas não ad.e rente e aderente, das células humanas, de macaco e de ratazana. A análise citofluorográfica das células ligadas ao estroma tri-di-mensional, i.e., a zona aderente, revelou a presença de precursores mielóides precoces e maduros, granulocitos maduros, linfoci-tos B e T, megacariocitos/plaquetas e monocitos/macrofagos.

Ainda que o número de células progenitoras localizadas na matriz seja variável, este facto pode ter resultado das popula-çães aleatórias de células de estroma usada para formar a matriz suporte.

Uma vez que a hematopoiese pode ser dependente de activi-dades e de factores relacionados com o crescimento, produzidos pe las células do suporte, as culturas tri-dimensionais foram cultivadas em balães que continham também uma mono-camada confluente de células de estroma. No sistema de cultura tri-dimensional na presença de células de estroma confluentes, observou-se uma inibi^ ção tanto da hematopoiese, como do crescimento das células de estroma; i.e., a mono-camada confluente de células de estroma presente no balão, parece "apagar" o sistema.; de cultura tri-dimens_i onal. Quando se tranferiu a cultura tri-dimensional para um outro balão, observou-se a recuperação da hematopoiese. Este resuJL tado sugere que os produtos de células de estroma influenciam não apenas as células hematopoiéticas, mas também outros elementos de estroma.

Nas subsecçães seguintes descrevem-se os processos, os re sultados e os dados obtidos. 69 900 6261-031-118

11.1. PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS DE MEDULA QSSEA

11.1.1. MEDULA 055EA HUMANA

Aspirou-se a medula óssea de vários locais da cristã ilíji ca posterior de voluntários adultos hematologicamente normais após se ter obtido consentimento. Recolheram-se os espécimes para tubos hepatinizados e suspenderam-se em 8 ml de meio RPMI 1640 que foi condicionado com 10$ de FBS e 5-10$ de HS e suplementado com hidrocortisona, fungizona, e estreptomicina. Desagregaram-se os conglomerados de células e dividiram-se em aliquotas de 5 x 106 células nucleadas.

11.1.2. MEDULA OSSEfl DE PRIMATA NÃO HUMANO

Adquiriram-se fémures intactos de macaco cinomólogo no Charles River Primate Center (Porter Washington, NY, E.U.A.). S_e pararam-se os terminais de epífise dos fémures do eixo do osso sob condiçBes estéreis. Removeu-se a medula vermelha, suspendeu--se em meio e dividiu-se em aliquotas de 5 x 106 células nucleadas.

11.1.3. MEDULA ÓSSEA DE RATAZANA

Anestesiaram-se ratazanas Long-Evans adultas, machos (225--400 g) com éter e após a remoção dos seus fémures, retirou-se o sangue a partir da aorta abdominal, usando seringas hepariniza-das. Separaram-se os fémures e rasparam-se os conteúdos de medula para uma caixa de petri esterilizada contendo 3 ml de meio de Fischer (Gibco, NY) condicionada com 10$ de FBS e 10$ de HS e suplementado com hidrocortisona, fungizona, heparina e antibióticos (Naughton et al., 1987, 0. Med. 18:219-250), Prepararam-se all-quotas de 5-7 x 10^ células.

11.2. ESTABELECIMENTO DA MATRIZ DE ESTROMA TRI-DIMEN5I0NAL

Usou-se tela de filtração de "nylon" (Ψ3-210/36, Tetko Inc., NY, E.U.A.) como molde para suporte todos os LTBMC que se descrevem nos exemplos seguintes. A tela consistia de fibras que tinham 90y^m de diâmetro, reunidas num padrão de tecido quadranqu 69 900 , 6261-031-118 - / ·' -64- lar com aberturas de rede de 210 μm. Inocularam-se as células de estroma usando os protocolos que se descrevem nas sub-secções seguintes. Seguiu-se a evolução da aderência e do crescimento subsequente dos elementos de estroma usando microscopia de contraste de fase inversa e microscopia electrónica de varrimento (SEM).

11.2.1. PREPARAÇÃO Dfl TELA E INOCULAÇÃO DE CÉLULAS DE ESTROMA PARA LTBMC HUMANA

Lavaram-se peças de tela com 8 mm x 45 mm em ácido acético 0,1 M durante 30 minutos e trataram-se com suspensão de polili sina 10 mM durante 1 hora para melhorar a ligação das células de suporte. Colocaram-se numa caixa de petri esterilizada e inocula 6 ram-se quer com 5 x 10 células de medula óssea humana, quer com iguais números de fibroblastos fetais humanos (#GM 1380, Coriell Institute» NY, E.U.A.). Cultivaram-se as fibroblastos fetais humanos até à confluência em mono-camadas, usando meio RPMI 1540 condicionado com 10$ de FBS, 5-10$ de HS, suplementado com hidro-cortisona, fungizona e estreptomicina, a 352C, em 5$ de C02 e com uma humidade relativa em excesso de 90$. Removeram-se estas células usando colagenase (10 ^g/ml durante 15 minutos) e transferi ram-se para a tela. Após 1-2 horas de incubação com 5$ de C02> colocaram-se as células num recipiente de cultura Corning de 25 2 cm e trataram-se com mais 5 ml de meio. As telas inoculadas com células de estroma de medula foram transferidas de um modo similar.

11.2.2. PREPARAÇÃO DA TELA E INOCULAÇÃO DE CÉLULAS DE ESTROMA PARA LTBMC DE PRIMATA NÃO HUMANO

Para a LTBMC de células de macaco utilizaram-se duas matrizes: rede de nylon inoculada com fibroblastos fetais humanos (tal como anteriorments se descreve) e rede de "nylon" que foi inoculada com 5 x 10^ células de medula óssea femural de um macaco cinomólogo. As condições de cultura e os protocolos de pré--tratamento da tela foram idênticos aos utilizados para as culturas humanas que anteriorments se descrevem. -65- 69 900 6261-031-118

11.2.3. PREPARAÇÃO Dfl TELA E INOCULAÇÃO DflS CÉLULAS DE ESTROMA PARA A LTBMC DE RATAZANA

Lavaram-se peças de tela de "nylon" com 8 mm x 45 mm em ácido acético 0,1 M durante 30 minutos e revestiram-se com colagái nio de ratinho do tipo IV solubilizado (Laboratórios Gibco, NY, E.U.A.) durante 1-2 horas* Inoculou-se a tela com 5-7 x 10 células de medula femural de ratazana Long-Evans e após 1-2 horas de incubação em 5% de 00« a 332C, transferiu-se a rede para um re ^ 2 cipiente de cultura de 25 cm . Para pôr a tela a flutuar adicionaram-se 5 ml de meio.

11.3. INOCULAÇÃO DA MATRIZ DE ESTROMA TR1-DIMEN5I0NAL COM CÉLULAS HEMATQPOIETICAS E ESTABELECIMENTO DA CULTURA

Quando aproximadamente 70$ das aberturas da rede estavam ligadas com células de suporte (10-14 dias para o estroma de rata zana, 7-13 dias para o estroma humano e de macaco, e 4-7 dias para os fibroblastos fetais humanos), transferiram-se as telas para 6 caixas de petri esterilizadas e inocularam-se com 5 x 10 células de medula óssea nucleadas humanas ou de macaco ou com 2-5 x 10^ células de medula femural de ratazana, respectivamente. Após 2 horas de incubação em 5% de C0£ agitou-se cada tela, lentamente, num recipiente Corning de 25 cm^ ao qual se adicionaram 5 ml de meio. Alimentaram-se as culturas de 5 em 5 dias por substituição do meio consumido com meio fresco. 0s vasos de cultura foram tani bém examinados para determinar o aparecimento de mono-camadas de células nas paredes dos vasos. Se estas mono-camadas estivessem presentes numa confluência superior a 25$, as culturas tri-dimen-sionais eram transferidas para outros recipientes.

11.4. EXAME DA CULTURA DE MEDULA 05SEA TRI-DIMENSIONAL 0 crescimento das células de medula óssea e o conteúdo das células das culturas tri-dimensionais foram avaliados histolo gicamente, por contagens diferenciais, por análise CFU-C e BFU-E, e por análise citofluorográfica tal como a seguir se descreve. -66- -66- i 69 900 6261-031-118

11.4.1. EXAME HISTOLOGICO

Para o estudo de microscopia electrónica, sacrificaram-se as culturas em vários instantes após a primeira inoculação de células de estroma e a segunda inoculação de células hematopoiéti-cas. Resumidamente, cortaram-se as telas de ‘'nylon" em 4 partes aproximadamente iguais e ficaram-se em solução tampão de fosfato com 3% de gluteraldeído, lavaram-se, desidrataram-se em acetona e colocaram-se num secador de Ponto Crítico Denton. Em alguns casos, a camada de estroma foi fisicamente rompida para permitir a visualização do crescimento das células das camadas interiores (Naughton et al., 1987, 0. Med. 18:219-250). Revestiram-se os es. pécimes com 60^ de ouro e 40$ de paládio e estudaram-se com uma SEM Amray.

0 padrão de crescimento das células humanas e de macaco na LTBMC tri-dimensional foi similar ao das de medula óssea de ra tazana. Resumidamente, as células de estroma (quer obtidas a pajç tir de medula quer de fibroblastos fetais humanos) cresceram linearmente ao longo de, e envolveram cada cadeia de "nylon" antes de começarem a cobrir as aberturas da rede (Fig. l). As células hematopoiâticas (e de estroma) do segundo inóculo foram semeadas nos interestícios naturais formados pelos processos de células de estroma que estão presentes em pelo menos 13% das aberturas na re de de 3,6 cm3 (Fig. 2). As células hematopoiêticas parecem não se ligar directamente ao "nylon" mas, em vez disso, às áreas onde as células de suporte estavam ligadas. A colonização foi evidente em todas as culturas, nos 3-6 dias após a segunda inoculação de células hematopoiêticas. A rede de 210jm forneceu érea suficiente para a expressão de colónias eritroides, mieloides e outras (Fig. 2). Observou-se a hematopoise, nas superfícies exteri ores da LTBMC tela de "nylon", mas foi mais extensiva nos interestícios das células de suporte em desenvolvimento.

11.4.2. CONTAGEM TOTAL DE CÉLULAS E ANALISE DE CITOSPINA D0 MEIO CONSUMIDO DA LTBMC TRI-DIMENSIONAL

Efectuaram-se contagens totais de células e preparaçães

69 900 6261-031-118 - 6 7 - de citospina usando meio consumido, removido quando se alimentam as culturas (de 5 em 5 dias). As contagens de células foram efe.c tuadas usando o método do hemacitometro. As citospinas foram coradas com Wright's-Giemsa e as contagens diferenciais foram reali zadas em campos aleatórios. A análise das lâminas de citospina preparadas apés cada alimentação revelou a presença de precursores em estado avançado das linhagens eritroide, mieloide e linfoi. de, nas culturas humana e de macaco (Tabela II). Estas persistiram até ao fim da cultura de cada espécie testada (39 dias para a ratazana, 12,5 semanas para os primatas), ainda que as percentagens relativas dos tipos de células tenham variado. Os macrofa-gos/monocitos/fibroblastos libertados para a zona não aderente das culturas humanas aumentou com o tempo,.principalmente à custa das células mieloides (Tabela II).

TABELA II CONTEÚDO CELULAR DA ZONA NÃO ADERENTE* __humano

Tempo de cultura Contagem diferencial (%) (semanas) MY E L MAC/BTR Outros 0 63,9 19,0 10,8 3,6 2,7 1 59,0 14,0 8,6 14,9 3,5 2 48,5 14,4 9,9 23,7 3,9 3 51,9 9,2 9,6 24,7 4,6 4 41,2 10,4 6,1 33,9 8,4 5 41,9 12,7 10,3 29,0 6,1 6 45,2 11,2 8,0 27,2 8,4 7 39,8 10,1 6,3 34,8 9,0 8 38,6 9,8 6,5 37,1 8,0 9 40,3 5,6 6,6 38,4 9,1 10 35,9 5,5 6,8 40,6 11,2 11 31,3 6,7 5,4 43,2 13,4 12 30,1 5,0 4,1 44,6 16,2 -68- 69 900 6261-031-118

MACACOS

Tempo de cultura Contagem diferencial {%) (semana) MY E L MAC/STR Outros 0 64,8 14,2 10,1 8,2 2,7 1 60,2 16,0 6,8 12,9 4,1 2 57,4 14,9 7,5 16,4 3,8 3 49,7 12,4 10,0 23,5 4,4 4 49,7 9,9 7,9 26,2 6,3 5 43,0 10,7 6,1 32,0 8,2 6 39,2 8,0 6,0 36,7 10,1 7 ND ND ND ND ND 8 38,8 4,3 8,4 39,2 9,8 9 27,6 7,7 8,6 46,1 10,0 10 35,5 6,2 7,7 42,0 10,6 11 ND ND ND ND ND 12 35,4 6,0 6,9 39,2 12,5 Os resultados reflectem uma média de 3 ra continha uma tela de "nylon" com 3, -5 culturas. Cada cultu 6 cm'*'. MY=mieloide , E=eritroide, L= linfoide, MAC/STR=macrofagos, mono eitos e células fibroblasticas, Outros =megacariocitos, blastos nSo identificados. ND=n3o realizado.

H.4.3. CONTAGENS DE CÉLULAS TOTAIS E ANALISE DE CITQSPINA DA ZONA ADERENTE DA LTBMC TRI-DIMEN5I0NAL

As contagens de células da zona aderente foram realizadas em diferentes intervalos de tempo da LTBMC, tratando a tela com uma mistura 1:1 de colagenase e tripsina (lO^g/ml) e com uma ul-tra-sonicação suave. Esta análise da zona aderente da LTBMC huma na e de macaco cinomologo revelou que a percentagem relativa de células de estroma para células hematopoiéticas aumentava na cultura com o tempo (Tabela III). Em particular» à medida que a co-

-69- J 69 900 6261-031-118 /

lonizaçSo hematopoiêtica prosseguia, a percentagem relativa de elementos de estroma caia. Contudo, o crescimento de cálulas de estroma nos últimos períodos do LTBMC ocorre à custa da hematopo.i ese.

TABELA III CONTEÚDO CELULAR DA ZONA ADERENTE* __HUMANO Tempo de cultura Contagem diferencial (%) (semana) de estroma E MY Outras 1 66,4 6,2 20,4 7,0 2 60,0 5,4 26,4 8,2 3 54,2 6,6 29,2 10,0 4 62,6 6,8 24,5 6,1 5 65,1 2,7 25,2 7,0 6 65,4 6,1 21,6 6,9 7 59,7 7,7 25,4 7,2 8 64,3 5,1 24,0 6,6 9 72,9 2,7 18,4 6,0 10 73,2 3,7 17,7 5,4 11 71,3 3,0 19,6 6,1 12 74,7 2,9 17,4 5,0

MACACOS

Tempo de cultura Contagem diferencial (%) (semana) de estroma 1 53,1 2 66,0 3 68,6 4 57,0 5 56,6 6 63,1 7 ND 8 68,1 9 59,3 10 70,0 11 ND 12 65,3 E MY Outras 8,0 35,7 3,2 8,3 19,2 6,5 7,4 18,1 5,9 5,1 29,2 8,7 5,8 27,5 10,1 3,9 24,0 9,0 ND ND ND 4,8 20,2 6,9 4,0 27,3 9,4 4,4 17,3 8,3 ND ND ND 4,2 21,9 8,6 69 900 6261-031-118

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As células da zona aderente foram desagregadas por tratamento com enzima. 0 estroma inclui fibroblastos, macrofagos, células do tipo adipo-citos e endoteliais» E=eritroide; MY=mieloide; Outros=linfoide, tromboides e blastos não identificados. ND=não efectuado -71- 69 900 6261-031-118 FBS e colocando a suspensão sobre uma camada de 106 PBLs em 0,5% de agar (Griffin et al., 1981, 0. Clin. Invest. 68:932). Contaram-se as colónias nos dias 7 e 14 após a colocação em placa (372C, 7% de CO2). As BFU-E humanas foram testadas após várias intervalos de tempo da LTBMC em 0,8% de metilcelulose em meio de Iscove contendo 30% de FBS, 1% de albumina de soro bovino, 10“^ M de me.r captoetanol, 2,5-5 I.U./ml de eritropoietina urinária humana parcialmente purificada (Waughton et al., 1985, 0. Surg. Oncol. 30: :184-197) e 4,5% de meio condicionada de leucócitos humanos estimulado com fito-hemaglutinina (Cashman et al., 1983, Blood 61:876--884).

Em relação aos números presentes no inóculo inicial recuperaram-se números substanciais de CFU-C da zona aderente das LTBMC de ratazana e humana (Fig. 4). As constatações preliminares indicam que o BFU-E persistiu também na LTBMC humana (Tabela IV).

TABELA IV

BFU-E NA ZONA ADERENTE EM \MRI0S INTERVALOS DA LTBMC

Tempo de cultura

(semanas; Números de BFU-E medula não cultivada 19 +_ 6 2 14+4 4 12 + 5 7 8+3 9 11 + 6 10 8+3 y 5

Colónias por 10 células; média de 3-4 placas +, SEM

11.4.5. ANALISE CIT0FLU0R0GRAFICA D0 TEOR CELULAR DA ZONA ADERENTE DA LTBMC TRI-DIMENSIONAL A análise citofluorográfica do teor celular das zonas adjs rentes de LTBMC humana e de macaco foi realizada usando o sistema 69 900 6261-031-118 -72- EPIC5 (Coulter Electronics, Hialeah, Fia. E.U.A.). Separaram-sa as células da tala de "nylon”, em vários intervalos após a inocu lação das células hematopoiéticas, usando colagenase e tripsina, seguindo-se uma lavagem extensiva. Incubaram-se depois as células durante 45-60 minutos em solução salina equilibrada de Hank, com Ca ou Mg . Fazem-se depois reagir com os anticorpos mono clonais seguintes, que estavam conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC)í Mo-1, T-3, B-l, Plt-1 e My-9 (Coulter Immu-nology, Fia. E.U.A,), Como controlos usaram-se células murinas tratadas com IgM-FITC. Escolheram-se as janelas de classificaçUo com base na fluorescência e nos histogramas de desvio da luz. De finiu-se, apropriadamente, uma janela de 0,255 e determinaram-se os perfis celulares. A análise citofluorográfica das zonas aderentes das eultu ras humanas nas semanas 2, 7 e 10,5 confirmou a presença de células mieloides precoces (MY-9) e maduras (Mo-l), de linfocitos B (B-l) e T (T-3), de megacariocitos/plaquetas (Plt-l) e de monoci-tos/macrofagos (Mo-l) (Tabela l/). 69 900 6261-031-118

-73-

TftBELfl \l REACTIVIDADE MEDIA PERCENTUAL DE MEDULA ÓSSEA NfiO CULTIVADA E DE CÉLULAS DE LTBMC TRI- •DIMENSIONAL, COM ANTICORPOS MONOCLONAIS3 MAb Humano*3 LTBMC de 2 semanas LTBMC de 7 semanas LTBMC de 10,5 semanas Não cultivada B-l 10,20+1,43 6,76+0,98 22,73+1,37 11,96+1,13 T-3 18,64+1,88 11,18+1,86 13,01+1,84 9,90^0,64 Plt-1 4,40+1,33 8,08+0,92 17,05+4,10 8,72+1,83 Mo-1 10,10+1,04 17,26+2,29 20,98+1,14 3,46+0,25 My-9 3,98+0,26 3,70+0,68 3,46+0,25 1,46+0,54 Macaco0 MAb LTBMC de 7 semanas Não cultivadas B-l 31,01 8,37+0,99 ίΛ 1 1— 18,13 11,56+2,1 Plt-1 46,50 8,53+1,09 Mo-1 40,87 26,64+2,25 My-9 21,64 5,49+0,83 a A reactividade percentual média foi calculada subtraindo, à marcação não específica, o controlo murino-IgM-FITC. MAb=anticorpo monoclonal. b Os resultados reflectem os valores de 4-5 culturas (+1 SE).

Os tempos indicados são posteriores à inoculação de células especificas de tecido. c Média de 2 culturas inoculadas em fibroblastos fetais humanos.

As LTBMC humanas e de macaco podem ser estabelecidas num estrato de fibroblastos humanos fetais mas esta matriz não suportará o crescimento de LTBMC de ratazana. As células de fibroblas. tos fetais atingem um estado de subconfluência que permitirá a inoculação das células de medula muito mais cedo do que o estroma -74- 69 900 6261-031-118 de medula. Quando se cultiva medula óssea de macaco num leito de fibroblastos fetais o perfil fenotípico da zona aderente mostra que reagem mais células com o anticorpo Plt-1 do que nas outras culturas estudadas, mas representam-se também outras linhagens hje matológicas (Tabela V). Não é conhecido até que ponto esta constatação reflecte a reactividade cruzada do anticorpo ou um desvio na população de células da zona aderente, mediado pelas células fetais.

11.4.6. 0 EFEITO DflS MQNQ-CAMADAS DE CÉLULAS DE ESTROPIA CONFLUEN TES ND CRESCIMENTO CELULAR EM CULTURAS TRI-DIMEN5IQNAI5

Adicionaram-se células de medula femural de ratazanas Long-Evans ou de macaco cinomolgo a uma coluna de 13 Fenu/al empacotada tal como é descrito por Bostuell e colaboradores (Bosmell et al. , 19B7, Exptl. Hematol. 15:46-53). Resumidamente, colocam-7 8 -se 10-10 células de medula femural em 4 ml de meio e adicionam -se através de uma coluna de lã de "nylon" que foi pré-incubada a 379C durante 45 minutos no meio. Após 45 minutos adicionais de incubação, drenaram-se as células não aderentes e removeram-se as células aderentes por lavagem extensiva e eluição com solução de EDTA-l/ersene (1:5000 em solução salina; GIBC0, Grand Island, N.Y., 7 E.U.A.). Em paralelo, inocularam-se aproximadamente 10 células 2 em recipientes de 25 cm e cultivaram-se até 50% e 100^ de confluência. Inseriram-se em cada recipiente LTBMC de tela de "nylon" prê-estabelecidas que estam normalizadas em relação ao tempo após a segunda inoculação. Observou-se microscopicamente o crescimento da LTBMC de tela de "nylon" e da monocamada. Realizaram-se con tagens de células e ensaios de citospina da zona não aderente, de 5 em 5 dias. As contagens diferenciais de preparaçães de citospi. na das células aderentes dissociadas com enzima foram realizadas 5 dias após a inserção da LTBMC de tela de "nylon".

Quando se co-cultivam mono-camadas de células de estroma confluentes com LTBMC de tela de "nylon", inibem-se na cultura em suspensão, tanto a hematopoiese como o crescimento de células de estroma (Tabela Ml), quando se compara com LTBMC suspensas em recipientes sem estroma aderente (p inferior a 0,05) ou com células 69 900

6261-031-118 -75- de estroma com uma confluência de aproximadamente 50$ (p inferior a 0,05). Adicionalmente, a co-cultura com mono-camada de estroma confluentes provoca o desprendimento e a libertação, para a zona não aderente, de células de estroma associadas à rede. As colónias hematopoiéticas coalescem e param de crescer. Se se transfere a LTBMC para um outro recipiente, observa-se a recuperação da hematopoiese em 3-5 dias.

TABELA VI EFEITO DAS MONO-CAMADAS DE ESTROMA COM UMA CONFLUÊNCIA DE APRQXI- MADAMENTE 50$ E 100$, NA PROLIFERAÇÃO CELULAR DE UMA LTBMC DE RE- DE DE "NYLON" EM SUSPENSÃO PARA A RATAZANA -CAMADA NA PRQLIFE 100$ de conflu ência Células Tempo de ex, . ~ b posição EFEITO DA M0N0 RACÃ0 CELULAR1 50$ de confljj ência (dias) células de es- 7 0 + 2,5 -13,5 _+ 4,7 tromac 15 +3,3 + 2,0 -18,0 _+ 5,1 28 +1,7 i 0,9 -24,3 + 4,0 Células hemato 7 -1,0 + 4,1 -17,3 + 5,2 poiéticas2 3·* 15 +6,3 + 3,4 -30,8 7,7 28 + 2,7 _+_ 1,9 -49,9 +_ 10,2 1

Inclui fibroblastos, macrofagos, células do tipo adipocitos e células endoteliais. 2

Os resultados estão expressos como -diferenças de percentagens médias (+/-) _+ 1 SEM quando comparados com o crescimento de LTBMC na ausência de células aderentes no fundo do recipiente. Testaram-se as culturas de medula óssea de rede de "nylon" nas 3 semanas após a segunda inoculação (com células hematopoieti-cas). ^ Tempo após a introdução da LTBMC de tela de "nylon" num recipji ente contendo células aderentes em, aproximadamente, 50$ ou 100$ de confluência.

Q -76- -76- d

Inclui blastos e precursores em estado avançado de todas as linhagens.

12. EXEMPLO: .SISTEMA DE CULTURA DE PELE TRI-DIMEN5IQNAL

As sub-secçães seguintes descrevem o sistema de cultura tri-dimensional da invenção para a cultura de pele irs vitro. Resumidamente, estabelecem-se culturas de fibroblastos em rede de "nylon" que foi previamente esterilizada. Nos 6-9 dias de incuba^ ção, os fibroblastos aderentes começam a crescer através das abejç turas da rede e depositam feixes paralelos de colagénio. A imuno -fluorescência indirecta usando anticorpos monoclonais mostrou predominantemente a presença de colagénio do tipo I, estando presente também algum do tipo III. Após 7 dias colocam-se na cadeia de fibroblastos co-culturas de melanocitos e queratinocitos. Não se adicionou TPA ou toxina de cólera pois os factores tróficos s3o produzidos pelos fibroblastos subconfluentes da camada adereji te. Os estudos de microscopia electrónica revelaram células de pele com caracteristicas morfológicas e ligaçães célula-célula normais.

i2.1. ESTABELECIMENTO DO ESTROMA TRI-DIMENSIONAL

Isolaram-se os fibroblastos de pele moendo o tecido dérmi co, por tripsinização durante 2 horas e separação das células para uma suspensão por meios físicos. Cultivaram-se os fibroblas- \ tos até a confluência em placas de cultura de tecidos Falcon de 2 25 cm e alimentaram-se com RPMI 1640 (Sigma, MO, E.U.A.) suplementado com 10$ de soro de bovino fetal (FBS), fungizona, genta-micina e penicilina/estreptomicina. Colheram-se os fibroblastos por tripsinização moderada e colocaram-se as células em rede de filtração de "nylon", cujas fibras têm aproximadamente 90de diâmetro e que estão reunidas num tecido quadrangular com uma abertura de rede de 210 ^m (Tetko, Inc., NY, E.U.A.). Pré-tratou, -se a rede com uma lavagem com ácido moderado e incubou-se em po-lilisina e FBS. Observou-se a aderência dos fibroblastos nas 3 horas seguintes, e os fibroblastos começaram a crescer através -77- das aberturas da rede 5-7 dias após a inoculação inicial. Estes fibroblastos eram metabolicamente activos, segregaram uma matriz extracelular e formaram rapidamente um equivalente dérmico compreendendo fibroblastos activos e colagénio. A Fig. 1 é uma mi-crografia electrónica de varrimento ilustrando a ligação dos fibroblastos e a extensão dos processos celulares através das aber. turas da rede.

12.2. INOCULAÇÃO DOS MELANOCITOS E QUERAT1M0CITQS

Os melanocitos foram isolados de acordo com o método de Eisinger e Marko (1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:2018-2022). Resumidamente, incubaram-se amostras de pele em tripsina durante 4-6 horas, permitindo a separação das camadas de epiderme e de derme. Suspenderam-se as células de epiderme em meio e colocaram -se em recipientes de cultura de tecido Falcon de 25 cm . Separa ram-se os melanocitos dos queratinocitos pelas suas qualidades de ligação preferenciais. Colocaram-se os melanocitos isolados em rede de "nylon" revestida com fibroblasto e deicaram-se a desenvolver durante 3 dias antes da adição dos queratinocitos. Os melanocitos crescem normalmente neste sistema pois exibem formaçSo de dendrite, permanecem pigmentados e mantêm a sua capacidade para transferir pigmento para os queratinocitos. A Fig. 6 ilustra o aparecimento dos melanocitos após 3 dias no sistema de cultura tri-dimensional. Os queratinocitos isolados foram colocados nos melanocitos 3-4 dias depois. Este "tecido" cresce rapidamente e é mantido em RPMI 1640, 10% de FBS e nos antibióticos apropriados Uma vez que os factores de crescimento naturais são segregados pe los elementos de derme, não é necessária a adição de factores exó genos (p.e., TPA, toxinas de cólera, etc., tal como se descreve em Sengel, 1983, em Biochemistry and Physiology of Skin, Vol. 1, pág. 102-131, Oxford Univ. Press, NY; e Eisinger et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:1937-1941).

12.3. ANALISE HISTOLÓGICA DA CULTURA DE PELE

Todas as culturas de pele foram examinadas histologicamen te por microscopia óptica usando o procedimento seguinte: fixou-

J 69 900 6261-031-118

-ss todo o tecido em gluteraldeído tamponizaclo a 2,5%, desidratou, -se com etanol e clarificou-se em xileno antes da incrustação em parafina. Cortaram-se secçães com uma espessura de 6 a 8 ^tm, coraram-se com hematoxilina-eosina e examinaram-se para avaliar as características morfológicas normais e alteradas.

Nas fotomicrografias das figs. 7 e 8» mostra-se uma sec- a

J ção transversal deste modelo de pele. £ óbvia a orientação e a morfologia normal das células. Os componentes de epiderme e de derme rodeiam completamente as fibras da rede e é evidente uma junção de derme-epiderme distinta (Fig. 7). Os queratinocitos ma nifestam uma morfologia normal e contêm grânulos de pigmento, e observa-se uma maturação de células com a evidência da formação de um stratum corneum (Fig. 8).

12.4. TRANSPLANTAÇÃO Dfl CULTURA DE PELE TRI-DIMENSIONAL IN VIVO

Os estudos de transplantação dos aplicantes em ratazanas indicaram que este sistema tri-dimensional permite o enxerto rápi. do dos componentes de derme e de epiderme, sem rejeição.

Nos estudos de transplantação de pele utilizaram-se vinte e quatro ratazanas. Cortaram-se as redes em pedaços circulares com 6 mm, esterilizaram-se em autoclave, trataram-se com ácido mo derado, incubaram-se com colagénio do tipo 11/, incubaram-se com soro de bovino fetal e inocularam-se com células de estroma com ou sem uma segunda inoculação de queratinocitos. As redes cobertas com componentes de células de derme e/ou de epiderme foram sjj turadas em áreas feridas e examinadas atentamente cada 12-14 horas como se segue: as ratazanas receberam uma ligeira anestesia com éter e raparam-se as suas superfícies dorsais e lavaram-se com uma solução de betadina. Fizeram-se punçães de 6 mm com uma agulha de biopsia de punção de Baker descartável e usou-se uma sutura sub-cuticular para manter as redes implantadas no lugar. Examinaram-se as ratazanas cuidadosamente nas 12 horas após a cirurgia e depois de 24 em 24 horas.

As áreas da implantação da rede não mostraram quaisquer sinais de eritema, dilatação, exudato ou fragilidade. Removeram- 69 900 6261-031-118 é?

-79--se as redes 7 dias, 14 dias e 21 dias após a transplantação. Nas

Figs. 9 e 10 ilustram-se os resultados destes transplantes todas as células de pele são visíveis 7 dias após o transplante (Fig. 9). Na Fig. 10 mostram-se os queratinocitos (k), os fibroblas- tos (f), o colagénio (c), os adipocitos (a) e células de músculos lisos (s), todas distribuídas numa configuração natural à volta da fibra da rede de "nylon" (m). A ausência de linfocitos e de outros imuno-componentes, conjuntamente com a ligação natural fo_r % te das células a rede indica que não está a ocorrer qualquer rejeição JLn vivo.

Realizaram-se estudos paralelos nos quais se implantaram redes com componentes de derme e de epiderme em biopsias de pele de 10 mm x 10 mm que foram depois mantidas em cultura durante 14 dias e examinadas histologicamente. Observaram-se nestes transplantes _in vitro padrães de migração celular, ligação e diferenciação similares. 0s estudos de enxertos até à data ajudam a substanciar a hipótese de que o sistema de matriz tri-dimensional do presente invento é um verdadeiro sistema fisiológico no qual todos os componentes celulares são activados sendo produzidos os factores de crescimento naturais.

Ainda que o presente invento seja descrita em pormenor por referência às suas concretizaçães específicas deve ser entendido que se podem fazer modificaçães partindo do espírito do presente invento tal como acima se descreve e a seguir se reivindica.

13. EXEMPLO: SISTEMA DE CULTURA TRI-DIMENSIONAL DE FÍGADO

13.1. MATERIAIS E MÉTODOS

13.1.1. ANESTESIA

Injectou-se intraperitonealmente uma ratazana Long-Evans adulta pesando aproximadamente 300 g, com 0,3 ml de pentabarbital de sódio injectável. -80- 69 900 6261-031-118 & // . - - ------

13.1.2. DISSECAÇÃO 0 animal foi picado com um fórceps agudo para assegurar que estava adequadamente anestesiado. Fez-se uma incisão na linha média entre o processo xifóide e a área inguinal seguindo-se outras incisães para produzir abas permitindo a entrada na cavidade abdominal. Os intestinos e os outros órgãos foram empurrados para o lado direito do animal, expondo a veia porta hepática. Expôs-se ainda mais a meia porta por dissecação e atou-se uma sutura 4,0 à volta da veia porta hepática distai em relação ao lugar onde se ia colocar o cateter. Colocou-se uma segunda sutura à volta da veia porta hepática próximal em relação ao local onde se ia colocar o cateter. Fez-se um pequeno furo na veia porta he pática com uma agulha de calibre 21. Ligou-se a bomba peristálti ca e iniciou-se uma infusão de 500 ml de tampão HEPES (contendo 4,1 g de NaCl, 0,25 g de KC1, 3 ml de NaOH 1 M, e 10 ml de HEPES de reserva a 0,24$ p/v); imediatamente depois cortou-se a veia cava inferior para permitir que o tampão se escapasse. Apôs a in fusão estar completa, desligou-se a bomba e removeu-se gentilmente o fígado para um funil de Buckner e depois perfundiu-se com solução de colagenase (0,4 g de NaCl, 0,05 g de KC1, 10 ml de reserva de HEPES (supra), 0,07 g de CaCl2.2H20, 6,6 ml de NaOH 1 M, 50 mg de colagenase em 100 cm3, ajustada a um pH 7,6, a 37SC). Dei. xou-se a perfusão continuar durante 15-20 minutos. Filtrou-se o conteúdo do funil de Buckner e removeu-se o fígado e colocou-se em solução de colagenase contendo 1,5$ (p/v) de BSA.

13.1.3. PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE CÉLULAS

Separaram-se os lóbulos do fígado perfundido e aparou-se o parenquima exterior. Moeu-se depois o parenquina interior em / \ 9+ 2 + solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) contendo Ca e Mg em quantidades fisiológica. Deixaram-se assentar os fragmentos de tecido de fígado grandes e centrifugou-se depois a suspensão de células através de um gradiente de Percoll (5 ml de DMEM mais 0,5 Iu/ml de insulina, 0,004 mg/ml de glucagon e 20$ de soro de bovino fetal), colocou-se num tubo de centrífuga cónico de 50 ml, adicionou-se HBSS, mais Ca e Mg em quantidades fisiológicas, -81- 69 900 6261-031-118 atê è marca dos 50 ml e por cima do HBSS ficaram 5 ml da solução de Percoll de trabalho /"""70$ de Percoll de reserva mais 30$ de PBS; o Percoll de reserva continha 9 partes de Percoll e 1 parte de meio de Dulbecco 10 vezes mais concentrado^, por centrifugação a 800 g durante 10 minutos. As células de parenquima de fí gado foram recolhidas do fundo do gradiente e adicionadas às culturas de rede tri-dimensionais com estroma subconfluente.

13.1.4. PREPARAÇÃO DA MATRIZ DE ESTROMA TRI-DIMEN5I0NAL

Lavaram-se peças de 8 mm x 45 mm de tela de filtração de "nylon" ($3-210/36, Tetko, Inc., NY, E.U.A.) em ácido acético 0,1 M durante 30 minutos e trataram-se com suspensão 10 mM de po-lilisina durante 1 hora. Colocaram-se as redes numa caixa de pe-tri esterilizada e inocularam-se com 1 x 106 fibroblastos colhidos a partir de fígado de ratazana em meio completo DMEM. Apés 1- -2 horas de incubação em 5$ de C0„ colocaram-se as telas num reci ^ 2 piente de cultura de tecido Corning de 25 cm , suspenderam-se com mais 5 ml de meio e deixaram-se atingir a subconfluência, sendo alimentadas com intervalos de 3 dias.

3,3.1,.5. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE TECIDO DE FIGADQ TRI-DIMENS10-NAIS

Apés a inoculação das células parenquimatosas de fígado na matriz de estroma tri-dimensional, mantiveram-se as culturas em meio DMEM completo a 372C e em 5$ de C0^ numa atmosfera humidificada e alimentaram-se com meio fresco de 3 em 3 dias.

3-3.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As células de fígado adulto cultivadas deste modo exibiram uma mitose activa e continuaram a segregar proteínas durante um período de tempo de três semanas. Os hepatocitos orientaram--se eles próprios em cordães de células (Fig. ll) e pareceram-se histologicamente com os hepatoblastos ou com as células de fígado regenerantes durante os primeiros 10-12 dias de cultura tri-dime_n % sional (Fig. 12). A medida que as culturas se íam tornando altamente confluentes, as células parenquimatosas começaram a parecejç -82-

-82- J 69 900 6261-031-118

-se com hepatocitos adultos maduros, com células do dueto biliar, com células de Kupfter e com outras células de estroma de fígado ainda presentes. As células dividiram-se, aproximadamente de 24 em 24 horas durante os primeiros 10-12 dias de cultura e continua, ram a dividir-se de 72 em 72 horas durante um período de até três semanas. A secreção de albumina continuou durante o período de cultura de três semanas e os hepatocitos mantiveram as suas enzimas activadas o que lhes permitiu metabolizarem produtos .in vitro. Após as culturas atingirem a confluência total, puderam ser manti das como substratos viáveis durante um período de até 12 semanas.

14. EXEMPLO: -SISTEMA DE CULTURA DE TECIDO DE EPITELIO DE MUCOSA TRI-DIMENSIONAL

14.1. MATERIAIS E MÉTODOS

14.1.1. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS DE EPITELIO DE MUCOSA

Obtiveram-se amostras de tecido de mucosa oral a partir de espécimes de cirúrgia ortodôntica. Lavou-se o tecido três vezes com MEM fresco contendo antibióticos (2 ml de solução de anti biótico antimicótico, da GIBCO nS. de Cat. 600-5240 AG; e 0,01 ml de solução de gentamicina da GIBCO, nS. de Cat 600-5710 AD por 100 cm^ de MEM), cortou-se em pequenos bocados, lavou-se depois com 0,02/6 de EDTA (p/v). Adicionou-se 0,25/6 de tripsina (em PBS sem Ca ou Mg ); alguns segundos depois removeram-se pedaços de tecido e colocaram-se em 0,25/6 de tripsina (em PBS sem Ca2 + ou Mg2+) e arrefeceu-se a 4SC de um dia para o outro. Removeram-se depois os tecidos e colocaram-.se em solução fresca de tripsina e agitou-se gentilmente até as células parecerem formar uma suspensão de células individuais. Diluiu-se depois a suspensão de células individuais em MEM contendo 10/6 de soro de bovino fetal, de sactivado por calor e centrifugou-se a 1400 x g durante 7 minutos. Decantou—se o sobrenadante e colocou—se o sedimento contendo as células de epitélio de mucosa em meio de sementeira. 0 meio consistia de DMEM com 2p de Ultrosen G, 1 x L-glutamina, 1 x amino-ácidos não essenciais, penicilina e estreptomicina. Semearam-se depois as células na matriz de estroma tri-dimensional (ver infra). -83- 69 900 6261-031-118

14.1.2. PREPARAÇÃO DA MATRIZ DE ESTROMA TRI-DIMENSIONAL

Gerou-se a matriz de estroma tri-dimensional, usada nas culturas de epitélio de mucosa, usando fibroblastos orais e peças ds 8 mm x 45 mm de tela de filtração de "nylon" (#3-210/36, Tetko Inc., NY, E.U.A.) tal como anteriormente se descreve para as culturas de fígado tri-dimensionais na Secção 13.1.4..

14.1.3. MANUTENÇÃO DA5 CULTURAS DE TECIDO DE EPITELIO DE MUCOSA TRI-DIMENSIONAIS

Após a inoculação das células de epitélio de mucosa na ma triz de estroma tri-dimensional, mantiveram-se as culturas em meio completo DMEM, a 379C e em 5J?o de 00^, numa atmosfera humidificada e alimentaram-se com meio fresco de 3 em 3 dias.

Í4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO A Fig. 13 é uma fotomicrografia de uma secção transversal de uma cultura de tecido de epitélio de mucosa tri-dimensional produzida pelos métodos que anteriormente se descrevem. cou-se que a cultura de tecido reproduz o epitélio escamoso estra tificado da mucosa oral in vivo; ê de notar que a medida que as células se aproximam da superfície da cultura, o núcleo torna-se achatado e orientado num plano paralelo à superfície, tal como ocorre iri vivo.

15. EXEMPLO: SISTEMA DE CULTURA DE TECIDO DE PANCREAS TRI-DI-MENSIONAL

15.1. MATERIAIS E MÉTODOS

15.1.1. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS ACINARES DE PANCREAS

As células acinares de pâncreas foram preparadas por uma adaptação da técnica descrita por Ruoff e Hay (1979, Cell Tissue Res. 204:243-252) e por Hay (1979 em "Methodological Surveys in Biochemistry", Vol. 8, Cell Populations", London, Ellis Horntuood, Ltd. págs. 143-160). 0 tecido foi colhido, a partir de ratazanas

Long-Evans, adultos, machos, e moído e lavou-se com tampão H8SS isento de magnésio e cálcio. Incubou-se depois o tecido moído nu -84- 69 900 6261-031-118 _______ ma solução contendo 0,25 por cento de tripsina e colagenase. Fil-traram-se as células dissociadas usando uma rede de "nylon" de 2Qywm, ressuspenderam-se em HBSS e sedimentaram-se por centrífuga ção a 300 x g durante 15 minutos. Ressuspendeu-se o sedimento re sultante numa pequena quantidade de meio completo DMEM e inoculou. -se na matriz de estroma tri-dimensional (ver infra)♦

15.1.2. PREPARAÇÃO Dfl MATRIZ DE ESTROMA TRI-DIMENSIONAL A matriz de estroma tri-dimensional, usada nas culturas de tecido pancreático, foi gerada usando fibroblastos pancreáti-cos de ratazanas adultas e bocados de tela de filtração de "nylon" (#3-210/36, Tetko, I nc. , l\IY, E.U.A.) tal como se descreve anteri-ormente, para as culturas de fígado tri-dimensionais, na secção 13.1.4..

15.3.,3. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE TECIDO PAiMCREATICQ TRI-DIMEN-SIONAIS

Após a inoculação das células acinares de pâncreas na matriz de estroma tri-dimensional, mantiveram-se as culturas em meio DMEM completo, a 379C e em 5% de C02, numa atmosfera humidificada e alimentaram-se com meio fresco de 3 em 3 dias.

15.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO A Fig, 14 é uma fotomicrografia de uma secção transversal de uma cultura de tecido de pâncreas tri-dimensional produzido pjs los métodos que se descrevem anteriormente. As células acinares da cultura de tecido podem ser identificadas com base nas inclu-sães de gotículas de zimogénio j_"""seta_J7, quando comparadas com o aspecto mais homogéneo das células de estroma (asterisco). As células da "ilhota" permanecem concentradas no centro de cada abertura da rede e formam uma estrutura contendo 1-2 x 10 células segregadoras de insulina.

69 900 6261-031-118 -85-

16. EXEMPLO; .SISTEMA MODELO TRI-DIMENSIOMfll· PARft A BARREIRft SANGUE-CEREBRQ 16.1. MATERIAIS E METQD05

16.1.1. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS ENDOTELIAIS OE PEQUENOS VASOS

As células endoteliais de pequenos vasos, isoladas a partir do cérebro de acordo com o método de Larson et al. (1987, Microvasc. Res. :184), foram cultivadas in vitro usando balães de cultura de tecido T-75. Mantiveram-se as células numa combina ção de Meio de Eagle, com a modificação de Dulbecco/meio Hans-F--12 (a solução está disponível como uma mistura 1; 1). Suplementou -se o meio com 20/ de soro de vitelo fetal desactivado por calor (FCS), glutamina e antibióticos. Semearam-se as células numa con centração de 1 x 10^ células por balão e atingiram um estado de confluência em uma semana. Transfegaram-se as células uma vez por semana e, adicionalmente, foram alimentadas uma vez por semana com DMEM/Hans-F-12 contendo FCS, glutamina e antibióticos,.tal como anteriormente se descreve. Para transfegar as células, lava ram-se duas vezes os balões com 5 ml de PBS (sem Ca ou Mg +) e tripsinizaram-se com 3 ml de tripsina a 0,05/q e EOTA 0,53 mM. se dimentaram-se as células, ressuspenderam-se e testaram-se para de terminar a viabilidade, pela exclusão do azul de tripano, semearam-se e alimentaram-se com 25 ml do meio suplementado DMEM/Hans--F-12 anteriormente referido. Usa-se um ensaio de antigénio rela cionado com o factor VIII (Grulnick et al., 1977, Ann. Int. Med. 86^:598-616) para identificar positivamente as células endoteliais e coloração com prata para identificar os complexos de punção for te, específicas apenas do endotélio de pequenos vasos.

16.1.2. PREPARAÇÃO E SEMENTEIRA DA REDE

Preparou-se a rede de tela de filtração de "nylon" (#3--210/36, Tetko, Inc, , l\IY, _E.U.A.) essencialmente como anteriormen te se descreve para os sistemas de cultura de tecido de fígado, pâncreas e medula óssea, etc.. Lavou-se a rede numa solução de ácido acético (l. ml de ácido acético glacial em 99 ml de t^O destilada) durante trinta minutos e enxaguou-se com pequenas quanti- -86- 69 900 6261-031-118 íl; i - dades de água destilada e, depois, esterilizou-se em autoclave.

Revestiram-se as redes com 6 ml de soro de bovino fetal por rede de 8 x 8 cm e incubou-se de um dia para o outro. Empacotaram-se 7 depois as redes, três em altura e semearam-se 3 x 10 células e_n doteliais de pequenos vasos (cultivadas como anteriormente se dejs creveu) por pacote, e incubou-se durante três horas, a 37SC em 5% de CO^, numa atmosfera humidificada. Alimentaram-se as redes ino culadas com 10 ml de meio DMEM/Hans-F-12 cada 3-4 dias até se atingir a confluência total (em aproximadamente duas semanas). 16.1.3. PREPARAÇÃO DAS POPULACOES DE CÉLULAS DE NEURONIOS E DE A5TR0CIT05

Os neurónios e os astrocitos foram isolados a partir de cerebelo de ratazana fetal. Removeram-se por dissecação os cere-belos de 5 ratazanas e colocaram-se em tampão PBS. Removeu-se dje pois o PBS e adicionou-se, a cada um, 1 ml de solução de tripsina (10 mg de tripsina, 1 ml de PBS com 0,01 g de HgSO^.71-^0 e 6 yul de NaOH 1 l\l). Após 3 minutos, lavou-se o tecido com cerca de 1 ml de tampão PBS e com 2 ml de uma solução de reserva consistindo de 7,5 mg de ADNase mais 15 ml de ΒΙΊΕ de Earles. Suspenderam-se depois as células individuais aspirando o tecido através de agulhas de seringa progressivamente mais pequenas com dimensão compreendida entre o calibre 18 e 25, até a solução ter um aspecto nebuloso. Depois, centrifugou-se a suspensão de células individuais resultante a 800 x g durante 5 minutos e ressuspendeu-se o sedimento de células em meio e fez-se depois passar através de um filtro de 33^*m. Colocaram-se então as células num gradiente de passo de Percoll 60$/35$ e centrifugaram-se durante 10 minutos a 800 x g. As células da interface 0$/35$ eram sobretudo células gliais e astrocitos? as células da interface 35$/60$ eram princi palmente neurónios. Recolheram-se ambas as populaçães e diluiram -se separadamente em 5 ml de PBS, lavaram-se e recolheram-se por centrifugação a 2500 x g durante 5 minutos. Ressuspenderam-se eji tão as células em meio (BME contendo 10$ de soro de cavalo desac-tivado por calor). Colocaram-se separadamente ambos os tipos de células em placas de cultura pré-revestidas com poli-D-lisina. -87- 69 9Q0 6261-031-118

Primeiro, foram colocadas nas placas pré-revestidas com 100da poli-D-lisina, incubaram-se durante 20-45 minutos e depois lavaram-se ligeiramente com PBS; as células gliais e os astrocitos aderiram selectivamente às placas de cultura e os neurónios foram removidos na lavagem. Colocou-se depois o tampão de lavagem em placas de cultura revestidas com 500jaq de poli-D-lisina, tendo neste caso os neurónios aderido as placas de cultura.

16.1.4. SEMENTEIRA DOS ASTROCITOS NAS CULTURAS DE CÉLULAS END0-TELIAIS TRI-DIMENSIONAIS 5

Semearam-se 5 x 10 astrocitos nas redes cobertas com células endoteliais confluentes (que anteriormente se descrevem), re movendo o meio da rede, inoculando as redes com astrocitos e depois incubando durante uma hora, a 379C e em 5% de CC^, numa atmo.s fera humidificada. Alimentou-se depois a rede com DMEM-kl2 conterj do interferão, transferrina, selénio e subsequentemente, alimenta ram-se com intervalos de 2-3 dias.

Í6.1.5. SEMENTEIRA DOS NEUR0NI0S NAS CULTURAS DE TECIDOS DE CÉLULAS END0TELIAIS-ASTR0CIT0S

Aproximadamente 5 dias depois, semearam-se os neurónios nas culturas de tecido de células endoteliais-astrocitos. Colheram-se as culturas de células de neurónios, exibindo um crescimeji to de neurite (que foi observado após cerca de uma semana em cul-tura), e semearam-se cerca de 5 x 10 células nas redes de cultura tri-dimensional de células endoteliais/astrocitos. Semearam--se as células de neurónios num volume mínimo de meio de cultura e, depois, incubaram-se durante 3 horas, a 37SC e em 5% de C02> numa atmosfera humidificada, período de tempo após o qual se al_i mentaram as redes com um volume padrão de DMEM/F12, re-incubaram--se e, subsequentemente, alimentaram-se com intervalos de 2-3 dias.

3.6.2, RESULTADOS E DISCUSSÃO A rede de "nylon" foi pré-revestida com soro de bovino fe tal, na qual se semearam células endoteliais de pequenos vasos,

J 69 900 6261-031-118

-88- cultivadas até à confluência em cultura de mono-camada convencional, e deixaram-se desenvolver até à confluência completa.

Prepararam-se os neurónios e os astrocitos a partir do ce rebelo de ratazanas fetais, e separaram-se por aderência diferencial. Cultivaram-se os astrocitos na matriz de estroma tri-dimeri sional de células endoteliais confluentes e, subsequentemente, adicionaram-se células de neurénio à cultura de tecido tri-dimen-sional.

J i A cultura de tecido tri-dimensional de células endoteli-ais/astrocitos/neurónios resultante foi depois mantida até atingir um segundo estado de semi confluência cobrindo a camada de células endoteliais. Este sistema de cultura tri-dimensional de multi-camada, tal como se mostra na Fig. 15, onde uma camada consiste de células endoteliais confluentes de pequenos vasos sangu^t neos e onde a outra camada consiste de astrocitos e de neurónios, recria a estrutura da barreira sangue-cérebro que se encontra in vivo, onde as substâncias no sangue tem de penetrar o endotélio de pequenos vasos sanguíneos para atingir o tecido de neurónios do cérebro. Pode usar-se este sistema modelo da barreira sangue--cêrebro para estudar a passagem ou a sua ausência, de produtos químicos ou de vírus para o cérebro; é vantajoso determinar quais os antibióticos ou os antivirais, por exemplo, que podem pje netrar a barreira sangue-cérebro para tratar infecçoes do sistema nervoso central. Adicionalmente, pode usar-se este sistema mode lo como substrato para o estudo da acção e da potência de várias neurotoxinas.

17. EXEMPLO: SISTEMA DE CULTURA DE TECIDO DE ADENOCARCINOMA TRI-DIMENSIONAL

17.1. MATERIAIS E MÉTODOS

17.1.1. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS DE ESTROMA E DE PARENQUIMA DE ADENOCARCINOMA

As células de adenocarcinoma foram separadas das células de estroma, moendo as células de tumor em HBSS, incubando as células em Q,27'7& de tripsina, durante 24 horas a 372C e incubando -89- de novo as células em suspensão, em meio DMEM completa, numa caixa de petri de plástico durante 12 horas a 379C. As células de estroma aderiram selectivamente às caixas de plástica.

17.1.2. PREPARAÇÃO DA MATRIZ DE ESTROMA TRI-DIMENSIONAL A matriz de estroma tri-dimensional, usada nas culturas de tecido de adenocarcinoma, foi gerada usando células de estroma, obtidas a partir do tumor (uer Secção 17.1.1., supra) e peças de 8 mm x 45 mm de tela de filtração de "nylon" (41=3-210/36, Tetko, Inc. , NY, E.U.A.), tal como anteriormente se descreve na Secção 13.1.4. para as culturas de fígado tri-dimensionais.

17.1.3. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE TECIDO DE ADENOCARCINOMA TRI-DIMENSIONAIS

Após inoculação das células de adenocarcinoma na matriz de estroma de tumor tri-dimensional, as culturas foram mantidas em meio DMEM completo com um alto teor de glucose, 15% de FBC e 0,03% de glutamina, a 379C e em 5% de C02, numa atmosfera humidifi^ cada e foram alimentadas com meio fresco de 3 em 3 dias.

17.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO A Fig. 16 é uma fotomicrografia de uma cultura de tecido de adenocarcinoma tri-dimensional. As células de adenocarcinoma mostraram um empilhamento e uma orientação característicos de uma estrutura tri-dimensional do tipo da dos tumores. As células man tiveram o seu aspecto do tipo epitelial.

18. EXEMPLO: SISTEMA. - DE TESTE DE CIT0T0XICIPAPE EM CULTURA DE TECIDO TRI-DIMENSIONAL

18.1. MATERIAIS E MÉTODOS

18.1.1. PREPARAÇÃO DAS CULTURAS DE TECIDO DE MEDULA ÓSSEA TRI--DIMENSIONAIS

As culturas de tecido de medula óssea tri-dimensionais fo ram preparadas de acordo com o método que se descreve na Secção 11, supra. -90- 69 900 6261-031-118

18.1.2. EXPOSIÇÃO DAS CULTURAS DE MEDULA ÓSSEA TRI-DIMENSIONAIS A AGENTES CITOTÓxICOS

Mantiveram-se as culturas de medula óssea tri-dimensio-nais individuais, em cada cavidade de uma placa de cultura de te eidos de 96 cavidades, para os testes de citotoxicidade.

Exposeram-se as culturas a séries de diluições de 1:10 de adriamicina, compreendidas entre 0,1 e 10^aM, durante 24 horas. 0s controlos foram expostos a séries de diluições de 1:10 de albu mina de soro bovino (BSA).

Similarmente, exposeram-se outras culturas de medula óssea tri-dimensionais, numa unidade de cultura de tecido de múltiplas cavidades com 96 cavidades, a séries de diluições de 1:10 de cis-platina, compreendidas entre 1-75durante 24 horas. Ex. poseram-se os controlos a séries de diluições de BSA.

Em todos os casos, compararam-se mono-camadas de fibro-blastos humanos, cultivados usando técnicas convencionais, com culturas tri-dimensionais quer das células de estroma sozinhas, quer em conjunção com células hematopoiéticas.

18.1.3. ENSAIO DE CITOTOXICIDADE

Removeu-se o meio das células e adicionaram-se, a cada cavidade, 0,2 ml de solução de corante de vermelho neutro/meio (ver secção 18.1,4., infra). Depois, incubaram-se as culturas a 37SC durante 3 horas. Nas placas de cultura contendo culturas tri-dimensionais, a cavidade IA serviu como controlo e continha rede sozinha sem células.

Após a incubação, removeu-s'e o corante/meio e lavou-se ra pidamente cada cavidade com formal-cãlcio (ver 18.1,4> infra) para remover o vermelho neutro não incorporado e melhorar a ligação das células ao substrato.

Adicionaram-se a cada cavidade 0,2 ml de solução de ácido acêtico/etanol (ver 18.1.4., infra) e mantiveram-se as culturas à temperatura ambiente durante 15 minutos (para extrair o corante) e depois agitaram-se durante alguns segundos numa placa de agitação.

69 900 6261-031-118 -91-

Transferiram-se depois as placas de cultura para um leitor de microplacas Dynatech, equipada com um filtro de 540 nm, para leitura e registo espectrofotomêtrico automático. A solução de ácido acético/etanol numa cavidade de controlo serviu como branco.

18.1.4. SQLUÇ0E5 PflRfl 0 ENSAIO DE CITOTQXICIDADE A solução de vermelho neutro/meio foi preparada como se segue. 0 vermelho neutro foi preparado na forma de uma solução aquosa a 4/o de reserva e protegeu-se da luz com papel. Preparou--se uma diluição fresca de 1:80 do corante. Imediatamente antes do uso, centrifugou-se a solução de corante/meio, durante 5 minutos a 1500 x g, e usou-se o fluido sobrenadante para o ensaio de vermelha neutro. A solução de formal-cálcio foi preparada como se segue. Adicionaram-se 5 g de CaCl^ (anidro) a 497,5 ml de l-^O destilada esterilizada. Adicionaram-se então 2,5 ml de formaldeído a 40Jò para preparar uma solução de formal-cálcio que tinha 1% de CaC^ e 0,5% de formalina. A solução de ácido acético-etanol foi preparada como se segue. Adicionaram-se 1,09 ml de ácido acético glacial a 99 ml de etanol a 55%. A adriamicina e a cis-platina foram adquiridas na Sigma Chemical Co., St. Louis, M0, E.U.A..

18.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As Figs. 17 e 18 mostram os resultados dos ensaios de ci totoxicidade na cultura de medula óssea tri-dimensional, usando adriamicina e cis-platina, respectivamente, como agentes de teste. E de notar que, em cada caso, os sistemas de cultura tri--dimensionais mostram uma resposta ao agente de teste relacionada com a dose. Significativamente, quer com a adriamicina, quer com a cis-platina, o TD^g para as culturas tri-dimensionais de medula óssea foi diferente do TD,-g determinado usando culturas de mono-camada de fibroblastos convencionais. De um modo impor-

69 900 6261-031-118 tante, estes resultados indicam que as culturas de mono-camada p_o dem não ser medidas precisas para determinar a citotoxicidade; talvez devido às células estarem crescendo num ambiente extremamente artificial, as culturas de células de mana-camada podem ser mais sensíveis aos agentes tóxicos. E crucial ser possível deter^ minar a toxicidade real de uma substância teste; por exemplo, em quemoterapia, pode ser importante administrar a dose tolerada mais elevada por forma a eliminar eficazmente as células malignas. Uma sub-estimativa da dose tolerada mais elevada pode resultar na administração de uma quantidade menos eficaz de agente anti-tumor. Fornecendo culturas de tecido tri-dimensionais não apenas de medu la óssea e de outros tecidos normais, mas também de tecidos de tu mor, o presente invento permite a determinação JLn vitro da dose óptima de agente quemoterapêutico.

19. EXEMPLO: SISTEMA OE CULTURA DE PELE TRI-DIMENSIQNAL PftRA IMPLANTAÇÃO USANDO UMA NEQDERME EM CDBAIftS

Os transplantes de pele foram realizados em quatro cobaias Charles River. As experiências foram concebidas para comparar os efeitos da neoderme, do substrato de rede permeada com lisado de células, e de rede sozinha, na contracção, cicatrização e formação de epitélio de feridas a meia espessura e a toda a espessura. Cojn pararam-se múltiplas feridas paralelas ao longo da superfície do_r sal de cada animal, para permitir a determinação exacta da cicatrização em cada área. Nestes estudos semeou-se uma rede biodegradável com fibroblastos de derme de porco e transplantou-se como um substituto da derme. Outras redes incluíram fibroblastos de derme humana e fibroblastos de derme de porco semeados com que ratinocitos de porco. Examinando as áreas enxertadas por secções histológicas e grandes modificações no aspecto (exudato, eritema, etc.), foi possível estudar a eficiência do sistema de pele tri--dimensional como modalidade de transplante.

19.1. MATERIAIS E MÉTODOS

19.1.1. PREPARAÇÃO DO LEITO DE FERIDA

Para avaliação adequada do enxerto de epiderme era essen- -93- "· 69 9G0 6261-031-118 ciai que o leite de enxerto da ferida fosse preparado por forma a não estarem presentes, derme, foliculos de cabelo, glandulas sudo, ríferas ou sebaceas. Para conseguir isto usou-se um dermatoma de Brouine com um ajuste de 1,9 a 2,3 milímetros para remover a pele a toda a espessura do lado lateral superior do porco. Criaram-se áreas feridas de 5 cm x 5 cm" Quando se pretenderam preparar re-giães laterais inferiores, ajustou-se o dermatoma a 1,5 - 1,9 milímetros. Colocou-se no leito, logo acima da faseia a rede sozinha ou a rede com células cultivadas. 0 leito preparado como der; matoma esterilizado reduziu a possibilidade de contaminação e per; mitiu a hemostase absoluta no leito de enxerto.

Quando se verificou uma pequena hemorragia após a remoção da pele, colocou-se uma compressa de gaze seca na ferida e pressi. onou-se durante 10-15 minutos. De todas as vezes cobriu-se o lei. to esterilizado com gaze esterilizada, pré-molhada com PBS, até se colocarem os enxertos na faseia. Colocaram-se suturas de seda a uma distância de aproximadamente vinte e cinco e trinta e oito milímetros de ambos os lados do leito de enxerto preparado para manter uma força de compressão no lugar. Removeram-se os enxertos cultivados (redes com células) dos balées de cultura de tecidos com forcipes esterilizados e suturaram-se no local usando pontos subcuticulares convencionais. Cobriram-se os enxertos com gaze de petrolatum e apertaram-se as ligaduras de seda por forma a conseguir-se uma força de compressão. Ligou-se o porco com Elastoplast. Mudaram-se os pensos da ferida quatro dias depois.

19.1.2. ANESTESIA

Anestesiaram-se os porcos usando hidrocloreto de cetamina (Ketalar) e mantiveram-se sob anestesia usando uma mistura de ha-loetano, óxido nitroso e oxigénio. Lavou-se a área de pele com povidona-iodo (Betadina) e com álcool a 7%, antes da preparação de quatro leitos de enxerto a toda a espessura, na região lateral do porco, tal como anteriormente se descreve.

19.1.3. MANUTENÇÃO DOS ANIMAIS

Após 4 a 5 dias removeram-se os pensos das feridas, estu- 69 900 6261-031-118 /* /"ι //V-cigP1 „ íf -94- daram-se as áreas enxertadas para determinar sinais de infecção e/ou de rejeição e depois cobriram-se uma vez mais com gaze de p.e trolatum e ligaram-se com Elastoplast. Observaram-se subsequente mente as feridas, com intervalos de quatro dias, sendo colhidas biopsias das áreas tratadas. Anestesiaram-se os animais com Ke-talar para permitir a remoção asséptica de uma biopsia de 4 mm utilizando uma punção de Baker descartável e uma técnica asséptica. Enviaram-se as amostras para avaliação histológica por forma a determinar a ligação do enxerto e a cicatrização da ferida.

19.1.4. ENXERTOS DE EPITELIO

Os animais seleccionados receberam meios enxertos de que-ratinocitos autólogos 10 dias após a implantação com o equivalente de derme. As folhas de queratinocitos produzidas a partir das células isoladas, cultivadas até a sobre-confluência, tinham sido cultivadas durante 10-14 dias, antes da implantação, no equivaleji te de derme. As folhas foram ligadas por quatro suturas locais e cobriram-se com gaze de petrolatum e ligaram-se para permitir a ligação das células.

19,2. RESULTADOS

Em todos os animais tratados os equivalentes de derme ligaram-se bem, evitaram a contracção e a desidratação, e constitui, ram um leito de tecido vivo no qual as células epiteliais puderam migrar ou puderam ser colocadas num transplante autólogo. A Fig. 19 é representativa de uma cicatrização 10 dias após a implantação do equivalente de derme humana (neoderme) numa ferida a toda a espessura. Notou-se uma contracção mínima da área e não se observaram sinais de rejeição, indicando a utilidade dos fibroblajs tos alogeneicos em transplantes. A avaliação histológica destas áreas mostra o crescimento activo dos fibroblastos e a deposição de colagénio com uma infiltração mínima de glóbulos brancos (Fig. 20). As feridas a meia espessura mostraram diferenças naturais na contracção, formação de epitélio, pigmentação e no crescimento de cabelo, quando comparadas com feridas tratadas com equivalente de derme (esquerda) e com rede biodegradável sozinha (direita) -95- 69 900 6261-031-118 (Fig. 2l). A rede embebida com lisado de células de fibroblastos mostrou uma melhoria do crescimento de epitélio à \/olta da fibra da rede (Fig. 22), mas uma progressão de cicatrização global mais lenta do que em áreas tratadas com neoderme viva. A neoderme melhorou a migração epitelial na área de cicatrização. Tal como se pode observar na Fig. 23, formam-se pinos de rede profundos pelos queratinocitos à medida que migram para, e se ligam, ao equivalente de derme vivo. Este padrão é caracte-rístico da formação de epitélio em éreas de cicatrização.

Os queratinocitos autólogos ligaram-se bem e tiveram uma cicatrização equitativa na neoderme. A Fig, 24 ilustra a compara ção da cicatrização de uma ferida, metade da qual tinha recebido um enxerto epitelial autólogo e metade da qual recebeu neoderme sozinha. 0 enxerto de epitélio cicatrizou equitativamente, evitando uma contracção adicional e ligou-se firmemente ao equivaleji de de derme subjacente. A Fig. 25 mostra o crescimento equitativo e a ligação das células de epiderme à neoderme. A neoderme pa. receu consistir de fibroblastos crescendo activamente e de fibroblastos segregados naturalmente. As fibras de rede estavam ainda presentes tal como se pode observar na secção transversal.

19.3. DISCUSSÃO

As experiências de transplantação até à data têm indicado que a neoderme (fibroblastos e colagéçio segregado naturalmente na rede biodegradável) constitui um excelente tratamento para feridas a toda a espessura. A utilização bem sucedida de transplantes xenogeneicos ilustra a capacidade de utilizar neoderme alogeneica em vítimas de queimaduras e pacientes com úlceras de cubitus. Os transplantes permitem a migração de células de epitélio para a su. perfície implantada, bem como o suporte e o crescimento de folhas de epitélio autólogo. Os enxertos foram permanentes, sem qualquer evidência de cicatrizes, quer superficiais quer profundas, após quatro meses.

Claims (83)

1. 69 900 6261-031-118 -96- REIV INDICAÇÕES 1 - Processo de cultura de células _in vitro caracterizado por compreender: (a) a inoculação de células parenquimatosas numa matriz de sstroma tri-dimensional compreendendo células de estroma numa matriz tri-dimensional composta de um material que permite que as células se liguem a ele, ou que pode ser modificado por forma a permitir que as células se liguem a ele, e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a incubação da matriz de estroma tri-dimensional num meio nutriente, por forma a que as células inoculadas proliferem em cultura.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caraeterizja do por as células de estroma compreenderem fibroblastos.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriz.a do por as células de estroma compreenderem, adicionalmente, células endoteliais, pericitos macrófagos, monócitos, leucócitos, células de plasma, mastócitos ou adipócitos.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriz.a do por a matriz tri-dimensional compreender um material biodegradável .
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizji do por o material biodegradável compreender algodão, ácido poli glicólico, fio "catgut", celulose, gelatina ou dextrano.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriz.a do por a matriz tri-dimensional compreender um material não bio degradável.
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caraeterizja do por o material não biodegradável compreender um composto de poliamida, poliéster, poliestireno, polipropileno, poliacrilato, polivinilo, policarbonato, politetrafluoretileno ou nitrocelulo se. -97- 69 900 6261-031-118 //
8. 8 - Processo de acordo com as reivindicaçães 4, 5, 6 ou 7, caracterizado por o material estar revestido com colagénio.
9. 9 - Processo de cultura de células de medula óssea in vi-tro, caracterizado por compreender: (a) a inoculação de células hematopoiéticas numa matriz de estroma tri-dimensional compreendendo células de estroma sub confluentes numa matriz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ele e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a incubação da matriz de estroma tri-dimensional ino culada num meio nutriente por forma a que as células inoculadas proliferem em cultura.
10. 10 - Processo de cultura de células de pele in vitro caracterizado por compreender: (a) a inoculação de melanócitos e de queratinóeitos numa matriz de estroma tri-dimensional compreendendo células de estro ma subconfluentes numa matriz tri-dimensional composta de um ma terial e com uma forma que permite que as células se liguem a ele e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a incubação da matriz de estroma tri-dimensional ino culada num meio nutriente por forma a que as células inoculadas proliferem em cultura.
11. 11 - Processo de cultura de células de pele ί,η vitro» caracterizado por compreender: (a) a inoculação de melanócitos e de queratinóeitos numa matriz estrómica tri-dimensional compreendendo células estrómi-cas confluentes numa matriz tri-dimensional composta de um mate rial e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a incubação da matriz estrómica tri-dimensional inoculada num meio nutriente por forma a que as células inoculadas I 69 900 6261-031-118 -98- . ΐ proliferem em cultura.
12. 12 - Processo de cultura de células neuronais in vitro, caracterizado por compreender: (a) a inoculação de astrôcitos numa matriz estrómica tri dimensional compreendendo células endoteliais confluentes numa ma triz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, e que permite que as célu las cresçam em mais do que uma camada; e ainda

    (b) a inoculação, nos referidos astrôcitos, de células neuronais; e (c) a incubação da matriz estrómica tri-dimensional, ino culada, num meio nutriente.
13. 13 - Processo de cultura de epitélio de mucosa iji vitro, caracterizado por compreender: (a) a inoculação de células epiteliais de mucosa numa ma triz estrómica tri-dimensional compreendendo células estrómicas subconfluentes numa matriz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e J (b) a incubação da matriz estrómica tri-dimensional, ino culada, num meio nutriente por forma a que as células inoculadas proliferem em cultura.
14. 14 - Processo de cultura de células de tecido de tumor in vitro, caracterizado por compreender: (a) a inoculação de células de tumor numa matriz estrómica tri-dimensional compreendendo células estrómicas subconflueji tes numa matriz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a incubação da matriz estrómica tri-dimensional, injg culada, num meio nutriente por forma a que as células inoculadas proliferem em cultura. 69 900 6261-031-118
15. 15 - Processo de cultura de células do fígado in vitro, caracterizado por compreender: (a) a inoculação de hepatócitos numa matriz estrómica tri-dimensional compreendendo células estrómicas subconfluentes numa matriz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela» e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a incubação da matriz estrómica tri-dimensiona, inoculada, num meio nutriente por forma a que as células inoculadas proliferem em cultura.
16. 16 - Processo de cultura de células pancreáticas in v/i— tro, caracterizado por compreender: (a) a inoculação de células de ácino pancreáticas numa matriz estrómica tri-dimensional compreendendo células estrómicas sub-confluentes numa matriz tri-dimensional, composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a incubação da matriz estrómica tri-dimensional, ino culada, num meio nutriente por forma a que as células inoculadas proliferem em cultura.
17. 17 - Processo para testar a citoxicidade de uma substância de teste, caracterizado por compreender: (a) a exposição de uma cultura de células tri-dimensional à substância de teste, compreendendo, a cultura de células tri-di. mensional, células de parênquima cultiv/adas numa matriz estrómica tri-dimensional compreendendo células estrómicas crescendo activa mente numa matriz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, ou que pode ser modificada para permitir que as células se liguem a ela, e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a determinação do número de células danificadas ou mortas na cultura de células correlacionando-se o número de células danificadas ou mortas com a citotoxicidade da substância de teste. 69 900 6261-031-118

    -100-
18. 18 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substân cia de teste de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as células estrómicas compreenderem fibroblastos.
19. 19 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substâ_n cia de teste de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por as células estrómicas compreenderem, adicionalmente, células endo. teliais, pericitos, macrófagos, monócitos, leucócitos, células de plasma, mastócitos ou adipócitos.
20. 20 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substân cia de teste de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a matriz tri-dimensional compreender um material biodegradável.
21. 21 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substâri cia de teste de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o material biodegradável compreender algodão, ácido poliglicólico, fio "catgut", celulose, gelatina ou dextrana.
22. 22 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substâri cia de teste de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a matriz tri-dimensional compreender materiais não biodegradáveis.
23. 23 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substâji cia de teste de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o material não biodegradável compreender um composto de poliamida, poliéster, poliestireno, polipropileno, poliacrilato, polivinilo, policarbonato, politetrafluoroetileno ou nitrocelulose.
24. 24 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substân cia de teste de acordo com as reivindicaçQes 20, 21, 22 ou 23, ca, racterizado por o material estar revestido com colagénio.
25. 25 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substâri cia de teste de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as células de parênquima compreenderem células hematopoiéticas.
26. 26 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substâji cia de teste de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as células de parênquima compreenderem melanocitos e queratinóci-tos. -101- 69 900 6261-031-118
27. 27 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substâjn cia de teste de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as células de parênquima compreenderem hepatóxitos.
28. 28 - Processo para testar a citotoxicidade de uma substâjn cia de teste de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por as células de parênquima compreenderem células de ácino pancreáti cas.
29. 29 - Processo para testar o efeito de uma droga, caracterizado por compreender: (a) a exposição de uma cultura de células tri-dimensional à droga compreendendo a cultura de células tri-dimensional, células de parênquima cultivadas numa matriz estrdmica tri-dimensional compreendendo células estrómicas sub-confluentes numa matriz tri--dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, ou que pode ser modificada para permitir que as células cresçam em mais do que uma camada; e (b) a determinação do efeito da droga nas células em cul_ tura.
30. 30 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células estrómicas compreenderem fibroblastos.
31. 31 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por as células estrómicas compreenderem adicionalmente células endoteliais, pericitos, ma-crófagos, monócitos, leucócitos, células de plasma, mastôcitos ou adipócitos.
32. 32 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por a matriz tri-dimensional compreender um material biodegradável.
33. 33 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o material biodegradável compreender algodão, ácido poliglicólico, fio "catgut", celulose, gelatina ou dextrana. -102- 69 900 6261-031-118
34. 34 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por a matriz tri-dimensional compreender materiais não biodegradáveis.
35. 35 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o material não biodegra dável compreender um composto de poliamida, poliéster, poliestire no, polipropileno, poliacrilato, polivinilo, policarbonato, poli-tetrafluoroetileno ou nitrocelulose.
36. 36 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com as reivindicaçães 32, 33, 34 ou 35, caracterizado por o material estar revestido com colagônio.
37. 37 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parênqui-ma compreenderem células hematopoiéticas.
38. 38 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parênqui-ma compreenderem melanôcitos e queratinócitos.
39. 39 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parênqui-ma compreenderem hepatócitos.
40. 40 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parênqui-ma compreenderem células de ácino pancreáticas.
41. 41 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parênqui-ma compreenderem células epiteliais de mucosa.
42. 42 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parênqui-ma compreenderem células epiteliais de mucosa infectadas com um vírus.
43. 43 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parênqui-ma compreenderem células epiteliais de mucosa infectadas com um 69 900 6261-031-118

    -103-virus herpes.
44. 44 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parênqui-ma compreenderem células epiteliais de mucosa infectadas com um vírus papiloma.
45. 45 - Processo para testar o efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as células de parônqui-ma compreenderem células de tumor.
46. 46 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade num paciente, caracterizado por compreender: (a) a obtenção de uma amostra de células do paciente; (b) a inoculação das células da amostra numa matriz es-trémica tri-dimensional compreendendo células estrómicas crescendo activamente numa matriz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se .liguem a ela, ou que pode ser modificada para permitir que as células se liguem a ela e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; (c) a incubação da matriz estrémica tri-dimensional, ino culada, num meio nutriente por forma a que as células inoculadas proliferem em cultura} e (d) a determinação da presença de células malignas nas células proliferadas em cultura.
47. 47 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células esi trómicas compreenderem fibroblastos.
48. 48 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por as células es, trómicas compreenderem adicionalmente células endoteliais, pericjl tos, macrófagos, monécitos, leucócitos, células de plasma, mastó-citos ou adipócitos.
49. 49 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a matriz tri--dimensional compreender um material biodegradável. -104- 69 900 6261-031-118
50. 50 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o material biodegradável compreender algodão, ácido poliglicólico, fioHcat-gut", celulose, gelatina ou dextrana.
51. 51 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a matriz tri--dimensional compreender materiais não biodegradáveis.
52. 52 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por o material não biodegradável compreender um composto de poliamida, poliêster, po, liestireno, polipropileno, poliacrilato, polivinilo, policarbonato, politetrafluoroetileno ou nitrocelulose.
53. 53 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com as reivindicaçães 49, 50, 51 ou 52, caracterizado por o material estar revestido com colagénio.
54. 54 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células de parênquima compreenderem células hematopoiéticas.
55. 55 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células de parênquima compreenderem melanócitos e queratinócitos.
56. 56 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células de parênquima compreenderem hepatócitos.
57. 57 - Processo para diagnosticar ou seguir uma malignidade de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células de parênquima compreenderem células de ácino pancreáticas.
58. 58 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética, caracterizado por compreender! (a) a inoculação das células de parênquima transfectadas numa matriz estrómica tri-dimensional onde: (i) as células de parênquima transfectadas contêm um gene estranho sob o controlo de um elemento de expressão? e -105- 69 900 6261-031-118 (ii) a matriz estrómica tri-dimensional compreende células estrémicas crescendo activamente numa matriz tri-dimensio nal composta de um material e com uma forma que permite que as cé lulas se liguem a ela, ou que pode ser modificada para permitir que as células se liguem a ela, e que permite que as células cres, çam em mais do que uma camada; e (b) a incubação da matriz estrémica tri-dimensional, ino culada, num meio nutriente por forma a que as células transfecta-das proliferem em cultura.
59. 59 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por as células estrémicas Gompreenderem fibroblastos.
60. 60 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as células estrémicas compreenderem ainda células endoteli-ais, pericitos, macrófagos, monóeitos, leucócitos, células de pias, ma, mastócitos ou adipécitos.
61. 61 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por a matriz tri-dimensional compreender um material biodegradável.
62. 62 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética de acordo com a reivindicação 61, caracterizado por o material biodegradável compreender algodão, ácido poliglicó lico, fio "catgut", celulose, gelatina ou dextrana.
63. 63 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por a matriz tri-dimensional compreender materiais não biodegradjé veis.
64. 64 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por o material não biodegradável compreender um composto de poli-amida, poliéster, poliestireno, polipropileno, poliacrilato, polj. vinilo, policarbonato, politetrafluoroetileno ou nitrocelulose. -106- -106- } 69 900 6261-031-118
65. 65 - Processo para cultiv/ar células construídas por engenharia genética de acordo com as reivindicações 61, 62, 63 ou 64, caracterizado por o material estar revestido com colagênio.
66. 66 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por as células de parênquima compreenderem células hematopoieti-cas.
67. 67 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por as células de parênquima compreenderem melanócitos e querati-nócitos.
68. 68 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por as células de parênquima compreenderem hepatdcitos.
69. 69 - Processo para cultivar células construídas por engenharia genética, caracterizado por as células de parênquima compreenderem células de ácino pancreáticas.
70. 70 - Processo para analisar uma doença ou uma condição num paciente que compreende: (a) a obtenção de uma amostra de células do paciente; (b) a inoculação das células da amostra numa matriz es-trámica tri-dimensional compreendendo células estrómicas crescendo activamente numa matriz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, ou que pode ser modificada para permitir que as células se liguem a ela, e que permite que as células cresçam em mais do que uma cama da; (c) a incubação da matriz estrúmica tri-dimensional inoculada, num meio nutriente por forma a permitir que as células inoculadas proliferem em cultura; (d) a análise das células proliferadas em cultura para procurar sinais da doença ou da condição. 69 900 6261-031-118 -107- ΛΓ'
71. 71 - Proeesso para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por as células estrd micas compreenderem fibroblastos.
72. 72 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 71, caracterizado por as células estró micas compreenderem adicionalmente células endoteliais, pericitos, macrófagos, monócitos, leucócitos, células de plasma, mastócitos ou adipócitos.
73. 73 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por a matriz tri-di- mensional compreender um material biodegradável.
74. 74 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 73, caracterizado por o material biodj3 gradável compreender algodão, ácido poliglicólico, fio "catgut", celulose, gelatina ou dextrana.
75. 75 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por a matriz tri-di- mensional compreender materiais não biodegradáveis.
76. 76 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 75, caracterizado por o material não biodegradável compreender um composto de poliamida, poliéster, pjo liestireno, polipropileno, poliacrilato, polivinilo, policarbonato, politetrafluoroetileno ou nitrocelulose.
77. 77 - Processo para estudar os mecanismos de doença de acordo com a reivindicação 73, 74, 75 ou 76, caracterizado por o material estar revestido com colagénio.
78. 78 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por as células de pai rênquima compreenderem células hematopoiéticas.
79. 79 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por as células de pja rênquima compreenderem melanocitos e queratinócitos.
80. 80 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de -108- · -108- · .·Λ> 69 900 6261-031-118 acordo com a reivindicação 70, caracterizado por as células de pa, rênquima compreenderem hepatócitos.
81. 81 - Processo para estudar os mecanismos de uma doença de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por as células de pa rênquima compreenderem células de ácino pancreáticas.
82. 82 - Processo para testar a capacidade de uma substância em atravessar a barreia sangue-cérebro, caracterizado por compreender: (a) a exposição de uma quantidade eficaz da substância à superfície endotelial de um sistema de cultura tri-dimensional preparado; (i) por inoculação de astrocitos numa matriz estró-mica tri-dimensional compreendendo células endoteliais confluentes numa matriz tri-dimensional composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela, e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; (ii) por inoculação adicional, nos referidos astró-citos, de células neuronais; e (iii) por incubação da matriz estrémica tri-dimen-sional inoculada num meio nutriente; e (b) a detecção dos efeitos da substância nos astrécitos ou nas células neuronais da matriz estrémica tri-dimensional inoculada.
83. 83 - Um sistema modelo para a barreira sangue-cérebro com preendendo uma cultura de tecidos tri-dimensional preparada de acordo com o processo seguinte: (a) a inoculação dos astrécitos numa matriz estrémica tri-dimensional compreendendo células endoteliais confluentes numa matriz tri-dimensional, composta de um material e com uma forma que permite que as células se liguem a ela e que permite que as células cresçam em mais do que uma camada; e adicionalmente (b) a inoculação nos referidos astrécitos de células neti ronais; e -109- 69 900 6261-031-118 (c) a incubação da matriz estrómica tri-dimensional inoculada, num meio nutriente. Lisboa,

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