HUT56393A - Three dimensional cell and tissue culturing systems - Google Patents

Three dimensional cell and tissue culturing systems Download PDF

Info

Publication number
HUT56393A
HUT56393A HU895973A HU597389A HUT56393A HU T56393 A HUT56393 A HU T56393A HU 895973 A HU895973 A HU 895973A HU 597389 A HU597389 A HU 597389A HU T56393 A HUT56393 A HU T56393A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
matrix
dimensional
skeletal
culture
Prior art date
Application number
HU895973A
Other languages
English (en)
Other versions
HU895973D0 (en
Inventor
Gail K Naughton
Brian A Naughton
Original Assignee
Marrow Tech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/242,096 external-priority patent/US4963489A/en
Application filed by Marrow Tech Inc filed Critical Marrow Tech Inc
Publication of HU895973D0 publication Critical patent/HU895973D0/hu
Publication of HUT56393A publication Critical patent/HUT56393A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0669—Bone marrow stromal cells; Whole bone marrow
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C12N5/0698—Skin equivalents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/081—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/086—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system glial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/091—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells melanocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/094—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells keratinocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/097—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells oral mucosa cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1305—Adipocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány a 07/242,096 sorszámú találmány folytatása, melyet 1988 szeptember 8-án jegyeztek be; ami a 038,110 sorozatszámú, 1987 április 14-én bejegyzett találmány folytatása; ami a 036,154 sorozatszámú, 1987 április 3-án bejegyzett találmány folytatása; ami 1988 január 26-án jelent meg az amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások között, 4,721,096 sorozatszámmal; ami a 853,569 sorozatszámú, feladott találmány folytatása; az alábbiakban ezek mindegyikét teljességében ismertetjük referenciaként.
1. Ismertetés
A találmány három-dimenziós sejt-, és szövettenyésztő rendszerek vizsgálatával foglalkozik. Ezeket a rendszereket a sejtekben és a szövetekben hosszabb időtartam során in vitro kialakuló sejtosztódások tanulmányozására alkalmazhatjuk, sokkal szorosabban megközelíthető környezetben, mint in vivő. Az alábbiakban bemutatásra kerülő tenyésztő rendszer biztosítja a sejtosztódást és a megfelelő sejt érést, melynek során az in vivő szövetekkel analóg szerkezetű másolatok keletkeznek.
A kialakuló tenyészetek széles körben alkalmazhatók, az in vivő transzplantációtól és implantációtól a citotoxikus vegyületek és a gyógyszerészeti készítmények in vitro, valamint a bioreaktorokban keletkező biológiailag aktív anyagok ellenőrzéséig. A találmányt a csontvelő, bőr, máj, nyálkahártya epitelium, hasnyálmirigy, és adenokarcinóma három-dimenziós tenyésztését leíró példák esetében, valamint a három-dimenziós tenyésztő rendszerekben a citotoxicitás mérések során, az agy-vér-gát modell rendszerben, és a bőr transzplantáció során történő felhasználását bemutató példák során ismertetjük.
2. A találmány háttere
A gerincesekből származó sejttenyészetek túlnyomó része in vitro egy fázisban növekszik, mesterséges szubsztrátot tartalmazó tápközegben. Az egy-fázisú növekedést biztosító szubsztrát szilárd anyag lehet, például plasztikus anyag, vagy szemíszilárd gél, például kollagén, illetve agar. Napjainkban a szövet-, és sejttenyésztés céljára a plasztikus anyagok tűnnek megfelelőbbnek.
Számos kutató vizsgálta a membránok alapvető alkotóival kapcsolatos természetes szubsztrátok alkalmazását. A membránok glikoproteineket és proteoglikánokat tartalmaznak, melyek a sejtet veszik körül in vivő. így például Reld és Rojkund (1979, In. Methods ín Enzymology, Vol.57, Cell Culture, Jakoby & Pástén, eds., New York, Acad. Press, PP263-278); Vlodavsky és társai (1980, Cell, 19:607-617);
Yang és társai (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3401) a heptociták, az epitéliális sejtek, és az endotéliális szövetek tenyésztése során kollagént alkalmaztak. A sejtek növekedéséhez úszó kollagén (Michalopoulos és Pitot, 1975, Fed. Proc., 34:826), és cellulóz-nitrát membránokat (Savage és Bonney, 1978, Exp. Cell Rés., 114:307-315) alkalmaztak a terminális differenciálódás elősegítésére irányuló kísérletek során. A meghosszabbított terminális differenciálódást és a szövetek ilyen rendszerben történő tenyésztését eddig nem sikerült megvalósítani.
Az egér embrió fibroblasztok tenyészetét a sejtek, különösen a kis sűrűséggel rendelkező fajták, növekedésének fokozására használták fel. A kapott eredményeket részben a tápközeg kiegészítésének, részben a szubsztrátok sejt termékek által történő szabályozásának tulajdonították.Az említett rendszerekben a fibroblasztokat tápláló réteg konfluens monolayerként alakult ki, mely alkalmassá tette a felszínt arra, hogy más sejtek is hozzá kapcsolódjanak. így például a normál magzati zsigereken egyesülés útján kialakult tápláló rétegen növekvő gliómákról számoltak be (Lindsay, 1979, Natúré, 228:80).
Bár a sejttenyészetek előállításának, megfigyelésének és tanulmányozásának általánosan ismert módja a sejtek két dimenzióban történő tenyésztése, mely megengedi a nagy arányú osztódást is, a módszerből hiányzik a teljes szövetre jellemző sejt-sejt, és sejt-mátrix kapcsolatok jellemzésének lehetősége. A funkcionális és morfológiai kapcsolatok elemzése céljából számos kutató vizsgálta a három-dimenziós szubsztrátok alkalmazásának lehetőségeit, mint például a kollagén gélt (Douglas és társai, In Vitro, 16:306-312; Yang és társai, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76:3401; Yang és társai, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2088-2092; Yang és társai 1981, Cancer Rés., 41:1021-1027); a cellulóz szivacsot önmagában (Leighton és társai, 1951, J. Natl.
Cancer Inst. 12:545-561), vagy kollagénnel bevonva (Leighton és társai, 1968, Cancer Rés., 28:286-296); a zselatin szivacsot, és a gélhabot (Sosour és társai, 1975, J.
Neurosurg.
43:742-749).
A három-dimenziós szubsztrátok inokulálása általában a tenyésztett sejtekkel történik. A beszámolók szerint számos sejt-tipus hatol be a mátixba, szövet-specifikus morfológiát hozva létre. így például a három-dimenziós kollagén géleket a mell epitelium sejtjeinek (Yang és társai 1981, Cancer Rés., 41:1021-1027), és a szimpatikus neuronoknak (Ebendal, 1976, Exp. Cell. Rés., 98:159-169) a tenyésztése során alkalmazták. Ráadásul számos kísérletet végeztek a szétszórt, monolayer tenyészetek szövet-szerű felépítésének regenerálására. Kruse és Miedema (1965, J. Cell Bioi., 27:273) arról számolt be, hogy az elárasztott egy rétegű tenyészetek több, mint tíz sejtnyi mélységben is tudnak növekedni, valamint a szerves eredetű szerkezetek képesek megfelelő táptalajban több rétegű tenyészetekben fejlődni (lásd Schneider és társai, 1963, Exp. Cell Rés., 30:449-459; Bell és társai, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1274-1279); Green (1978, Science, 200:1385-1388) a humán epidermális keratinociták dematoglif (szétdörzsölt crista) képzéséről számolt be, ami a sejtek több hétig áthelyezés nélkül történő fenntartása során alakul ki; Folkman és Haudenschild (1980, Natúré, 288:551-556) a vaszkuláris endotéliális sejtek tenyészetében endotéliális növekedési faktort, valamint kondicionált tumor sejteket tartalmazó táptalaj jelenlétében kialakuló kapilláris tubulusok képződéséről számol be; Sirica és társai (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:283-287; 1980, Cancer Rés., 40:3259-3267) hepatociták elsődleges tenyészetét tartotta fenn 10-13 napig, vékony kollagén réteggel bevont nylon hálón. Azonban, a bemutatott rendszerek egyikében sem sikerült elérni a meghosszabbított időtartamú tenyészeteket, és sejtosztódást.
A szövetek, például a csontvelő meghosszabbított időtartamú tenyésztésének megvalósítását valójában már megpróbálták, de az eddigi próbálkozások nem hoztak sikeres eredményeket, bár a különböző típusú sejteket tartalmazó váz-sejt rétegek gyorsan kialakultak, de ezeket a jelentős hematopoezis miatt nem sikerült reális időtartamon keresztül fenntartani (lásd Dexter és társai, In Long Term Boné Marrow Culture, 1984, Alán R. Liss, Inc., pp.57-96).
3. A találmány összefoglalása
A találmány tárgya három dimenziós sejt tenyésztő rendszer, amelyet in vitro különböző sejtek és szövetek meghosszabbított időtartam során történő tenyésztésére alkalmazhatunk széles körben. A találmány szerint a kívánt szövetekből származó sejtek inokulálása és növekedése egyelőre meghatározott, a kötőszöveti vázon fenntartott mátrixon történik. A kötőszöveti vázon fenntartott mátrix váz-sejteket tartalmaz, mint például a fibroblasztokat, amelyek a három dimenziós mátrixon hatékonyan tudnak növekedni. A váz-sejtek további, a laza kötőszövet! állományban megtalálható sejteket is tartalmazhatnak, így például endotheliális sejteket, makrofágokat/monocitákat, adipocytákat, pericytákat, a sztróma-csontvelőből származó retikuláris sejteket, stb. A váz-mátrixok a sejttenyészetben a fenntartást, valamint a megnövelt időtartam során fenntartott aktív osztódáshoz szükséges szabályozó, és növekedési faktorokat szolgáltatják. A három-dimenziós rendszerben történő növekedés során sejtosztódásban résztvevő sejtek megérnek, és szegregálódnak, miáltal a felnőtt szövetek alkotóit hozzák létre, melyek az in vivő megfigyelt másolatokkal analógok.
A találmány alapja részben az a felfedezés, mely szerint a három dimenzióban kialakított váz-sejteken a sejttenyészetek aktív sejtosztódása hosszabb ideig tartható fenn, mint a monolayer tenyészetekben. Ez részben a háromdimenziós mátrixra jellemző megnövelt felszínnek tulajdonítható, mely a váz-sejtek meghosszabított időtartamú osztódását eredményezi. Az említett osztódó váz-sejteket alkotó fehérjék, valamint a növekedési, és szabályozó faktorok mind a váz-sejtek, mind a váz-mátrixra inokulált szövet-specifikus sejtek esetében szükségesek a meghosszabított időtartamú osztódás eléréséhez. Ráadásul a három-dimenziós mátrix olyan térbeli eloszlást tesz lehetővé, mely szorosan megközelíti az in vivő állapotot, így hozzájárul a sejtek megéréséhez és migrációjához előnyös mikro-környezet kialakulásához. A sejtek növekedése az említett támaszték jelenlétében fehérjék, glikoproteinek, glükóz-amino-glikánok, celluláris mátrix, és egyéb anyagok hozzáadásával tovább fokozható, az említett anyagokat magához a támasztó szerkezethez adhatjuk, illetve a támasztó szerkezetet bevonhatjuk velük.
A három-dimenziós támaszték alkalmazása lehetővé teszi azt, hogy a sejtek több rétegben növekedjenek, és így alakítsák ki a találmány szerinti három-dimenziós sejttenyésztő rendszereket. Számos szövet-, és sejt-típus képes az ilyen, három-dimenziós tenyésztési rendszerben növekedni.
A kialakuló tenyészetek ráadásul a fiziológiai és patológiai körülmények tanulmányozását is lehetővé teszik, így például a találmány jelentős felismerése szerint a három-dimenziós tenyésztési rendszerek alkalmasak az agy-vér gát modellezésére. A találmány további jelentős felismerése, mégpedig korlátozások nélkül, a mukózális epitelium háromdimenziós tenyésztési rendszere, melyet a herpesz-vírus és a papillóma-vírus tanulmányozására alkalmazhatunk. A kapott tenyészetek széles körben alkalmazhatók, a tenyészetekben növekvő sejtek ín vivő transzplantációjától és implantációjától a citotoxicitási teszteken és az alkotók in vitro vizsgálatán keresztül a biológiai anyagokat in vitro termelő bioreaktorok tervezéséig.
« · ·· · · * ί· · · • · · · · ♦ • · · · · ·
- 9 3.1. Az alkalmazott kifejezések, és rövidítések
Az alkalmazott szakkifejezések jelentését az alábbiakban ismertetjük:
Adherens réteg: azok a sejtek, melyek közvetlenül a három-dimenziós mátrixhoz kapcsolódnak, illetve azok, melyek indirekt módon olyan sejtekhez kötődnek, melyek közvetlenül a mátrixhoz kapcsolódnak.
Váz-seltek: fibroblasztiszok, melyek a laza kötőszövet! állományban található más sejtekkel és/vagy egyéb alkotókkal együtt, illetve azok nélkül fordulnak elő, megkötések nélkül beleértve az endotéliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, plazma sejteket, gazda-sejteket, adipocitákat, stb.
Szövet-soecifikus, vagy parenchimális sejtek: a nélkülözhetetlen szöveteket és szerveket alkotó sejtek, melyek támasztó vázukról ismerhetők fel.
Három-dimenziós mátrix: három-dimenziós mátrix, melyet olyan anyagok, illetve formák alkotnak, melyek
a. ) lehetővé teszik a sejteknek a hozzájuk való kapcsolódást (vagy úgy vannak módosítva, hogy ezt lehetővé tudják tenni); és
b. ) lehetővé teszik a sejteknek, hogy több rétegben nőjenek. A támasztó szerkezet kialakítása a három-dimenziós vázmátrixot létrehozó sejtekkel történő inokulálással történik.
Három-dimenziós váz-mátrix: váz-sejtekkel inokulált • Μ · * · « · · » ·· • · * «· « ·· • · · · · · ♦ «·· ·« · ♦ · · Λ ·« három-dimenziós mátrix. Azt, hogy a találmány szerinti vázsejtek növekedése és szétválása folytatódik-e, konfluencia, és a szubkonfluencia határozza meg. A váz-sejtek segítséget nyújtanak a növekvő szövet-specifikus sejteknek, melyekkel a továbbiakban a három-dimenziós sejttenyészetet inokuláljuk.
Három-dimenziós seittenvészetet: a szövet-specifikus sejtekkel és tenyészetekkel inokulált három-dimenziós vázmátrix. Általában a három-dimenziós váz-mátrix inokulálásához alkalmazott specifikus sejtek tartalmazhatják a szövetek visszatartott (stem-, reserve-sejtek) sejtjeit is; így például az új sejteket létrehozó sejteket, melyek az elkülönített sejtekbe kerülnek, és az érés során hozzák létre a szövetekben a parenchima-szöveteket.
Az alkalmazott rövidítések jelentését az alábbiakban ismertetjük:
BFU-E = burst-képző eritroid-egység CFU-C = telepképző egység-tenyészet CFU-GEMM - granulum-egységet, eritroidot, monocitát, megakariocitát képző telep
EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav FBS = fetális szarvasmarha szérum HBSS = Hank-féle, kiegyenlített só-oldat HS = ló-szérum
LTBMC = meghosszabbított időtartamú csontvelő tenyészet
MÉM = minimáltáptalaj
PBL = perifériális vér-leukociták
PBS = foszfát pufferrel beállított pH-jú fiziológiás sóoldat
11.RPMI 1640 = Roswell Park Memóriái Institute tápközeg száma 1640 (GIBCO, Inc. Grand. Island, NY)
SEM = pásztázó elektronmikroszkóp
4. Az ábrák ismertetése
1. ábra
Pásztázó elektronmikroszkóppal készült mikrográfia, mely egy fibroblasztnak a három-dimenziós mátrixhoz való kapcsolódását szemlélteti, a celluláris folyamatok meghosszabbítása során, egészen a háló megindulásáig. A fibroblasztok hatékonyan választják ki a mátrix-fehérjéket, és a konfluencia megfelelő állapotában vannak, amit a szövet-rspecifikus sejtek inukulálásakor figyelhetünk meg. ábra
Pásztázó elektronmikroszkóppal, 210 um-es szűrővel készült mikrográfia a három-dimenziós LTBMC-ről, az eritroid, mieloid, és más tenyészetek szemléltetésére. A támasztósejtek lineárisan nőnek tovább, és beburkolják a háromdimenziós mátrixot.
3. ábra
A három-dimenziós LTBMC-hez a több hetes tenyésztés során hozzátapadt, illetve az ahhoz nem tapadt sejtek teljes mennyiségét (számát) bemutató ábra. A teljes sejt-szám, és a nem-adherens rész citospin készítménye az öt naponként táplált tenyészet elhasznált tápközegének eltávolításakor »· »ί·ϊ ·· • * 4 · · » · · · · ♦ 9 ·*
- 12 készült. Az adherens részen sejtek számát az LTBMC különböző intervallumaiben határoztuk meg, miután a megtapadt sejteket a három-dimenziós sejttenyészetből a kollagenázzal és tripszinnel való kezeléssel eltávolitottuk. A tenyészetben néhány hét után kialakult steady state állapot, és a celluláris sejtosztódás.
. ábra
A CFU-C per 10 sejt számát szemléltető ábra, melyeket a három-dimenziós LTBMC megtapadt részéből nyertünk, a több hetes tenyésztés során.
5. ábra
A bőr három-dimenziós modellje. Látható a dermális/epidermális kapcsolódás, mely felett pigmentált melanociták, és több rétegben pigmentet tartalmazó keratinociták helyezkednek el. A váz-sejtek a mátrixhoz kapcsolódnak, így hozzák létre a bőr összetevőit.
6. ábra
Pásztázó elektronmikroszkóppal készült mikrográfia, mely a három-dimenziós vázról készült, három nappal a melanocitákkal való inokulálás után. A melanociták szabályosan növekednek a három-dimenziós rendszerben, dendritet képeznek, pigmentációjukat, és a pigmentnek a keratinocitákhoz való szállításának képességét megőrzik.
7. ábra
A három-dimenziós bőr-tenyészet keresztmetszetéről készült, hematoxilin-eozinnal festett fotomikrográfia. A normál epidermális sejtek (E) sejt-morfológiája és orientációja nyilvánvaló. Az epidermális és dermális (D) alkotók teljesen
- 13 körülveszik a hálót alkotó rostokat (M), valamint látható az ábrán a dermális/epidermális kapcsolódás is.
8. ábra
A három-dimenziós bőr-tenyészet epidermiszéről készült, hematoxilin-eozinnal festett fotomikrográfia. A keratinociták (K) normál morfológiával, pigment granulumokat (P) tartalmazva jelennek meg. Látható a sejtek érése, különös tekintettel a stratum corenum-ra (SC).
9. ábra
Patkányokba beoltott három-dimenziós bőr-tenyészetről készült fotomikrográfia, 7 nappal az utólagos transzplantáció után. Az eltérő dermális és epidermális kapcsolódás egyértelmű. A sejtek a kiürülés jele nélkül, határozottan kapcsolódnak a hálóhoz.
10. ábra
Patkányokba beoltott három-dimenziós bőr-tenyészetről készült fotomikrográfia, 7 nappal az utólagos transzplantáció után. A kollagén csomók (c) , és a bemutatott különböző sejt-típusok, beleértve a keratinocitákat, fibroblasztokat (f), adipocitákat (a), és a sima izom sejteket (s), természetes konfigurációban helyezkednek el a nylon háló (m) körül.
11. ábra
Három-dimenziós felnőtt máj-tenyészetről készült fotomikrográfia, ahol a három-dimenziós több-rétegű szövetek kialakítása máj váz-sejteken történt.
12. ábra
Hatékonyan eloszlatott hepatocitákról készült
V ·*··' ·· ·»♦»·· · * • · · · > · ♦ * · · · · « · ··« ·· »·^» « ♦·
- 14 fotomikrográfla, a három-dimenziós tenyészetre történő inokulálás után 10-12 nappal, láthatjuk, hogy a sejtek a hepatoblasztokra, illetve a máj regeneráló sejtjeire hasonlítanak.
13. ábra
A mukózális epitelium három-dimenziós szövet-tenyészetének keresztmetszetéről készült fotomikrográfia.
14. ábra
A hasnyálmirigy három-dimenziós szövet-tenyészetének keresztmetszetéről készült fotomikrográfia. A zimogén granulumok egyik acinusos sejtjéhez nyíl mutat. A csillag váz-sejtet jelöl.
15. ábra
Az agy-vér-gát modell rendszer három-dimenziós szövettenyészetének keresztmetszetéről készült fotomikrográfia. Az erek endotellális sejtjeihez zárt nyil mutat. Az idegsejtekhez nyitott nyil mutat. A csillag asztrocitát jelöl.
16. ábra
Az adenokarcinóma szövet-tenyészetének keresztmetszetéről készült fotomikrográfia.
17. ábra
A vázon egy rétegben növekvő fibroblasztoknak és a találmány szerinti három-dimenziós háló-rendszerben teljes vastagságban növekvő csontvelő tenyészetnek a követése. A sejtek életképességének vizsgálatára a neutrál-red vizsgálat során alkalmazott adriamicinre a szubsztrát dózis-függő válasz-reakciót adott.
18. ábra • «· ·· ·*·«» · ······ ♦ · • ♦ · Λ 9 *· • · · · · · ♦ ·· ·· ···· · ··
A neutrál-red vizsgálat eredményeként a cisz-platinumra adott dózis-függő válaszok ábrázolása, három-dimenziós csontvelő tenyészetek vázán vizsgálva.
19. ábra
Humán neodermisz törpe sertésbe történő implantációja során a seb teljes vastagságának felszíni fényképe, tíz nappal az implantáció után. Minimális összehúzódás figyelhető meg, a kiürülés, illetve a dehidratálódás jele nélkül.
20. ábra
Az aktív fibroblasztok, illetve a természetesen kiválasztott kollagén mentén kialakult neodermisz hisztológiai kiértékelésének fotomikrográfiája a háló rostok keresztmetszetén.
21. ábra
A seb fényképe, összehasonlítva neodermisszel (bal) kezelt, illetve önmagán a biodegradálódott hálón (jobb) kialakult esetekben. Megfigyelhető a kontrakció csökkenése, és a pigmentáció növekedése, illetve az implantált neodermiszt tartalmazó seben a szőrzet növekedése.
22. ábra
Humán dermális fibroblaszt lizátumba áztatott hálóról szerzett biopszia hisztológiai kiértékelésének fotomikrográfiája. Az önálló háló rostok körül az epitéliális sejtek migrációjának erősödése figyelhető meg.
23. ábra
A dermális ekvivalens hisztológiai kiértékelésének fotomikrográfiája, 21 nappal az implantáció után. Az ···«·· · · • · · · · *· • · 4 · · · ·«· ·· ···· · ·* epitéliális sejtek a dermális felszínről befelé vándorolnak, egyenletesen kapcsolódnak, ezáltal a normál differenciálódást, és növekedést szemléltetik. A háló mélyebb részein történő növekedés a transzplantált bőrre jellemző. A háló oldódása 3-4 hónapon keresztül figyelhető meg.
24. ábra
A seb teljes vastagságának fényképe, 21 nappal a neodermisszel való kezelés után. A neodermisz felét autogén tenyészet epiteliális oltása útján kaptuk. Az epiteliális oltás helye teljesen meggyógyult, ezáltal meggátolva a további kontrakciót, és szilárdan hozzátapadt a mélyebben elhelyezkedő dermális ekvivalenciához.
25. ábra
Az N ábrán bemutatott dermális/epidermális helyszín hisztológiai kiértékelésének fényképe. A keratinociták egyenletes növekedése, és dermális ekvivalenshez kapcsolódása figyelhető meg. 21 nappal a transzplantáció után még szemmel láthatók a háló rostjai, és a fibroblasztok maradéka még aktív a természetesen szekretált kollagén rostok között.
5. A találmány szerinti a három-dimenziós sejttenyésztő rendszer részletes leírása
A találmány tárgya három-dimenziós mátrixok kialakítása, és azok három-dimenziós, több rétegű sejttenyészet vázaként történő felhasználása. Az eddig ismert szövet-tenyésztő rendszerekben a sejtek egy rétegben nőttek. A találmány szerint a három-dimenziós váz segítségével növekvő sejtek több rétegben fejlődnek, és ezáltal celluláris mátrixot hoznak létre. Ez a mátrix rendszer az eddig ismert monolayer szövettenyésztő rendszerekkel szemben jobban megközelíti az in vivő fiziológiai körülményeket. A három-dimenziós sejttenyésztő rendszer a különböző sejtek, valamint a különböző formájú szövetek, (beleértve, de nem korlátozó módon a csontvelőt, bőrt, májat, hasnyálmirigyet, vesét, adrenalint, és idegszöveteket) sejtosztódásának létrehozására alkalmasak.
A tenyésztési-rendszer széles körben alkalmazható. így például egyes szövetek (például bőr, mirigy, stb.) háromdimenziós tenyészetét magába az élő szervezetbe transzplantálhatjuk, illetve implantálhatjuk. A szétterjedő szövetek, például a csontvelő esetében lehetőség van az osztódó sejteknek a transzplantálandó tenyészetből történő izolálására. A három-dimenziós tenyésztési-rendszereket felhasználhatjuk in vitro citotoxicitás mérésekre, valamint az alkotó anyagok ellenőrzésére. A három-dimenziós tenyésztési-rendszerek bioreaktorként való további felhasználása lehetőséget nyújt a celluláris termékek mennyiségi előállítására.
A találmány szerint a kívánt szövetekből származó sejteket (itt mint szövet-specifikus sejtek, illetve parenchima sejtek) inokuláljuk, és előre kialakított háromdimenziós váz mátrixon tenyésztjük. A támasztó mátrix tartalmazza a három-dimenziós mátrixon, vagy hálón növekvő váz-sejteket. A váz-sejtek fibroblasztokat tartalmaznak, valamint egyes esetekben az alábbiakban bemutatásra kerülő további sejteket és/vagy elemeket tartalmazhatják. A vázban megtalálható fibroblasztok, és más sejtek és/vagy elemek magzati vagy felnőtt eredetűek lehetnek, és általánosan ismert forrásokból származhatnak, így például bőrből, májból, hasnyálmirigyből, stb. Ezek a szövetek és/vagy szervek biopsziás vagy autopsziás eredetűek lehetnek. Általánosan tulajdonképpen a boncoláskor kapott szerveket alkalmazzák a váz-sejtek, és elemek kialakításához.
A fetális eredetű fibroblaszt támasztékot nyújt a különféle sejteknek és szöveteknek a három-dimenziós tenyésztési-rendszerekben történő növekedéséhez, és így a mátrixra inokulálható, mint általános támasztó váz-mátrix, a különböző sejtek és szövetek tenyésztése során. Ugyanakkor egyes példák szerint előnyösebb a specifikus, mint az általános támasztó váz-mátrixok felhasználása, ebben az esetben a támasztó váz-sejtek, és alkotó-elemek különleges, egyéni szövetekből, vagy szervekből származnak. így például abban az esetben, amikor a három-dimenziós tenyészeteket in vivő transzplantáció vagy implantáció céljára használjuk fel, előnyösebb a transzplantálandó vagy implantálandó szövetet befogadó egyénből beszerezni a szükséges vázsejteket, és alkotó-elemeket. Ez a megközelítés különösen előnyös lehet a transzplantátumnak és/vagy átültetendő szövetnek a gazda betegségével szemben történő immunológiai kiürülése esetén. Továbbá a fibroblasztok és más váz-sejtek és/vagy elemek ugyanabból a szövet-típusból származhatnak, mint a három-dimenziós rendszerben tenyésztettek. Ez előnyös lehet az egyéni szerkezeti/funkcionális szerepet betöltő különleges váz-sejteket tartalmazó szövetek tenyésztése során, mint például a glia-sejteket tartalmazó idegszövetek, a máj Kupffer sejtjei, stb.
Azok a váz-sejtek, amelyeket egyszer a három-dimenziós mátrixra oltottunk a mátrixon szaporodni kezdenek, és támasztékot nyújtanak a találmány szerinti három-dimenziós tenyésztés rendszerre inokulált szövet-specifikus sejteknek. A szövet-specifikus sejtekkel történő inokulálás során a három-dimenziós tenyésztési rendszerben tulajdonképpen hosszú időn keresztül aktív sejt-szaporodást tartunk fenn. Növekedési és szabályozó faktorokat adhatunk a tenyészethez, de ez azért nem elengedhetetlen, mert a támasztó váz-mátrix feldolgozza azokat.
Rendkívül fontos megismételni, hogy a találmány szerint a tenyészetekben az egyes szövetek körül in vivő található celluláris mikrokörnyezetben a parenchima sejtek inokulása során váz-sejtek növekedésének mértéke függ a háromdimenziós szövettenyészeten növekvő szövet típusától. így például a három-dimenziós csontvelő-tenyészet esetében előnyösebb a hematopoietikus sejteket a szubkonfluens vázmátrixra inokulálni. Ugyanakkor a bőr a három-dimenziós szövettenyészete esetében a találmány szerint előnyösebb, ha a váz-sejtek előbb kapcsolódnak össze, mint ahogy a keratinocitákkal és/vagy melanocitákkal történő inokulálás megtörténik, mivel így újra kialakulhat a bőr dermális alkotóinak szerkezete. Fontos az a tény is, hogy mivel a hálón levő nyílások lehetővé teszik a váz-sejteknek a tenyészetből való kijutását, a konfluens váz-tenyészetek nem mutatnak kontakt gátlást, a váz-sejtek folytatják a növekedést, osztódást, és funkcionálisan aktívak maradnak.
A találmány alapja részben az a felfedezés, mely szerint a három dimenzióban kialakított váz-sejteken a sejttenyészetek aktív osztódása hosszabb ideig tartható fenn, mint a monolayer tenyészetekben. Továbbá a háromdimenziós rendszerek segítik az in vitro sejttenyészetekben az érést, a differenciálódást, és a szeggregációt, miáltal a felnőtt szövetek alkotóit hozzák létre, melyek az in vivő megfigyelt másolatokkal analógok.
Bár a szabadalmaztatónak nem kötelessége vagy feladata megvilágítani a szabadalom tárgyának működési mechanizmusát, számos, a három-dimenziós tenyésztési rendszerre vonatkozó tényező járul hozzá annak sikeres felhasználásához:
(a) A három-dimenziós mátrix nagyobb felületet biztosít a fehérjék kapcsolódása, és ennélfogva a váz-sejtek megtapadása során.
(b) A három-dimenziós mátrixon a váz-sejtek aktívan növekednek, ellentétben a monolayer tenyészetekkel, melyek a növekedés során kontakt gátlást mutatnak, és abbahagyják a növekedést, és osztódást. A váz-sejtek replikációja során a növekedési és szabályozó faktorok feldolgozása lehet részben felelős a sejttenyészetekben az osztódás stimulálásáért, és a differenciálódás szabályozásáért.
(c) A három-dimenziós mátrix a celluláris alkotók térbeli eloszlását teszi lehetővé, ami az in vivő megfigyelt másolatokkal analóg.
(d) A három-dimenziós rendszerben a sejtek növekedéséhez rendelkezésre álló hasznos térfogat lehetővé teszi a celluláris éréshez vezető lokalizált mikrokörnyezet kialakulását.
(e) A három-dimenziós mátrix maximálja a sejt-sejt kapcsolatokat, nagyobb hatékonyságot biztosít a sejtek, például a makrofágok, monociták, és llmfociták részére az adherens rétegben való mozgáshoz és migrációhoz.
(f) Mint már megjegyeztük, a differenciált celluláris fenotípusok fenntartása nem csak növekedésí/differenciálódási faktorokat igényel, hanem megfelelő celluláris kapcsolatokat is. A találmány szerinti eljárás hatékony lehetőséget nyújt a szövetek mikrokörnyezetének újrateremtéséhez is.
Az alábbiakban a három-dimenziós támasztó váz, a tenyésztési rendszer, és fenntartása, valamint a háromdimenziós tenyésztési rendszer alkalmazási lehetőségeinek részletes bemutatása következik.
5.1. A három-dimenziós támasztó váz létrehozása
A három-dimenziós támasztékot olyan anyagokból és/vagy formákból hozhatjuk létre, melyek: (a) lehetővé teszik a sejtek számára a hozzájuk kapcsolódását (vagy úgy lettek módosítva, hogy a fent említett kapcsolódás létrejöhessen); és (b) lehetővé teszik a sejtek több rétegben történő növekedését. A mátrix kialakításához számos anyag fajtát alkalmazhatunk, beleértve, de nem meghatározó módon az alábbiakat: nylon (poliamidok), dakron (poliészterek), polisztirén, polipropilén, poliakrilátok, polivinilvegyületek (például polivinil-kloridok), polikarbonátok (PVC), politetrafluor-etilén (PTFE; teflon), termanox (TPX), nitrocellulóz, pamut, poliglikolsav (PGA), katgut varratok, cellulóz, zselatin, dextrán, stb. A fenti anyagok bármelyikét hálóba szőhetjük, és így például három-dimenziós mátrixot hozhatunk létre. Egyes anyagok, például a nylon, polisztirén, stb. gyenge szubsztrátot biztosítanak a celluláris kapcsolódás során. így, amennyiben ezeket az anyagokat használjuk fel a három-dimenziós támasztó-váz kialakítására, célszerű a váz-sejtekkel való inokulálás előtt a mátrixot előkezelni, a váz-sejtek és a mátrix összekapcsolódásának megkönnyítésére. így például vázsejtekkel történő inokulálás előtt a nylon matricákat 0.1 M ecetsavval kezeljük, majd poliszilinnel, FBS-el, és/vagy kollagénnel inkubáljuk, a nylon szálak bevonása céljából. A polisztirént kénsav alkalmazásával hasonló módon kezelhetjük.
Abban az esetben, amikor magát a három-dimenziós tenyészetet implantáljuk in vivő, előnyösebb a biodegradábilis matricák, így például a poli-glikol-sav, katgut varratok, vagy zselatin alkalmazása. Amennyiben a tenyészeteket hosszabb időtartamon keresztül hűtéssel tartósítjuk, a nem-biodegradábilis anyagok, így például nylon, dakron, polisztirén, poliakrilátok, polivinilvegyületek, teflon, pamut, stb. felhasználása előnyösebb. A találmány szerint általánosan alkalmazott nylon háló a Nítex, egy 210 um átlagos pórusmérettel, és 90 um átlagos szál-átmérővel rendelkező nylon szűrő-háló (#3-210/36, Tetko, Inc., N.Y.).
Az alábbiakban bemutatásra kerülő, fibroblasztot tartalmazó váz-sejteket, melyek egyéb elemekkel együtt, vagy azok nélkül fordulhatnak elő, a mátrixra inokuljuk. Az említett fibroblasztok különböző szervekből, így például a bőrből, májból, hasnyálmirigyből, stb. származhatnak, melyek (alkalmas esetben) biopsziás vagy autopsziás eredetűek lehetnek. A fibroblasztok nagy mennyiségben történő beszerzésére az alkalmas holttestek nyújtanak lehetőséget. Amint azt már előbb kifejtettük, a magzati eredetű fibroblasztokat általános három-dimenziós váz-mátrix kialakítására használhatjuk, mely a különböző sejtek és/vagy szövetek növekedését segíti. A specifikus váz- mátrixot a három-dimenziós mátrix fibroblaszttal történő inokulálásával állíthatjuk elő - ebben az esetben a fibroblaszt olyan szövetből származik, amelyet tenyésztünk, és/vagy abból az egyénből, aki a későbbiekben befogadja a találmány szerinti három-dimenziós rendszerben nőtt sejteket vagy szöveteket.
A fibroblasztok izolálása egyszerűen történhet, a fibroblaszt forrásául szolgáló alkalmas szerv vagy szövet lebontása útján. Az említett célra alkalmas eljárások a szakmában jártas kutatók számára általánosan ismertek. így például a szerveket vagy szöveteket mechanikus úton, és/vagy emésztő enzimmel, és/vagy kelát képző szerrel bonthatjuk le, ezáltal legyengíthetjük a szomszédos sejtek közötti kapcsolatokat, és lehetővé tehetjük a sejtek észrevehető törése nélkül a sejtek szövetekbe történő diszpergálását. Az enzimes disszociáció kivitelezése a szövetek felaprításával történik, ezután a felaprított sejteket a számos emésztő enzim közül néhánnyal önmagában, vagy kombináltan kezeljük. Az említett enzimek közé tartoznak, mégpedig korlátozások nélkül, többek között az alábbiak: tripszin, kimotripszin, kollagenáz, elasztáz, és/vagy hialuronidáz, DN-áz, pronáz, diszpáz, stb. A mechanikai sejtfeltárás kivitelezése különféle eljárásokkal történhet, mégpedig korlátozások nélkül, többek között az alábbiak szerint: darálók, keverők, sziták, homogenizátorok, a sejtek nyomása, stb., csak néhányat megnevezve a lehetőségek közül. A szövetek alkotókra bontására alkalmas eljárásokat ismertet Freshney, Culture of Animál Cells. A manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Láss, Inc., New York, 1987, Ch. 9, ppl07-126.
Az önálló sejtek szuszpenziójává átalakított szövetek szuszpenzióját több alcsoportra választhatjuk szét, melyekből kinyerhetők a fibroblasztok, és/vagy más váz sejtek és/vagy eleinek. Ezt a sejtek szeparálására alkalmas, általánosan ismert eljárásokkal hajthatjuk végre, beleértve, mégpedig korlátozások nélkül, többek között az alábbiakat: klónozás, a különleges sejt-típusok szelekciója, a nemkívánt sejtek elpusztítása (negatív szelekció), a kevert populációk sejtjeinek eltérő kapcsolódási képességére alapozott elválasztás, fagyasztásos-olvasztásos eljárások, a kevert populációk sejtjeinek eltérő adhéziós képességére alapozott elválasztás, szűrés, általános és zonális centrlfugálás, centrifugálásos ülepítés (ellenáramú centrifugálás), tömeg-egységen alapuló szeparálás, ellenáramú eloszlás, elektroforézis, fluoreszcenciás sejtszétválasztás. A klónozásos és szeparálás! eljárásokat ismerteti Freshney, Culture of Animál Cells. A manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 és 12, ppl37-168.
A fibroblasztok izolálása például az alábbi eljárással történhet: a friss szövet-mintákat Hank-féle kiegyenlített só-oldatban alaposan lemossuk és felaprítjuk, a szérum eltávolítása céljából. A felaprított szöveteket az emésztő enzim, például tripszin frissen készített oldatában 1-12 órán keresztül inkubáljuk. Az inkubálás után a disszociált sejteket felszuszpendáljuk, a pelleteket lecentrifugáljuk, és tenyésztő-edénybe helyezzük. A sejtek közül először a fibroblasztok kapcsolódnak, így a megfelelő váz-sejtek szelektíven elkülönülhetnek és növekedhetnek. Az izolált fibroblasztok ezután konfluensen növekedhetnek, majd kiemelhetők a konfluens tenyészetből, és a három-dimenziós • ·
- 26 mátrixra inokulálhatók (lásd Naughton és társai, 1987, J. Med. 18 (3&4) : 219-250) . A három-dimenziós mátrix nagy koncentrációjú váz-sejt oldattal, például 10 -5x10 sejt/ml, történő inokulálása a három-dimenziós támasztó váz rövidebb idő alatt végbemenő kialakulásához vezet.
A fibroblasztokon kívül más sejteket is adhatunk a három-dimenziós váz-mátrixhoz, a hosszú időtartamú tenyészet létrehozása céljából. így például a laza kötőszöveti állomány egyes sejtjei a fibroblasztokkal együtt inokulálhatók a három-dimenziós mátrixra. Ilyen sejtek lehetnek, korlátozások nélkül, az endotéliális sejtek, periciták, makrofágok, monociták, plazma-sejtek, adipociták, stb. Ezek a váz-sejtek legegyszerűbben a megfelelő szervekből, a májból, bőrből, stb. nyerhetők, a szakmai körökben jól Ismert, előbb említett eljárásokkal. A találmány egyik megjelenési formája a speciális szövetekből a tenyésztés céljára elkülönülített váz-sejtek fibroblaszt vázhoz történő hozzáadása. így például a hematopoietikus szövetek váz-sejtjei - beleértve, de nem korlátozó módon a fibroblasztok, endotéliális sejtek, makrofágok/monociták, adipociták, és retikuláris sejtek - alkalmasak a háromdimenziós szubkonfluens váz létrehozására, a megnövelt időtartamú in vitro csontvelő tenyészetekben. A hematopoietikus váz-sejteket könnyen kinyerhetjük a csontvelő szuszpenzióban kialakult álhártyás bevonat (buffy coat) alacsony fordulatszám, például 3000xg, mellett történő centrifugálásával. A máj váz-sejtjei a fibroblasztokat, Kupffer sejteket, a vaszkuláris és epe • · · · •·· ·· · · · • * · · · ·· • · · · · « • · · ««·· « ··
- 27 vezetékeket, valamint az endotéliális sejteket tartalmazhatják. Hasonló módon alakalmazhatunk támasztó»> vázként, az ideg-sejtek és szövetek osztódásának megkönnyítésére glia-sejteket; erre a célra az embrionális vagy felnőtt agy tripszinezésével, vagy kollagenázos emésztésével juthatunk glia-sejtekhez (Pontén és Westermark, 1980, in Federof, S. Hertz, L., eds, Advances in Cellular Neurobiology, Vol.l, New York, Academic Press, pp.209-227).
Ismételten megjegyezzük, hogy azokban az esetekben, amikor a tenyésztett sejteket in vivő transzplantálásra vagy implantálásra alkalmazzuk, előnyösebb a beteg saját szöveteiből kinyerni a váz-sejteket. A három-dimenziós támasztó váz-mátrix jelenlétében a sejtek növekedése fokozható azzal, ha a mátrixhoz, vagy bevonatként a mátrixra fehérjéket (például kollagének, elasztikus szálak, retikuláris szálak), glikoproteineket, glükóz-aminoglikánokat (például heparán-szulfát, chondroitin-4-szulfát, chondroitin-6-szulfát, dermatán-szulfát, keratán-szulfát, stb.), celluláris mátrixot, és/vagy egyéb anyagokat adunk.
A váz-sejtek inokulálása után a három-dimenziós mátrixot megfelelő tápközegben kell inkubálni. így általánosan alkalmazható például az RPMI 1640, a Fisher-, Iscove-, McCoy-féle, stb. közeg. Rendkívül fontos a háromdimenziós váz-mátrixot az inkubálás ideje alatt a tápközegben felszuszpendálni, a sejt-osztódás maximális hatékonysága elérése céljából. Továbbá, a tenyészetet az elhasznált tápközeg eltávolítása, a friss közeg adagolása, és a kiszabadult sejtek kiirtása céljából periodikusan kell
táplálni .
Az inkubációs periódus alatt a váz-sejtek lineárisan nőnek tovább, és beburkolják a három-dimenziós mátrixot, mielőtt a mátrix nyílásain keresztül annak belseje felé kezdenének nőni. Rendkívül fontos a megfelelő mértékű sejtnövekedés biztosítása, ami a váz-sejtek jelenlétét tükrözi az ín vivő szövetekben, hasonlóan a szövet-specifikus sejtekkel inokulált váz-mátrixhoz.
A mátrix nyílásainak megfelelő méretűeknek kell lenniük, hogy lehetőséget nyújtsanak a váz-sejtek számára a nyílásokon való átjutást. A mátrixon átnyúló, aktívan növekvő váz-sejtek fenntartása fokozza a váz-sejtek által feldolgozásra kerülő növekedési faktorok termelését, ezáltal segítve a meghosszabbított időtartamú tenyészeteket. így például, amennyiben túl kicsik a nyílások, a váz-sejtek gyorsan összekapcsolódnak, de nem tudnak kijutni a hálóból; az elfogott sejtek kontakt gátlást mutatnak, és abbahagyják a megnövelt időtartamú tenyészetek fenntartását, és az osztódás segítését. Amennyiben túl nagyok a nyílások, a váz-sejtek nem tudnak rajtuk átnyúlni; ez csökkenteni fogja a váz-sejtekben az osztódást és a megnövelt időtartamú tenyészetek fenntartását segítő megfelelő faktorok termelését. Háló típusú mátrix alkalmazása esetén, amint már említettük, a 150-220 um közötti nyílásokat találtuk kielégítőnek. Azonban, a mátrix három-dimenziós szerkezete és bonyolultsága miatt az eltérő méretek is megfelelőek lehetnek. így tulajdonképpen minden forma, vagy szerkezet, ami lehetővé teszi a váz-sejtek számára a mátrixon való «?. ν ·· < · «»*· •·· ·· · ·· « · 4 · · • · · · · · • · · «» ««<·· *
- 29 átnyúlást, és a megnövelt időtartamú replikációt és növekedést, megfelel a találmány szerinti rendszerek céljára.
A mátrixra eltérő arányban lerakodott különböző típusú kollagének hatással vannak a később inokulált szövetspecifikus sejtek növekedésére. így például a hematopoietikus sejtek optimális növekedéséhez a mátrix előnyös esetben III, IV, és I típusú kollagént tartalmaz, a megfelelő, 6:3:1 arányban, a kiindulási mátrixra vonatkoztatva. A bőr három-dimenziós tenyésztési rendszerében előnyösebb a kiindulási mátrixra lerakodott I, és III típusú kollagén. A lerakodott kollagén-típusok aránya a megfelelő kollagén-típust kialakító fibroblasztok szelektálásával befolyásolható, fokozható. Ez megfelelő izotópokkal jelölt monoklonális antitestek segítségével történhet, melyek a komplementek aktiválására és a speciális kollagén-típusok felismerésére képesek. Az említett antitestek és komplementek a kívánt kollagén-típust expresszáló fibroblasztok negatív szelektálására alkalmasak. A mátrix inokulálására alkalmazott sztróma a kívánt, megfelelő kollagén-típust szintetizáló sejtek elegye lehet. A kollagén öt típusának az eredetét és eloszlását mutatja be az 1. táblázat.
így a tenyésztett szövettől és a kívánt kollagéntípustól függően választhatjuk ki a három-dimenziós mátrixra inokulálandó megfelelő váz-sejteket.
- 30 1. táblázat
A kollagén öt típusának eredete és eloszlása
kollagén-típus eloszlás a legfontosabb szövetekben kiindulási sejtek
I laza és sűrű kötőszövet fIbroblasztok
kollagén rostok retikuláris sejtek
rostos porc síma izom sejtek
csont oszteoblaszt
dentin odontoblaszt
II hialin és
rugalmas porcok porcsejtek
szem üvegtestje retinális sejtek
III laza kötőszövet fibroblasztok
retikuláris rostok bőr papilláris rétege retikuláris sejtek
erek sima izom sejtek endoteliális sejtek
szemlencse tok lencse-rostok
V fetális membránok placenta alap membránok csont fibroblasztok
síma izom sima izom sejtek
- 31 A három-dimenziós támasztó váz inkubálása alatt a mátrix kibocsátja az osztódó sejteket. A kibocsátott sejtek a tenyésztő edény falához tapadhatnak, ahol tovább folytatják a szaporodást, és összefüggő réteget képeznek (monolayer). A jelenség megakadályozására, vagy minimális mértékűre csökkentésére vagy a kibocsátott sejteket távolitjuk el a tenyészet táplálása során, vagy a háromdimenziós támasztó mátrixot helyezzük át új tenyésztő edénybe. Az összefüggő réteg (monolayer) jelenléte az edényben leállítja a sejtek három-dimenziós mátrixon és/vagy tenyészetben történő növekedését. Az összefüggő réteg (monolayer) eltávolítása, vagy a mátrix másik edénybe, friss tápközegbe való áthelyezése visszaállítja a három-dimenziós tenyésztő-rendszerben az osztódás hatékonyságát. Az eltávolítást, illetve áthelyezést akkor célszerű alkalmazni, amikor a monolayer tenyészet eléri a 25 %-os konfluenciát. A kibocsátott sejtek megtapadását megakadályozhatjuk az edény összerázásával is, vagy a tenyészet periodikus táplálása helyett olyan rendszer kialakításával, melyben a friss tápközeg folyamatosan áramlik. Az áramlási viszonyokat úgy célszerű beállítani, hogy a három-dimenziós tenyészetben az osztódás mértéke a lehető legnagyobb legyen, a kibocsátott sejtek a mátrixból kimosódjanak, így ne tudjanak megtapadni az edény falán, és konfluensen növekedni. Egyes esetekben a kibocsátott sejteket összegyűjthetjük és a későbbi felhasználásig fagyasztva tárolhatjuk.
- 32 • <
• · · ·
t · Λ *> ·
5.2. A szövet-specifikus sejtek három-dimenziós támasztó mátrixra inokulálása, és a tenyészet fenntartása
Amikor a három-dimenziós támasztó mátrix elérte a megfelelő növekedési fokot, a tenyészteni kívánt szövetspecifikus sejtekkel (parenchima sejtek) beoltjuk a mátrixot. A nagy koncentrációjú inokulum alkalmazása gyorsabb és erőteljesebb osztódást eredményez, mint az alacsonyabb koncentráció alkalmazása. Az ínokulálás céljára kiválasztott sejteket a tenyésztendő szövetek határozzák meg, melyek korlátozások nélkül az alábbiak lehetnek: csontvelő, bőr, máj, hasnyálmirigy, vese, ideg szövetek, adrenalin mirigy, stb.
így például, korlátozások nélkül, számos epiteliálís sejtet tenyészthetünk az élő három-dimenziós mátrixon. Az epiteliálís sejtek, korlátozások nélkül, a száj nyálkahártyája, és a gyomor-bél traktus sejtjei lehetnek. Az epiteliálís sejteket a szövetek enzimes kezelésével, ismert eljárásokkal izolálhatjuk, kiterjesztve az eljárást a három-dimenziós támasztó váz epiteliálís sejtjeire (neoszubmukóza). A szubmukóza jelenléte növekedési faktorokat és egyéb fehérjéket biztosít, melyek elősegítik a száj nyálkahártya sejtjeinek, és a gyomor-bél traktus sejtvonal sejtjeinek normál elválasztását és differenciálódását. Az eljárás alkalmazásával a többi epiteliálís sejt sikeresen növekszik, beleértve az orr, a légző traktus, a hüvely, és a szaruhártya epiteliumát.
- 33 Számos tumor képes az élő, három-dimenziós támasztó vázon növekedni. Ilyen tumor lehet, korlátozások nélkül, az adenokarcinóma és a malignáns melanóma, mely közvetlen eredetű lehet, vagy áttételes helyről származhat. Ezeket a tenyészeteket a három-dimenziós epiteliális tenyészetekhez hasonlóan hozhatjuk létre. Röviden, a beteg tumor, vagy normál szövetéből, vagy allogén forrásból származó vázsejtjei hozzák létre a hálót. A közel konfluens állapot elérése után a váz-sejteket beoltjuk a tumor-sejtekkel. A tumor-sejtek gyorsan folytatják az osztódást, és létrehozák a három-dimenziós szilárd tumort. Az ilyen három-dimenziós támasztékon növekvő tumor-sejtek morfológiája hasonlít az in vivő állapotban található formához, és mind a felületi antigének expresszálása, mind azok leadása a szilárd tumorokhoz hasonló módon történik; a monolayer tenyészetben fejlődő malignáns sejtek nem mutatnak ilyen mértékű hasonlóságot az in vivő tumor szövetekkel. A tumor-sejtek élettani növekedése a tanulmány szerinti alkalmazás mellett új gyógyszerészeti anyagok, egyéni kemoterápiás étrendek kifejlesztését, és az anyagcsere mechanizmusának tanulmányozását teszik lehetővé. Ráadásul az ilyen tumortenyészetek az egyéni immunoterápiában is felhasználhatók. Az CR felszabadulás tanulmányozásával foglalkozó kísérletek azt mutatták, hogy a Lak sejtek jóval hatásosabb választ válthatnak ki a három-dimenzióban fejlődött tumorsejtekkel szemben, mint a monolayer tenyésztettekkel szemben. Az immun-sejteket a hagyományos eljárások segítségével nyerhetjük ki a betegekből, és tehetjük
4* ♦ *·« * · · · · « • · · · ·«<t • -* ♦ · · ♦ « »*« r« ···· ··*
- 34 érzékennyé a beteg saját sejtjeinek három-dimenziós tenyészetében nőtt tumor-sejtjeivel szemben.
Az inokulum általában tartalmazhatja a szövet visszatartott (stem-, reserve-sejtek) sejtjeit is; így például az új sejteket termelő sejteket, melyek a a szövet számos összetevőjét létrehozó differenciálódott sejtekben érnek meg.
Az inokulumként alkalmazott parenchimális, vagy szövet-specifikus sejteket a kívánt szövet lebontása útján kapott szuszpenzióból az 1. pontban bemutatott általános eljárások segítségével kaphatjuk meg. A három-dimenziós támasztó váz-mátrix beoltásához magát a teljes celluláris szuszpenziót felhasználhatjuk. Eredményként a homogenátumban levő regenerálódó sejtek a mátrixon megfelelő módon osztódni, érni, és differenciálódni kezdenek, míg a nemregenerálódó sejtek nem. A speciális sejteket a szuszpenzióból általánosan ismert eljárások segítségével, így például az 1. pontban bemutatott frakcionálással kaphatjuk meg. A már izolált visszatartott (stem-, reserve-sejtek) sejteket előnyösen felhasználhatjuk a három-dimenziós támasztó váz inokulálásához. így például a csontvelő tenyészetek esetén a három-dimenziós vázt friss, vagy fagyasztva tárolt csontvelő sejtekkel ínokulálhatjuk. A bőr tenyészetek esetén a három-dimenziós vázt melanocita vagy keratinocita sejtekkel inokulálhatjuk. A máj tenyészetek esetén a három-dimenziós vázt hepatocitákkal inokulálhatjuk. A hasnyálmirigy tenyészetek esetén a háromdimenziós vázt belső elválasztású hasnyálmirigy sejtekkel
Τ · 99 ·· 999999 · · 9 9 99 · · · · ♦·· « · « · 9 ·« »·· ** ···· *99 inokulálhatjuk. A parenchima sejtek szövetekből történő elválasztására alkalmas eljárásokat lásd: Freshney, Culture of Animál Cells. A manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 20, pp257-288.
Az inkubálás után a három-dimenziós sejttenyészetet a tápközegben felszuszpendáljuk vagy beleáztatjuk. A tenyészetet a friss közeggel periodikusan táplálhatjuk. De, és ezt ismételten megjegyezzük, meg kell akadályozni a tenyészetből kiszabadult sejteknek az edény falához tapadását, mivel különben a sejtek ott osztódni kezdenek, és konfluens monolayert hoznak létre. A sejtek kiszabadulása a három-dimenziós tenyészetből a diffúz szövetek alkalmazása esetén sokkal könnyebben történik meg mint a szerkezettel bíró szövetek alkalmazása esetén. így például a bőr találmány szerinti, három-dimenziós tenyészete hisztológiailag és morfológiailag megfelelő; a különböző dermális és epidermális rétegek nem bocsátanak ki sejteket a környező táptalajba. Ezzel szemben a találmány szerinti három-dimenziós csontvelő tenyészet érett, nem-adherens sejteket bocsát ki a tápközegbe, mégpedig az in vivő kibocsátáshoz hasonló úton. Amint azt már előbb is kifejtettük, a kibocsátott sejtek az edény falához tapadhatnak, és konfluens monolayert alkothatnak, ezzel leállítva a három-dimenziós tenyészetben az osztódást. Ezt a jelenséget elkerülhetjük a kibocsátott sejtek táplálás során történő eltávolításával, a három-dimenziós tenyészet másik edénybe helyezésével, a tenyészet felkeverésével, ami a kibocsátott sejtek falhoz tapadását akadályozza meg, illetve
4····· • 4 • ·» •4 •♦· a friss tápközeg folyamatos, a kibocsátott sejtek eltávolításához szükséges folyadékáramú áramoltatásával. Egyes esetekben a kibocsátott érett sejteket összegyűjtjük, és a további felhasználásig fagyasztva tároljuk.
Növekedési és szabályozó faktorokat is kell a tápközegbe adnunk, mivel ezeket a három-dimenziós váz-sejtek feldolgozzák. Ugyanakkor ezeknek a faktoroknak az adagolása, vagy a speciális sejtekkel történő inokulálás fokozhatja, átalakíthatja, vagy módosíthatja a tenyészetben a sejtek osztódását és érését. A sejtek növekedését és aktivitását a tenyészetben számos növekedési faktor befolyásolhatja, így például az inzulin, a növekedési hormonok, a szomatomedinek, a telep stimuláló faktorok, az eritropoetin, az epidermális növekedési faktor (hepatopoetin), és a máj-sejt növekedési faktor. Más faktorok, melyek az osztódást és/vagy differenciálódást szabályozzák, a prosztaglandinok, interleukinok, és a természetben előforduló chalonok.
• · · Λ · ·* • · · · · · · ··· ·· ···· · ··
5.3. A három-dimenziós tenyésztési rendszer alkalmazása
A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszert széles körben alkalmazhatjuk. Ebbe korlátozások nélkül beleérthetjük a mátrixból kapott, tenyésztett sejtek, valamint az in vivő tenyésztett mátrix transzplantációját vagy implantációját; citotoxikus komponensek, például allergének, növekedési/szabályozó faktorok, gyógyszerészeti vegyületek, stb. in vivő vizsgálatát; egyes betegségek mechanizmusának felderítését; egyes drogok/növekedési faktorok működésének a tanulmányozását; rákos betegek diagnosztizálását, és a betegség követését; a gén terápiát; és a biológiailag aktív termékek előállítását - hogy csak a legfontosabbakat említsük meg.
Az ín vivő transzplantáció vagy implantáció céljára a sejteket a burkoló fehérjétől függően a tenyészetből nyerhetjük, vagy magát az egész három-dimenziós tenyészetet implantálhatjuk. így például a három-dimenziós csontvelő tenyészeteket in vitro hosszú ideig fenntarthatjuk; az ilyen tenyészetekből izolált sejteket transzplantációs célokra alkalmazhatjuk, vagy az egész tenyészetet implantálhatjuk. Ezzel szemben a bőr-tenyészetek esetében a teljes háromdimenziós tenyészetet in vivő oltjuk át az égési sérülések, bőr fekélyesedés, sebek, stb. kezelésére.
A három-dimenziós tenyészetek implantációját a találmány a szerint már meglevő szövetek másolatának létrehozására, vagy méretének növelésére használhatjuk, új, vagy átalakított szövetek elfogadtatására, mesterséges • ·
- 38 végtagok alkalmazásánál, illetve biológiai szövetek vagy szerkezetek összekapcsolásánál. így például, korlátozások nélkül, a találmány felhasználásának módja lehet (i) a három-dimenziós csontvelő tenyészet implantációja a kemoterápiás kezelés során elpusztult csontvelő helyettesítésére; (ii) a három-dimenziós máj tenyészet implantációja cirrhosisban szenvedő betegek máj-funkciójának fokozására; (iii) a három-dimenziós tenyészetben nőtt sejtek genetikai megváltoztatása (mint például az inzulint kódoló rekombináns gént expresszáló fibroblasztok három-dimenziós tenyészete); (iv) a porc három-dimenziós tenyészetével bevont csípő protézis; fog-protézis összekapcsolása a száj nyálkahártyájával.
A három-dimenziós tenyészeteket in vitro számos vegyület vizsgálatára alkalmazhatjuk, például citotoxikus vegyületek, növekedési/szabályozó faktorok, gyógyszerészeti készítmények, stb. A tenyészeteket ezért in vitro tartjuk fenn, és tesszük ki a vizsgálandó anyag hatásainak. A citotoxikus vegyületek aktivitását a tenyészetben károsított, vagy elpusztított sejtek száma alapján határozhatjuk meg. Ezt vitális festési technikákkal határozhatjuk meg. A növekedési/szabályozó faktorok meghatározása a mátrix celluláris tartalmának elemzésével történik, például az összes sejtszám, és a különböző sejtek száma. Ezeket standard citológiai és/vagy hisztológiai eljárásokkal határozhatjuk meg, beleértve az antitesteket alkalmazó immunocitokémiai eljárások alkalmazását, melyek speciális típusú celluláris antigéneket határoznak meg. A különféle drogoknak a három-dimenziós rendszerben tenyésztett normál sejtekre gyakorolt hatását szintén meghatározhatjuk. így például a vörös vértestek számát növelő drogokat három-dimenziós csontvelő tenyészetekben vizsgálhatjuk. A koleszterin metabolizmust befolyásoló, például csökkenő koleszterin termelést okozó drogokat három-dimenziós máj-tenyészetekben vizsgálhatjuk. A háromdimenziós tumor-tenyészeteket modell rendszerként alkalmazhatjuk, például az tumor ellenes gyógyszerek hatékonyságának vizsgálatára.
A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszert fiziológiai és patológiai viszonyok tanulmányozására alkalmazhatjuk. így például a háromdimenziós tenyésztési rendszerek alkalmasak az agy-vér-gát modellezésére; a modell alkalmas az agy-vér-gáton bejutó anyagok vizsgálatára. További felhasználási terület, korlátozások nélkül, a mukózális epitelium három-dimenziós tenyészete, mely a herpesz-, és papilloma-virus tanulmányozásához biztosít megfelelő modellt; a modell rendszer az anti-virális gyógyszerek hatékonyságának vizsgálatára alkalmas.
A három-dimenziós sejt-tenyészetek a rosszindulatú daganatok és betegségek diagnózisának megállapításában is segítséget nyújthatnak. így például a malignáns betegséggel gyanúsított betegből szövet biopsziát veszünk (például csontvelő, bőr, máj, stb.). Amennyiben a biopsziát a találmány szerinti három-dimenziós rendszerben tenyésztjük, a malignáns sejtek a tenyészetben az osztódás során klónozva terjednek el. így nőni fog a malignancia kimutatásának lehetősége, és a diagnózis hitelessége. Az eljárás különösképpen alkalmas az AIDS-es megbetegedések esetében, ahol a fertőzött sejtek mennyisége in vivő lecsökken. Továbbá a betegből nyert tenyészetet a citotoxikus és/vagy gyógyszerészeti készítmények hatékonyságának vizsgálatára, és a leghatékonyabb anyag kiválasztására is felhasználhatjuk; így például a malignáns, vagy beteg sejtek elpusztítása is már megkíméli a normál sejteket. Az erre alkalmas gyógyszert célszerű a beteg kezelése során felhasználni.
A találmány szerint a betegből viszonylag kis mennyiségű csontvelőt kell gyűjteni, majd a beteg csontvelőt kemoterápia vagy sugárzás segítségével elpusztítjuk. Ezután a csontvelő mintát a beteg sejtektől megfelelő kemoterápiás anyagokkal megtisztítjuk, in vitro elszaporítjuk, és végül visszajuttatjuk a betegbe. így ráadásul sokkal hatékonyabb tisztítást is elérhetünk, ha a beteg csontvelő kis mennyiségét megtisztítjuk, és ezután in vitro elszaporítjuk, mivel a három-dimenziós tenyésztési rendszer nagyobb mennyiségű tisztított csontvelő létrehozására is alkalmas. A legtöbb tisztító anyag káros mellékhatást okoz, például a normál hematopoietikus bőr-sejtek elpusztulását és szétesését, ami megnöveli az átültetés idejét, és a másodlagos fertőzések következtében sok esetben a beteg halálához vezet. Egy hatásos tisztító anyag az akut, nem limfocitás leukémia esetén a 4-hidroperoxioyolo-foszfamid (4HC), mely a malignáns sejtek kétszeres logaritmusos • · · · ···· · · • · · · · · • · · · · · pusztulását okozza. A hagyományos kezelés során 500-1000 ml beteg csontvelőt kezelünk, az ex vivő csontvelő 60-100 ng 4HC/ml mennyiséggel történő inkubálásával. Ezután a csontvelőt fagyasztva tároljuk a klinikai kemoterápia után 2-3 héttel történő visszajuttatásig. A találmány szerint a csontvelő összehsonlítható mennyiségét összegyűjtjük, 4HCvel tisztítjuk, és három-dimenziós tenyészetben in vitro elszaporítjuk, ezzel meggyorsítva az átültetés idejét, és lecsökkentve a betegek elhalálozását.
Az in vitro eljárások mind az állati (csontvelő transzplantációja egerekbe), mind a humán (allogén epidermális átültetés) transzplantáció esetén a sejtek kiürülésének lecsökkentésére alkalmasak. A három-dimenziós csontvelő tenyészetet az idegen antigének tolerálásának meggyorsítására is alkalmazhatjuk. Ilyenkor a donor hematopoietikus sejtjei a befogadó fél három-dimenziós támasztó vázán nőnek. Az ilyen tenyészetek három-dimenziós timusz-tenyészetek jelenlétében nőnek, amelyek ráadásul növekedési faktorokat és szabályozó faktorokat is biztosítanak a rendszernek, melyek a limfociták érését indukálják a csontvelő rendszerben. A hematopoietikus sejtek replikációjuk és érésük során megtanulják a befogadó sejt antigéneket sajátjuknak tekinteni, ezáltal tolerálni tudják az idegen sejteket.
Az osztódó sejtek és szövetek tervezett felhasználásától függően számos speciális sejtet adhatunk a három-dimenziós tenyészethez. így például a csontvelő megnövelt időtartamú három-dimenziós tenyészetében egyes mononukleáris sejt-tenyészetek, növekedési faktorok adagolásával, illetve olyan váz-sejtek adagolásával, melyeket úgy kezeltünk, hogy megtermeljék a kívánt növekedési faktorokat, fokozhatjuk a növekedést. Az ilyen tenyészetekből összegyűjtött sejteket transzfúzió, transzplantáció, illetve tárolás céljára használhatjuk fel. Ráadásul a beteg három-dimenziós bőr-tenyészetéből származó limfociták segítségünkre lehetnek az egyes immunológiai rendellenességek kiértékelésében és diagnosztizálásában, mint például az egyes autoimmun betegségek. Hasonlóképpen, amennyiben a betegből származó limfocitákat és úgynevezett mást sejteket adunk a három-dimenziós bőr-tenyészethez, a rendszer segíthet a beteg különféle allergénekre adott allergiás válaszának kiértékelésében, anélkül, hogy a beteget az allergéneknek ki kellene tennünk. Ehhez a betegből limfocitáit és úgynevezett mást sejtjeit tartalmazó három-dimenziós bőr-tenyészetet tesszük ki az egyes allergéneknek. A limfociták által termelt IgE és a bennlakó úgynevezett mást sejtek összekapcsolódnak, majd annak az allergénnek a hatására, amelyre a beteg érzékeny, vazoaktív mediátorok, például hisztamin kibocsátása indul meg. Az allergénnek kitett három-dimenziós tenyészetben az ilyen mediátoroknak a tenyészetbe történő kibocsátása a beteg allergiás válaszjeleként fogható fel és mérhető. Ez az eljárás lehetővé teszi az allergológiai tesztek elvégzését, anélkül, hogy a beteget a veszélyes és potenciálisan káros allergéneknek kitennénk. Hasonló rendszert alkalmazhatunk a kozmetikumok in vitro vizsgálatára is.
<t. · * · · · *··· · · ··« · · · · · • · · · · ·· • · · · · · ··· ·· ···· * ··
- 43 A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszer a gének és géntermékek in vivő génterápiás alkalmazását is lehetővé teszi. így például a rekombináns DNS technológia alkalmazásával vírus-, vagy szövetspecifikus kontrol mellett a betegbe bejuttathatjuk a hiányzó gént. A rekombináns DNS-t tartalmazó gént transzformáció során, vagy klónozott gazdasejt transzfekciója során alkalmazhatjuk, majd a kiónokat a három-dimenziós tenyésztési rendszerben elszaporíthatjuk. Az aktív génterméket expresszáló három-dimenziós tenyészeteket ezután olyan egyénekbe implantálhatjuk, akiknek szervezetéből az adott termék hiányzik.
A három-dimenziós tenyészetek génterápiás alkalmazásának számos előnye van. Először is, mivel a tenyészet eukarióta sejteket tartalmaz, a géntermék a tenyészetben szigorúan aktív terméket képezve fog expresszálódni, és feldolgozásra kerülni. Másodszor, a génterápiás eljárások csak akkor alkalmazhatók, ha a transzfektált sejtek száma lényegesen, a klinikai értékre fokozható; a találmány szerinti három-dimenziós tenyészet lehetővé teszi a transzfektált sejtek számának megnövelését, és a transzfektált sejtek kiegészítését (a sejtek elválasztásán keresztül).
Előnyös esetben az alkalmazott kontrol elemek a gén szabályozott expresszióját teszik lehetővé, így a végtermék in vivő csak szükség esetén szintetizálódik meg. A kiválasztott promotert részben a tenyésztett sejt, vagy szövet típusa határozza meg. Előnyösebbek a fehérjék
szekretálására képes sejtek és szövetek (például a durva endoplazmás retikulum, és a golgi komplex). így célszerű a májat és a többi mirigyes szövetet kiválasztani. A májsejtek alkalmazása esetén máj-specifikus virális promotereket, mint például a hepatitisz B vírus alkotóit alkalmazhatjuk az idegen sejteknek a májba való bevitele céljából, és az adott gének expressziójának szabályozására. Lehetőség van máj-specifikus promoter, például albumin alkalmazására is.
Példák a már leírt, és alkalmazható szövet-specifitást mutató transzkripcionális kontrol területekre, korlátozások nélkül: elasztáz I gén kontrol terület, mely a hasnyálmirigy acinusos sejtjeiben aktív (Swift és társai, 1984, Cell 38:639-646; Ornitz és társai, 1986, Cold Spríng Harbor Symp. Quant. Bioi. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:42S51S); inzulin gén kontrol terület, mely a hasnyálmirigy béta sejtjeiben aktív (Hanahan, 1985, Natúré 315:115-122); immunoglobulin kontrol terület, mely a limfoid sejtekben aktív (Grosschedl és társai, 1984, Cell 38:647-658; Adams és társai, 1985, Natúré, 318:533-538; Alexander, 1987, Mól.
Cell Bioi. 7:1436-1444;) albumin gén kontrol terület, mely a májban aktív (Pinkert és társai, 1987, Genes and Devel., 1:268-276); alfa-fetoprotein kontrol terület, mely a májban aktív (Krumlauf és társai, 19854, Mól. Cell Bioi. 5:16391648; Hammer és társai, 1987, Science 235:53-58); alfa-1antitripszin gén kontrol terület, mely a májban aktív (Kelsey és társai, 1987, Genes and Devel. 1:161-171); bétaglobin kontrol terület, mely a mieloid sejtekben aktív ·· «··'
- 45 (Magram és társai, 1985, Natúré 315:338-340; Kollias és társai, 1986, Cell 46:89-94); mlelin bázisos fehérje gén kontrol terület, mely az agy oligodendrocit sejtjeiben aktív (Readhead és társai, 1987, Cell 48:703-712); miozin könnyű kettős-lánc gén kontrol terület, mely a szkeletális izomban aktív (Shani és társai, 1985, Natúré 314:283-286); és a gonadotrop kibocsátó hormon gén kontrol terület, mely a hipotalamuszban aktív (Mason és társai, 1986, Science 234:1372-1378).
A találmány további felhasználása szerint a háromdimenziós tenyészeteket a gén transzdukció elősegítésére is alkalmazhatjuk. így például, korlátozások nélkül, a rekombináns vírust expresszáló vektort tartalmazó fibroblaszt váz három-dimenziós tenyészete a váz-mátrixai való kapcsolat útján alkalmas a rekombináns vírus sejtbe vitelére, ezzel stimulálja a vírus in vivő átöröklődését. A három-dimenziós tenyésztési rendszer sokkal eredményesebb utat biztosíthat a gén transzdukcióra, mint az eddigi DNS transzfekciós eljárások.
A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszer további felhasználási lehetősége a biológiai termékek nagy mennyiségben in vitro történő termelése. így például azok a sejtek, melyek nagy mennyiségű speciális biológiai anyagot termelnek (például növekedési faktorokat, szabályozó faktorokat, peptid hormonokat, antitesteket, stb.), vagy a genetíc engineering eljárásokkal idegen anyagok termelésére átalakított gazda-sejtek kiónjai a három-dimenziós tenyésztési rendszerben in vitro
- 46 elszaporíthatók. Amennyiben a transzformált sejtek kiválasztják a géntermékeket a tápközegbe, azt az általánosan ismert eljárásokkal elválaszthatjuk az elhasznált vagy kondicionált tápközegtől (például HPLC, oszlopkromatográfia, elektroforézises eljárások, stb.). A folyamatos áramlásos eljárás alkalmazásával, a háromdimenziós tenyészet táplálásával in vitro bioreaktort tervezhetünk. A bioreaktor három-dimenziós tenyészetén friss közeget nyomunk át, ami mind a génterméket, mind a kiszabadult sejteket eltávolítja a rendszerből. Ezután a génterméket az elfolyó anyagból vagy a kondicionált tápközegből izolálhatjuk (például HPLC, oszlopkromatográfia, elektroforézises eljárások, stb.).
Az alábbi fejezetekben számos példában ismertetjük a találmány alkalmazási lehetőségeit. Csak a leírás céljából ismertetjük, korlátozások nélkül, a különböző típusú sejtek és szövetek felhasználására alapozott, találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszert. A leírások korlátozások nélkül tartalmaznak csontvelőt, bőrt, májat, hasnyálmirigyret, de a három-dimenziós tenyészetben természetesen más sejt-, és szövet-típusok is alkalmazhatók. A találmányt tehát a bemutatott rendszerek jellemző adatait szemléltető példákon illusztráljuk.
- 47 6. A csontvelő három-dimenziós tenyésztési rendszere
A találmány szerinti három-dimenziós tenyészet segítségével a csontvelő sejtek másolatát kaphatjuk in vitro, fiziológiailag hasonló körülmények között. Rendkívül fontos, hogy az említett rendszerben létrehozott csontvelő replikák minden sejtet tartalmaznak, mely a normál csontvelőben előfordul, vagyis azokat a sejteket, melyek az eredeti, a kiindulási tenyészetnél alkalmazott csontvelő inokulumban jelen voltak.
Bár a csontvelő sejtjei, ha egyedül tenyésztjük őket, limitált növekedésre képesek, az ilyen tenyészetekben a megnyújtott időtartamú növekedés csak akkor alakulhat ki, ha jelen vannak a váz-sejtek is, vagy azok szekretált termékei. Lásd: Long-Term Boné Marrow Culture, D.G. Wright & J.S. Greenberger, eds., A.R. Liss, New York, (1984) ppl41-156.
A találmány szerint a csontvelő-sejtek fibroblasztok (fetális vagy csontvelő eredetű), vagy a normál csontvelő vázát tartalmazó sejt-típusok elegyében (beleértve a fibroblasztokat, makrofágokat, retikuláris sejteket, és adipocitákat) növekszenek a három-dimenziós támaszték jelenlétében. A lépből és/vagy hepatikus (máj) makrofág tenyészetekből, vagy a váz-sejtek részhalmazából származó faktorokat is adhatunk a tenyészetekhez. Úgy tűnik, hogy a találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszer maximális mértékűre fokozza a multipotenciális hematopoietikus stem sejtek osztódását, melyek
rendelkeznek a csontvelő újra-kialakításának képességével. A csontvelő elpusztulhat közvetlenül, vagy a környezet közvetítésével, egyes betegségek során, vagy a betegségek *kemoterápiával és/vagy sugárzással történő kezelése során.
Az általánosan alkalmazott monolayer tenyésztési eljárások alkalmazása során a csontvelő újra-kialakításának képességével rendelkező stem sejtek (marrow repopulatíng activity, MRA) megnövelt időtartamon keresztül maradnak fenn, és replikálódnak a szarvasmarha csontvelő tenyészetekben. Ezekben a rendszerekben a hematopoietikus sejtek expresszálódásának érését elsődlegesen a mieloid és monocítoid sejtek származása limitálja. A humán és nem-humán csontvelő sejtek folyamatos csökkenést mutatnak az idő múlásával, ami az őssejtekből mérhető (CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, stb.). Az ilyen monolayer tenyészetekben, mint például a szarvasmarhából előállított rendszerben, a legnagyobb expresszált sejt a granulocita. Ezzel szemben úgy tűnik, hogy a találmány szerinti három-dimenziós vázrendszerben a vértestek hematopoietikus ősseejtjei és a hematopoietikus prekurzorok replikálódnak és osztódnak. Továbbá úgy tűnik, hogy a differenciálódás fiziológiai úton folytatódik. így például az eritroid, mieloid, limfoid, makrofág, és megakarocita sejtek növekedése a találmány szerint ugyanilyen rendszer alkalmazása esetén ugyanilyen módon, folyamatosan történik. A stem sejtek replikációja szintén bizonyítható az erre alkalmas eredeti sejtek fenntartott, osztódó tenyészeteiből.
6.1. A csontvelő-sejtek kinyerése
Az inokulumként felhasználandó csontvelő sejteket közvetlenül a donorból, vagy fagyasztva történő tárolás után kaphatjuk. A sejteket először fizikai úton eltávolítjuk a retikulumból. Ennek megfelelően a donor csípőtarajából kis mennyiségű mintát (10-15 cc csontvelő/perifériális vérszuszpenzió) szívunk fel. A transzplantáció szempontjából ideális eredményt akkor kapunk, ha: (a) az az egyén, akitől a tenyészethez és/vagy a fagyasztáshoz a csontvelőt vettük, 40 évnél fiatalabb, és (b) a páciens nem beteg; de ezek a körülmények nem korlátozzák a találmányt. A csontvelő leszívása a donorból általánosan ismert eljárással történik. Erre a 4,481,946 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban találhatunk példákat.
Amennyiben a csontvelőt azért tenyésztjük, hogy a metastatikus betegségben, vagy hematológiai malignanciában szenvedő beteget kezeljünk, a betegből nyert csontvelőt a tenyésztés előtt fizikai, vagy kemoterápiás úton meg kell tisztítani a beteg sejtektől. Jelenleg a fizikai, vagy kemoterápiás tisztítási eljárások nagy mennyiségű mintát igényelnek, mert az eljárás nem szelektív, és mind a malignáns, mind a normál sejteket elpusztítja. A szelektív eljárások kifejlesztése most folyik. így például a malignáns sejtek specifikus antitestjeivel próbálják a toxikus anyagokat megcélozni, és a malignáns sejteket elpusztítani. Ezekhez a szelektív tisztítási eljárásokhoz kis mennyiségű • *
- 50 minta is elegendő. A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszerben a kis mennyiségű minta hatásosan megtisztítható, és a megmaradó egészséges sejtek elszaporíthatók. A donorból eltávolított csontvelő replikálható, vagy későbbi replikáció céljából megőrizhető. Amennyiben későbbi replikáció céljából tartósítjuk, számítógéppel vezérelt kriotechnológiai készülék alkalmazásával szaporodva fagyasztjuk a csontvelőt. így például a friss csontvelő/vér szuszpenzió aliquot mennyiségét ekvimoláris mennyiségben Nunc-csőbe, majd összetört jeget tartalmazó széles szájú bögrébe helyezzük, míg a fagyasztva történő tartósítás kivitelezésére alkalmas kamra is eléri a 4°C-ot. Közvetlenül azelőtt, hogy a mintát a kamrába helyeznénk, sterilen minden egyes Nunc-csőhöz dimetil-szulfoxidot és glicerolt tartalmazó védőanyagot adunk, melynek végső mennyisége megközelítőleg 5-7 % között lesz. A fagyasztási program közvetlenül a minták bevitele után indul. Fagyasztási programot a CryoMed Model Number 1010 controllel 1. számú programjával hajtottuk végre.
Az eljárás alkalmazásával a tripán kék festéses eljárás szerint a sejtek 80 %-ban megőrzik életképességüket a fagyasztás, majd 80°C-ra történő gyors felolvasztás után. Ráadásul az eredeti kolóniáknak több, mint 80 %-a képez egység-tenyészetet (CFU-C) (unit culture), mely a fagyasztás után visszanyerhető. A 4,107,937 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás példákat mutat be a csontvelő és egyéb biológiai anyagok fagyasztására, előre kiszámított hőmérséklet-, és idő-lefutásokkal. Előnyösebb esetben a
csontvelő-sejteket folyékony nitrogén alatt, -196°C-on tároljuk, amelyen a celluláris metabolikus aktivitás megszűnik.
6.2. A három-dimenziós váz-mátrix kialakítása
A csontvelő szuszpenzióból származó váz-sejteket el kell választani a csontvelő egyéb alkotóitól. A célnak megfelelő eljárások általánosan ismertek. így például alacsony fordulatszámon, körülbelül 3000xg mellett 20 percig centrifugáljuk a sejteket, ezáltal kinyerhetjük a makrofágok, fibroblasztok, adipociták, mononukleáris vérsejtek, retikuláris sejtek, és endoteliális sejtek színtelen alkotóit (például buffy coat). A buffy coat sejtjeit alkalmas közegben, például FBS-el, HS-el, hidrocortison-hemiszukcináttal és megfelelő antibiotikumokkal kiegészített RPMI 1640 tápközegben felszuszpendáljuk.
Ezután a sejteket a három-dimenziós mátrixra helyezzük. Az inokulumban a váz-sejteket magas koncentrációban alkalmazzuk, így a támasztó váz-mátrix hamarabb éri el a megfelelő mérétkű szubkonfluenciát. így például a háromdimenziós mátrixra, mely például petri csészében, vagy egyéb megfelelő edényben levő (például Titer-Tek konténer) steril nylon háló lehet (Tetko Corp. of New York, New York, USA) 10-10 váz-sejt/ml mennyiséget viszünk fel.
Ezután az inokulált hálót a megfelelő tápközeget, és a
- 52 tenyészetet tartalmazó edénybe helyezzük. A tenyészetet 3537°C közötti hőmérsékleten, körülbelül 5 % C02 jelenlétében, környezeti nyomáson, 90 %-os relatív páratartalom mellett inkubáljuk. Az elsősorban fibroblasztokból álló váz-sejtek a - háló nylon szálait teljesen körülnövik, mielőtt a nyílásokon keresztül a háló belseje felé kezdenének nőni. Az inokulum sejt-koncentrációjától függően a folyamat megközelítően 5-18 napig tarthat. A hematopoietikus sejtek inokulálása előtt a váz-sejtek szubkonfluenciájának mértéke az 1. ábrán látható. A három-dimenziós mátrixon növekvő szuszpendált vázsejtek ugyanolyan eljárással fagyaszthatok, mint az előbb, a < csontvelő esetében ismertettük. A hálón levő szubkonfluens sejtek fagyasztva történő tárolása esetén a nylon hálót összecsavarjuk, és védőanyagként dimetil-szulfoxiddal és glicerollal kiegészített RPMI 1640 tápközegben Nunc-cőbe helyezzük, melynek végső mennyisége megközelítőleg 5-7 % között lesz. A váz-sejtek hálón történő megfagyasztása során -l°C/perc kezdeti fagyasztási rátát alkalmazunk, +1°C és -40°C között. A végső -84°C eléréséig -2°C/perc és -3°C/perc közötti fagyasztási ráta alkalmazása az ideális. Az eljárás során a hálóról a sejteknek megközelítőleg 20-25 %-a válik le a hálóról.
6.2.1. A csontvelő váz-sejtek növekedésének fokozása
A csontvelő váz-sejtek növekedését elsődlegesen limitáló tényező a csontvelő váz-sejtek között levő
-- Λ9 • »«?.♦ * • · · fibroblasztok viszonylag alacsony mitotikus indexe. Az említett sejtek növekedése és az extracelluláris mátrixalkotókra való lerakódása hidrocortison-hemiszukcináttal és/vagy nagy sejt-eloszlású tenyésztett humán fibroblasztokból származó önszabályozó növekedési faktorok adagolásával fokozható.
A fibroblasztoknak a hálón való megtapadását és növekedését az alábbiakkal fokozhatjuk: a hálót I-IV típusú kollagénnel előre bevonhatjuk; vagy fetális humán fibroblaszt, illetve felnőtt fibroblaszt (az alábbiakban mint növekedést fokozó fibroblaszt) által szekretált kollagénnel bevont, vagy abba beágyazott hálót alkalmazhatunk. Az utóbbi esetet a fibroblaszt azon képességére alapoztuk, mely szerint az az egyes kollagén típusok előállítására képes. Ehhez a növekedést fokozó fibroblasztokat enyhe tripszinezés segítségével a hálóról a konfluencia elérésekor összegyűjtjük (5-7 nap a fetális humán fibroblaszt, illetve 14-18 nap a felnőtt fibroblaszt esetében), majd vagy az előbb leírt módon a csontvelő vázsejtekkel inokuláljuk, vagy a későbbi felhasználásig fagyasztva tároljuk.
A találmány további felhasználása szerint a kollagént, és az egyéb extracelluláris mátrix-alkotókat termelő, növekedést fokozó fibroblasztok a konfluencia eléréséig növekszenek a hálón. Ezután a hematopoietikus, és a csontvelő váz-sejtek elegyét a szubkonfluenciás növekedést fokozó fibroblaszt szitavászonra inokuláljuk.
A növekedést fokozó fibroblasztok növekedése, részhalmaz képzése, és fagyasztva tárolása során alkalmazott eljárásokat az alábbiakban ismertetjük.
(a) A növekedést fokozó fibroblasztok tenyészete.
A növekedést fokozó fibroblasztok tenyészetének kialakításához számos eljárást alkalmazhatunk. így például a fibroblasztok a megfelelő, 2-10 % FBS-el vagy 2-10 % HS-el kiegészített RPMI 1640 táptalajon növekedhetnek, melyhez 2 ug/ml gentamícint, penicillint, sztreptomicint, és fungizont adtunk. A tenyészet 35-37°C közötti hőmérsékleten, körülbelül 5 % CO2 jelenlétében, környezeti nyomáson, 90 %os relatív páratartalom mellett növekszik.
(b) A növekedést fokozó fibroblasztok részhalmaz képzése.
A növekedést fokozó fibroblasztok részhalmaz képzésére számos eljárást alkalmazhatunk. így például 5.0 x 10θ fibroblasztot, mely a csontvelő szuszpenzió, dermális fibroblaszt, vagy a holttestből nyert máj fibroblaszt buffy coat rétegéből származik, microtiter lyukakba” (microtiter csövekbe) helyezzük (lmm ) a konfluens növekedés céljából. A sejteket a tenyészetből ismételt
O _l_ 2 4- mosással gyűjtjük össze, ehhez általában Ca és Mg mentes, Hank-féle kiegyenlített sóoldatot alkalmazunk, és a mosást 4-6-szor ismételjük meg. A microtiter lyukakban maradó mátrixot az egyes mátrix-alkotókhoz kialakított, ♦ *· ·
- 55 direkt, illetve indirekt jelöléssel láthatóvá tett monoklonális antitestek alkalmazásával, indirekt immunofluoreszcenciás eljárással vizsgálhatjuk. így például a jelenlevő kollagén-típus meghatározására a különleges mátrix-alkotókkal szemben specifikus, nem-jelölt szarvasmarha IgG monoklonális antitestet enzimmel, vagy fluoreszcens izotiocianáttal jelölt nyúl anti-egér immunoglobulin G-vel tehetjük láthatóvá. Ezután számos, ismert eljárást alkalmazhatunk a negatív szelekcióhoz. Például a szuszpendált sejteket a komplement aktiválására képes (például IgG, IgM, stb.), különleges mátrix-alkotókat definiáló (például I-IV típusú kollagén, elasztin tropoelasztin, vagy fibronektin) izotípusú monoklonális antitesttel kezeljük, így izolálhatjuk azokat a sejteket, melyek minden egyes terméket megszintetizálnak. Amennyiben a sejteket tengerimalac komplementtel kezeljük, azok a sejtek, melyekhez a monoklonális antitestek kapcsolódnak, erősen károsodni fognak, vagy elpusztulnak. A mintában maradó életképes sejteket a növekedéshez az előbb ismertetett eljárással visszahelyezhetjük a microtiter lyukakba, majd összegyűjthetjük azokat. Az izolálási eljárás hatékonyságát a mátrix által szekretált, túlélő sejteknek és a direkt, vagy indirekt jelöléssel láthatóvá tett, megfelelő monoklonális antitesteknek a reakciójával követhetjük.
A hematopoietikus sejtek optimális növekedéséhez alkalmas kiindulási mátrix 6:3:1 arányban III, IV, és I típusú kollagént tartalmaz.
• · · · (c) A növekedést fokozó fibroblasztok fagyasztva történő tárolása.
A növekedést fokozó fibroblasztok fagyasztva történő tárolása számos eljárással történhet, amint ezt már a vázsejteknél ismertettük. A váz-sejtekhez hasonlóan a növekedést fokozó fibroblasztok közül is némelyik leválik a hálóról a fagyasztás alatt. A háló azonban hozzájárul a csontvelő váz-sejtek megtapadásához, és így csökkenti a mátrix kialakulásához szükséges időt, ami hasznos a hematopoietikus sejtek növekedése szempontjából.
6.3. Inokulálás hematopoietikus sejtekkel
A csontvelő sejteket megfelelő tápközegben felszuszpendáljuk (például FBS-el, HS-el, hidrocortisonnal és megfelelő antibiotikumokkal kiegészített RPMI 1640 tápközegben), majd a három-dimenziós támasztó vázra inokuláljuk. A sejtek frissek, vagy a fagyasztva tárolás után gyorsan felolvasztottak lehetnek, az utóbbi esetben körülbelül 80°-ra olvasztjuk fel a sejteket. A szubkonfluens váz-sejtekből álló hálószövetre megfelelő koncentrációjú sejtet inokulálunk. így például a három-dimenziós vázra 25 *7 mm -es plasztik tenyésztő edényekbe 10-10 sejtet inokulálhatunk, melyek 33-34°C-on, 5 % CC^-ben, környezeti nyomáson növekednek. A tenyészetek körül a relatív nedvességtartalom 90 %-os lehet. 3 nap után 35-37°C-ra ♦ ♦ t«
- 57 emeljük a hőmérsékletet.
A hematopoietikus sejtek általában a szubkonfluens váz-sejtek által kialakított természetes lyukakban nőnek,' és az eredeti sejtek a sejtek által kialakított adherens rétegben maradnak. Az adherens réteget vagy a közvetlenül a hálóhoz tapadt sejtek alkotják, vagy azok, melyek indirekt módon más, a hálóhoz közvetlenül tapadó sejtekhez kapcsolódnak. Bár a hematopoietikus tenyészetek gyorsan kialakulnak, a hematopoiezis szempontjából a limitáló lépésnek a vázak beoltása tűnik, mivel az inokulumból származó hematopoietikus sejtek főleg azokat a területeket oltják be, ahol a támasztó váz-mátrix jelen van. A mátrix külső felszínén látható kolonizálódás a részlegesen kifejlődött váz-rétegekben történik. A tenyészetek felszíne valamivel kissebb, mint a mátrixban, és úgy tűnik, hogy ezzel egy időben a nem-adherens zóna is bele tartozik. A tenyészetek lazán kapcsolódnak, és ez a kapcsolódás a rendszer táplálása után is megmarad. Az említett sejtek, melyek tehát az LTBMC típusú monolayer tenyészetekben egyenletesnek tűntek, a pszeudo-adherens réteg elnevezést kapták (Coulombel és társai, 1983, Blood 62:291-297).
4-5 nap után a nem-adherens rétegben megjelentek az érett granulociták, mononukleáris sejtek, és eritrociták, melyeket a citospin preparátumokon figyelhettünk meg. 7-10 nap után számos hematopoietikus tenyészetet figyelhettünk meg a háló intersticiumaiban, melyek morfológiailag megegyeztek a CFU-C-val, a kevert kolóniákkal, és a limfoid kolóniákkal. A megakariocita növekedés, bár korlátozott,
I * > η ebben a mátrix rendszerben jól megfigyelhető. Egy 3.6 cm területű tenyészeten átlagosan 450-950 CFU-C/hét keletkezett.
Az azonos egyedből származó váz-sejteket és a
- hematopoietikus sejteket tartalmazó tenyészeteket (autológ) elegendő hetente egyszer táplálni. A különböző egyed(ek)bői származó csontvelővel inokulált csontvelő-tenyészeteket (allogén) hetente háromszor kell táplálni, ezzel biztosíthatjuk az érett immunokompetens sejteknek a nemadherens rétegből történő, szükséges elpusztítását.
6.4. A három-dimenziós csontvelő tenyészetek megnövelt időtartamú növekedése
A három-dimenziós csontvelő tenyészeteket a megnövelt időtartamú növekedés fokozása céljából mononukleáris sejtekkel inokulálhatjuk. A perifériális vér mononukleáris sejtjeit Ficoll-hypaque, és Percoll heparinezett szuszpenziójából állíthatjuk elő. A perifériális vér sejtek, és a csontvelő hematopoietikus sejtek előnyös esetben ugyanabból az egyedből származnak (autológ). Ezeket a csontvelőből történő mintavétellel egyidőben, a véna felszúrásával, illetve fagyasztva történt tárolás útján kaphatjuk. A perifériális vér sejteket ezen kívül, a tenyésztés során a betegtől szerezhetjük be. Azonban, metastatikus betegség gyanúja esetén a mintát először meg kell tisztítani, amint ezt már fent említettük. A
- 59 mononukleáris sejteket közvetlenül a három-dimenziós csontvelő sejtekkel történt inokulálása után inokulálhatjuk. így például 4-5 nappal a csontvelő hemopoietikus sejtjeinek kezdeti inokulálása után, majd ezután minden harmadik héten
6
5x10-10 mononukleáris sejtet (ennél a lépésnél előnyös a mononukleáris sejt-rétegben a monocita sejteket alkalmazni) inokulálhatunk a hálóra. Az eljárás heti 10-13 %-al fokozhatja a hematopoiezist.
Kísérleteinkben a konfluens váz-sejt tenyészet nem, vagy inkább csak kis mértékben segítette a hematopoiezist. A humán hematopoietikus őssejtek definiálatlan növekedése a szükséges, sztrómából származó növekedési/szabályozó faktorok adagolása esetén előfordulhat. A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszer lehetővé teszi a vázsejtek számára a szubkonfluens állapot fenntartását, és így a rendszer hosszabb időn keresztül termeli meg a hematopoiezishez szükséges faktorokat. Ugyanakkor a háromdimenziós tenyésztési rendszer esetében alkalmazható, alább bemutatásra kerülő eljárások segítségével az idő-periódust meghosszabbíthatjuk.
így például a kiindulási csontvelő mintát aliquot mennyiségekre oszthatjuk, úgy, hogy mindegyik körülbelül 10θ hematopoietikus sejtet tartalmazzon. Ezek mindegyikét a szubkonfluens váz-sejtekből álló hálószövetre inokuláljuk. A tenyészeteket közvetlen megfigyeléssel, reverz fáziú mikroszkóppal követhetjük, vagy a táplálás után az elhasznált közegből készült citospin készítményen a nemadherens sejtek differenciálszámításával. A konfluencia
- 60 elérése előtt a tenyészeteket kollagenázzal kezeljük, és enyhe körülmények között megközelítőleg 6-10 percig ultraszonikáljuk. A tenyészetből disszociált hematopoietikus sejteket és váz-sejteket például érzékeny gradiens eljárás segítségével frakcionálhatjuk. A hematopoietikus sejtek mennyiségét hemacitométer segítségével meghatározhatjuk, és megközelítőleg 50 %-át fagyasztva tároljuk, a fent említett eljárás alkalmazásával. A hematopoietikus sejtek maradék 50 %-át aliquot mennyiségekre osztjuk, úgy, hogy mindegyik
ZZ körülbelül 10 hematopoietikus sejtet tartalmazzon, és a szubkonfluens váz-sejt tenyészetre inokuláljuk, mely fokozatosan növekszik. Amikor az említett tenyészet eléri a szubkonfluens állapotot, ugyanezt az eljárást ismételjük meg. Az eljárás: (a) a hematopoietikus sejtek növekedését a szükséges növekedési faktorokat termelő mikrokörnyezetben állandósítjuk, és (b) összefüggő részt hozunk létre, ahova a hematopoietikus őssejtek az átültetéshez megfelelő mennyiségben lerakodhatnak.
6.5. A hematopoiezis módosítása meghosszabbított időtartamú három-dimenziós csontvelő tenyészetekben
A humán csontvelő számos celluláris termékét tenyészthetjük a három-dimenziós rendszerben, mint szeparált tenyészeteken. A makrofágok, retikuláris sejtek, adipociták, és fibroblasztok külön-külön növekedhetnek, és szekréciós váladékképző aktivitásukat számos anyaggal való kezeléssel
- 61 módosíthatjuk. A fibroblaszt aktivitás módosítását fent már ismertettük.
A hematopoiezis módosítása a meghosszabbított időtartamú három-dimenziós csontvelő tenyészetekben, amennyiben a növekedés az alábbi módon folyik, az extramedulláris makrofágok szekréciójának módosításával történhet (Kupfer sejtek). A Kupfer sejteket például pronázos feltárással elválasztjuk a váz-szervről. Röviden, a szövet mintákat egy órán keresztül pronáz oldatban [0.2 % pronáz (Calbiochem) és Gey-féle kiegyenlített sőoldat (Gey's Balanced Salt Solution, BSS)] óvatos rázás mellett inkubáljuk. Az oldat pH-ját például IN NaOH alkalmazásával 7.3-7.5 közötti értékre állítjuk. A fenti eljárás során 30 perces intervallumokban deoxiribonukleázt (0.5 mg;
Calbiochem) adunk hozzá, a keletkező sejteket leszűrjük, és 10 percig 350xg fordulatszámmal centrifugáljuk. A pelleteket BSS-ben felszuszpendáljuk, és a littorális sejteket (makrofágok és endoteliális sejtek) Percoll alkalmazásával (Pharmacia) elválasztjuk a celluláris törmeléktől, és az érett vér-sejtektől. A kapott sejt frakciót 10 %-os módosított fetális szarvasmarha szérummal kiegészített Dulbecco-féle közeggel 3-szor 3 percig mossuk, majd 3-4xl06 sejttérfogatú műanyag tenyésztőedényekbe helyezzük.
Az egy órás inkubálás után azokat a sejteket, melyek nem tapadtak meg, a tápközeggel lemossuk, és az adherens sejteket 33°C-os 80 % relatív nedvesség tartalmú, 6 % CO2~t tartalmazó gázelegyben tartjuk. A sejtek növekedési és/vagy szekréciós aktivitását az alábbi módokon fokozhatjuk: (a) a • · • · · ·
- 62 CO2:<^2 arány változtatása, (b) a tenyészetek latex gyöngyökkel történő kezelése, (c) a tenyészetek szllikával történő kezelése, (d) prostaglandin E2, Ep vagy ?2alfa adagolása a közeghez, (f) a tápközeg interleukin 1-el, illetve interleukin 2-el történő kiegészítése. A makrofágok szekréciós termékeit ezekkel az eljárásokkal/anyagokkal módosíthatjuk.
A makrofágok szekréciós termékeivel kondicionált közeget a meghosszabbított időtartamú három-dimenziós csontvelő tenyészetekben az eritropoietikus/granulopietíkus arány módosítására alkalmazhatjuk.
• · · ·
6.6. A három-dimenziós csontvelő tenyésztési rendszerek alkalmazása
6.6.1. Transzplantáció
A találmány szerinti három-dimenziós csontvelő tenyészeteket olyan betegségek, vagy állapotok kezelésére alkalmazhatjuk, melyek során az egészséges csontvelő elpusztul, vagy melyek elnyomják annak funkciós képességét. Az eljárás különsen a csontvelőre is átterjedő hematológiás malignanciák, és más neopláziák esetén alkalmazható. Ebből a szempontból a találmány hatásos azoknak a betegeknek a kezelésére, akiknél a környezeti tényezők ellentétesen hatottak a csontvelőre (például sugárzás, toxikus anyagok, stb.), vagy akiknek a betegsége során kemoterápiás és/vagy sugárzásos terápiák váltak szükségessé, melyek nem közvetlenül a csontvelő ellen irányultak. Ezekben az esetekben például az egészséges paciensből eltávolítjuk a csontvelőt, és tárolás után replikáljuk, majd visszajuttatjuk a beteg paciensbe, akinek a csontvelője közvetlenül elpusztult, vagy akinek kezelése közvetlenül a csontvelőt károsította.
A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszer számos előnyös tulajdonsággal rendelkezik a csontvelő transzplantálást igénylő betegek esetében. Az autológ transzplantáció az az eset, amikor a paciens saját sejtjeit fogadja be; ebben az esetben kicsi a valószínűsége annak, hogy a szervezet elutasítja a transzplantátumot. Az autológ transzplantáció az átültetés során kizárja a csontvelő elutasításának fő okozóit, és a gazdaszervezet· ellen irányuló reakciót. Amennyiben a csontvelő malignáns, vagy beteg sejteket tartalmaz, a találmány szerinti háromdimenziós tenyésztési rendszerben sokkal hatásosabban tisztíthatjuk meg a kis mennyiségű csontvelő mintákat. Mint már fent kifejtettük, a malignáns, vagy beteg sejtek tisztítására a kis mennyiségű csontvelő mintából kiinduló szelektív eljárások biztosítják a leginkább megfelelőnek. A bemutatott három-dimenziós tenyésztési rendszerben mindez megvalósítható. A betegből kinyert kis mennyiségű mintát a szelektív eljárásokkal sokkal hatékonyabban tisztíthatjuk meg, az eljárás a malignáns sejteket elpusztítja, míg az egészségeseket megkíméli. A megmaradó egészséges sejteket ezután elszaporíthatjuk a találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszerben. Ráadásul a jelen találmány szerinti eljárás sokkal agresszívebb kezeléseket tesz lehetővé a neoplasztikus betegségek kemoterápiás vagy sugárzásos kezelése során. A kezeléseket csak a csontvelő toxicitása limitálja.
6.6.2. A beteg állapotának követése
A rákos, vagy egyéb betegségben szenvedő paciensek esetében a beteg állapotának követésére megfelelő eljárás, ha a beteg csontvelejéből mintát veszünk, melyet megvizsgálhatunk. Ilyen módon a klinikai nyilvánvalóság előtt detektálható a betegség kiújulása, vagy metastázisa. így a csontvelő vizsgálatával lehetőség nyílik a beteg állapotának követésére.
A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszer alkalmazásával a felszívott csontvelő mintából származó, meghosszabbított időtartamon keresztül növekedő meg nem tisztított sejtekben fokozható a kromoszóma abnormalitásokkal szemben a klónokból származó metastatikus sejtek és hematopoietikus sejtek detektálhatósága. Ezeket a sejteket a találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszerben klónosan elszaporíthatjuk, és így könnyen detektálhatjuk. Ezek a sejtek az általánosan alkalmazott, frissen felszívott csontvelőből készített kenetek vizsgálatakor elkerülhetik a kutatók figyelmét.
6.6.3. A komponensek követése
A csontvelőnek a gyógyszerészeti, anti-neoplazmatikus, és karcinogén anyagokkal, élelmiszer adalékokkal, és egyéb anyagokkal szemben mutatott citotoxicitását in vitro a találmány szerinti csontvelő replikáló rendszer alkalmazásával követhetjük.
Először egy stabilan növekvő csontvelő tenyészetet (beleértve mind a váz-sejteket, mind a hematopoietikus sejteket) hozunk létre. Ezután különböző koncentrációjú vizsgálandó anyagok mellett elszaporítjuk a tenyészetet. A vizsgálandó anyagokkal történő inkubálás után a tenyészetet fázismikroszkóppal megvizsgáljuk, így meghatározhatjuk a legmagasabb elfogadható dózist (HTD) - a vizsgálandó anyag olyan koncentrációját, mely mellett legkorábban jelennek meg a morfológiai abnormalitások. A citotoxicitási vizsgálatokat a szakmai körökben jól ismert szupravitális festési eljárások alkalmazásával végezhetjük el, így a sejtek életképességét is meghatározhatjuk a három-dimenziós rendszerben. A HTD meghatározása koncentráció sorozatot nyújt a további vizsgálatokhoz.
A vizsgálati sorozat létrehozása után a vizsgálandó anyagot számos koncentrációban vizsgálhatjuk meg, így meghatározhatjuk a vizsgálandó anyagnak a csontvelő tenyészetet alkotó különböző sejt típusok életképességére, növekedésére és/vagy morfológiájára gyakorolt hatását.
Hasonló eljárással állapíthatjuk meg a drogoknak a három-dimenziós tenyésztési rendszerre gyakorolt kedvező hatásait is, in vitro; így például a vörös vérsejtek képződését fokozó növekedési faktorok, hormonok, drogok vizsgálhatók. Ebben az esetben stabilan növekedő tenyészeteket vizsgálhatunk meg a teszelt anyagokkal szemben. Ezzel az eljárással az inkubálás után megvizsgálhatjuk a tenyészetek életképességét, növekedését, morfológiáját, a sejt típusát, stb. A drogokat különböző koncentrációban vizsgálhatjuk.
A találmány szerinti három-dimenziós sejttenyésztő rendszerek alkalmazása elfogadott a drogok vizsgálatára, és a citotoxicitási tesztek végzésére. A 18. fejezetben egy példát mutatunk be a három-dimenziós csontvelő tenyészeteknek a citotoxicitási vizsgálatok során történő alkalmazására.
7. A bőr három-dimenziós tenyésztési rendszere
A találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszer lehetőséget nyújt az epidermális és dermális elemek in vitro replikálására. Rendkívül fontos, hogy az így replikálódó sejtek megfelelően szegregálódjanak, és mind morfológiailag, mind hisztológiailag szabályos epidermális és dermális komponenseket alkossanak.
A három-dimenziós tenyésztési rendszer alkalmazása az epidermális és dermális sejtek növekedéséhez számos előnyös tulajdonsággal rendelkezik a monolayer tenyésztéssel szemben. Ez a modell lehetővé teszi a normális sejt-sejt kapcsolatok kialakulását, a természetes növekedési faktorok szekrécióját, valamint virtuálisan kimutatható, in vivő előforduló, összekapcsolódó szövet-háló kialakítását; a váz-sejtek fajta-specifikus, és faj-specifikus kollagént hoznak létre. Az így keletkező, tökéletesen eltávolítható hálószövet transzplantálható, fagyasztva tárolható, vagy, mint cél-szövet, citotoxicitási és drog mechanizmusok tanulmányozására alkalmazható. A modell lehetővé teszi a fibroblasztok önálló növekedését, mely által dermális ekvivalens jön létre, vagy a keratinocitákkal és melanocitákkal együtt történő növekedést, melynek során a
teljes vastagságú bőrrel egyenértkű ekvivalens keletkezik. A három-dimenziós rendszerben minden sejt metabolikusan aktív marad, és mitózison megy keresztül, ami a modell fő előnye.
A bőr találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszere számos alkalmazási lehetőséget nyújt, többek között mint az egyes vegyületek szubsztrátja a vegyület vizsgálata során, transzplantáció, bőrátültetés, valamint a bőrbetegségek és rendellenességek tanulmányozása. így például a vegyi anyagok potenciálisan toxikus természetük gyanúja miatt alapos vizsgálatra szorulnak, ezért nyilvánvaló a rövid idejű, érzékeny és reprodukálható, in vitro mérések fejlesztése iránti igény, melyek a drogok, kozmetikumok, élelmiszer adalékok, és peszticidek vizsgálatára alkalmasak. A bőr találmány szerinti háromdimenziós tenyésztési rendszere megengedi a szövetekvivalensek a vizsgálatok alapjaként történő alkalmazását, és az in vivő állapothoz közel hasonló rendszert ajánl, mely a normál sejtkapcsolatok előnyeivel rendelkezik.
Az égési sérülések esetében nyilvánvaló a bőr replikációjának szükségessége. Az Amerikai Egyesült Államokban és Európában számos kutatóközpont alkalmaz tenyésztett humán keratinocita allotranszplantátumokat és autotranszplantátumokat az égési sebek és a fekélyek folytonos beborítására (Eisinger és társai, 1980, Surgery 88:287-293; Green és társai, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5665-5668; Guono és társai, 1987, Plast.Reconstr. Surg. 80:626-635). Ezek az eljárások gyakran eredménytelenek, és a jelen találmány szerint a gyógyult * < *·
- 69 transzplantátum felhólyagzása és/vagy bőrgyengesége is kimutatható, a transzplantált epidermális réteg alatti egy vagy több kapcsolódó szövet komponens abnormalitása miatt (Woodley és társai, 1988, JAMA 6:2566-2571). A bőr találmány szerinti három-dimenziós tenyésztési rendszere mind az epidermis mind a dermis helyettesítésére lehetőséget biztosít, mellyel legyőzhetjük a tenyésztett keratínocitákkal történő, általánosan jellemző problémákat. A bőr citotoxicitása és helyettesítése esetén a bőr háromdimenziós tenyésztési rendszere ipari hozamok elérését biztosítja, továbbá lehetőséget nyújt az egyes bőrbetegségek tanulmányozására, új készítmények kifejlesztésére, a kezelések módosítására, és a természetesen szekretált gyógyszerészeti készítmények számára forrást biztosít.
7.1. A három-dimenziós támasztó váz kialakítása és a dermális ekvivalens létrehozása
A fibroblasztoknak a három-dimenziós mátrixra való inokulálása, és szubkonfluens növekedésük dermális ekvivalens kialakulásához vezet. A találmány előnyösebb alkalmazása szerint a fibroblasztokat addig hagyjuk osztódni, amíg teljesen beborítják a szubsztrátot; ezzel megmutathatjuk, hogy miután a fibroplaszok elérték a konfluenciát, folytatják az osztódást, mivel a háromdimenziós mátrix lehetővé teszi a sejtek létezését, ezáltal megakadályozva a kontakt gátlást. Bár inokulumként számos
fibroblasztot alkalmazhatunk, előnyösebb a bőr fibroblasztok alkalmazása, mivel ezek a megfelelő kollagén-típusra lerakódnak, és egyéb dermális alkotókat hoznak létre. A fibroblasztok allogének és autológok lehetnek. A bőr fibroblasztokat a dermális szövetek mechanikus és/vagy enzimatíkus lebontásával kaphatjuk. A kapott celluláris szuszpenzió bevonásakor a fibroblasztok a többi sejtnél gyorsabban megtapadnak, így konfluensen nőhetnek, majd enyhe enzimes kezeléssel összegyűjthetők, és az előbb ismertetett eljárással a három-dimenziós mátrixra inokulálhatók.
A három-dimenziós mátrixra történő inokulálás után hamarosan észrevehető a fibroblasztok megtapadása (például órák múlva), majd a pár nap múlva fibroblasztok elkezdenek keresztül nőni a mátrix nyílásain. A fibroblasztok metabolikusan aktívak, extracelluláris mátrixot szekretálnak, és gyorsan kialakítják az aktív fibroblasztokat és kollagént tartalmazó dermális ekvivalenst. A később inokulálandó epidermális sejtek növekedésének segítésére a fibroblasztoknak a háromdimenziós mátrixon megközelítően 60 %-os konfluenciát kell elérniük.
Bár a fibroblasztok önmagukban való alkalmazása is elegendő lenne a három-dimenziós váz-mátrix kialakításához, a három-dimenziós mátrix inokulálásakor egyéb váz-sejteket is adhatunk a rendszerhez. Ezek, korlátozások nélkül az alábbiak lehetnek: endoteliális sejtek, periciták, makrofágok, monociták, limfociták, plazma sejtek, adipociták, stb.
-♦ · • · · ί · · · ♦ · · e · ♦ ♦ ·«· · · · · · * · ” ·
7.2. A dermális ekvivalens epidermális sejtekkel történő inokulálása
Ahhoz, hogy teljes vastagságú bőrt tenyészthessünk, beleértve mind a dermális, mind az epidermális réteget, a dermális ekvivalenst epidermális sejtekkel kell inokulálni. Ekkor melanocitákkal, és keratinocitákkal egyszerre inokulálunk, vagy előnyösebb esetben egymás után. így például a keratinocitákkal inokulálhatjuk a szubkonfluens melanocitákat, melyek előzőleg lettek a váz-mátrixra inokulálva.
A melanociták, és keratinociták a fibroblaszt vázsejtektől függően allogének, vagy autológok lehetnek, és a bőrből izolálhatok, általánosan ismert eljárásokkal, például a bőr emésztőenzimben, például tripszinben történő inkubálásával, mely eljárás a dermális és epidermális rétegek elválasztására is alkalmas.
így például, korlátozások nélkül, a melanociták, és keratinociták az alábbi eljárásokkal izolálhatok. A szövet mintát, például a preputiumot úgy rendezzük el, hogy egész felszíne kezelhető legyen antibiotikumokkal. A szövetet először 20 percig, majd kétszer tíz percig tömény antibiotikummal mossuk. A szövet külső részét kis darabokra vágjuk, melyeket 0.15 %-os tripszin oldatba (PBS-ben, kálcium és magnézium nélkül) helyezünk, gyorsan eltávolítunk, majd ugyanolyan, de friss tripszin oldatba helyezünk (a szövetek be legyenek borítva az oldattal), majd egy éjszakán keresztül 2-8°C-ra hűtve tárolunk. Másnap a szövetdarabokat eltávolítjuk a tripszin oldatból, és görbe fogó segítségével eltávolítjuk az epidermiszt a dermisztől. Az epidermiszt kónikus csőbe helyezzük, és 0.15 % tripszint tartalmazó PBS-el (kálcium és magnézium nélkül) feltárjuk a szövetet, így egyszerű sejt szuszpenziót kapunk; a folyamat megkönnyítésére a mintákat Pasteur pipettával ismételten felszívjuk. Amikor a minta egyszerű sejt szuszpenziónak tűnik, 1400xg fordulatszámmal 7 percig centrifugáljuk, majd a tápközegben, vagy 0.01 mg/ml PMA-t tartalmazó, a melanocitákra nézve szelektív ktápközegben felszuszpendáljuk. Ennek megfelelően a tenyészetben keratinocitákat, vagy melanocitákat termelhetünk. Az epidermális sejteket felszuszpendálhatjuk, és a dermális ekvivalens inokulálására használhatjuk. Az epidermális sejtszuszpenziót bevonhatjuk, és a keratinocitákat, illetve a melanocitákat eltérő tapadási képességük alapján szeparálhatjuk. Az izolált melanocitákat először a dermális ekvivalensre inokuláljuk, majd a keratinociták inokulálása előtt pár napig nőni hagyjuk. Az így kapott szövet gyorsan növekszik, és a tápközegben exogén növekedési faktorok nélkül fenntartható.
A bőr-pótlások hátránya az, hogy a transzplantált területeken a haj tüszők, izzadság, és faggyú mirigyek hiányával járnak. Ennek a hiányosságnak a következtében a beteg nem képes a megfelelő hőmérséklet szabályozásra, ezért a bőre erősen kiszárad, és zilálva lélegzik. A probléma csökkentésére a bőrnek a transzplantációban nem érintett területéről biopsziát távolítunk el, melyet a dermális ekvivalensre implantálunk. A blopszián található tüszők, -és a kapcsolódó mirigyek a megfelelő helyeken a transzplantátumba helyezzük. A biopsziák mérete 4-8 cm között lehet, melyeket általánosan alkalmazott Baker-féle lyukasztóval távolítunk el. A nagyság szerint osztályozott, méretre készített biopsziákat eltávolítjuk a dermális transzplantátumról, és a tüszőket tartalmazó implantátummal pótoljuk, így előállítjuk a hisztológiailag megfelelő, és a normál bőrhöz hasonló transzplantátumot.
Néhány példa, korlátozások nélkül, a három-dimenziós bőr-sejt tenyészetek előállítására:
(a) a fibroblasztokat hagyjuk a hálón megtapadni, és
7-9 napig nőni, ezalatt elérik a konfluens állapotot, és lerakódnak az I, vagy III típusú kollagénre, úgy, ahogyan azt a növekedést fokozó fibroblasztoknak a csontvelő replikációs rendszerekben in vitro történő alkalmazásáról szóló fejezetben már bemutattuk;
(b) a melanocitákat a váz hálóra helyezzük, és a szubkonfluencia eléréséig, körülbelül 5 napig nőni hagyjuk;
(c) a keratinocitákat a szubkonfluens melanocitákra inokuláljuk.
Előnyösebb esetben az alábbi úton állítjuk elő a három-dimenziós bőr tenyésztési rendszert:
(a) a fibroblasztokat hagyjuk a hálón megtapadni, és körülbelül 14 napig nőni, ezalatt elérik a konfluens állapotot, és lerakódnak az I, vagy III típusú kollagénre;
• · · · · · e ··· ·· ···· * ·» (b) a melanocitákat a váz hálóra helyezzük, és a szubkonfluencia eléréséig, körülbelül 5 napig nőni hagyjuk;
(c) a keratinocitákat a szubkonfluens melanocitákra inokuláljuk.
A találmányt korlátozások nélkül alkalmazhatjuk az égési sérülések kezelésére is, így a sérülés után rövid idővel beboríthatjuk a sebet; ebben az esetben a találmány szerinti három-dimenziós sejttenyészet főleg fibroblasztokból áll, és a dermisznek (eddig úgy hivatkoztunk rá, mint neodermiszre) megfelelően a sebre helyezzük; melanocitákat és keratinocitákat egyaránt alkalmazhatunk. A neodermisz a beteggel szemben autológ vagy autogén sejteket tartalmazhat. Az epidermális sejtek a beteggel szemben allogének, vagy előnyösebb esetben autológok lehetnek. A találmány tartalmazza az élő, növekvő neodermisz implantációját, melyhez epidermális sejteket adhatunk, in vivő, illetve in vitro; egy lehetséges megoldást nyújt az az eset is, amikor a beteg saját sejtjeivel hozzuk létre a transzplantált neodermiszt.
7.3. A bőr három-dimenziós tenyészetének morfológiai jellemzése
A három-dimenziós váz morfológiai jellemzése szerint a mátrixra inokulált fibroblasztok átnyúlnak a mátrix nyílásain, lerakódnak rajta, és a belseje felé vándorolnak. Az 1. ábra szerint a fibroblasztok párhuzamos rétegeket alkotva rendeződnek el a természetes úton szekretált kollagén csomók között. A fibroblasztok gyorsan eloszlanak a sejtekben, és fehérjéket szekretálnak. A melanociták a három-dimenziós vázon normálisan nőnek, dendritet képeznek, és megőrzik pigment szállító képességüket (lásd 6.-8. ábra).
A teljes vastagságú bőr a levegővel érintkező határfelületen számos úton jöhet létre. A keratinociták levegő hatására sokkal gyorsabban differenciálódnak, és a keratin rétegek sokkal erőteljesebb szekréciót mutatnak, ami rendkívül fontos lehet a bőr penertációjának tanulmányozásakor.
Az említett sejttenyésztési rendszer fő előnye a többi, általánosan alkalmazott dermatológiai kutatással és átültetési tanulmánnyal szemben az, hogy a fibroblasztok a három-dimenziós mátrixban szubkonfluens, vagy konfluens növekedést érhetnek el, amint ezt fent már leírtuk, valamint megőrzik metabolikus aktivitásukat, természetes növekedési faktorokat, és a természetben előforduló I és III típusú kollagént szekretálnak. A sejtek megfelelő metabolikus aktivitása teszi a rendszert különlegesen előnyössé a citotoxicitási mérések céljára, a közvetlen kollagén szekréciót okozó rendellenességek, illetve a betegségből következő, kóros átalakulást okozó dermális és epidermális kölcsönhatások tanulmányozására.
7.4. In vivő transzplantáció
A transzplantációk és átültetések céljára előnyös a három-dimenziós matricákat biodegradálható anyagokból, például katgut varrartból, zselatinból, stb. létrehozni. Ez komoly előnyt jelent a három-dimenziós rendszer alkalmazása esetén, és lehetővé teszi, hogy a transzplantált szövet akkor is megőrizze sértetlenségét, amikor a háló természetes úton degradálódik, a test által adszorbeálódik, és a területére vándorló normál sejtek helyettesítik.
A három-dimenziós váz-mátrixot előnyös az átültetést befogadó beteg bőréből származó fibroblasztokból létrehozni. Lehetőség van fetális fibroblasztok, vagy fetális fibroblasztok és a beteg fibroblasztjai elegyének alkalmazására is. A találmány szerint a fibroblasztok autológ, allogén, vagy xenogén eredetűek lehetnek; a 19. fejezet példája a találmány különleges alkalmazását illusztrálja, amikor humán fibroblasztok találmány szerinti tenyészetét sikeresen ültették be malacokba. Ennél sokkal fontosabb az, hogy a később inokulálásra kerülő epidermális sejtek, a betegből származzanak, és ezáltal megakadályozzuk az átültetett rész kiürülését.
A találmány alkalmazásának egyik lehetősége szerint • · ·
- 77 magát a neodermiszt alkotó három-dimenziós támasztó vázat ültetjük át a beteg sebére. Ebben az esetben a beteg saját epidermális sejtjei in vivő alkotják a váz-mátrixot, és osztódnak rajta, létrehozva a teljes vastagságú bőrt, így például az epidermális, és a dermális réteget. Lehetőség van arra, hogy az epidermális sejteket a neodermiszre ültessük át, vagy az epidermális sejtek rétegeit alkalmazhatjuk. Amennyiben nagy területű sebet kell befedni, előnyös a teljes három-dimenziós bőrtenyészetet átültetni, vagy kombináltan alkalmazni a teljes neodermiszt, és a teljes vastagságú bőrtenyészetet. Például a neodermiszt a seb szélére ültethetjük át, míg a teljes vastagságú bőrtenyészetet a seb belső területére, így fokozható a növekedés, és a gyógyulás, valamint minimálisra csökkenthető a sebhely képződés.
7.5. A három-dimenziós bőrtenyészet in vitro alkalmazása
A bőr három-dimenziós tenyészetét számos célra felhasználhatjuk, beleértve a toxikus anyagok vizsgálatát, a drogok hatásmechanizmusának tanulmányozását, a bőrbetegségek és bőrrendellenességek tanulmányozását, stb.
A bőr három-dimenziós tenyészetét az egyes vegyületek citotoxicitási vizsgálata során szubsztrátként alkalmazhatjuk. Például a citotoxicitási vizsgálatok során a 6 cm-es lemezekre vágott hálón növekvő humán sejteket 96 • ·
- 78 lyukú síma felszínű szövettenyésztő mikroteszt lemezre helyezzük, és a megfelelő tápközeggel tápláljuk. Minden egyes mintához hozzáadjuk a vizsgálandó anyagot. A vizsgálandó anyagot előnyösen alkalmazhatjuk a limitáló higításos technikák felhasználásával, amikoris a toxikus anyag különböző koncentrációit vizsgáljuk. Az egyes szövettípusokat három sorban visszük fel a hálóra, így megkapjuk a megháromszorozódás adatait. A mérés az alábbi eljárással válik ellenőrzötté: háló önmagábamn; fibroblasztokkal inokulált háló; fibroblasztokkal és melanocitákkal inokulált háló; fibroblasztokkal, melanocitákkal, és keratinocitákkal inokulált háló. A vegyi anyagokat hozzáadjuk a szubsztráthoz, és körülbelül 24 órán keresztül inkubáljuk a rendszert. Az egyes anyagok citotoxikus hatását számos eljárással értékelhetjük ki. így például általánosan ismert eljárás a neutral vörös (neutral red) mérés, melyet a fenti rendszerre adaptálhatunk. Ehhez a közeg eltávolítása után a lyukakat kiöblítjük, mielőtt hozzáadnánk a neutral red méréshez szükséges 0.4 %-os vizes alapoldatot. A különböző időintervallumok után a festéket eltávolítjuk, majd 4.0 %-os formaldehiddel, és 1.0 %-oc CaCl2-al gyorsan lemossuk a sejteket. 20 perc után 540 nm-es szűrővel felszerelt Dynatech microplate reader segítségével megmérjük a mintákban a festék mennyiségét. A vitális festés során adszorbeált festék mennyiség közvetlenül arányos az egyes lyukakban jelen levő élő sejtek számával. A leolvasott értékeket átlagolhatjuk, és az eredményt, mint a kontroll tenyészetben mért alapvonal szintje feletti abszorbancia
- 79 értékeket fejezhetjük ki.
Tanulmányunk szerint a bőr az immunrendszer integrális és aktív része (Cooper és társai, 1987, The mechanobollous diseases. In: Dermatology in Generál Medicine, 3d. Ed., McGraw Hill, NY, pp610-626). A bőr egyik legnagyobb, az immunaktivitásért felelős sejtje a Langerhans sejt. A sejtet a friss bőr-mintából nyerhetjük, majd a három-dimenziós bőrtenyészethez adva immunológiailag komplett szövetrendszert kapunk. Ezeket a sejteket meghosszabbított időtartamú, eddig általánosan alkalmazott tenyészetekben nehéz szaporítani. A sejtekének a három-dimenziós tenyészetben történő növekedése tanulmányunk szempontjából, beleértve a az átültetéseket, citotoxicitási vizsgálatokat, és a betegség mechanizmusának tanulmányozását, rendkívül fontos. Az ilyen típusú bőrtenyészetek komoly előrelépést jelentettek a kutatásokban, beleértve a direkt, vagy indirekt úton a bőrhöz kapcsolódó autoimmun betegségeket (lupus erythematosis, bullous pemephlgoid, stb.).
Amint azt már fent kifejtettük, a bőr három-dimenziós tenyészetét az allergén érzékenységi vizsgálatok során is alkalmazhatjuk. Az allergia tesztek céljára a bőrtenyészetet a betegből származó limfocitákkal (vagy plazma sejtekkel) és mást-sejtekkel inokuláljuk. A tenyészetet IgE antitesttel összekapcsolt (limfoclták által termelt) allergénnel kezeljük, mely a jelenlevő mast-sejtekhez kapcsolódik, és a mast-sejtek ezáltal vazoaktív mediátorokat, például hlsztamint bocsátanak ki. A tenyészet hisztamin kibocsátása mérhető, és összefügg a betegnek az allergénre adott • · « ·
- 80 allergiás válaszreakciójával.
8. A máj három-dimenziós tenyésztési rendszere
A hepatocitákat a humán máj biopsziás vagy autopsziás anyagra adaptálva számos, általánosan ismert eljárással izolálhatjuk (Berry and Friend, 1969, J. Cell Bioi. 43:506520). A májkapuérbe (portai vein, portai branch) injekciós tűt vezetünk be, és a májat kálcium-, vagy magnézium-mentes pufferrel perfuzáljuk, addig, amíg a szövetek színe ki nem fakul. Ezután hasonló folyadékáramú proteolitikus enzimmel, például kollagenáz oldattal perfuzáljuk a szervet. így feltárjuk a kapcsolódó szövetszerkezetet. A következő lépésben a májat pufferrel mossuk, és a sejteket diszpergáljuk. A sejtszuszpenziót a törmelék eltávolítása céljából 70 um-es nylon hálón szűrjük. Két vagy három centrifugálással elválasztjuk a hepatocitákat a sejtszuszpenziótól.
A kimetszett humán máj egyes lebenyeinek perfúziójához HEPES puffért használunk. A kollagenázt tartalmazó HEPES pufferes perfúziót 30 ml/perc folyadékárammal végezzük. A rendszert kollagenázzal 15-20 percig 37°C-on tovább inkubáljuk, így egyedül álló sejtek szuszpenzióját (single cell suspension) kapjuk (Guguen-Guillouzo and Guillouzo, eds, 1986, Isolated and Culture Hepatocytes Paris, INSERM, and London, John Libbey Eurotext, pp.1-12; 1982, Cell Bioi. Int. Rep. 6:625-628).
Ezután az izolált hepatocitákat a három-dimenziós váz inokulálás-ára használhatjuk fel. Az inokulált vázat a hepatociták in vitro replikálása céljából a fiziológiai állapotokhoz hasonló körülmények között, a csontvelőhöz és a májhoz hasonlóan, a fent bemutatott eljárással tenyésztjük. Az eljárás a hepatociták megnövelt expresszióját eredményezi.
Az ilyen módon fenntartott máj-tenyészeteket számos célra alkalmazhatjuk, beleértve a citotoxicitási vizsgálatokat, a drogok vizsgálatát, stb. Egy lehetőség a máj három-dimenziós tenyésztési rendszerének alkalmazására a karcinogén és mutagén anyagok in vitro vizsgálata.
Részletesebben az alábbiakról van szó. Jól ismert tény, hogy bakteriális, vagy gomba eredetű teszt organizmusokkal szemben számos komponensnek gyengül a mutagenitása, és ez a kísérleti állatokban tumort okoz. Ezt a metabolikus aktivitás okozza; például egyes vegyi anyagok a májban levő, illetve az egyes szövetekben levő enzimek hatására metabolikus átalakuláson mennek keresztül (P450 oxidáz rendszer,, vagy hidroxilező rendszer), és új, karcinogén, vagy mutagén anyagokat hoznak létre. A karcinogének azonosítására Ames és munkatársai eljárást fejlesztettek ki, mely szerint a máj extraktumot a teszt organizmus előtt vegyi anyaggal ínkubáljuk (Ames és munkatársai, 1975, Műt. Rés. 31:347-364). Bár a megközelítés bonyolultabb, Ames módszeréből mégis hiányzik az érzékenység. Ezzel szmben a máj három-dimenziós tenyészete mind a metabolikus átalakítók, mind a teszt organizmusok esetében • »» · t ···· · ·<* <· · ♦ * · · • · · * · · · alkalmazható a vizsgált anyag mutagenitásának és karcinogenitásának vizsgálatára.
9. Az agy-vér gát három-dimenziós modell rendszere
A találmány szerinti az agy-vér gát három-dimenziós szövettenyésztő modell-rendszere előállítható. A háromdimenziós tenyészet újrateremti az endoteliális sejt gátat, mely a központi idegrendszert a három-dimenziós hálón konfluensen növekvő, az agyi hajszálerekből származó endoteliális sejtek segítségével választja el a véráramtól. Az endoteliális sejtekből álló váz-mátrixon először asztrocitákat, majd neuronokat alkalmazunk, úgy, hogy az endoteliális sejtek a tenyészet felett, és a neuronok alatt egy-egy gátat képezzenek. Egy, az endoteliális sejtek felszínén található alkotóanyagnak kell áthatolni az endoteliális sejtrétegen, és eljutnia a neuronok alá.
Például, korlátozások nélkül, az agyi hajszálerekből Larson és társai eljárásával (1987, Microvasc. Rés. 34:184) izolálhatunk endoteliális sejteket, melyeket az általánosan ismert in vitro eljárásokkal tovább szaporíthatunk. A hajszálerekből származó endoteliális sejteket a megfelelő hálóra inokulálhatjuk (például Tetko, Inc., #3-210/36), majd a teljes konfluencia eléréséig nőni hagyjuk; az endotelium hajszálereivel specifikus, és az endotelium gát funkciójához kapcsolódó szorosan egyesült komplex (junctional complex) jelenlétét ezüst festéssel f V v ·» ··· ·· •<f « · · · · · • · · « · ♦· ·«« ·· *··· · · ♦
- 83 állapíthatjuk meg.
A neuronokat és az asztrocitákat embrionális, vagy perinatális patkányokból nyerhetjük, majd általánosan ismert eljárásokkal választhatjuk el egymástól (Hattan és társai, 1988, J. Cell Bioi. 106: ). A neuronokat az asztrocitáktól például a szubsztráthoz való eltérő kapcsolódásuk alapján választhatjuk el, az edény falához tapadt asztrocitákat 100 ug/ml poli-D-lizinnel vonjuk be, míg az edény falához tapadt neuronokat 500 ug/ml poli-D-lizinnel.
Az asztrocitákat a konfluens, endoteliális sejtekből álló három-dimenziós váz-matricákra inokuláljuk, körülbelül 5 napig tenyésztjük, majd inokuláljuk a neuronokkal.
A több rétegű három-dimenziós szövettenyészet a hajszálerek endoteliális sejtjeinek egy rétegét, valamint asztrocitáknak és neuronoknak egy rétegét tartalmazza, és újrateremti az agy-vér gát in vivő megtalálható szerkezetét, ahol a vérben levő anyagok áthatolnak a hajszálerek endoteliumán, és elérik az agy neuron szövetét. A rendszert az egyes anyagok agy-vér gáton való átjutásának vizsgálata során alkalmazhatjuk. Mivel az említett gáton számos anyag nem képes átjutni, régóta volt szükség egy olyan in vitro rendszer létrehozására, melyen gyorsan követhető a vizsgálandó anyagok penetrációs képessége. Például egyes antibiotikumok nem képesek áthatolni az agy-vér gáton.
Fontos lenne az utóbbi időkben kifejlesztett antibiotikumok penetrációs képességének gyors vizsgálata is; viszonylag kis számú antibiotikum alkalmazható az egyes fertőzések esetén a központi idegrendszer kezelésére, ezek között penicillin84 származékok is vannak, melyeknél nagyobb az allergiás reakció valószínűsége, így egyre sürgetőbb az igény a CNSaktivítással rendelkező anyagok fejlesztésére.
10. A hasnyálmirigy-szövet három-dimenziós tenyésztési rendszere
A hasnyálmirigy acinusos sejtjeiből általánosan ismertetett eljárások alkalmazásával állíthatunk elő szuszpenziót (Ruoff és Hay, 1979, Cell Tissue Rés. 204:243252; és Hay, 1979, in, Methodological Surveys in Biochemistry. Vol. 8, Cell Populations. London, Ellis Hornwood, Ltd., pp.143-160). Röviden, a szöveteket összevágjuk és kálcium-mentes, magnézium-mentes pufferrel mossuk. Az összevágott darabokat trlpszin és kollagenáz oldatában inkubáljuk. A disszociált sejteket 20 um-es nylon hálón szűrjük, megfelelő pufferben, például Hank-féle kiegyenlített sóoldatban mossuk, és a pelleteket lecentrifugáljuk. A kapott pellleteket kis mennyiségű, megfelelő közegben felszuszpendáljuk, és a fent már ismertetett eljárással a három-dimenziós vázra inokuláljuk. Az acinusos sejteket a zimogén cseppecskékből kialakult zárványok alapján azonosíthatjuk. A hasnyálmirigy acinusos sejtjeinek három-dimenziós tenyésztési rendszere meghosszabbíthatja a sejtek túlélését a tenyészetekben.
··· ·’*· *··: • ! * .· · ·· ·:.. ; .··. ··
11. példa: A csontvelő három-dimenziós tenyésztési rendszere
A következő alfejezetek a három-dimenziós tenyésztési rendszer alkalmazását demonstrálják, humán, nem-humán főemlősök, és patkányok meghosszabbított időtartamú csontvelő tenyészetében. A három-dimenziós tenyészeteket pásztázó elektronmikroszkóppal, míg a sejt-tartalmat számos eljárással értékeltük ki. Az eredeti sejtek mennyiségét a CFU-C és a BFU-E alapján határoztuk meg; a sejt-tartalmat differenciálszámítással, és a különböző hematopoietikus sejtvonallal specifikus, jelzett monoklonális antitest alkalmazásával, citofluorográfiás analízissel határoztuk meg.
Az eredmények szerint a három-dimenziós tenyésztő rendszer elősegíti a különböző hematológiai eredet expresszióját, amit a humán, makákó, és patkány sejtek nemadherens és adherens zónáinak differenciálszámításával bizonyíthatunk. A három-dimenziós vázhoz kapcsolódott sejtek, azaz az adherens zóna citofluorográfiás analízise korai és késői mieloid prekurzorok, érett granulociták, B és T limfociták, megakarociták/vérlemezkék, és monociták/makrofágok jelenlétét mutatta ki. Változó volt a mátrixban elhelyezkedő érett prekurzorok száma, ami a támasztó mátrix váz-sejtjeinek random populációjából következett.
Mivel a hematopoiezis függ a növekedés aktivitásától, és a váz-sejtek által termelt faktoroktól, a három-dimenziós tenyészet konfluens, monolayer váz-sejteket tartalmazó edényekben nőtt. Konfluens váz-sejtek jelenlétében mind a hematopoiezis, mind a váz-sejtek növekedése gátolt volt;. azaz úgy tűnt, hogy a váz-sejtek konfluens rétege (monolayer) leállítja a három-dimenziós tenyésztési rendszert. Amikor a három-dimenziós tenyészetet másik edénybe helyeztük, a hematopoiezis újból megfígyelhetővé vált. Az eredmények szerint a váz-sejtek termékei nem csak a hematopoietikus sejtekre hatnak, hanem a váz elemekre is.
A következő alfejezetekben részletesen ismertetjük az eljárásokat, eredményeket, és az adatokat.
11.1. A csontvelő minta előállítása
11.1.1. A humán csontvelő
Megfelelően informált, hematológiailag normális felnőtt önként jelentkezők hátsó csípőtaréjának a különböző helyeiről csontvelő mintát szívtunk fel. A mintát heparinezett csövekbe gyűjtöttük, majd 8 ml, 10 % FBS-t, és 5-10 % HS-t tartalmazó, hidrocortisonnal, fungizonnal, és sztreptomicinnel kiegészített RPMI 1640 tápközegben felszuszpendáltuk. A sejt-alvadékot disszociáltuk, majd a magvas sejteket 5x10 aliquot reszre osztottuk.
• · • · · ·
11.1.2. A nem-humán főemlősökből származó csontvelő
Egészséges cynomolgus makákó majmokból származó combcsontokat vásároltunk a Charles River Primate Center-tői (Porter, Washington, NY). A combcsont epifizeális végét steril körülmények között elválasztottuk a nyéltől. A vörös velőt eltávolitottuk, tápközegben felszuszpendáltuk, és a magvas sejteket 5x10^ aliquot részre osztottuk.
11.1.3. Patkányból származó csontvelő
Felnőtt, hím Long-Evans patkányokat éterrel érzéstelenítettünk, és combcsontjuk eltávolítása után hasüregi aortájukból heparinezett fecskendővel vért vettünk. A combcsontot elhasítottuk, és a csontvelőt 10 % FBS-t, és 10 % HS-t tartalmazó, hidrocortisonnal, fungizonnal, heparinnal, és antibiotikumokkal kiegészített 3 ml Fischerféle tápközeget (Gibco, NY) tartalmazó steril petri csészébe kapartuk (Naughton és társai, 1987, J. Med. 18:219-250).
11.2. három-dimenziós váz-mátrix előkészítése
A fenti LTBMC kialakításának segítségeként nylon szűrő falat alkalmaztunk (#3-210/36, Tetko Inc., NY). A fal 90 um átmérőjű rostszálakból állt, melyeket 210 um-es szűrőnyílásokkal rendelkező négyszögletes szövetmintákon gyűjtöttünk össze. A megtapadást, majd a váz-elemek növekedését invert fázisú kontraszt mikroszkóppal, és pásztázó elektronmikroszkóppal követtük.
11.2.1. A fal, és a három-dimenziós nem-humán főemlős
LTBMC előkészítése
A 8 mm x 45 mm-es darabokra vágott falat 30 percig 0,1
M-os ecetsavba áztattuk, majd a támasztó-sejtek megtapadásának fokozására egy órán keresztül 10 mM-os poliszilin szuszpenzióval kezeltük. Ezután a darabokat steril petri csészébe helyeztük, és vagy 5xl06 humán fetális csontvelővel, vagy ekvimoláris mennyiségű humán fetális fibroblaszttal inokuláltuk (#GM 1380, Coriell Institute, NY). A humán fetális fibroblaszt a 10 % FBS-t, és 5-10 % HS-t tartalamzó, hldrocortisonnal, fungizonnal, és sztreptomicinnel kiegészített RPMI 1540 táptalajon 35°C-on, 5 % CO2, és 90 % relatív nedvességtartalom mellett konfluens monolayerekben fejlődött. A sejteket kollagenázzal összegyűjtöttük (10 ug/ml, 15 percig), és a falra vittük.
1-2 órás inkubálás után a falat 5 % CO2 mellett Corning-féle 2 cm -es tenyészedénybe helyeztük, és további 5 ml közeget adtunk hozzá. A csontvelő váz-sejtekkel inokulált falat hasonló módon helyeztük át.
11.2.2. A fal előkészítése, és a nem-humán főemlősökből származó elsődleges LTBMC váz-sejtjeinek inokulálása
A majom-sejtekből két másolatot alkalmaztunk: humán· fetális fibroblasztokkal inokulált nylon hálót (amint fent £ ismertettük), és cynomolgus makákókból számrmazó, 5x10 combcsonti velő-sejttel inokulált nylon hálót. A tenyésztés paramétereit, és a fal előkezelése során alkalmazott eljárást a humán tenyészetnél leírtak alapján hajtottuk végre.
11.2.3. A fal előkészítése, és a patkányokból származó
LTBMC váz-sejtjeinek inokulálása
A 8 mm x 45 mm-es darabokra vágott falat 30 percig 0,1 M-os ecetsavba áztattuk, majd IV típusú szolubilizált kollagénnel (GIBCO Labs, NY) 1-2 óra alatt bevontuk. A falat 5-7xl06 combcsonti velő-sejttel inokuláltuk, majd 1-2 órás inkubálás után a falat 5 % CO2 mellett 25 cm -es tenyészedénybe helyeztük, és további 5 ml közeget adtunk hozzá.
11.3. A három-dimenziós váz-mátrix inokulálása hematopoietikus sejtekkel, és a tenyészet előkészítése
Amikor a váz-sejtek a háló nyílásainak megközelítően 50 %-át áthidalják (patkány sztrómánál 10-14 nap, humán fetális fibroblasztoknál 4-7 nap), a falat steril petri csészébe visszük, és 5χ10θ magvas csontvelő sejttel, vagy 2-5xl06 patkány combcsonti velő-sejttel inokuláljuk. 2 órás inkubálás után a falat 5 % CO2 jelenléte mellett Corningféle 25 cm -es tenyészedénybe helyezüük, és további 5 ml közeget adunk hozzá. A tenyészetet minden 5. napon az elhasznált közeg kicserélésével együtt tápláltuk. A tenyészedények falán ellenőriztük a monolayer sejtek megjelenését. Amint megfigyelhetővé váltak a monolayer sejtek, a három-dimenziós tenyészetet áthelyeztük egy másik edénybe.
11.4. A három-dimenziós csontvelő tenyészet kiértékelése
A három-dimenziós csontvelő tenyészet növekedése és a sejttartalom mérése a már ismertetett hisztológiás eljárással, differenciálszámítással, CFU-C, és BFU-E analízissel, és citofluorográfiás eljárással történt.
11.4.1. A hisztológiai kiértékelés
Az elektronmikroszkópos vizsgálathoz az első inokulálás utáni váz-sejteket, és a második inokulálás utáni hematopoietikus sejteket különböző idő-intervallumokban áldoztuk fel. A nylon hálót megközelítőleg négy egyforma darabra vágtuk, 3 % glutáraldehiet tartalmazó foszfátpufferben rögzítettük, mostuk, acetonnal dehidratáltuk, és Denton Critical Point Dryer-be (szárító) helyeztük. Egyes esetekben feltártuk a váz-sejteket, és így láthatóvá tettük az alul növekvő sejteket (Naughton és társai, 1987, J. Med. 18:219-250). A mintákat 60 % arannyal és 40 % palládiummal vontuk be, és Amray-féle pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) vizsgáltuk.
A humán és makákó sejtek növekedése a három-dimenziós LTBMC-ben hasonló volt a patkány csontvelő sejtekéhez. A váz-sejtek (mind a fetális velőből, mind a fetális humán fibroblasztból származó) lineárisan nőttek, és mielőtt elkezdtek volna áthatolni a háló nyílásain, beburkolták az egyes nylon rostokat (1. ábra). A második inokulum hematopoietikus (és váz) sejtjeivel oltottuk be a 3.6 cm -es háló nyílásainak legalább 70 %-ában jelenlevő, a váz-sejtek által kialakított természetes intersticiumokat tartalmazó hálót (2. ábra). Úgy tűnt, hogy a hematopoietikus sejtek nem közvetlenül a nylonhoz kapcsolódnak, hanem inkább ahhoz a területhez, ahol a támasztó-sejtek megtapadtak. A tenyészet kialakulása a hematopoietikus sejtekkell való második inokulálás után nyilvánvaló. A 210 nm-es szűrő elegendő tért biztosított az eritroid, mieloid, és egyéb tenyészetek expressziójához (2. ábra). Az LTBMC nylon falának külső felszínén hematopoiezis volt megfigyelhető, mely jóval erősebbnek tűnt a fejlődő támasztó-sejtek intersticiumaiban.
11.4.2. A három-dimenziós LTBMC elhasznált tápközegének teljes sejt száma, és citospin analízise
A teljes sejt szám, és a citospin preparátum meghatározás az elhasznált tápközegből történt, amikor a rendszer táplálása során, 5 naponként eltávolítottuk az elhasznált tápközeget. A citospínt Wright's-Giemsa festékkel megfestettük, majd véletlenszerű hozamokból differenciálszámítást végeztünk. A citospin lemezek táplálása után történt kiértékelése szerint a humán és majom tenyészetekben késői állapotú eritroid, mieloid, és limfoid prekurzorok jelenléte mutatható ki (II. táblázat). Ezek a vizsgált mintákban a tenyésztés teljes ideje alatt jelen voltak (patkányoknál 39 hét, főemlősöknél 12.5 hét), bár a sejtek %-os aránya változott. A humán tenyészetek nemadherens zónájába kibocsátott makrofágok/monociták/fibroblasztok idővel szaporodtak, mégpedig valószínűleg a mieloid sejtek kárára (II.
táblázat).
II. táblázat *
A nem-adherens zóna cellulárls tartalma humán
tenyészet kora differenciálszámítás (¾)
(hét) MY E L MAC/STR Egyéb
makákó
tenyészet kora differenciálszámítás (%)
(hét) MY E L MAC/STR Egyéb
* Az eredmények egyes tenyészet 3-5 napos tenyészeteket 2 3.6 cm -es nylon hálót mutatnak be. Minden tartalmazott.
My=mieloid, E=eritroid, L=limfoid, MAC/STR=makrofágok, monociták, és fibroblasztikus sejtek, Egyéb=megakarociták, definiálatlan anyagok. ND=nincs.
·*» ·
11.4.3. A három-dimenziós LTBMC adherens zónájának teljes sejt száma, és citospin analízise
Az adherens zóna teljes sejt számának meghatározása az
LTBMC különböző idő intervallumaiban történt, a fal 1:1 arányú kollagenáz és tripszin oldattal (lOug/ml) való kezelésével, majd enyhe ultraszonífíkálással. A humán és a cinomolgus makákó LTBMC adherens zónájának elemzése szerint a tenyésztés során a váz-sejtek százalékos aránya nőtt a hematopoietikus sejtekkel szemben (III. táblázat). Ugyanis a hematopoietikus tenyészet előrehaladása során a váz-elemek százalékos aránya lecsökkent. Ugyanakkor az LTBMC későbbi periódusában a váz-sejtek növekedése a hematopoiezis rovására történt.
III. táblázat
A nem-adherens zóna celluláris tartalma humán
tenyészet kora differenciálszámítás (%)
(hét) sztróma E MY Egyéb
makákó
tenyészet kora differenciálszámítás (%)
(hét) sztróma E MY Egyéb
* Az adherens zóna sejtjeit enzimes kezeléssel bontottuk le A váz fibroblasztokat makrofágokat, adipocita-szerű sejteket, és endotellát tartalmazott; My=mieloid, E=eritroid, Egyéb=limfoidok, tromboidok, definiálatlan anyagok. ND=nincs.
• ·
- 96 A sejtosztódás a tenyészetben néhány hét után steady state állapotot ért el; az LTBMC hetenként elvégzett vizsgálatai során azonos mennyiségű sejt volt mind az adherens, mind a nem-adherens zónában (3. ábra). A tenyésztés első 1-2 hetében valamennyire lecsökkent a nemadherens zóna sejtjeinek száma. Kísérleteink során számos sejt, amely a tenyésztés korai stádiumában jelent meg a közegben, lazán kapcsolódott a mátrixhoz. Ezek könnyen váltak le, és így mesterségesen megnövelték a nem-adherens zónában található sejtek számát. Hasonlóan, a viszonylag s & alacsony oltóhatás következtében kezdetben csak 5x10-10 sejt tapadt meg a hálón, még akkor is, ha az inokulum 5χ105-10θ sejtet tartalmazott. Ezek a problémák fordultak elő a sejtosztódás során a tenyésztés első hetében.
11.4.4. A három-dimenziós LTBMC adherens zónájának CFU-C és BFU-E tartalma
A LTBMC adherens zónájának CFU-C tartalmát Bradley és Metclaf módosított eljárásával vizsgáltuk (1966, Austr. J. Exptl. Bioi. Med. Sci. 44:287-300). Röviden összefoglalva az eljárást, 4xl04 sejet bevontunk, és 37°C-on, 7-7.5 % CO2 tartalom mellett inkubáltuk. A patkány CFU-C színképző aktivitásának stimulálására alkörmös mitogén patkány lépsejtekkel kondicionált közeget alkalmaztunk (CSA), és a tenyésztés 14. napján meghatároztuk a CFU-C számot. A humán
CFU-C meghatározása aliquot mennyisegű, 10 magvas sejtből, •« · «· * · β » · 9 · · · • · > · · « « «4* · * · · · · · «·
- 97 20 % FBS-el kiegészített Iscove's Modified Dulbecco's közegben történt, a sejteket 0.5 % agart tartalmazó 106 PBLs-el vontuk be (Griffln és társai, 1981, J. Clin. Invest. 68:932). A tenyészeteket 7-14 nappal a bevonás után jelöltük (37°C, 7 % CO2) * A humán BFU-E mérése az LTBMC különböző idő intervallumaiban történt, 0.8 % metil-cellulózt, 30 %FBS-t, 1 % szarvasmarha szérum albumint, 10-4 M merkapto-etanolt, 2.5-5 I.U./ml részlegesen megtisztított humán urea eritroproteint (Naughton és társai, 1985, J. Surg. Oncol. 30:184-196), és 4.5 % fitohemaglutinin-stimulált humán leukocitákkal kondicionált közeget (Cashman és társai, 1983, Blood 61:876-884) tartalmazó Iscove-féle közegben.
Összehasonlítva a kiindulási inokulummal, mind a patkány, mind a humán LTBMC-ből nagy mennyiségű CFU-C-t nyertünk vissza (4. ábra). Az előzetes megfigyelések szerint a BFU-E szintén megmaradt a humán LTBMC-ben (IV táblázat).
• « · ·
IV. táblázat
Az LTBMC különböző idő intervallumaiban az adherens zóna
BFU-E tartalma * tenyészet BFU-E szám kora (hét) nem tenyésztett csontvelő * tenyészet/10^ sejt; 3-4 lemez+-SEM
11.4.5. A három-dimenziós LTBMC adherens zónájának citofluorográfiás analízise
A humán és majom három-dimenziós LTBMC adherens zónájának citofluorográfiás analízise EPICS rendszerrel történt (Coulter Electronics, Hialeah, Fia.). A sejteket a hematopoietikus sejtek inokulálása után különböző idő intervallumokban kollagenáz és tripszin segítségével elválasztottuk a nylon falról, majd alaposan megmostuk. A sejteket 45-60 percig Ca++-t, és Mg++-t tartalmazó Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban inkubáltuk. Ezek az alábbi,
fluoreszcens izotioclanáthoz kapcsolt monoklonális antitestekkel reagáltak: Mo-1, T-3, B-l, Plt-1, és MY-9 (Coulter Immunology, Fia.). Fluoreszcens és fényszóródásos hisztogramok alapján kiválogattuk az ablakokat. A 0.255 ablakokat megfelelően szűrtük, és a celluláris profilt meghatároztuk.
A humán tenyészet adherens zónájának citofluorográfiás analízisét 2, 7, és 10.5 héttel azután végeztük, hogy a korai (MY-9), és a korai (Mo-1) mieloid sejtek, B (B-l) és T (T-3) limfociták, megakarociták/lemezkék (Plt-1), és makrofágok/monociták (Mo-1) jelenléte bizonyossá vált (V táblázat).
V. táblázat
Monoklonális antitestek nem-tenyésztett csontvelővel, és a három-dimenziós LTBMC sejtjeivel szemben mutatott átlagos, %-os reaktivitása3
MAb humán LTBMCb
2 hetes 7 hetes 10.5 hetes Nem-tenyésztett
makákó LTBMCc
MAb 7 hetes Nem-tenyésztett
•S « · · · · · • · · · · Λ • · · ♦ · ♦ ··· ·· ···· ·
- 100 a Az %-os reaktivitást a nem-specifikusan jelölt szarvasmarha-FITC kontrol levonásával határoztuk meg.
MAb=monoklonális antitest 13 Az eredmények a 4-5 hetes tenyészet adatait ismertetik (+-SE) .
Az idő-adatok a szövet-specifikus sejtek következő inokulálását jelölik.
c 2 humán, fetális fibroblasztra inokulált tenyészet átlaga.
A humán, és a majom LTBMC-t létrehozhattuk a fetális humán fibroblasztok rétegén, de ebben az esetben a mátrix nem segíti a patkány LTBMC növekedését. A fetális fibroblasztok elérték a konfluenciát, ami a csontvelő sejtek inokulálását előbb tette lehetővé, mint a velő-vázét. Amennyiben a makákó csontvelő a fetális fibroblasztok területén nőtt, az adherens zóna fenotipusos körvonala szerint több sejt reagál a Plt-1 antitesttel, mint a többi, általunk vizsgált tenyészet esetében, de az eltérő hematológiai eredet is igazolható (V. táblázat). Az azonban még nem ismeretes, hogy ez a megfigyelés milyen mértékben tükrözi az antitestek keresztreaktivitását, vagy a fetális sejtek által közvetített adherens zóna sejt populációjának a változását.
101 .t ···
1··· ·· ·
• ·· ··
11.4.6. A konfluens monolayer váz-sejtek hatása a három-dimenziós tenyészet növekedésére
Long-Evans patkányok, vagy cynomolgus makákók combcsontjából származó csontvelő sejteket Fenwal gyapjúval töltött oszlopra vittük fel, Boswell és társai leírása szerint (Boswell és társai, 1987, Exptl. Hematol. 15:46-53).
Q Az alábbiakban röviden ismertetjük az eljárást. 10-10 combcsonti csontvelő sejtet 4 ml tápközegbe helyeztünk, és olyan nylon gyapjú oszlopra vittük fel, melyet előzőleg a tápközegben 37°C-on 45 percig inkubáltunk. További 45 perces inkubálás után a nem-adherens sejteket lemostuk, míg az adherens sejteket erős mosással, és EDTA-Versene oldatos elúcióval távolítottuk el (1:5000 sejt sóoldatban; GIBCO,
Grand Island, NY). A 25 cm -es tenyészedényeket párhuzamosan, megközelítőleg 10 sejttel inokuláltuk, és az %-os, valamint 100 %-os konfluencla eléréséig nőni hagytuk. Az előre kialakított LTBMC nylon falat, melyet a második inokulálás időpontjával standardizáltunk, az edényekbe helyeztük. Az LTBMC nylon fal és a monolayer növekedését mikroszkóppal követtük. A nem-adherens zóna sejtszáma és a citospin meghatározása 5 naponként történt. Az enzimhez kötött adherens sejtek citospinjének differenciálszámítása a LTBMC nylon fal behelyezése után 5 nappal történt.
Amennyiben konfluens monolayer váz-sejteket tenyésztettünk a LTBMC nylon falon, mind a hematopoiezis, mind a szuszpendált tenyészet váz-sejtjeinek a növekedése • · · ·
102 gátolva volt (VI táblázat), összehasonlítva az adherens zónát nem tartalmazó edényekkel (p kisebb, mint 0.05), vagy a megközelítőleg 50 %-os konfluenciát mutató váz-sejtekkel (p kisebb, mint 0.05). Ráadásul a konfluens monolayer vázsejtekkel való együtt tenyésztés a nem adherens zóna hálóhoz kapcsolódott váz-sejtjeinek elválását, és kibocsátását eredményezte. A hematopoietikus tenyészetek összenőttek, és a növekedés megszűnt. Amennyiben az LTBMC-t másik edénybe helyeztük, 3-5 napon belül a hematopoiezis visszaállását figyelhettük meg.
VI. táblázat
A megközelítőleg 50 %-os konfluenciát mutató monolayer váz hatása a celluláris sejtosztódásra, patkányok szuszpendált nylon LTBMC-jén a monolayer hatása sejtek a sejtosztódásra3 expocíció idejeb konfluencia (nap) %-os
100 %-os váz-sejtekc hematopoietikus sejtekd
103 a Az eredmények az átlagos %-os differenciát (+/-) +- SEM mutatják, összehasonlítva az edény alján, az adherens sejtek hiányában növekvő LTBMC-vel.
A csontvelő tenyészet nylon falát a második inokulálás (hematopoietikus sejtekkel) után 2 nappal vizsgáltuk.
b Az LTBMC nylon hálójának az 50-100 % konfluenciát mutató adherens sejteket tartalmazó edénybe történő bevitele után eltelt idő.
c Beleértve a fibroblasztokat, makrofágokat, adipocita-szerű sejteket, és az endoteliát.
b Beleértve a különböző eredetű, késői fázisban levő prekurzorokat, és az egyéb anyagokat.
12. példa: A bőr három-dimenziós tenyésztési rendszere
A következő alfejezetek a bőr találmány szerinti in vitro tenyésztési rendszerét mutatják be. Röviden, a fibroblasztok tenyészetét előzőleg sterilezett nylon hálón hoztuk létre. Az inkubálás 6-9 napján belül az adherens fibroblasztok elkezdtek átnőni a háló nyílásain, és lerakódni a háló párhuzamos rostjaira. A monoklonális antitesteket alkalmazó indirekt fluoreszcenciás eljárás túlnyomó többségében I típusú kollagént mutatott, és kis
104 mennyiségű III típusút. 7 nap múlva humán melanociták és keratinociták együttes tenyészetét helyeztük a fibroblaszt hálószövetre. Az adherens réteg szubkonfluens fibroblasztjai által termelt trofikus faktorok jelenléte miatt sem TPA-t, sem kolera toxint nem adtunk a rendszerhez. Az elektronmikroszkópos vizsgálatok a bőr-sejteket és a sejtsejt kapcsolatokat morfológiailag szabályosnak mutatták.
12.1. A három-dimenziós váz előkészítése
A bőr fibroblasztok szeparálása a dermális szövetek felaprításával, 2 órás tripszinezésével, majd a sejteknek a szuszpenziótól fizikai úton való elválasztásával történt. A fibroblasztok a konfluencia eléréséig 25 cm -es Falcon-féle tenyészedényben növekedtek, táplálásuk 10 %-os fetális szarvasmarha szérummal (FBS), fungizonnal, gentamicinnel, és penicillinnel/sztreptomicinnel kiegészített RPMI 1640 (Sigma, MO) tápközeggel történt. A fibroblasztokat enyhe tripszinezéssel összegyűjtöttük, majd a sejteket nylon szűrő-hálóra helyeztük, mely a 90 um átmérővel rendelkező, négyzet alakú szövetet alkotó rostokból állt, 210 um-es nyílásokkal (Tetko, Inc. NY). A háló előkezelése enyhe tejsavas mosással, valamint políszilin és FBS jelenlétében való inkubálással történt. Három óra múlva a fibroblasztok megtapadását észleltük, majd a kezdeti inokulálás után 5-7 nappal a fibroblasztok elkezdtek átnyúlni a háló nyílásain. A fibroblasztok metabolikus aktivitással rendelkeztek,
105 extracelluláris mátrixot szekretáltak, és gyorsan kialakították az aktív fibroblasztokat és kollagént tartalmazó dermális ekvivalenst. Az 1. ábra a fibroblasztok kapcsolódását, és háló nyílásain való áthatolását mutatja be.
12.2. A melanociták és keratinociták inokulálása
A melanocitákat Eisinger és Marko eljárása szerint izoláltuk (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2018-2022). Röviden, a bőr mintákat tripszinben egy órán keresztül inkubáltuk, ezalatt a dermális és az epidermális réteg elvált egymástól. Az epidermális sejteket tápközegben szuszpendáltuk, és 25 cm -es Falcon-féle tenyészedénybe hegyeztük. A melanocitákat kedvezőbb kapcsolódási tulajdonságaik alapján választottuk el a keratinocitáktól. Az izolált melanocitákat fibroblaszttal bevont nylon hálóra helyeztük, és a keratinociták hozzáadása előtt 3 napig nőni hagytuk. A melanociták szabályosan növekedtek a rendszerben, dendritet képeztek, pigmentációjuk megmaradt, valamint megőrizték azt a tulajdonságukat, mely szerint pigmentet szállítanak a keratinocitákhoz. A 6. ábra a melanociták megjelenését mutatja a három-dimenziós tenyésztési rendszerben, 3 nap után. 3-4 nap múlva izolált keratinocitákat helyeztünk a melanocitákra. A szövet, melyet RPMI 1640, 10 % FBS, és a megfelelő antibiotikumok jelenlétében tartottunk fenn, gyorsan növekedett. Amíg a • · • ·
- 106 dermális elemek természetes növekedési faktorokat szekretáltak, nem adtunk exogén faktorokat (például kolera toxint, stb., amint ezt Sengel, 1983, in Biochemistry and Physiology of Skin, Vol.l, ppl02-131, Oxford Univ. Press, NY; valamint Eisinger és társai, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1937-1941 leírták) a rendszerhez.
12.3. A bőr tenyészet hisztológiai elemzése
A bőr tenyészet hisztológiai kiértékelése fénymikroszkóppal történt, az alábbi eljárás szerint: a szöveteket 2.5 %-os puffereit glutáraldehidben rögzítettük, etanollal dehidratáltuk, majd a paraffinba ágyazás előtt xilénnel tisztítottuk. A metszeteket 6-8 um vastagságúakra vágtuk, hematoxilin-eozinnal megfestettük, és megvizsgáltuk morfológiai jellemzőik változását.
A bőr-modellek keresztmetszetének fotomikrográfiáját a
7., és 8. ábrán mutatjuk be. Mind a szabályos sejt orientáció, mind a szabályos morfológia szemmel látható. Az epidermális és a dermális alkotók teljesen körülveszik a háló rostjait, és szembeszökő a tiszta dermális-epidermális kapcsolódás (7. ábra). A keratinociták szabályos morfológiát mutatnak, pigment granulumokat tartalmaznak, látható a sejtek érése, és látható a korneális réteg kialakulása (8. ábra).
107
12.4. A három-dimenziós bőrtenyészet in vivő transzplantációja
Patkányokon végzett transzplantációs kísérleteink szerint a három-dimenziós rendszer lehetővé teszi a dermális és epidermális rétegek kiürülés nélküli, gyors átültetését.
Transzplantációs kísérleteink során 24 db patkányt vizsgáltunk. A hálót 6 mm-es kerek darabokra vágtuk, aotoklávoztuk, tej savval kezeltük, IV típusú kollagénnel inkubáltuk, és fetális szarvasmarha szérummal inokuláltuk, majd ezután, másodszorra vagy inokuláltuk keratinocitákkal, vagy nem. A hálót dermális és/vagy epidermális sejtalkotókkal borítottuk be, majd a seb területére varrtuk, és 12-14 óránként az alábbiak szerint vizsgáltuk: a patkányokat éterrel enyhén érzéstelenítettük, hátukat megborotváltuk, és betadin oldattal lemostuk. A rendelkezésünkre álló Baker-féle lyukasztó biopsziás tűvel 4 darab 6 mm-es lyukat fúrtunk rajtuk, és az implantált hálót szubkutikuláris varrással rögzítettük. A patkányokat közvetlenül a sebészeti beavatkozás után, majd a továbbiakban 24 óránként megvizsgáltuk.
Az implantált területen bőrvörösséget, duzzadást, és izzadást nem tapasztaltunk. A transzplantáció után 7, 14, és 21 nappal eltávolítottuk a hálót. A transzplantáció eredményét a 9. és a 10. ábrán mutatjuk be. Minden bőrsejtet 7 nappal a transzplantáció után mutatunk be (9. ábra). A 10. ábrán a nylon háló (m) körül természetes • «
- 108 konfigurációban elrendeződve a keratinocitákat (k), a fibroblasztokat (f), a kollagént (c), az adipocitákat (a), és a sima izom sejteket (s) mutatjuk be. A limfociták ésegyéb immun komponensek hiánya a sejtek és a háló erőteljes összekapcsolódásának területén arra utal, hogy in vivő nincs kiürülés.
Párhuzamos kísérleteket végeztünk, melyek során a dermális és az epidermális komponenseket 10x10 mm-es bőr biopsziákra implantáltunk, melyeket 14 napig tartottunk fenn a tenyészetben, majd hisztológiásan vizsgáltunk. Ezeknél az in vitro transzplantátumoknál hasonló sejt migrációt, megtapadást, és differenciálódást tapasztaltunk. Az eddigi átültetéses kísérletek tapasztalatai azt a hipotézist bizonyítják, mely szerint három-dimenziós mátrix rendszerünk valódi fiziológiás rendszer, melyben minden sejt-alkotó aktiválva van, és természetes növekedési faktorok keletkeznek.
Bár a találmányban részletes leírásokat, és referenciákat közlünk annak alkalmazhatóságáról, az egyes felhasználási területek eltérhetnek a találmány eddig bemutatott, és a későbbiekben igényelt szempontjaitól.
13. példa: A máj három-dimenziós tenyésztési rendszere
13.1. Anyagok és módszerek
V * • ·
- 109 -
13.1.1. Érzéstelenítés
Egy megközelítőleg 300 g tömegű Long-Evans patkányt intraperitoneálisan 3 ml nátrium-penta-barbitállal injekcióztunk.
13.1.2. Az operáció
A megfelelő érzéstelenítés bizonyítása céljából éles csipesszel megcsíptük a patkányokat. A processus xiphoideus és az inguinalis terület középvonalát bevágtuk, majd további vágásokat végeztünk, melyek a hasüregbe való bejutást tették lehetővé. A belső szerveket, és a többi szervet az állat jobb oldalára toltuk, és a májkapueret szabaddá tettük. A hepatikus májkapueret szétvágtuk, és 4.0 varratot rögzítettünk köré, disztálisan attól a helytől, ahol a katétert elhelyeztük. A második varratot proximálisan helyeztük el a hepatikus májkapuér katétertől. 21-es méretű tűvel kis vágást ejtettünk a hepatikus májkapuéren. Perisztaltikus pumpával 500 ml HEPES puffért (4.1 g NaCl, 0.25 g KC1, 3 ml 1 M-os NaOH, és 10 ml 0.24 %-os [tömeg/térfogat] HEPES alapoldat) kezdtünk infúziósán adagolni; közvetlenül ezután az alsó gyűjtőeret elvágtuk, így a puffer eltávozhatott. Az infúzió befejezése után a pumpát elzártuk, a májat azonnal Bückner-tölcsérbe helyeztük, és kollagenáz oldatot (0.4 g NaCl, 0.05 g KCP, 10 « *
- 110 ml HEPES oldat [lásd fent], 0.07 g CaCl2x2H2O, 6.6 ml 1 M-os NaOH, 50 mg kollagenáz 100 cm3-ben, pH=7.6, 37°C) áramoltattunk át rajta. Az eljárást 15 percig folytattuk. A Bückner-tölcsér tartalmát leszűrtük, a májat eltávolítottuk, és 1.5 % BSA-t tartalmazó kollagenáz oldatba helyeztük.
13.1.3. A sejt-oldat készítése
A fenti májlebenyt szeparáltuk, és külső parenchímáját elrendeztük. A belső parenchimát összevágtuk, és fiziológiás 2-4- 2 +
Ca -t, és Mg -t tartalmazó Hank-féle kiegyenlített sóoldatba helyeztük (HBSS). A nagy máj szöveteket eltávolítottuk, a sejt szuszpenziót Percoll gradiensben (5 ml DMEM és 0.5 IU/ml Inzulin, 0.007 mg/ml glukagon és 20 % fetális szarvasmarha szérum) az alábbiak szerint centrifugáltuk le: 50 ml-es kónikus centrifuga csövekbe helyeztük, és 5 ml Percoll munkaoldatba (70 % Percoll alapoldat és 30 % PBS; a Percoll alapoldat 9 rész Percollt, és 1 rész lOx koncentrált Dulbecco-féle közeg) rétegeztük, a HBSS tetejére, majd 800 g fordulatszám mellett 10 percig centrifugáltuk. A máj parenchima sejtjeit összegyűjtöttük a gradiens tetejéről, és a szubkonfluens vázú három-dimenziós tenyészetre helyeztük.
111
13.1.4. A három-dimenziós váz-mátrix előkészítése
A nylon szűrő fal (#3-210/36, Tetko, Inc., NY) 8x45 mm-es darabjait 30 percre ecetsavba áztattuk, és 1 órán keresztül 10 mM-os poliszilin szuszpenzióval kezeltük. A hálót DMEM táptalajt tartalmazó steril petri csészébe helyeztük, és ΙχΙΟθ patkány májból származó fibroblaszttal inokuláltuk. 1-2 órás, 5 % CO tartalom mellett végzett inkubálás után a hálót Corníng-féle 25 cm -es tenyészedénybe helyeztük, további 5 ml közeget adtunk hozzá, és hagytuk, hogy elérje a konfluens állapotot, miközben 3 naponként tápláltuk.
13.1.5. A máj három-dimenziós szövettenyészetének fenntartása
Miután a máj parenchima sejtjeivel inokuláltuk a három-dimenziós váz-mátrixot, a tenyészetet 5 % CO , és növelt páratartalom mellett, 37°C-on DMEM tápközegbe helyeztük, és 3 naponként friss tápközeggel tápláltuk.
13.2. Eredmények, és diszkusszió
Az ilyen módon tenyésztett felnőtt máj-sejtek aktív mitózist mutattak, és fehérjéket szekretáltak a három hetes »··'** .* • · · * · · · • · · · · · • 4 · ·· · * * » · ·*
- 112 periódus alatt. A hepatociták a sejtlánc felé orientálódtak (11. ábra); összehasonlítottuk a hepatoblasztokat, vagy a regeneráló máj-sejteket a három-dimenziós tenyésztés első 10-12 napja során (12. ábra). Amikor a tenyészet erősen konfluenssé vált, a parenchima sejtek az érett felnőtt hepatocitákhoz kezdtek hasonlítani, míg epe-vezeték sejtek, Kupfter-sejtek, valamint egyéb máj váz-sejtek is jelen voltak. A sejtek az tenyésztés első 10-12 napja során körülbelül 24 óránként osztódtak, majd a három hét további részében 72 óránként osztódtak. A három hetes tenyésztés során folytatódott az albumin szekréció, és a hepatociták visszanyerték enzim aktivitásukat, miáltal lehetővé vált számukra termékeik in vitro metabolizálása. Miután a tenyészetek elérték a teljes konfluenciát, azokat további 12 hétig mint csíraképes szubsztrátokat tartottuk fenn.
14. példa: A nyálkahártya epitelium három-dimenziós szövettenyésztési rendszere
14.1. Anyagok és módszerek
14.1.1. A nyálkahártya epitelium sejtek előkészítése
Az orális nyálkahártya szövetet fogszabályozás során nyertük a sebészeti mintából. A szöveteket friss MEM-et
113 tartalmazó antibiotikumokkal mostuk (2 ml antibiotikus, antimikózisos oldat, Gibco, Cat. #600-5240 AG; és 0.01 ml gentamicin oldat, Gibco, Cat. #600-5710 per 100 cc MÉM), .kis darabokra vágtuk, 0.02 %-os EDTA-val (w/v), és 0.25 %-os + 2 + tripszinnel (PBS-ben, Ca és Mg nélkül) mostuk; néhány perc múlva a szövetdarabokat 0.25 %-os friss tripszinbe helyeztük (PBS-ben, Ca2+ és Mg2+ nélkül), és éjszakára 4°Cra tettük. Ezután ismét friss tripszin oldatba helyeztük a szöveteket, és a mintát óvatosan kevertük, míg különálló sejteket tartalmazó szuszpenziót nem kaptunk. Ezután a különálló sejteket tartalmzó szuszpenziót hígított, 10 % hő-inaktivált fetális szarvasmarha szérumot tartalmazó MÉM tápközegbe helyeztük, és 1400xg fordulatszámm mellett 7 percig centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, és a nyálkahártya epitelium sejteket tartalmazó pelleteket az oltó közegbe helyeztük. Ezután a sejteket átoltottuk a három-dimenziós váz-mátrixra (lásd fent).
14.1.2. A három-dimenziós váz-mátrix előkészítése
A nyálkahártya epitelium sejtek tenyésztésére alkalmazott három-dimenziós váz-mátrixot orális fibroblasztokból és 8x45 mm-es nylon szűrő-háló darabokból (#3-210/36, Tetko Inc., NY) hoztuk létre, úgy, ahogy ezt a
13.1.4. fejezetben, a máj három-dimenziós tenyészete esetében már ismertettük.
114 <· ·· • •η» « *· • ♦· · • « ·· ··· 4····· • · • ·· • · · » ·«
14.1.3. A nyálkahártya epitelium három-dimenziós szövettenyészetének fenntartása
A nyálkahártya epitelium sejtjeinek a három-dimenziós váz-mátrixra történő inokulálása után a tenyészeteket 5 % CO2, és növelt páratartalom mellett, 37°C-on DMEM tápközegbe helyeztük, és 3 naponként friss tápközeggel tápláltuk.
14.2. Eredmények, és diszkusszió
A 13. ábra a fenti módon kapott nyálkahártya epitelium három-dimenziós szövettenyészet keresztmetszetének fotomikrográfiája. A szövettenyészet az orális nyálkahártya rétegződött pikkelyes epiteliumán in vivő replikálódott; meg kell jegyeznünk, hogy amikor a sejtek megközelítik a tenyészet felszínét, a mag lapossá válik, és az in vivő állapotnak megfelelően a felülettel párhuzamosan orientálódnak.
15. példa: A hasnyálmirigy három-dimenziós szövettenyésztő rendszere
15.1. Anyagok és módszerek
- 115 -
15.1.1. A hasnyálmirigy acinusos sejtjeinek előkészítése
A hasnyálmirigy acinusos sejtjeihez Ruoff és társai (1979, Cell Tissue Rés. 204:243-252), és Hay (1979, Methodological Surveys in Biochemistry, Vol. 8, Cell Populations, London, Ellis Hornwood, Ltd. pp. 143-160) eljárásának módosításával jutottunk hozzá. A szöveteket felnőtt Long-Evans patkányokból gyűjtöttük, összevágtuk, és Ca és Mg mentes HBSS pufferrel mostuk. Az összevágott szöveteket 0.25 % tripszint és kollagenázt tartalmazó oldatban inkubáltuk. A disszociált sejteket 20 um-es nylon hálón leszűrtük, HBSS-ben felszuszpendáltuk, és 300xg fordulatszám mellett 15 percig centrifugáltuk. A kapott pelleteket felszuszpendáltuk, kis mennyiségű DMEM közegben összegyűjtöttük, és a három-dimenziós vázra inokuláltuk (lásd fent).
15.1.2. A három-dimenziós váz-mátrix előkészítése
A hasnyálmirigy szövetek tenyésztésére alkalmazott három-dimenziós váz-mátrixot felnőtt patkány hasnyálmirigy fibroblasztokból és 8x45 mm-es nylon szűrő-háló darabokból (#3-210/36, Tetko Inc., NY) hoztuk létre, úgy, ahogy ezt a
13.1.4. fejezetben, a máj három-dimenziós tenyészete esetében már ismertettük.
116
15.1.3. A hasnyálmirigy szövetek három-dimenziós szövettenyészetének fenntartása
A hasnyálmirigy acinusos sejtjeinek a három-dimenziós váz-mátrixra történő inokulálása után a tenyészeteket 5 % CO^, és növelt páratartalom mellett, 37°C-on DMEM tápközegbe helyeztük, és 3 naponként friss tápközeggel tápláltuk.
15.2. Eredmények, és diszkusszió
A 14. ábra a fenti módon kapott három-dimenziós hasnyálmirigy szövettenyészet keresztmetszetének fotomikrográfiája. Az acinusos sejtek szövettenyészetét a zimogén cseppecskék zárványai alapján azonosítottuk (nyíl), összehasonlítva a sokkal homogénebb megjelenésű vázsejtekkel (csillag). A sziget sejtek a háló-nyílások egyes centrumaiban koncentrálódtak, 1-2x10 inzulin szekretáló sejtet tartalmazó szerkezetet kialakítva.
117
16. példa: Az agy-vér gát három-dimenziós modell rendszere
16.1. Anyagok és módszerek
16.1.1. A hajszálerek endoteliális sejtjeinek előkészítése
A hajszálerek endoteliális sejtjeit Larson és társai eljárása szerint (1987, Microvasc. Rés. 34:184) az agyból izoláltuk, és T-75 szövettenyésztő edényben tenyésztettük. A sejteket Dulbecco-féle módosított közeg és Hams-F-12 elegyében tartottuk fenn (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Hams-F-12). A tápközeg 20 % hő-inaktivált fetális borjú szérummal, glutaminnal, és antibiotikumokkal volt kiegészítve. A sejteket lxlO^/edény koncentrációban átoltottuk, így pár hét alatt elérték a konfluens állapotot. A sejteket hetenként egyszer passzáltuk, és, ráadásul, hetenként egyszer tápláltuk a fent már ismertetett, FCS-t, glutamint, és antibiotikumokat tartalmazó DMEM/Hams-F-12 tápközeggel. A sejtek passzálása során az edényt kétszer 5 ml PBS-el (a2+, és Mg2+ nélkül) kiöblítettük, majd 3 ml 0.05 %-os tripszinnel, és 0.53 mM-os EDTA-val tripszineztük. A sejteket pelletizáltuk, felszuszpendáltuk, tripán kék kizárással megvizsgáltuk életképességüket, majd átoltottuk a fent ismertetett, kiegészített DMEM/Hams-F-12 tápközegbe. Az
118 endoteliális sejtek pozitív azonosítását a VIII faktor antigénjének mérésével végeztük (Grulnick és társai, 1977, Ann. Int. Med. 86:598-616), míg a hajszálerek endoteliumával specifikus, szorosan kapcsolódó komplex azonosítását ezüst festéssel végeztük.
16.1.2. A háló előkészítése, és az átoltás
A nylon szűrő hálót (#3-210/36, Tetko, Inc., NY) a fenti, a máj, hasnyálmirigy, csontvelő, stb. szövettenyésztő rendszereknél ismertetett eljárásokkal alakítottuk ki. A hálót harminc percre ecetsav oldatba áztattuk (1 ml jégecet 99 ml desztillált vízben), majd bőséges mennyiségű desztillált leöblítettük, és autoklávoztuk. A hálót 8x8 mmes darabonként 6-6 ml fetális szarvasmarha szérummal vontuk be, és egy éjszakán keresztül inkubáltuk. Ezután három réteget egymásra helyeztünk, 3x10 hajszálér endoteliális sejtet (a fenti eljárással tenyésztettük) ráoltottunk, és nedves légkörben, 37°C-on 5 % CC^ jelenlétében három órát inkubáltuk. Az inokulált hálót a teljes konfluencia eléréséig (megközelítőleg két hétig) naponta 3-4 alkalommal 10 ml DMEM/Hams-F-12 közeggel tápláltuk.
16.1.3. A neuron és az asztrocita sejt-populációk előkészítése • ·
- 119 A neuronokat és az asztrocitákat fetális patkány cerebellumból izoláltuk. 5 patkányból kivágtuk a cerebellumot, és PBS pufferbe helyeztük. A PBS eltávolítása után mindegyikhez 1-1 ml tripszin oldatot adtunk (10 mg tripszin, 1 ml PBS 0.01 g MgSO4-7H2O-el, és 6 ul 1 N NaOH). 3 perc múlva a szöveteket 1 ml PBS puffer és 2 ml alapoldat (mely 7.5 mg DNS-ázt és 15 ml Earles BME-t tartalmazott) elegyével leöblítettük. A különálló sejteket 18-25-ös méretű fecskendők segítségével összegyűjtöttük, mégpedig úgy, hogy fokozatosan, egyre kisebb fecskendővel szívtuk fel a szuszpenziót, addig, amíg zavarosnak találtuk. Az így kapott egyedülálló sejeket tartalmazó szuszpenziót 800xg fordulatszám mellett 5 percig centrifugáltuk, a sejt pelleteket a közegben felszuszpendáltuk, és 33 um-es szűrőn átnyomtuk. Ezután 60 %/35 % Percoll lépcsőzetes gradienssel rétegeztük, és 800xg fordulatszám mellett 10 percig centrifugáltuk. A 0 %/35 %-os határfelületen elsősorban glia-sejteket és asztrocitákat találtunk; a 35 %/60 %-os határfelületen elsősorban neuronokat találtunk. Mindkét populációt összegyűjtöttük, külön-külön 5-5 ml PBS-el hígítottuk, mostuk, és 2500xg fordulatszám mellett 5 percig centrifugáltuk. Ezután a megfelelő közegben felszuszpendáltuk a sejteket (10 % hő-inaktivált ló szérumot tartalmazó BME). Minden egyes sejt-típust, külön-külön, poli-D-lizinnel bevont tenyészedénybe helyeztünk. Amikor a sejteket behelyeztük a 100 ug poli-D-lizinnel előzőleg bevont tenyészedényekbe, először 20-45 percig inkubáltuk azokat, majd PBS-el óvatosan leöblítettük; a glia-sejtek és
120 az asztrociták a tenyészedény falán szelektíven megtapadtak, míg a neuronok klmosódtak a rendszerből. A mosó puffért 500 ug poli-D-lizinnel bevont tenyészedénybe helyeztük, és ekkor a neuronok az edény falához tapadtak.
16.1.4. Az endoteliális sejtek három-dimenziós tenyészetének asztrocitákkal történő beoltása
A konfluens endoteliális sejtekkel borított hálóra (lásd fent) 5x10 asztrocitát oltottunk, úgy, hogy a közeget eltávolítottuk a hálóról, a hálót asztrocitákkal inokuláltuk, majd nedves légkörben, 37°C-on 5 % CO2 jelenlétében egy órát inkubáltuk. A rendszert 2-3 naponként interferonnal, transzferrinnel, és szeleniummal kiegészített DMEM-kl2 közeggel tápláltuk.
16.1.5. A neuronok átoltása a három-dimenziós endoteliális sejt-asztroclta szövettenyészetekre
Körülbelül 5 nap után neuronokat oltunk az endoteliális sejt-asztrocita szövettenyészetekre. Az axon kinövéseket (melyek a tenyészeten egy hét után figyelhetők meg) tartalmazó neuron sejttenyészeteket összegyűjtöttük, és megközelítőleg 5x10 sejtet a három-dimenziós endoteliális sejt/asztrocita tenyészet hálójára oltottunk. A neuronsejteket minimális mennyiségű tápközegbe oltottuk, nedves
121 légkörben, 37°C-on 5 % C02 jelenlétében három órát inkubáltuk, miután a hálót a szokásos DMEM/F12 közeggel tápláltuk, újra inkubáltuk, majd 2-3 naponként ismét tápláltuk.
16.2. Eredmények és diszkusszió
A hajszálerek endoteliális sejtjeit fetális szarvasmarha szérummal bevont nylon hálóra helyeztük, ekkor szabályos monolayer tenyészetben konfluens növekedés folyt, majd a hálót átoltottuk, és a teljes konfluencia eléréséig növekedni hagytuk.
A neuronokat és az asztrocitákat fetális patkány cerebellumból izoláltuk, és eltérő megtapadási képességük alapján szeparáltuk. Az asztrociták az endoteliális sejtek konfluens, három-dimenziós váz-mátrixán növekedtek, majd a három-dimenziós szövettenyészethez neuron-sejteket adtunk.
Az endoteliális sejtek/asztrociták/neuronok így kapott három-dimenziós szövettenyészetét addig tartottuk fel, amíg, beborítva az endoteliális sejtek rétegét, elérte a szemikonfluencia második fázisát. Ez a több rétegű, háromdimenziós szövettenyésztö rendszer - amint a 15. ábrán látható, egy rétegben konfluens hajszálér endoteliális sejteket tartalmaz, és egy másik rétegben asztrocitákat és neuronokat tartalmaz - újrateremti az agy-vér gát in vivő megfigyelhető szerkezetét, amelyen a vérben levő anyagoknak az agy idegszövete eléréséhez át kell hatolniuk a
c. ·
- 122 hajszálerek endoteliumán. Az agy-vér gát modell rendszerét az áthatolásnak, vagy ennek hiányának tanulmányozására, iletve vegyszerek vagy vírusok agyba történő bejutásának . tanulmányozására alkalmazhatjuk; előnyös meghatározni például azt, hogy melyik antibiotikum, vagy antivirális anyag tud átjutni az agy-vér gáton, és válik ezáltal alkalmassá a központi idegrendszer kezelésére a fertőzések során. Továbbá, a fenti modellt a különböző neurotoxinok hatásmechanizmusának és hatékonyságának tanulmányozása során szubsztrátként alkalmazhatjuk.
17. példa: Az adenokarcinóma három-dimenziós szövettenyésztésí rendszere
17.1. Anyagok és módszerek
17.1.1. Az adenokarcinóma váz-, és parenchimasejtjeinek előkészítése
Az adenokarcinóma sejteket HBSS-ben levő tumor sejtek összevágásával választottuk el a váz-sejteketől, 0.27 %-os tripszlnben 37°C-on 24 órát inkubáltuk, majd a felszuszpendált sejteket 37°C-on, műanyag petrl csészékben, DMEM közegben további 12 órát inkubáltuk. A váz-sejtek szelektíven tapadtak a műanyag edény falához.
• ·· *« ·♦«· · * *·«.·* · ·· • · · * * ·· • · « · · · ·*» ♦ · ··a· · · ·
- 123 -
17.1.2. A három-dimenziós váz-mátrix előkészítése
Az adenokarcinóma szövetek tenyésztésére alkalmazott három-dimenziós váz-mátrixot tumorból származó váz-sejtekből (lásd fent, 17.1.1. fejezet), és 8x45 mm-es nylon szűrő fal darabokból (#3-210/36, Tetko, Inc., NY) hoztuk létre, amint azt a máj három-dimenziós tenyésztési rendszerénél, a 13.1.4. fejezetben már ismertettük.
17.1.3. A három-dimenziós adenokarcinóma szövettenyészet fenntartása
A három-dimenziós tumor váz-mátrix adenokarcinóma sejtekkel történő inokulálása után a tenyészetet magas glükóz tartalmú, 15 % FBC-t, és 0.03 % glutamint tartalmazó DMEM tápközegben tartottuk fenn, nedves légkörben, 37°C-on 5 % CC>2 jelenlétében, és 3 naponként friss közeggel tápláltuk.
17.2. Eredmények és diszkusszió
A 16. ábra a három-dimenziós adenokarcinóma szövettenyészet fotomikrográfiája. Az adenokarcinóma sejtek jellegzetesen felhalmozódtak, és a három-dimenziós tumorszerű szerkezethez orientálódtak. A sejtek visszanyerték az ·«
- 124 epiteliális sejtekhez való hasonlóságukat.
18. Példa: A három-dimenziós szövettenyésztő rendszer citotoxicitási vizsgálatok céljára történő alkalmazása
18.1. Anyagok és módszerek
18.1.1. A három-dimenziós csontvelő tenyészet előkészítése
A három-dimenziós csontvelő tenyészetet a 11. fejezetben leírtak alapján készítettük elő.
18.1.2. A három-dimenziós csontvelő tenyészet kezelése citotoxikus anyagokkal
A csontvelő jellegzetes, három-dimenziós tenyészetét a citotoxicitási vizsgálatok céljából 96 lyukú tenyésztő tálcára helyeztük.
A tenyészeteket 24 órán keresztül 10-szeres higítási sorozatban, 0.1-10 um-os adriamicinnel kezeltük. A kontrolt 10-szeres higítású szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) kezeltük.
Hasonlóképpen, egy másik 96 lyukú tenyésztő tálcára
- 125 helyezett három-dimenziós csontvelő tenyészetet 24 órán keresztül 10-szeres higítási sorozatban, 1-75 um-os cisplatinummal kezeltünk. A kontrolt hasonló higitású szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) kezeltük.
Minden esetben humán fibroblasztok általános eljárással létrehozott monolayer tenyészetével hasonlítottuk össze a váz-sejtek önálló, vagy hematopoietikus sejtekkel együtt létrehozott három-dimenziós tenyészeteit.
18.1.3. A citotoxicitási vizsgálatok
Az anyagot eltávolítottuk a sejtekről, és a lyukakba 0.2 ml semleges vörös festő-anyag oldatot (lásd 18.1.4. fejezet) tettünk. A tenyészeteket 37°C-on három órán keresztül inkubáltuk. A három-dimenziós tenyésztő tálcán az 1A lyukba helyeztük kontrollt, ami csak hálót tartalmazott.
Az inkubálás után a festéket/közeget eltávolítottuk, és az egyes lyukakat a felhalmozódott semleges vörös festék eltávolítása, és a sejtek szubsztráthoz tapadásának fokozása céljából gyorsan formális kálcium oldattal (lásd 18.1.4. fejezet) mostuk.
0.2 ml ecetsav/etanol elegyet (lásd 18.1.4. fejezet) adtunk a lyukakhoz, a tenyészeteket 15 percig szobahőmérsékleten tartottuk (a festék eltávolítása céljából), majd néhány percre rázó tálcára helyeztük.
A tenyésztő tálcákat 540 nm-es szűrövei ellátott
Dinatech microplate reader-be helyeztük, melyhez automata
126 spektrofotométer, és kijelző tartozott. Kontrollként ecetsav/etanol elegyet alkalmaztunk (vak).
18.1.4. A citotoxicitási vizsgálatok során alkalmazott oldatok
A semleges vörös festő-anyag oldatot az alábbi módon állítottuk elő. 0.4 %-os vizes semleges vörös alapoldatot készítettünk, és a fény hatása ellen fóliával védtük meg. A festékből frissen 1:80 higítású oldatot készítettünk. Közvetlenül a felhasználás előtt a festő-anyagot 1500xg fordulatszám mellett 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszót használtuk a semleges vörös festési vizsgálatokban.
A formális kálcium oldatot az alábbi módon állítottuk elő. 5 g CaCl2-t (vízmentes) 497.5 ml steril desztillált vízbe vittünk. Ezután 2.5 ml 40 %-os formaldehidet adtunk hozzá, és így 1 % CaCl2-t, és 0.5 % formalínt tartalmazó formális kálcium oldatot kaptunk.
Az ecetsavas etanol oldatot az alábbi módon állítottuk elő: 1.09 ml jégecetet adtunk 99 ml 50 %-os etanolhoz.
Az adriamicint és a cis-platinumot a Sígmától szereztük be (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
127
18.2. Eredmények és diszkusszió
A 17. és 18. ábra a három-dimenziós csontvelő tenyészetek adriamicinnel és a cis-platinummal, mint teszt-anyagokkal végzett citotoxicitási vizsgálatai során kapott eredményeket mutatja be. Meg kell jegyeznünk, hogy a három-dimenziós tenyészet a teszt-anyagokkal szemben minden esetben dózis függő választ adott. A csontvelő háromdimenziós tenyészetére jellemző Τϋ5θ érték mind adriamicin, mind cis-platinum esetében szignifikánsan különbözött a csontvelő monolayer tenyészetére jellemző Τϋ5θ értéktől. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a monolayer tenyészetek nem alkalmasak a citotoxicitási vizsgálatok pontos kivitelezésére; valószínűleg a rendkívül természetellenes növekedési környezet okozza azt, hogy a monolayer tenyészetek sokkal érzékenyebbek a toxikus anyagokkal szemben. Döntő a teszt anyag aktuális toxicitásának meghatározása; így például a kemoterápia során a malignáns sejtek kiválasztása szempontjából fontos lehet a legnagyobb tolerálható dózis adagolása. A legnagyobb tolerálható dózis alábecslése esetén a tumor ellen alkalmazott anyag hatékonysága erősen lecsökkenhet. A csontvelő, és más szövetek, vagy tumor szövetek háromdimenziós tenyészetének találmány szerinti alkalmazása lehetővé teszi a kemoterápiás kezelés során alkalmazott anyagok optimális dózisának in vitro meghatározását.
128
19. példa: A bőr három-dimenziós tenyésztési rendszerének implantációra történő alkalmazása, neodermisz ben törpe sertésben történő felhasználásával
A bőr transzplantációt négy darab Charles-River törpe sertésen hajtottuk végre. A kísérleteket úgy terveztük, hogy összehasonlíthassuk a neodermisz hatásait, a sejt-lizátummal átitatott háló-szubsztrát, és az önmagában vizsgált háló összehúzódását, gyógyulását, és a megbontott seb, valamint a teljes vastagságú seb epitelium képzését. Az állatok háti felszínén levő több rétegű, párhuzamos sebeket hasonlítottuk össze, a gyógyulás pontos kiértékelésekor. A tanulmányok során a sertések dermális fibroblasztjaival oltottuk a biodegradábilis hálót, és azt, mint dermális replikát transzplantáltuk. Másik hálókat, beleértve a humán és sertés dermális fibroblasztokat, sertés keratinocitákkal oltottunk. Az átültetett területek hisztológiai metszeteinek, és a megjelenés erőteljes megváltozásának követésével (váladék, bőrpirosság, stb.) a három-dimenziós bőr-rendszer hatékonyságának transzplantációs körülményeit tudtuk tanulmányozni.
19.1. Anyagok és módszerek
19.1.1. A sebterület előkészítése
129
Az^epidermális átültetés kiértékelése szempontjából a sebterület előkészítése során lényeges, hogy haj tüszők, izzadság, és faggyú mirigyek ne maradjanak annak területén. Ennek megvalósítása céljából Browne dermatommal 0.190-0.229 cm-t kijelöltünk, és a sertések felső laterális részéről teljes vastagságában eltávolítottuk a bőrt. A seb területét 5x5 cm-esre alakítottuk. Amikor az alacsonyabban levő laterális területet készítettük elő, 0.152-0.190 cm-t jelöltünk ki. A területre, pontosan az izomburok fölé csak hálót, vagy tenyésztett sejteket tartalmazó hálót helyeztünk. A steril dermatommal előkészített terület lecsökkentette a fertőzés veszélyét, és lehetővé tette az átültetett terület teljes hemosztázisát.
Amennyiben a bőr eltávolítása után kisebb vérzés fordult elő, száraz géz kötést helyeztünk a sebre, és 10-15 percig nyomást alkalmaztunk. Eközben a steril seb területeire PBS-el előnedvesített steril gézt borítottunk addig, amíg az átültetendő részt az izomburokra helyeztük. A rögzítés és összenyomás céljából megközelítőleg 3.75 cm-es selyem varratot (3-0) helyeztünk az átültetés területének így létrehozott oldalaira. A tenyésztett, átültetendő szövetet (háló sejtekkel) steril csipesszel eltávolítottuk a szövettenyésztő edényből, és általánosan alkalmazott szubkutikuláris öltésekkel a helyére varrtuk. Az átültetett területre vazelines gézt borítottunk, és a rögzítés és összenyomás céljából selyem érkötő fonallal lekötöttük. A sertéseket Elatoplasttal bekötöztük. A sebeken négy • · ·
- 130 naponként kötést cseréltünk.
19.1.2. Érzéstelenítés
A sertéseket ketamin-hidrokloriddal érzéstelenítettük (Ketalar), és haloton, kéjgáz, valamint oxigén elegyével tartottuk érzéstelenítve. A sertések laterális oldalán a bőrt a négy teljes vastagságú átültetési terület előkészítése előtt (lásd fent) povidon-jodiddal (Betadine), és 7 %-os alkohollal mostuk.
19.1.3. Az állatok fenntartása
4-5 nap után eltávolítottuk a sebről a kötést, és az átültetett területen megvizsgáltuk a fertőzés és/vagy kiürülés jeleit, majd a sebre ismét vazelines gézt borítottunk, és a sertéseket Elatoplasttal bekötöztük. A sebeket négy naponként vizsgáltuk meg, a kezelt területről származó biopsziás minták segítségével. Az állatok Ketalarral való érzéstelenítése lehetővé tette a 4 mm-es biopsziák steril Baker-féle lyukasztóval, és steril eljárással történő eltávolítását. Az átültetett szövetek kapcsolódásának, és a seb gyógyulásának megállapítása céljából hisztológiai értékelésre küldtünk mintákat.
131
19.1.4. Az átültetett epiteliális szövet
A kiválasztott állatok 10 nappal a dermális ekvivalens implantációja után félakkora autológ keratinocitákat kaptak. A keratinocita rétegeket izolált sejtekből hoztuk létre, melyeket a dermális ekvivalens implantációja előtt 10-14 napig tenyésztettük, mégpedig úgy, hogy túl-konfluenssé váljanak. A négy helyi varrathoz tapadt rétegekeket vazelines gézzel beborítottuk, és bekötöztük, így segítve a sejtek kapcsolódását.
19.2. Eredmények
A dermális ekvivalens minden kezelt állatnál jól rögzült, az összehúzódást és a dehidratálódást megakadályozta, és olyan élő szövetterületet adott, ahol az epiteliális sejtek vándorolni tudtak, illetve autológ transzplantátumra helyezhetőkké váltak. A 19. ábra a teljes vastagságú sebre implantált humán dermális ekvivalens (neodermisz) gyógyulását mutatja 10 nappal az implantáció után. A területen minimális összehúzódás tapasztalható, míg a kiürülés jeleit nem észleltük, ez azt mutatja, hogy az allogén fibroblasztok használhatók a transzplantátumok céljára. A területek hisztológiai kiértékelése a fibroblasztok aktív növekedését, valamint a kollagénre történő lerakódását mutatta a fehérvérsejtek minimális beszűrődése mellett (20. ábra). A hasított vastagságú sebek
132 kontrakciója, epitelizációja, pigmentációja, és szőrzet növesztő képessége jelentősen különbözött a dermális ekvivalensétől (balra), és az önmagában álló biodegradábilis hálóétól (jobbra) (21. ábra). A fibroblaszt sejtlizátumba beáztatott hálón fokozódott a háló rostjai körül az epiteliális növekedés (22. ábra), de a gyógyulás általában lassabb volt, mint az élő neodermisszel kezelt területeken.
A neodermisz fokozta az epiteliális sejteknek a hálóra történő migrációját. A 23. ábrán a keratinocitáknak a dermális ekvivalenshez vándorlása, és megtapadása során kialakult létrehozott mély ékek láthatók. A sebek gyógyulása során ez a minta jellemző az epitelium képződésére.
Az autológ keratinociták jól kapcsolódnak a neodermiszhez, és egyenletesen gyógyulnak. A 24. ábra a gyógyuló sebet hasonlítja össze, a seb egyik fele autológ epiteliális szövetet, a másikra csak neodermiszt kapott. Az átültetett epiteliális szövet egyenletesen gyógyult, megakadályozva a későbbi összehúzódást, és erőteljesen kapcsolódott az alul elhelyezkedő dermális ekvivalenshez. A 25. ábra az epidermális sejtek egyenletes növekedését, és a neodermiszhez való kapcsolódását mutatja be. Úgy tűnt, hogy a neodermisz aktívan növekvő fibroblasztokból és természetesen szekretált fibroblasztokból áll. A keresztmetszeten láthatjuk, hogy jelen vannak a háló rostjai is .
• · • · · · · ♦ •«· ·· ···· · * *
- 133 19.3. Diszkusszió
Az eddigi transzplantációs kísérletek szerint a neodermisz (a biodegradábilis hálón levő fibroblasztok és a természetesen szekretált kollagén) tökéletes eljárást nyújt a teljes vastagságú bőr kezelésére. A xenogeneikus transzplantáció sikeres alkalmazása szerint az allogenikus neodermiszt felhasználhatjuk az égési sérülések, és a fekélyes betegségek kezelésére. Az átültetett szövetek permanensek voltak, anélkül, hogy négy hónappal később felszíni vagy mélyebb forradások jeleit mutatták volna.

Claims (132)

1. Eljárás szubkonfluens váz-sejteket tartalmazó három-dimenziós váz-mátrix előállítására olyan anyagokból vagy idomokból kialakított három-dimenziós mátrixon, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
2. Az 1. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak.
3. A 2. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endotéliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mast-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
4. Az 1. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábilis anyagból áll.
5. A 4. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poliglikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
135 • *·»» · · <* · « · ·· ♦ · ♦ · · · ··
6. Az 1. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nembiodegradábilis anyagból áll.
7. A 6. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a nem-biodegradábilis anyag poliamid, poliészter, polisztirén, polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
8. A 4., 5., 6., vagy 7. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
9. Eljárás parenchima sejteket tartalmazó háromdimenziós sejttenyészet előállítására szubkonfluens vázsejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
10. A 9. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak.
11. A 10. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endoteliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mast-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
136
12. A 9. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábilis anyagból áll.
13. A 12. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poliglikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
14. A 9. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nembiodegradábilis anyagból áll.
15. A 14. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a nem-biodegradábilis anyag poliamid, poliészter, polisztirén, polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
16. A 12., 13., 14., vagy 15. igénypont szerinti vázmátrix, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
17. Eljárás hematopoietikus sejteket tartalmazó háromdimenziós csontvelő sejttenyészet előállítására szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós vázmátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő • · »·
- 137 kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
18. Eljárás melanocitákat és keratinocitákat tartalmazó három-dimenziós bőr-tenyészet előállítására szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
19. Eljárás melanocitákat és keratinocitákat tartalmazó három-dimenziós bőr-tenyészet előállítására konfluens vázsejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
20. Eljárás neuron sejteket és asztrocitákat tartalmazó három-dimenziós tenyésztő rendszer előállítására konfluens, hajszálerekből származó epiteliális sejtekből álló háromdimenziós váz-mátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy Idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a • ·· ···· ·* ··» ♦· * · ·
4 · « * » ··
4 » « · · · ♦ ·· · v « · · »« · ·*
- 138 sejtek egynél több rétegben nőjenek.
21. Eljárás a nyálkahártya epiteliális sejtjeit tartalmazó három-dimenziós tenyészet előállítására konfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
22. Eljárás tumor-sejteket tartalmazó három-dimenziós tumor-tenyészet előállítására szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
23. Eljárás hepatocitákat tartalmazó három-dimenziós máj-tenyészet előállítására szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
24. Eljárás endokrin acinusos sejteket tartalmazó
139 • -*· ·* ·>*·· ·· ·· i' * · ·· ·
9 · · · ♦e» • · · · · ♦ ♦ ··· 4» ···· **· három-dimenziós hasnyálmirigy tenyészet előállítására szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós vázmátrixon, melyet olyan anyagokból, vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
25. Eljárás sejtek in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a parenchima sejteket szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot ínkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
26. A 25. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak, b
27. A 26. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endoteliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mast-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
4 «· 4« «· «··· «· ··*··· · · « · · 4 · «· • · · « · · · ··· ·· ···· ♦ ··
140
28. A 25. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábllis anyagból áll.
29. A 28. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a biodegradábllis anyag pamutból, poliglikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
b
30. A 25. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nembiodegradábilis anyagból áll.
31. A 30. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a nem-biodegradábilis anyag poliamid, poliészter, polisztirén, polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
32. A 28., 29., 31., vagy 31. igénypont szerinti vázmátrix, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
33. Eljárás csontvelő-sejtek in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hematopoietikus sejteket szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé
141 teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, Illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
34. Eljárás bőr-sejtek in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a melanocitákat és keratinocitákat szubkonfluens vázsejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
35. Eljárás bőr-sejtek in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a melanocitákat és keratinocitákat konfluens vázsejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek • · ·
- 142 hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
36. Eljárás neuron-sejtek in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) az asztrocitákat konfluens endoteliális sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
37. Eljárás nyálkahártya epitelium in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a nyálkahártya epitelium sejteket szubkonfluens vázsejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és
143 (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
38. Eljárás tumor szövet sejtek in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a tumor-sejteket szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
39. Eljárás máj-sejtek in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hepatocitákat szubkonfluens váz-sejtekből álló háromdimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben
144 elszaporodnak.
40. Eljárás hasnyálmirigy sejtek in vivő tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hasnyálmirigy acinusos sejtjeit szubkonfluens vázsejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
41. Eljárás sejtek in vivő transzplantációjára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a transzplantálandó vagy implantálandó szövet-típusból származó parenchima sejteket úgy tenyésztjük, hogy in vitro osztódjanak; és (b) az osztódott parenchima sejteket in vivő implantáljuk.
42. A 41. igénypont szerinti transzplantációs és implantációs eljárás, azzal jellemezve, hogy:
(a) a parenchima sejteket szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan
145 módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
43. A 42. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak.
44. A 43. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endotéliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mást-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
45. A 42. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábilis anyagból áll.
46. A 45. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poliglikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
47. A 42. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nembiodegradábilis anyagból áll.
48. A 47. igénypont szerinti váz-mátrix, azzal
146 jellemezve, hogy a nem-biodegradábilis anyag poliamid, poliészter, polisztirén, polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
49. A 45., 46., 47., vagy 48. igénypont szerinti vázmátrix, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
50. Eljárás csontvelő sejtek in vivő transzplantációjára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hematopoietikus sejteket in vitro tenyésztjük, úgy, hogy a hematopoietikus sejtek osztódjanak; és (b) az osztódott hematopoietikus sejteket in vivő implantáljuk.
51. Az 50. igénypont szerinti eljárás csontvelő sejtek transzplantácijára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hematopoietikus sejteket szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a • · • ♦ · · · · · • · · · · · ··«·····*···
- 147 tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
52. Eljárás bőr-sejtek in vivő transzplantációjára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a melanocitákat és keratinocitákat in vitro tenyésztjük, úgy, hogy a melanociták és keratinociták osztódjanak; és (b) az osztódott melanocitákat és keratinocitákat in vivő implantáljuk.
53. Az 52. igénypont szerinti eljárás bőr-sejtek transzplantációjára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a melanocitákat és keratinocitákat szubkonfluens vázsejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
53. Az 52. igénypont szerinti eljárás bőr-sejtek transzplantációjára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a melanocitákat és keratinocitákat konfluens váz148 sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
55. Eljárás máj-sejtek in vivő transzplantációjára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hepatocitákat in vitro tenyésztjük, úgy, hogy a hepatociták sejtek osztódjanak; és (b) az osztódott hepatocitákat in vivő implantáljuk.
56. Az 55. igénypont szerinti eljárás máj-sejtek transzplantácijára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hepatocitákat szubkonfluens váz-sejtekből álló háromdimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben
- · »
- 149 elszaporodnak.
57. Eljárás hasnyálmirigy sejtek in vivő transzplantációjára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hasnyálmirigy sejteket in vitro tenyésztjük, úgy, hogy a hasnyálmirigy sejtek osztódjanak; és (b) az osztódott hasnyálmirigy sejteket in vivő implantáljuk.
58. Az 57. igénypont szerinti eljárás hasnyálmirigy sejtek transzplantációjára és implantációjára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a hasnyálmirigy sejteket szubkonfluens váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
59. Eljárás váz-sejtek in vivő implantációjára, azzal jellemezve, hogy szubkonfluens váz-sejtekből álló háromdimenziós váz-mátrixot implantáljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé
150 teszik a sejtek hozzájuk való kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek.
60. Az 59. igénypont szerinti implantációs eljárás, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak.
61. A 60. igénypont szerinti implantációs eljárás, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endoteliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mást-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
62. Az 59. igénypont szerinti implantációs eljárás, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábilis anyagból áll.
63. A 62. igénypont szerinti implantációs eljárás, azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poli-glikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
64. Az 59. igénypont szerinti implantációs eljárás, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nembiodegradábilis anyagból áll.
65. A 64. igénypont szerinti implantációs eljárás, azzal jellemezve, hogy a nem-biodegradábilis anyag poliamid,
151 poliészter, polisztirén, polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
66. A 62., 63., 64., vagy 65. igénypont szerinti vázmátrix, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
67. Eljárás citotoxicitási vizsgálatokra, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó anyag az alábbiakból áll:
(a) a vizsgálandó anyaggal kezeljük a három-dimenziós sejttenyészetet, amelyben a parenchima sejtekből álló három-dimenziós sejttenyészet aktívan növekvő váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixon növekszik, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) meghatározzuk a tenyészetben a károsodott, vagy elpusztult sejtek számát, azzal jellemezve, hogy a károsodott, vagy elpusztult sejtek száma összefügg a vizsgálandó anyag citotoxicitásával.
68. A 67. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak.
9 ·» *· ···< *♦ ·» · · ♦ * • · « 9 · ♦« • « « « · · ♦ ·> · « · · ··»· · ♦
- 152 -
69. A 60. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endoteliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mast-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
70. A 67. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábilis anyagból áll.
71. A 70. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poli-glikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
72. A 67. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nem-biodegradábilis anyagból áll.
73. A 72. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a nem-biodegradábilis anyag poliamid, poliészter, polisztirén, polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
74. A 70., 71., 72., vagy 73. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
153
75. A 67. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hematopoietikus sejtekből állnak.
76. A 67. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek melanocitákból és keratinocitákból állnak.
77. A 67. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hepatocitákból állnak.
78. A 67. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a hasnyálmirigy acinusos sejtjeiből állnak.
79. Eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy:
(a) a droggal kezeljük a három-dimenziós sejttenyészetet, amelyben a parenchima sejtekből álló három-dimenziós sejttenyészet szubkonfluens váz-sejtekből álló háromdimenziós váz-mátrixon növekszik, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek;
és
4» ·· • · ··
154 (b) meghatározzuk a tenyészetben a drognak a sejtekre gyakorolt hatását.
80. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak.
81. A 80. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endoteliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mast-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
82. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábilis anyagból áll.
83. A 82. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poli-glikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
84. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nem-biodegradábilis anyagból áll.
85. A 84. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a nem-biodegradábilis
155 anyag poliamid, poliészter, polisztlrén, polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
86. A 82., 83., 84., vagy 85. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
87. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hematopoietikus sejtekből állnak.
88. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek melanocitákból és keratinocitákból állnak.
89. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hepatocitákból állnak.
90. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a hasnyálmirigy acinusos sejtjeiből állnak.
91. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a nyálkahártya epiteliális sejtjeiből állnak.
156
92. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a nyálkahártya vírussal fertőzött epiteliálls sejtjeiből állnak.
93. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a nyálkahártya herpeszvírussal fertőzött epiteliális sejtjeiből állnak.
94. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a nyálkahártya papillomavírussal fertőzött epiteliális sejtjeiből állnak.
95. A 79. igénypont szerinti eljárás drogok hatásának vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek tumor sejtekből állnak.
96. Eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a beteg sejtjeiből mintát veszünk;
(b) a minta sejteket aktívan növekvő váz-sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek;
157 és (c) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak;
(d) meghatározzuk a malignáns sejtek jelenlétét az osztódó sejtek tenyészetében.
97. A 96. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak.
98. A 97. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endoteliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mast-sejteket, és adipocítákat tartalmaznak.
99. A 96. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábilis anyagból áll.
100. A 99. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poliglikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
101. A 96. igénypont szerinti eljárás malignáns
158 betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nembiodegradábilis anyagból áll.
102. A 101. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a nem-biodegradábilis anyag poliamid, poliészter, polisztirén, polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
103. A 99., 100., 101., vagy 102. igénypont szerinti citotoxicitási vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
104. A 96. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hematopoietikus sejtekből állnak.
105. A 96. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek melanocitákból és keratinocitákból állnak.
106. A 96. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal . jellemezve, hogy a parenchima sejtek hepatocitákból állnak.
» ·
- 159 -
107. A 82. igénypont szerinti eljárás malignáns betegségek diagnosztizálására vagy ellenőrzésére, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a hasnyálmirigy acinusos sejtjeiből állnak.
108. Eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy:
(a) a transzfektált parenchima sejteket három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyben (i) a transzfektált parenchima sejtek expressziós alkotó ellenőrzése alatt álló idegen gént tartalmaznak; és (ii) a három-dimenziós váz-mátrix aktívan növekvő vázsejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixon növekszik, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; és (b) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így a transzfektált sejtek a tenyészetben elszaporodnak.
109. A 108. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek fibroblasztokból állnak.
160
110. A 109. Igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a váz-sejtek még endotéliális sejteket, pericitákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mast-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
111. A 108. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a váz-mátrix biodegradábilis anyagból áll.
112. A 111. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poli-glikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
113. A 108. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nem-biodegradábilis anyagból áll.
114. A 113. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a nembiodegradábilis anyag poliamid, poliészter, polisztirén,
161 polipropilén, pollakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyülét.
115. A 111., 112., 113., vagy 114. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
116. A 108. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hematopoietikus sejtekből állnak.
117. A 108. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek melanocitákból és keratinocitákból állnak.
118. A 108. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hepatocitákból állnak.
119. A 109. igénypont szerinti eljárás genetic engineering (DNS-génsebészeti) technikával történő sejttenyésztésre, azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a hasnyálmirigy acinusos sejtjeiből állnak.
* «
- 162 -
120. Eljárás a paciensek betegségének, és állapotának elemzésére, azzal jellemezve, hogy:
(a) a paciensből sejt-mintát veszünk;
(b) a sejteket aktívan növekvő váz-sejtekből álló háromdimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek;
(c) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben, így az inokulált sejtek a tenyészetben elszaporodnak; és (d) analizáljuk a tenyészetben szaporodott sejteket, mint a betegség, vagy állapot markereit.
121. A 120. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a vázsejtek fibroblasztokból állnak.
122. A 121. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a vázsejtek még endoteliális sejteket, pericltákat, makrofágokat, monocitákat, leukocitákat, plazma sejteket, mást-sejteket, és adipocitákat tartalmaznak.
123. A 120. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a vázmátrix biodegradábilis anyagból áll.
• ·♦
- 163 -
124. A 123. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a biodegradábilis anyag pamutból, poli-glikol-savból, katgut varratból, cellulózból, zselatinból, vagy dextránból áll.
125. A 120. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a három-dimenziós mátrix nem-biodegradábilis anyagból áll.
126. A 125. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a nembiodegradábilis anyag poliamid, poliészter, polisztirén. polipropilén, poliakrilát, polivinil, polikarbonát, politetrafluor-etilén, vagy nitrocellulóz vegyület.
127. A 123., 124., 125., vagy 126. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy az anyagot kollagénnel vontuk be.
128. A 120. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hematopoietikus sejtekből állnak.
129. A 120. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek melanocitákból és keratinocitákból állnak.
164 • ·· ·· »··« ·' ·· ·· · · · · · · • · · r · » · • · ♦ » « « · *·· «* ««·· · ♦·
130. A 120. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek hepatocitákból állnak.
131. A 120. igénypont szerinti eljárás a paciensek betegségének, és állapotának azzal jellemezve, hogy a parenchima sejtek a hasnyálmirigy acinusos sejtjeiből állnak.
132. Eljárás az anyagoknak az agy-vér gáton való áthatoló képességének vizsgálatára, azzal jellemezve, hogy:
(a) három-dimenziós tenyésztési rendszer felszínén levő endoteliális sejteket a vizsgálandó anyagnak tesszük ki, az alábbi módon (i) az asztrocitákat konfluens endoteliális sejtekből álló három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; (il) az említett asztrocitákra neuron sejteket inokulálunk; és (iii) az inokulált háromdimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben; és (b) detektáljuk a vizsgálandó anyagnak a háromdimenziós váz-mátrixra inokulált asztrocitákra vagy neuron sejtekre gyakorolt hatását.
133. Eljárás a három-dimenziós szövettenyészetből kialakított agy-vér gát modell rendszerére, azzal
4· ·· ··«· *·· • · · · 4 · ν · · · ·· • · « · · · • ·* ···· * ··
165 jellemezve, hogy:
(a) az asztrocltákat konfluens endoteliális sejtekből állő három-dimenziós váz-mátrixra inokuláljuk, amelyet olyan anyagokból vagy idomokból alakítunk ki, amelyek lehetővé teszik a sejtek hozzájuk valő kapcsolódását, illetve olyan módosítást, hogy a sejtek hozzájuk kapcsolódjanak, és lehetővé teszik, hogy a sejtek egynél több rétegben nőjenek; továbbá (b) az említett asztrocitákra neuron sejteket inokulálunk;
és (ci) az inokulált három-dimenziós váz-mátrixot inkubáljuk a tápközegben.
HU895973A 1988-09-08 1989-09-07 Three dimensional cell and tissue culturing systems HUT56393A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/242,096 US4963489A (en) 1987-04-14 1988-09-08 Three-dimensional cell and tissue culture system
US07/402,104 US5032508A (en) 1988-09-08 1989-09-01 Three-dimensional cell and tissue culture system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU895973D0 HU895973D0 (en) 1991-07-29
HUT56393A true HUT56393A (en) 1991-08-28

Family

ID=26934819

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU895973A HUT56393A (en) 1988-09-08 1989-09-07 Three dimensional cell and tissue culturing systems
HU91750A HU910750D0 (en) 1988-09-08 1991-03-27 Maize seeder mountable onto motor-driven garden hoeing machine

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU91750A HU910750D0 (en) 1988-09-08 1991-03-27 Maize seeder mountable onto motor-driven garden hoeing machine

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5032508A (hu)
EP (1) EP0358506A3 (hu)
JP (3) JPH04501657A (hu)
BR (1) BR8907642A (hu)
CA (1) CA1335657C (hu)
DK (1) DK40591A (hu)
FI (1) FI911142A0 (hu)
HU (2) HUT56393A (hu)
NZ (1) NZ230572A (hu)
PT (1) PT91676A (hu)
WO (1) WO1990002796A1 (hu)

Families Citing this family (294)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5032508A (en) * 1988-09-08 1991-07-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US5902741A (en) * 1986-04-18 1999-05-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional cartilage cultures
US5266480A (en) * 1986-04-18 1993-11-30 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional skin culture system
US5863531A (en) * 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5567612A (en) * 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US6309635B1 (en) 1986-11-20 2001-10-30 Children's Medical Center Corp. Seeding parenchymal cells into compression resistant porous scaffold after vascularizing in vivo
US5851816A (en) * 1988-06-30 1998-12-22 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Cultured high-fidelity three-dimensional human urogenital tract carcinomas and process
US5496722A (en) * 1988-06-30 1996-03-05 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Method for producing non-neoplastic, three dimensional, mammalian tissue and cell aggregates under microgravity culture conditions and the products produced therefrom
US6117674A (en) * 1988-06-30 2000-09-12 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Pathogen propagation in cultured three-dimensional tissue mass
US5175092A (en) * 1989-05-04 1992-12-29 Millipore Corporation Vitro toxicology kit and method therefor
US5705732A (en) * 1989-06-12 1998-01-06 Oklahoma Medical Research Foundation Universal donor cells
US5635386A (en) * 1989-06-15 1997-06-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture
US5605822A (en) * 1989-06-15 1997-02-25 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for growing human hematopoietic cells
CA2062741A1 (en) * 1989-06-15 1990-12-16 Stephen G. Emerson Methods, compositions and devices for growing cells
US5437994A (en) * 1989-06-15 1995-08-01 Regents Of The University Of Michigan Method for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
US5763266A (en) * 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
IL95429A (en) * 1989-09-15 1997-09-30 Organogenesis Living tissue equivalents comprising hydrated collagen lattice and a collagen gel and their production
US5061620A (en) * 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5256418A (en) * 1990-04-06 1993-10-26 Organogenesis, Inc. Collagen constructs
US5242806A (en) * 1990-05-07 1993-09-07 Baxter Diagnostics Inc. Method for conducting the cytotoxicity assays on tumor cells
IT1248934B (it) * 1990-06-01 1995-02-11 Fidia Spa Membrane forate biocompatibili,processi per la loro preparazione,loro impiego come supporto per la crescita in vitro di cellule epiteliali, pelli artificiali cosi' ottenute e loro impiego nei trapianti di pelle
EP0470681A3 (en) * 1990-08-08 1992-04-22 W.R. Grace & Co.-Conn. Cell clusters or sheets comprising a plurality of cell species and preparations thereof
DE69133205T2 (de) * 1990-10-19 2003-12-11 New York University, New York Eine methode zur transplantation von zellen in das gehirn und ihre therapeutische verwendung
US5618531A (en) * 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
EP0499932A1 (en) * 1991-02-16 1992-08-26 W.R. Grace & Co.-Conn. Cancer cell cluster comprising cancer cells and normal cells and preparation thereof
US5192312A (en) * 1991-03-05 1993-03-09 Colorado State University Research Foundation Treated tissue for implantation and methods of treatment and use
US6967086B2 (en) * 1991-04-18 2005-11-22 Becton Dickinson And Company Method for determining the presence or absence of respiring cells on a three-dimensional scaffold
EP0513803A2 (en) * 1991-05-17 1992-11-19 Japan Vilene Company, Ltd. Carrier for immobilization of animal cells, process for manufacture thereof, and methods for cultivation
EP0597964A4 (en) * 1991-08-07 1994-11-30 Einstein Coll Med PROLIFERATION OF HEPATOCYTE PRECURSORS.
US6069005A (en) 1991-08-07 2000-05-30 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshwa University Hapatoblasts and method of isolating same
WO1993007913A1 (en) * 1991-10-24 1993-04-29 Children's Medical Center Corporation Neomorphogenesis of urological structures in vivo from cell culture
JP3190042B2 (ja) 1991-10-31 2001-07-16 マトリテク インコーポレイテッド 核マトリックス蛋白液アッセー
JPH07501224A (ja) * 1991-11-25 1995-02-09 コーネル リサーチ ファウンデイション インコーポレイテッド 自動化多区画細胞培養システム
AU3422893A (en) * 1992-01-02 1993-07-28 Regents Of The University Of Michigan, The Methods for regulatory lineages of human hematopoietic cells
US6013853A (en) * 1992-02-14 2000-01-11 The University Of Texas System Continuous release polymeric implant carrier
US5876452A (en) * 1992-02-14 1999-03-02 Board Of Regents, University Of Texas System Biodegradable implant
IT1255657B (it) * 1992-05-29 1995-11-09 Colture di tessuto di mucosa congiuntivale differenziata, procedimentoper la loro preparazione e supporti per il loro uso.
DE69329340T2 (de) * 1992-06-25 2001-02-01 Bernhard M. Babior Aufbewahren von stammzellen
AU4657993A (en) * 1992-06-29 1994-01-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Matrix for universal donor microvascular endothelial cells
US5800537A (en) * 1992-08-07 1998-09-01 Tissue Engineering, Inc. Method and construct for producing graft tissue from an extracellular matrix
WO1994003584A1 (en) * 1992-08-07 1994-02-17 Tissue Engineering, Inc. Production of graft tissue from extracellular matrix
US5478739A (en) * 1992-10-23 1995-12-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional stromal cell and tissue culture system
US5888720A (en) * 1992-10-27 1999-03-30 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs
AU5552794A (en) * 1992-11-25 1994-06-22 Merck & Co., Inc. Hepatic model
US5610007A (en) * 1993-01-21 1997-03-11 Universite Laval Chimeric sheets of epithelial cells
US5656492A (en) * 1993-02-12 1997-08-12 Brigham And Women's Hospital, Inc. Cell induction device
CA2119064A1 (en) * 1993-03-17 1994-09-18 Richard A. Berg Dermal-epidermal in vitro test system
GB9306449D0 (en) 1993-03-29 1993-05-19 Nat Heart Research Fund Tissue equivalents
US6008047A (en) * 1993-04-08 1999-12-28 Livercell L.L.C. Cell culturing method and medium
JP2813467B2 (ja) * 1993-04-08 1998-10-22 ヒューマン・セル・カルチャーズ・インコーポレーテッド 細胞培養法および培地
US5709854A (en) * 1993-04-30 1998-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo
US5858783A (en) * 1993-05-25 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Production of normal mammalian organ culture using a medium containing mem-alpha, leibovitz L-15, glucose galactose fructose
AU5116593A (en) * 1993-10-08 1995-05-04 Martin Rosdy In vitro human epidermal sun-tanning test
JPH07298876A (ja) * 1994-03-09 1995-11-14 Res Dev Corp Of Japan 通液性細胞培養担体と、この担体を用いる培養方法お よび培養装置
US5656450A (en) * 1994-05-27 1997-08-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Activation of latent transforming growth factor β by matrix vesicles
US20020055786A1 (en) * 1994-08-16 2002-05-09 Anthony Atala Reconstruction of urological structures with polymeric matrices
US5899909A (en) * 1994-08-30 1999-05-04 Medscand Medical Ab Surgical instrument for treating female urinary incontinence
SE506164C2 (sv) * 1995-10-09 1997-11-17 Medscand Medical Ab Instrumentarium för behandling av urininkontinens hos kvinnor
KR970705951A (ko) * 1994-09-12 1997-11-03 가일 케이. 노우톤 심장 판막 구조에서 3차원 사람 세포 배양물과 이의 용도(three-dimensional human cell cultures on cardiac valve franeworks and their uses)
US5562946A (en) * 1994-11-02 1996-10-08 Tissue Engineering, Inc. Apparatus and method for spinning and processing collagen fiber
US7001328B1 (en) 1994-11-15 2006-02-21 Kenton W. Gregory Method for using tropoelastin and for producing tropoelastin biomaterials
US20030152909A1 (en) * 1994-11-16 2003-08-14 Mitrani Eduardo N. In vitro micro-organs, and uses related thereto
US5891558A (en) * 1994-11-22 1999-04-06 Tissue Engineering, Inc. Biopolymer foams for use in tissue repair and reconstruction
US5709934A (en) * 1994-11-22 1998-01-20 Tissue Engineering, Inc. Bipolymer foams having extracellular matrix particulates
US5716404A (en) * 1994-12-16 1998-02-10 Massachusetts Institute Of Technology Breast tissue engineering
US6485723B1 (en) * 1995-02-10 2002-11-26 Purdue Research Foundation Enhanced submucosal tissue graft constructs
US7008634B2 (en) * 1995-03-03 2006-03-07 Massachusetts Institute Of Technology Cell growth substrates with tethered cell growth effector molecules
US6123727A (en) * 1995-05-01 2000-09-26 Massachusetts Institute Of Technology Tissue engineered tendons and ligaments
US5855610A (en) * 1995-05-19 1999-01-05 Children's Medical Center Corporation Engineering of strong, pliable tissues
US6284284B1 (en) 1995-06-06 2001-09-04 Advanced Tissue Sciences, Inc. Compositions and methods for production and use of an injectable naturally secreted extracellular matrix
US5830708A (en) * 1995-06-06 1998-11-03 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix
US6129761A (en) 1995-06-07 2000-10-10 Reprogenesis, Inc. Injectable hydrogel compositions
US5741685A (en) * 1995-06-07 1998-04-21 Children's Medical Center Corporation Parenchymal cells packaged in immunoprotective tissue for implantation
US5716413A (en) * 1995-10-11 1998-02-10 Osteobiologics, Inc. Moldable, hand-shapable biodegradable implant material
EP0801676A2 (de) * 1995-10-20 1997-10-22 Michael Sittinger Neue künstliche gewebe, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US6419920B1 (en) 1995-10-25 2002-07-16 Trans Karyotic Therapies, Inc. Hybrid matrix implants and explants
US5965125A (en) * 1995-10-25 1999-10-12 Transkaryotic Therapies, Inc. Hybrid matrix implants and explants
US5911942A (en) * 1995-11-02 1999-06-15 Tissue Engineering, Inc. Method for spinning and processing collagen fiber
US5800539A (en) * 1995-11-08 1998-09-01 Emory University Method of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation without graft failure or graft vs. host disease
US6482231B1 (en) * 1995-11-20 2002-11-19 Giovanni Abatangelo Biological material for the repair of connective tissue defects comprising mesenchymal stem cells and hyaluronic acid derivative
FR2743817B1 (fr) * 1996-01-23 1998-03-13 Oreal Equivalent de peau comprenant des cellules de langerhans
US5842477A (en) * 1996-02-21 1998-12-01 Advanced Tissue Sciences, Inc. Method for repairing cartilage
CN1061812C (zh) * 1996-04-01 2001-02-14 胡杰 制备皮肤移植体的方法
AU2808397A (en) * 1996-04-26 1997-11-19 Case Western Reserve University Skin regeneration using mesenchymal stem cells
EP0915967A1 (en) * 1996-05-28 1999-05-19 The Board Of Regents Of The University Of Michigan Engineering oral tissues
US6213127B1 (en) 1996-07-29 2001-04-10 Emory University Methods for treating cancer using allogeneic lymphocytes without graft vs host disease activity
US5925510A (en) * 1996-10-11 1999-07-20 Cornell Research Foundation, Inc. Medium for preserving tissue without tissue culturing occurring
US6033896A (en) * 1996-11-15 2000-03-07 The Ohio State University Process of separation of cells from liquid by adsorption onto fiber
FR2757635B1 (fr) * 1996-12-24 1999-02-05 Oreal Procede d'evaluation des dommages induits dans la peau par les uv-a
FR2759381B1 (fr) * 1997-02-11 1999-04-16 Oreal Procede d'evaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant et/ou allergene d'un produit
US6039686A (en) 1997-03-18 2000-03-21 Kovac; S. Robert System and a method for the long term cure of recurrent urinary female incontinence
CA2207882A1 (en) 1997-06-17 1998-12-17 Joel Claveau Assessment of human skin damage following exposure to harmful agents
AU9111698A (en) * 1997-09-04 1999-03-22 Pharmacia & Upjohn Company A method for the evaluation of antiviral drugs
US6440734B1 (en) 1998-09-25 2002-08-27 Cytomatrix, Llc Methods and devices for the long-term culture of hematopoietic progenitor cells
GB9720987D0 (en) * 1997-10-01 1997-12-03 Biocure Ltd A multicellular in vitro assay of angiogenesis
US6225118B1 (en) 1997-10-01 2001-05-01 Biocure Limited Multicellular in vitro assay of angiogenesis
EP1032435B1 (en) * 1997-10-31 2003-09-03 Children's Medical Center Corporation Bladder reconstruction
CA2307637C (en) * 1997-10-31 2008-10-07 Children's Medical Center Corporation Penile reconstruction
US7101545B1 (en) 1997-11-26 2006-09-05 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method for using human intervertebral disc cells
US6080579A (en) * 1997-11-26 2000-06-27 Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority Method for producing human intervertebral disc cells
DE19752900A1 (de) * 1997-11-28 1999-06-02 Biotechnolog Forschung Gmbh Knochenmatrix und/oder osteogene Zellen, deren Verwendung, therapeutische Zubereitung und Kit
US7687057B2 (en) * 1998-01-09 2010-03-30 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs, and uses related thereto
US6291240B1 (en) 1998-01-29 2001-09-18 Advanced Tissue Sciences, Inc. Cells or tissues with increased protein factors and methods of making and using same
US20020034819A1 (en) * 1998-02-23 2002-03-21 Alan K. Smith Human lineage committed cell composition with enhanced proliferative potential, biological effector function, or both; methods for obtaining same; and their uses
DE19811114C2 (de) * 1998-03-14 2003-08-21 Hellmut Augustin Verfahren zur definierten Herstellung multizellulärer sphäroidaler Aggregate lebender Blutgefäßwandzellen
US6143293A (en) * 1998-03-26 2000-11-07 Carnegie Mellon Assembled scaffolds for three dimensional cell culturing and tissue generation
US6382214B1 (en) * 1998-04-24 2002-05-07 American Medical Systems, Inc. Methods and apparatus for correction of urinary and gynecological pathologies including treatment of male incontinence and female cystocele
CN1115407C (zh) * 1998-11-05 2003-07-23 四川大学华西医院 复合场三维细胞培养装置
US6548299B1 (en) 1999-11-12 2003-04-15 Mark J. Pykett Lymphoid tissue-specific cell production from hematopoietic progenitor cells in three-dimensional devices
AU1720400A (en) * 1998-11-12 2000-05-29 Cell Science Therapeutics, Inc. Lymphoid tissue-specific cell production from hematopoietic progenitor cells in three-dimensional devices
AU769637B2 (en) * 1998-11-19 2004-01-29 Organogenesis Inc. Bioengineered tissue constructs and methods for producing and using them
RU2249039C2 (ru) * 1999-02-04 2005-03-27 Текнион Рисерч Энд Дивелопмент Фаундейшн Лтд. Способ размножения/поддержания недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников (варианты), способ приготовления кондиционированной среды стромальных клеток, способ трансплантации недифференцированных гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников (варианты)
US20030007954A1 (en) * 1999-04-12 2003-01-09 Gail K. Naughton Methods for using a three-dimensional stromal tissue to promote angiogenesis
US6372494B1 (en) 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
US20040167634A1 (en) * 1999-05-26 2004-08-26 Anthony Atala Prosthetic kidney and its use for treating kidney disease
US7226407B2 (en) 1999-06-09 2007-06-05 Ethicon, Inc. Surgical instrument and method for treating female urinary incontinence
US7121997B2 (en) * 1999-06-09 2006-10-17 Ethicon, Inc. Surgical instrument and method for treating female urinary incontinence
US6932759B2 (en) 1999-06-09 2005-08-23 Gene W. Kammerer Surgical instrument and method for treating female urinary incontinence
DK1581162T3 (da) * 1999-06-09 2011-08-01 Ethicon Inc Indretning til justering af polymerimplantater ved bløde overflader
JP2001037472A (ja) 1999-07-28 2001-02-13 Bio Quest:Kk 三次元細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法
WO2001014527A1 (en) * 1999-08-23 2001-03-01 Organogenesis Inc. Skin care compositions and treatments
JP2001120582A (ja) * 1999-10-22 2001-05-08 Gunze Ltd 人工心臓弁およびその作製方法
US7799325B2 (en) * 1999-11-05 2010-09-21 Kleinsek Donald A Removal of hypertrophic scars
US20080267923A2 (en) * 1999-11-05 2008-10-30 Donald Kleinsek Hair undifferentiated cells
US6428802B1 (en) 1999-12-29 2002-08-06 Children's Medical Center Corp. Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate
US6376244B1 (en) * 1999-12-29 2002-04-23 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for organ decellularization
US6479064B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-12 Children's Medical Center Corporation Culturing different cell populations on a decellularized natural biostructure for organ reconstruction
US6368859B1 (en) 1999-12-29 2002-04-09 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for producing a fascial sling
US6828111B2 (en) 2000-01-13 2004-12-07 Wayne State University Three-dimensional in vitro model of human preneoplastic breast disease
DE10002803A1 (de) * 2000-01-24 2001-08-02 Conbio Lizenzverwertungsgesell System zur internen qualitativen und quantitativen Validierung von Markerindices
US7131943B2 (en) * 2000-03-09 2006-11-07 Ethicon, Inc. Surgical instrument and method for treating organ prolapse conditions
JP4876275B2 (ja) * 2000-03-31 2012-02-15 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 生物の組織を薄切した切片からなる動物細胞の培養担体と、この担体を用いる動物細胞の培養方法および移植方法
GB2365443B (en) * 2000-04-04 2004-12-22 Denis Eon Solomon A surgical-medical dressing for the treatment of body burns and for wound healing
DE10019604C2 (de) * 2000-04-20 2002-06-27 Ethicon Gmbh Implantat
JP3421741B2 (ja) * 2000-05-18 2003-06-30 筑波大学長 人工骨髄、血球細胞の増殖方法
JP2004500855A (ja) * 2000-05-31 2004-01-15 フラウンホファー　ゲセルシャフトツール　フェールデルンク　ダー　アンゲヴァンテン　フォルシュンク　エー．ファオ． 感染モデル
JP4426064B2 (ja) * 2000-05-31 2010-03-03 独立行政法人科学技術振興機構 脊椎動物の膵臓のインビトロ形成方法
CN1130971C (zh) * 2000-07-13 2003-12-17 胡杰 制备用作细胞种植框架和植入体的生物细胞外基质的方法
CN1116794C (zh) * 2000-07-13 2003-08-06 胡杰 制备软骨移植体的方法
CN1115957C (zh) * 2000-07-13 2003-07-30 胡杰 制备血管移植体的方法
US7025063B2 (en) 2000-09-07 2006-04-11 Ams Research Corporation Coated sling material
US6641525B2 (en) * 2001-01-23 2003-11-04 Ams Research Corporation Sling assembly with secure and convenient attachment
US6802807B2 (en) 2001-01-23 2004-10-12 American Medical Systems, Inc. Surgical instrument and method
US20020161382A1 (en) * 2001-03-29 2002-10-31 Neisz Johann J. Implant inserted without bone anchors
US7229453B2 (en) * 2001-01-23 2007-06-12 Ams Research Corporation Pelvic floor implant system and method of assembly
US6612977B2 (en) 2001-01-23 2003-09-02 American Medical Systems Inc. Sling delivery system and method of use
US20020147382A1 (en) * 2001-01-23 2002-10-10 Neisz Johann J. Surgical articles and methods
AU2002305444A1 (en) * 2001-05-07 2002-11-18 New York University Microvascular free flaps for local or systemic delivery
US8740987B2 (en) * 2001-06-04 2014-06-03 Warsaw Orthopedic, Inc. Tissue-derived mesh for orthopedic regeneration
US6923939B1 (en) * 2001-07-05 2005-08-02 Uop Llc Heat activated membrane introduction apparatus and method for screening materials
CA2453538A1 (en) * 2001-07-12 2003-01-23 Kyowa Medex Co., Ltd. Method for determination of denatured lipoprotein, reagent for determination of denatured lipoprotein, method for detection of cardiovascular disease, and reagent for detection ofcardiovascular disease
US7407480B2 (en) * 2001-07-27 2008-08-05 Ams Research Corporation Method and apparatus for correction of urinary and gynecological pathologies, including treatment of incontinence cystocele
US6648921B2 (en) 2001-10-03 2003-11-18 Ams Research Corporation Implantable article
US7087065B2 (en) * 2001-10-04 2006-08-08 Ethicon, Inc. Mesh for pelvic floor repair
BR0214217A (pt) * 2001-11-16 2004-09-21 Childrens Medical Center Aumento de função de órgão
CA2466903A1 (en) * 2001-11-19 2003-05-30 Amniotec Inc. Ectocornea-like sheet and method of constructing the same
US20030109036A1 (en) * 2001-12-06 2003-06-12 The Regents Of The University Of California Method for differentiating islet precursor cells into beta cells
MXPA04008407A (es) 2002-03-01 2005-12-12 Ethicon Inc Metodo y aparato para tratar prolapsos de organo pelvico en pacientes femeninas.
WO2003092546A2 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Cook Urological Inc. Sling for supporting tissue
US6943021B2 (en) * 2002-06-07 2005-09-13 Mattek Corporation Three dimensional vaginal tissue model containing immune cells
CN1668734A (zh) * 2002-06-20 2005-09-14 比奥索斯控股有限公司 在生长因子和生物基质或载体结构存在下进行细胞增殖和分化的方法和装置
AU2003242967A1 (en) * 2002-07-12 2004-02-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method and device for inducing biological processes by micro-organs
IL151660A0 (en) * 2002-09-09 2003-04-10 Univ Ben Gurion Method for isolating and culturing unculturable microorganisms
DE10253066A1 (de) * 2002-11-07 2004-05-27 Co.Don Aktiengesellschaft Gewebeersatzstruktur, Verfahren zur Modifikation einer Gewebeläsion und Verwendung von vorgeformtem dreidimensionalem Gewebe als Lieferant von Botenstoffen und/oder Strukturbausteinen
FR2847268B1 (fr) * 2002-11-19 2006-09-29 Coletica Procede d'identification d'une modification eventuelle d'au moins un parametre biologique mettant en oeuvre des cellules vivantes soumises a un stress et des cellules vivantes non soumises a ce meme stress
US20060141617A1 (en) * 2002-11-19 2006-06-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Multilayered microcultures
US20040126405A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-01 Scimed Life Systems, Inc. Engineered scaffolds for promoting growth of cells
US7067123B2 (en) * 2003-04-29 2006-06-27 Musculoskeletal Transplant Foundation Glue for cartilage repair
US7901457B2 (en) 2003-05-16 2011-03-08 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage allograft plug
US7744869B2 (en) * 2003-08-20 2010-06-29 Ebi, Llc Methods of treatment using electromagnetic field stimulated mesenchymal stem cells
EP2338441B1 (en) 2003-12-11 2013-01-23 Isto Technologies Inc. Particulate cartilage system
US7771999B2 (en) 2004-04-28 2010-08-10 Vaxdesign Corp. Disease model incorporation into an artificial immune system (AIS)
US8298824B2 (en) 2004-04-28 2012-10-30 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corporation Methods of evaluating a test agent in a diseased cell model
US7709256B2 (en) 2004-04-28 2010-05-04 Vaxdesign Corp. Disease model incorporation into an artificial immune system (AIS)
US8030070B2 (en) 2004-04-28 2011-10-04 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. Artificial lymphoid tissue equivalent
US7785806B2 (en) 2004-04-28 2010-08-31 Vaxdesign Corporation Method for determining the immunogenicity of an antigen
US20060275270A1 (en) * 2004-04-28 2006-12-07 Warren William L In vitro mucosal tissue equivalent
US8071373B2 (en) 2004-04-28 2011-12-06 Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. Co-culture lymphoid tissue equivalent (LTE) for an artificial immune system (AIS)
US7855074B2 (en) 2004-04-28 2010-12-21 Vaxdesign Corp. Artificial immune system: methods for making and use
US7785883B2 (en) 2004-04-28 2010-08-31 Vax Design Corp. Automatable artificial immune system (AIS)
US8047982B2 (en) * 2004-05-07 2011-11-01 Ethicon, Inc. Mesh tape with wing-like extensions for treating female urinary incontinence
US20050288796A1 (en) * 2004-06-23 2005-12-29 Hani Awad Native soft tissue matrix for therapeutic applications
WO2006015031A2 (en) * 2004-07-28 2006-02-09 Ethicon, Inc. Minimally invasive medical implant and insertion device and method for using the same
EP1802742A2 (en) * 2004-08-30 2007-07-04 IKEN Tissue Therapeutics, Inc. Compositions and methods of promoting hair growth
US7527588B2 (en) * 2004-09-15 2009-05-05 Ethicon, Inc. System and method for surgical implant placement
US7837740B2 (en) * 2007-01-24 2010-11-23 Musculoskeletal Transplant Foundation Two piece cancellous construct for cartilage repair
US20060165667A1 (en) * 2004-12-03 2006-07-27 Case Western Reserve University Novel methods, compositions and devices for inducing neovascularization
US7481314B2 (en) * 2005-02-02 2009-01-27 Ethicon, Inc. Packaging assembly for surgical mesh implants
JP4262695B2 (ja) * 2005-04-25 2009-05-13 独立行政法人海洋研究開発機構 膜状バイオデバイス及びバイオリアクター
WO2007001351A1 (en) * 2005-06-17 2007-01-04 Iken Tissue Therapeutics, Inc. Methods for treating ischemic tissue
US7815926B2 (en) * 2005-07-11 2010-10-19 Musculoskeletal Transplant Foundation Implant for articular cartilage repair
WO2007016083A1 (en) 2005-07-26 2007-02-08 Ams Research Corporation Methods and systems for treatment of prolapse
FR2889808B1 (fr) 2005-08-17 2011-07-22 Oreal Utilisation de l'acide 8-hexadecene-1,16-dicarboxylique comme agent de soin destine a favoriser la cohesion de la couche cornee
WO2007025290A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 Isto Technologies, Inc. Implants and methods for repair, replacement and treatment of joint disease
WO2007027592A1 (en) * 2005-08-29 2007-03-08 Ams Research Corporation System for positioning support mesh in a patient
CA2623106C (en) 2005-09-19 2013-12-24 Histogenics Corporation Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof
US20090221867A1 (en) * 2005-11-11 2009-09-03 Ams Research Corporation Integral Sling Connection System and Method
JP5113332B2 (ja) * 2005-12-19 2013-01-09 正美 丹羽 血液脳関門インヴィトロ・モデル、病態血液脳関門インヴィトロ・モデル、及びこれを用いた薬物スクリーニング方法、病態血液脳関門機能解析方法、病因解析方法
WO2007075979A2 (en) 2005-12-21 2007-07-05 Vaxdesign Corporation In vitro germinal centers
EP3091071B1 (en) * 2006-03-23 2019-07-03 Pluristem Ltd. Methods for cell expansion and uses of cells and conditioned media produced thereby for therapy
EP2019648A4 (en) 2006-05-19 2017-06-07 AMS Research Corporation Method and articles for treatment of stress urinary incontinence
WO2008012696A2 (en) * 2006-06-15 2008-01-31 Penelope Costello Methods and kits for testing the efficacy of therapeutica compounds and other therapies in a three-dimensional matrix with respect to tumorous cells and tissue
KR101115493B1 (ko) 2006-06-16 2012-03-13 에이엠에스 리써치 코오포레이션 골반질병치료용 임플란트, 도구 및 방법
CA2936752A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Ams Research Corporation Adjustable tension incontinence sling assemblies
WO2008094178A2 (en) 2006-06-27 2008-08-07 Vaxdesign Corporation Models for vaccine assessment
WO2008062467A2 (en) * 2006-10-13 2008-05-29 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Cultured melanocytes on biopolymers
WO2008061392A1 (fr) * 2006-11-22 2008-05-29 Hua Liu Procédé de préparation de populations cellulaires présentant une réponse immunitaire antitumorale
US8163549B2 (en) 2006-12-20 2012-04-24 Zimmer Orthobiologics, Inc. Method of obtaining viable small tissue particles and use for tissue repair
US8435551B2 (en) 2007-03-06 2013-05-07 Musculoskeletal Transplant Foundation Cancellous construct with support ring for repair of osteochondral defects
AU2008240191B2 (en) 2007-04-12 2013-09-19 Zimmer, Inc. Compositions and methods for tissue repair
JP2010528613A (ja) 2007-05-29 2010-08-26 クリストファー ビー． リード， 多能細胞集団を産生する方法およびその使用
US10590391B2 (en) * 2007-06-08 2020-03-17 Wake Forest University Health Sciences Selective cell therapy for the treatment of renal failure
ES2725502T3 (es) * 2007-06-08 2019-09-24 Univ Wake Forest Health Sciences Terapia celular selectiva para el tratamiento de la insuficiencia renal
WO2009048661A1 (en) 2007-07-16 2009-04-16 Vaxdesign Corporation Artificial tissue constructs comprising alveolar cells and methods for using the same
JPWO2009050965A1 (ja) * 2007-10-19 2011-02-24 国立成育医療センター総長 細胞凍結物固定化基材及び初代肝細胞培養ツール、並びに初代肝細胞培養ツールの製造方法
US8623034B2 (en) * 2007-10-19 2014-01-07 Ethicon, Gmbh Soft tissue repair implant
US8524494B2 (en) 2008-01-30 2013-09-03 Histogen, Inc. Low oxygen tension and BFGF generates a multipotent stem cell from a fibroblast in vitro
US20100166824A1 (en) * 2008-01-30 2010-07-01 Histogen, Inc. Extracellular matrix compositions
SG10201906494PA (en) * 2008-01-30 2019-09-27 Histogen Inc Extracellular matrix compositions
US8530415B2 (en) * 2008-01-30 2013-09-10 Histogen, Inc. Repair and/or regeneration of cells with a composition produced by culturing fibroblast cells under hypoxic conditions
US8535913B2 (en) * 2008-01-30 2013-09-17 Histogen, Inc. Soluble composition for promoting hair growth produced by hypoxic culture of fibroblasts cells
EP2265220A1 (en) 2008-03-05 2010-12-29 Musculoskeletal Transplant Foundation Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles
PL2288376T3 (pl) 2008-04-18 2016-07-29 Collplant Ltd Sposoby generowania i wykorzystywania prokolagenu
WO2009157585A1 (ja) * 2008-06-24 2009-12-30 独立行政法人海洋研究開発機構 動物細胞の凍結保存用担体、それを用いた凍結保存用バイオデバイス及び凍結保存方法
US8727963B2 (en) 2008-07-31 2014-05-20 Ams Research Corporation Methods and implants for treating urinary incontinence
US9017243B2 (en) 2008-08-25 2015-04-28 Ams Research Corporation Minimally invasive implant and method
US8968181B2 (en) 2008-08-25 2015-03-03 Ams Research Corporation Minimally invasive implant and method
JP5307489B2 (ja) * 2008-09-19 2013-10-02 株式会社クラレ 三次元細胞構造体の作製方法
WO2010056328A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Tengion, Inc. Isolated renal cells and uses thereof
WO2010057015A1 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Wake Forest University Health Sciences Kidney structures and methods of forming the same
AU2009314506B2 (en) 2008-11-14 2015-07-23 Histogen, Inc. Extracellular matrix compositions for the treatment of cancer
US8449573B2 (en) 2008-12-05 2013-05-28 Boston Scientific Scimed, Inc. Insertion device and method for delivery of a mesh carrier
US20100274362A1 (en) * 2009-01-15 2010-10-28 Avner Yayon Cartilage particle tissue mixtures optionally combined with a cancellous construct
JP5436905B2 (ja) * 2009-03-26 2014-03-05 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
US8968334B2 (en) 2009-04-17 2015-03-03 Boston Scientific Scimed, Inc. Apparatus for delivering and anchoring implantable medical devices
US9301750B2 (en) * 2009-11-03 2016-04-05 Boston Scientific Scimed, Inc. Device and method for delivery of mesh-based devices
US9060837B2 (en) 2009-11-23 2015-06-23 Ams Research Corporation Patterned sling implant and method
US9060836B2 (en) * 2009-11-23 2015-06-23 Ams Research Corporation Patterned implant and method
JP5667357B2 (ja) * 2009-11-30 2015-02-12 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
US8622886B2 (en) * 2010-03-16 2014-01-07 Ethicon, Inc. Surgical instrument and method for the treatment of urinary incontinence
KR102428776B1 (ko) 2010-05-12 2022-08-04 인리젠 생물활성 신장 세포
JP5884218B2 (ja) * 2010-06-17 2016-03-15 国立大学法人大阪大学 腫瘍組織モデルの製造方法
US10028813B2 (en) 2010-07-22 2018-07-24 Boston Scientific Scimed, Inc. Coated pelvic implant device and method
WO2012048105A1 (en) 2010-10-06 2012-04-12 Ams Research Corporation Implants with absorbable and non-absorbable features for the treatment of female pelvic conditions
FR2967163A1 (fr) 2010-11-05 2012-05-11 Centre Nat Rech Scient Procede in vitro ou ex vivo pour la maintenance en survie et la generation ou reconstruction d'un epiderme
EP2637711B1 (en) 2010-11-10 2024-03-27 ProKidney Injectable formulations for organ augmentation
EP3527214A1 (en) 2010-11-12 2019-08-21 Allergan, Inc. Metabolized conditioned growth medium and methods of use
US9572648B2 (en) 2010-12-21 2017-02-21 Justin M. Crank Implantable slings and anchor systems
US8597948B2 (en) 2011-03-10 2013-12-03 First Principles, Inc. Cloned biological material medical device and method thereof
US8808162B2 (en) 2011-03-28 2014-08-19 Ams Research Corporation Implants, tools, and methods for treatment of pelvic conditions
US20120253108A1 (en) 2011-03-28 2012-10-04 Fischer Brian G Implants, tools, and methods for treatment of pelvic conditions
US9492259B2 (en) 2011-03-30 2016-11-15 Astora Women's Health, Llc Expandable implant system
FR2976001B1 (fr) 2011-05-30 2014-10-31 Oreal Modele de cuir chevelu reconstruit et procede de screening de molecules actives
US10058240B2 (en) 2011-06-29 2018-08-28 Boston Scientific Scimed, Inc. Systems, implants, tools, and methods for treatments of pelvic conditions
US9351723B2 (en) 2011-06-30 2016-05-31 Astora Women's Health, Llc Implants, tools, and methods for treatments of pelvic conditions
US9414903B2 (en) 2011-07-22 2016-08-16 Astora Women's Health, Llc Pelvic implant system and method
EP2734148B1 (en) 2011-07-22 2019-06-05 Boston Scientific Scimed, Inc. Pelvic implant system
US9492191B2 (en) 2011-08-04 2016-11-15 Astora Women's Health, Llc Tools and methods for treatment of pelvic conditions
US20130035555A1 (en) 2011-08-05 2013-02-07 Alexander James A Systems, implants, tools, and methods for treatment of pelvic conditions
CN102614547B (zh) * 2012-03-13 2015-04-15 中山大学中山眼科中心 一种快速构建复层细胞的方法
WO2013163358A1 (en) 2012-04-24 2013-10-31 Harvard Bioscience, Inc. Engineered tissue scaffolds and supports therefor
JP5977580B2 (ja) * 2012-05-24 2016-08-24 秀実 高橋 ランゲルハンス細胞の調製方法
US20140178343A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Jian Q. Yao Supports and methods for promoting integration of cartilage tissue explants
WO2014110300A1 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Harvard Apparatus Regenerative Technology Synthetic scaffolds
WO2015005349A1 (ja) * 2013-07-09 2015-01-15 国立大学法人東京大学 細胞培養支持体、細胞培養装置、細胞培養キット、及び細胞シート
WO2015017749A1 (en) 2013-08-01 2015-02-05 Mohan P Arun Tissue adjustment implant
US9878071B2 (en) 2013-10-16 2018-01-30 Purdue Research Foundation Collagen compositions and methods of use
JP5813074B2 (ja) * 2013-10-21 2015-11-17 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
JP6277684B2 (ja) * 2013-11-18 2018-02-14 大日本印刷株式会社 細胞積層体の製造方法
CN104877953B (zh) * 2014-02-28 2018-06-01 上海尚瑞生物医药科技有限公司 促进黑色素细胞色素产生的皮肤制剂的制备方法
US10077420B2 (en) 2014-12-02 2018-09-18 Histogenics Corporation Cell and tissue culture container
JP5727665B2 (ja) * 2014-12-11 2015-06-03 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
JP5893786B2 (ja) * 2015-04-02 2016-03-23 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
WO2016172365A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Purdue Research Foundation Office Of Technology Commercialization Cell-collagen-silica composites and methods of making and using the same
RU2587755C1 (ru) * 2015-06-10 2016-06-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный Медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна Федерального Медико-биологического агентства" (ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России) Способ получения действующего вещества из пантов марала
GB201510913D0 (en) * 2015-06-22 2015-08-05 Nat University Of Singapore And Agency For Science Technology And Res Vascularized tissue, skin or mucosa quivalent
KR102078602B1 (ko) * 2015-07-23 2020-02-19 한국화학연구원 지방세포와 마크로파지의 3차원 공동 배양 방법
CN107921173B (zh) * 2015-08-03 2021-07-06 富士胶片株式会社 细胞结构体、非人模型动物、非人模型动物的制造方法及被检验物质的评价方法
JP6140322B2 (ja) * 2016-02-24 2017-05-31 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
CN109072276B (zh) * 2016-04-19 2022-11-01 凸版印刷株式会社 抗癌剂的评价方法
WO2017222065A1 (ja) * 2016-06-24 2017-12-28 株式会社資生堂 三次元培養皮膚シート、その製造に使用するための細胞培養容器及びその製造方法
US11123372B2 (en) 2016-07-29 2021-09-21 Prokidney Bioactive renal cells for the treatment of chronic kidney disease
WO2018200750A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Purdue Research Foundation 3-dimensional (3d) tissue-engineered muscle for tissue restoration
JP6490738B2 (ja) * 2017-04-28 2019-03-27 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
JP6915692B2 (ja) * 2017-08-21 2021-08-04 凸版印刷株式会社 抗がん効果の評価方法、及びがん免疫療法の奏効性予測方法
EP3716988A4 (en) * 2017-11-29 2021-12-15 Figene, LLC INTERACTION OF FIBROBLASTS AND IMMUNE CELLS FOR ACTIVATION AND THEIR USES
JP2018078906A (ja) * 2018-01-17 2018-05-24 大日本印刷株式会社 細胞積層体の製造方法
JP2019180354A (ja) * 2018-04-16 2019-10-24 国立研究開発法人理化学研究所 細胞シートの製造方法及び細胞シート
JP6657452B2 (ja) * 2019-02-27 2020-03-04 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
JP7002497B2 (ja) * 2019-06-20 2022-01-20 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
JP7556194B2 (ja) * 2019-12-13 2024-09-26 Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 細胞構造体及びその使用
JP6872051B2 (ja) * 2020-02-05 2021-05-19 テルモ株式会社 シート状細胞培養物の製造方法
CN112625193B (zh) * 2020-12-31 2022-06-14 青岛科技大学 极性改性凡士林及其制备方法

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH593339A5 (hu) * 1973-07-02 1977-11-30 Monsanto Co
US4144126A (en) * 1975-05-21 1979-03-13 Beecham Group Limited Cell culture method
US4280954A (en) * 1975-07-15 1981-07-28 Massachusetts Institute Of Technology Crosslinked collagen-mucopolysaccharide composite materials
US4016036A (en) * 1975-11-14 1977-04-05 Massachusetts Institute Of Technology Process for serially culturing keratinocytes
US4024020A (en) * 1975-12-15 1977-05-17 Monsanto Company Method of cell culture on polyacrylonitrile surface
DE2557870A1 (de) * 1975-12-22 1977-06-23 Linde Ag Verfahren und vorrichtung zum tiefgefrieren von biologischen substanzen
US4087327A (en) * 1976-04-12 1978-05-02 Monsanto Company Mammalion cell culture process
US4117881A (en) * 1977-06-14 1978-10-03 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration System for and method of freezing biological tissue
US4135975A (en) * 1977-12-14 1979-01-23 Lichtman Marshall A Obtaining human cell lines that elaborate colony stimulating activity for marrow cells of man and other species and methods of preparing same
US4228243A (en) * 1978-07-13 1980-10-14 Toray Industries, Inc. Cell culture propagation apparatus
US4299819A (en) * 1979-01-02 1981-11-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Process for treating burn victims
US4342828A (en) * 1979-07-20 1982-08-03 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells
US4642292A (en) * 1979-10-29 1987-02-10 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Method for isolation of connective tissue biomatrix
US4481946A (en) * 1980-08-14 1984-11-13 Altshuler John H Bone marrow transplant method and apparatus
US4486188A (en) * 1980-08-14 1984-12-04 Applied Medical Devices, Inc. Bone marrow transplant method and apparatus
US4553272A (en) * 1981-02-26 1985-11-19 University Of Pittsburgh Regeneration of living tissues by growth of isolated cells in porous implant and product thereof
US4539716A (en) * 1981-03-19 1985-09-10 Massachusetts Institute Of Technology Fabrication of living blood vessels and glandular tissues
US4546500A (en) * 1981-05-08 1985-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Fabrication of living blood vessels and glandular tissues
US4489710A (en) * 1981-06-23 1984-12-25 Xoma Corporation Composition and method for transplantation therapy
US4621100A (en) * 1981-09-25 1986-11-04 The Upjohn Company Treatment of osteoporosis with prostaglandins
DE3138597A1 (de) * 1981-09-29 1983-04-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur zuechtung von humanen fibrolasten und fibroblastenartigen zellen
US4458678A (en) * 1981-10-26 1984-07-10 Massachusetts Institute Of Technology Cell-seeding procedures involving fibrous lattices
JPS5881781A (ja) * 1981-11-11 1983-05-17 Ajinomoto Co Inc 動物細胞の培養方法
US4485096A (en) * 1982-02-26 1984-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Tissue-equivalent and method for preparation thereof
US4520821A (en) * 1982-04-30 1985-06-04 The Regents Of The University Of California Growing of long-term biological tissue correction structures in vivo
US4485097A (en) * 1982-05-26 1984-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Bone-equivalent and method for preparation thereof
US4645669A (en) * 1982-10-04 1987-02-24 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Culturing and emplacement of differentiated cells in vivo
JPS60123884A (ja) * 1983-12-09 1985-07-02 三菱電機株式会社 英語学習機
IL74715A0 (en) * 1984-03-27 1985-06-30 Univ New Jersey Med Biodegradable matrix and methods for producing same
EP0163543A3 (en) * 1984-06-01 1987-08-12 VXR, Inc. Marrow cell stimulator
JPS61227526A (ja) * 1984-07-25 1986-10-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規なコロニー刺激因子
US4604346A (en) * 1984-10-09 1986-08-05 Massachusetts Institute Of Technology Skin-equivalent prepared by the use of punch biopsy
AU589438B2 (en) * 1985-08-26 1989-10-12 Hana Biologics, Inc. Transplantable artificial tissue and process
US5032508A (en) * 1988-09-08 1991-07-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
CA1340581C (en) * 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US4835102A (en) * 1987-03-31 1989-05-30 Eugene Bell Tissue equivalent test systems

Also Published As

Publication number Publication date
JPH04501657A (ja) 1992-03-26
US5032508A (en) 1991-07-16
JP2000189158A (ja) 2000-07-11
WO1990002796A1 (en) 1990-03-22
DK40591A (da) 1991-05-07
PT91676A (pt) 1990-03-30
EP0358506A3 (en) 1990-05-23
NZ230572A (en) 1993-12-23
DK40591D0 (da) 1991-03-07
BR8907642A (pt) 1991-08-20
JP2001258555A (ja) 2001-09-25
FI911142A0 (fi) 1991-03-07
CA1335657C (en) 1995-05-23
HU895973D0 (en) 1991-07-29
EP0358506A2 (en) 1990-03-14
HU910750D0 (en) 1991-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT56393A (en) Three dimensional cell and tissue culturing systems
US5518915A (en) Three-Dimensional mucosal cell and tissue culture system
US5160490A (en) Three-dimensional cell and tissue culture apparatus
US4963489A (en) Three-dimensional cell and tissue culture system
US5478739A (en) Three-dimensional stromal cell and tissue culture system
US20070286880A1 (en) Inoculated spongiform scaffold for transplantation and tissue regeneration
KR20000052709A (ko) 와튼제대교질에서 분리된 세포를 이용하여 연골 조직을 생산
US20040052768A1 (en) Vascularised tissue graft
JPH09509827A (ja) 機能性ヒト組織の再生と利用
Liu et al. Reconstruction of a tissue‐engineered skin containing melanocytes
JP2015097524A (ja) 再構成皮膚の作製用の組成物および方法
Scuderi et al. Clinical application of autologous three-cellular cultured skin substitutes based on esterified hyaluronic acid scaffold: our experience
CA2419923C (en) Vascularised tissue graft
JP5340564B2 (ja) 人工皮膚およびその製造方法
JP4324988B2 (ja) 発毛誘導剤および発毛方法
AU2016357986A1 (en) Method for the production of hair follicles and de novo papillae, and use thereof for in vitro test and in vivo implants
Harriger et al. Cornification and basement membrane formation in a bilayered human skin equivalent maintained at an air-liquid interface
AU644578B2 (en) Three-dimensional cell and tissue culture system
KR0156685B1 (ko) 3차원 배양물을 이용한 약물의 효과를 테스트하는 방법
KR0156571B1 (ko) 3차원 세포 및 조직 배양계
Shin et al. Comparison of hair dermal cells and skin fibroblasts in a collagen sponge for use in wound repair
IL91536A (en) A three-dimensional cell and a tissue culture system that includes parenchymal cells cultured on living stromal tissue, a method for preparing such a system and its uses
AU2001283687B2 (en) Vascularised tissue graft
AU2001283687A1 (en) Vascularised tissue graft

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee